Rozwarstwienie, immunohistochemia i montaż mózgów larw i dorosłych osobników Drosophila w celu wizualizacji płata wzrokowego

System wzrokowy Drosophila, składający się z oka złożonego i leżącego pod nim płata wzrokowego, był doskonałym modelem do badania rozwoju i funkcji obwodów nerwowych. W ostatnich latach w szczególności płat wzrokowy stał się potężnym systemem, w którym można badać procesy neurorozwojowe, takie jak neurogeneza i okablowanie obwodów^{1,2,3,4,5,6,7,8}. Składa się z czterech neuropils: blaszki, rdzenia, zrazika i płytki zrazikowej (dwie ostatnie tworzą kompleks zrazika)^1,2,3,4,5,6. Fotoreceptory z oka celują w neurony blaszki i rdzenia, które przetwarzają bodźce wzrokowe i przekazują je do neuropils kompleksu zrazika^1,2,3,4,5,6. Neurony projekcyjne w kompleksie zrazika następnie wysyłają informacje wizualne do centrów przetwarzania wyższego rzędu w centralnym mózgu^1,5,9. Złożona organizacja płata wzrokowego, wymuszona potrzebą utrzymania retinotopii i przetwarzania różnych rodzajów bodźców wzrokowych, sprawia, że jest to atrakcyjny system do badania, w jaki sposób budowane są wyrafinowane obwody neuronowe. Warto zauważyć, że rdzeń ma uderzające podobieństwa zarówno pod względem organizacji, jak i rozwoju z neurosiatkówką, która od dawna jest modelem rozwoju obwodów nerwowych kręgowców^3,8.

Rozwój płata wzrokowego rozpoczyna się podczas embriogenezy, z wyszczególnieniem ~35 komórek ektodermalnych, które tworzą placode wzrokowy^2,4,5^,6,7,8. Po wykluciu się larwy placode wzrokowy dzieli się na dwie odrębne zawiązki: 1) zewnętrzne centrum proliferacji (OPC), które generuje neurony blaszki i zewnętrznego rdzenia oraz 2) wewnętrzne centrum proliferacji (IPC), które generuje neurony wewnętrznego rdzenia i kompleksu płatowego^4,5^,6,10. U larwy drugiego stadium rozwoju komórki neuroepitelialne OPC i IPC zaczynają przekształcać się w neuroblasty, które następnie generują neurony za pośrednictwem komórek macierzystych zwojów pośrednich^4,5,11,12. Neuroblasty płata wzrokowego są wzorowane na ograniczonych przestrzennie i czasowo czynnikach transkrypcyjnych, które działają razem, aby generować różnorodność neuronalną u ich potomstwa^11,12,13,14. W poczwarce obwody neuropils płata wzrokowego są łączone poprzez koordynację kilku procesów, w tym programowanej śmierci komórki^11,15, migracja neuronalna^12,16, celowanie aksonalne/dendrytyczne^10,17, tworzenie synaps^18,19 i neuropil rotations^10,17.

Tutaj opisujemy metodologię, za pomocą której larwy i dorosłe mózgi są preparowane, barwione immunologicznie i montowane do obrazowania płata wzrokowego. Biorąc pod uwagę jego złożoną trójwymiarową organizację, analiza płata wzrokowego wymaga zrozumienia, w jaki sposób jego dorosłe neuropils i larwalne przodki są ustawione względem siebie i centralnego mózgu. W związku z tym kładziemy szczególny nacisk na to, jak orientacja montażu odnosi się do organizacji przestrzennej struktur płata wzrokowego. Opisujemy trzy strategie montażu dla mózgów larw (przedni, tylny i boczny) oraz trzy dla mózgów dorosłych (przedni, tylny i poziomy), z których każda zapewnia optymalny kąt do obrazowania określonej populacji progenitorów płata wzrokowego lub neuropilu.

1. Przygotowanie mózgów larwalnych do obrazowania konfokalnego

1. Sekcje
   UWAGA: Przed rozpoczęciem sekcji należy przygotować roztwory fix (4% formaldehydu w buforze fosforanowym soli fizjologicznej (PBS)) i PBT (0,1-0,3% Trytonu w PBS). Roztwór fix należy umieścić na lodzie podczas sekcji. Chociaż w tym protokole stosuje się utrwalacz paraformaldehydu (PFA), dla określonych epitopów opisano alternatywne strategie utrwalania (przy użyciu PLP²⁰ lub PEM²¹). Do sekcji larw potrzebne są dwie pary kleszczy (Dumont #5 lub #55s). Zobacz tabelę materiałów, aby uzyskać więcej informacji.
   1. Zacznij od napełnienia każdej studzienki naczynia preparacyjnego 400 μl 1x PBS. Użyj kleszczy, aby delikatnie wybrać wędrujące larwy trzeciego stadium pełzające po wnętrzu fiolki. Umieść larwy w pierwszej studzience naczynia wypełnionego PBS.
   2. Weź jedną larwę i przenieś ją do środkowej studzienki. Używając ręki niedominującej, przytrzymaj ciało larwy u podstawy studni.
   3. Dominującą ręką delikatnie chwyć haczyk do ust larwy i odsuń się od ciała. Mózg larwy powinien być przymocowany do haczyka ustnego i innej tkanki dodatkowej i odpadnie, gdy tkanka zostanie odciągnięta.
   4. Usunąć dodatkowe dyski wyobrażeniowe i przenieść mózg larwy do trzeciego dołka naczynia preparacyjnego. Dyski wyobrażeniowe to tkanki nabłonkowe otaczające mózg larwy, które generują dorosłe struktury, takie jak czułki, oczy, nogi i skrzydła²⁰. Pozostawione na tkance dyski wyobrażeniowe mogą utrudniać prawidłowe barwienie immunologiczne mózgu larwy.
      1. Aby usunąć wyimaginowane dyski, użyj kleszczy, aby mocno chwycić mózg przez brzuszny rdzeń nerwowy. Za pomocą innej pary kleszczy delikatnie oderwij krążki.
      2. Ostrożnie usuń krążek oka, ponieważ owija się on po powierzchni płatów mózgowych. Aby usunąć krążek oka, użyj kleszczy, aby przytrzymać mózg przy podstawie naczynia. Zamiast trzymać mózg przez brzuszny rdzeń nerwowy, użyj kleszczy, aby lekko chwycić płat mózgu, uważając, aby go nie ścisnąć. Za pomocą innej pary kleszczy delikatnie odciągnij krążek oka.
         UWAGA: Dysk wyobrażeniowy oka w końcu spowoduje powstanie fotoreceptorów siatkówki. Dla osób zainteresowanych badaniem połączeń nerwowych między siatkówką a płatem wzrokowym, dysk oka można pozostawić w mózgu. Jednak dla osób zainteresowanych wyłącznie strukturami płata wzrokowego zaleca się usunięcie tarczy oka, ponieważ może to pogorszyć jakość obrazu ze względu na jego położenie na powierzchni mózgu.
   5. Powtarzaj kroki 1.1.2\u20121.1.4, aż zostanie pobrana wystarczająca liczba mózgów (lub upłynie 30 minut czasu sekcji). Sekcje nie powinny trwać dłużej niż 30 minut, aby zapewnić, że integralność tkanki nie zostanie naruszona.
   6. Po zakończeniu okresu preparacji użyj pipety P200, aby ostrożnie usunąć PBS z trzeciego dołka. Upewnij się, że w studzience pozostała niewielka objętość płynu, aby mózg był zanurzony.
      UWAGA: Bardzo ważne jest, aby mózgi były zanurzone w płynie we wszystkich punktach protokołu. Jeśli tkanka wyschnie, jakość plamy może być zagrożona przez niepożądaną autofluorescencję w obrazie konfokalnym.
   7. Dodać 500 μl roztworu utrwalającego na zimno do trzeciego dołka. Użyj kleszczy, aby delikatnie wymieszać płyn, pozwalając mózgom zawirować w naczyniu. Przykryj naczynie szkiełkiem podstawowym i umieść je na lodzie na 30 minut, aby umożliwić utrwalenie tkanki.
   8. Usunąć roztwór utrwalający i umyć mózgi 400 μl PBT, 5 razy.
      UWAGA: Triton to detergent z PBT, który zapobiega przywieraniu mózgów do siebie lub do naczynia i przygotowuje tkankę do optymalnej penetracji przeciwciał.
2. Immunohistochemia
   UWAGA: W Banku Hybrydoma Developmental Studies (DSHB) dostępnych jest kilka podstawowych przeciwciał, które można wykorzystać do znakowania określonych struktur płata wzrokowego lub typów komórek. DE-Kadheryna oznacza IPC i OPC neuroepitelia, Bruchpilot (Brp) oznacza rozwijające się neuropil i jamnik znakuje neurony blaszki i zrazika (a także niewielki podzbiór neuronów rdzenia). Dodatkowo Elav może być używany do oznaczania neuronów, Prospero do oznaczania komórek macierzystych ganglionu, a Repo do identyfikacji gleju.
   1. Przygotować roztwór przeciwciała pierwszorzędowego, dodając przeciwciała do PBT do całkowitej objętości 100 μl. Środek blokujący (10% normalna surowica kozia) może być użyty w celu zapobieżenia niespecyficznemu wiązaniu między pierwotnym przeciwciałem a tissue^20,22,23. Przeciwciała użyte w tym protokole specyficznie znakują tkankę mózgową bez potrzeby stosowania środków blokujących.
   2. Usuń ostatnie płukanie po utrwaleniu i dodaj pierwszorzędowy roztwór przeciwciała. Upewnij się, że w studzience znajduje się tylko niewielka ilość PBT przed dodaniem roztworu przeciwciała. Po dodaniu roztworu delikatnie wymieszaj mózgi kleszczami 5-10 razy. Przykryć szkiełkiem podstawowym, uszczelnić folią laboratoryjną i inkubować w temperaturze 4 °C przez noc.
      1. Alternatywnie, jeśli dostępna jest wytrząsarka orbitalna z chłodzeniem, umieść naczynie na wytrząsarce, aby zoptymalizować inkubację przez noc.
         UWAGA: Pierwotną inkubację przeciwciał i wszystkie kolejne etapy można alternatywnie przeprowadzić w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Objętość inkubacji pierwotnej i wtórnej może wynosić 100 μl, ale etapy przemywania należy wykonywać przy użyciu 800 μl lub więcej PBT.
   3. Po inkubacji wypłukać pierwszorzędowe przeciwciała PBT, jak w kroku 1.1.8 poprzedniej sekcji.
      UWAGA: Roztwór przeciwciała pierwotnego należy zachować i przechowywać w temperaturze 4 °C, ponieważ można go ponownie wykorzystać do kolejnych eksperymentów. Wiele przeciwciał pierwszorzędowych może być ponownie użytych do czterech razy.
   4. Dodaj 400 μl PBT do mózgu, aby uzyskać końcowe pranie. Przykryj naczynie szkiełkiem, zamknij folią laboratoryjną i umieść na wytrząsarce orbitalnej przy niskiej prędkości (100 obr./min) i temperaturze pokojowej (RT) na ~4 h.
      UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać. Mózg można pozostawić w praniu na 2-3 dni w temperaturze 4 °C.
   5. Przygotować drugorzędowy roztwór przeciwciała o całkowitej objętości 100 μl.
      UWAGA: W tym protokole wszystkie przeciwciała drugorzędowe są używane w rozcieńczeniu 1:500, bez środków blokujących.
   6. Usuń płuczkę PBT ze studzienki i dodaj wtórny roztwór przeciwciał. Wymieszaj tkankę w roztworze za pomocą kleszczy. Przykryj naczynie szkiełkiem i folią laboratoryjną. Umieścić naczynie na wytrząsarce orbitalnej w temperaturze pokojowej na minimalny okres inkubacji wynoszący 2 godziny. Ponieważ przeciwciała drugorzędowe zawierają światłoczułe fluorofory, przykryj naczynie folią aluminiową.
      UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać. Mózgi można pozostawić na noc w roztworze przeciwciał wtórnych w temperaturze 4 °C.
   7. Wypłukać przeciwciała drugorzędowe zgodnie z opisem w kroku 1.2.3. Dodaj 400 μl PBT do mózgu, aby uzyskać końcowe pranie. Przykryj naczynie szkiełkiem, zamknij folią laboratoryjną i folią. Umieść mózgi na wytrząsarce w temperaturze pokojowej przez 4 godziny
      UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać. Mózg można pozostawić w praniu na 2-3 dni w temperaturze 4 °C.
3. Montażu
   1. Usuń końcowe płukanie PBT i zastąp dwiema kroplami fluorescencyjnego nośnika montażowego. Umieść kroplę nośnika montażowego na środku szkiełka.
   2. Przenieś mózgi ze studni do kropli na zjeżdżalni za pomocą kleszczy. Aby uniknąć uszkodzenia płatów wzrokowych, mózg może być podtrzymywany przez brzuszny rdzeń nerwowy podczas przenoszenia na szkiełko.
   3. Zamontuj mózgi zgodnie z poniższymi strategiami montażu (Rysunek 1A).
      1. Przednia strona do góry
         UWAGA: Dla osób zainteresowanych wizualizacją przedniego rdzenia, blaszki lub zatyczki zrazikowej, ta orientacja montażu jest idealna. Najlepszym sposobem na odróżnienie mocowań przednich i tylnych jest zbadanie położenia brzusznego rdzenia nerwowego względem płatów mózgu.
         1. Użyj orientacji przedniej, aby obserwować brzuszny rdzeń nerwowy wystający ponad płaty (Rysunek 1B).
      2. Tylna strona do góry
         UWAGA: Ta orientacja jest zalecana dla osób zainteresowanych wizualizacją tylnych końcówek OPC (pOPC) lub IPC ^10,11.
         1. Użyj orientacji tylnej, aby zobaczyć brzuszny rdzeń nerwowy wystający spod płatów mózgowych (Rysunek 1C).
      3. Widok boczny
         UWAGA: Orientacja montażu bocznego służy do wizualizacji półksiężyca neuronów zatyczki blaszki, rdzenia lub zrazika zarówno w osi grzbietowo-brzusznej, jak i przednio-tylnej w jednej płaszczyźnie (Rysunek 1G).
         1. W przypadku montażu bocznego rozdziel płaty mózgu od siebie, aby opadły płasko na bok, z blaszką i zatyczką zrazika skierowaną do góry.
         2. Za pomocą dwóch par ostrych kleszczy podziel brzuszny rdzeń nerwowy na pół, zaczynając od miejsca, w którym sznur przyczepia się do płatów. Zauważ, że oba płaty są już oddzielone od siebie, a brzuszny rdzeń nerwowy utrzymuje je nienaruszone. W ten sposób rozdziel brzuszny rdzeń nerwowy od punktu rozszczepienia między płatami, aby je rozdzielić. Następnie odwróć każdy płat mózgu i przymocuj brzuszny rdzeń nerwowy po bokach, tak aby boczne powierzchnie były skierowane do góry.
            UWAGA: Do montażu bocznego zaleca się użycie igły wolframowej z cienką końcówką, aby ustawić płat mózgu na boku. Aby wyraźnie zobrazować orientację płatów i kierunek brzusznego rdzenia nerwowego podczas montażu, oświetlenie mikroskopu można regulować. W przypadku korzystania ze źródła światła LED na gęsiej szyi, gęsia szyja powinna być ustawiona równolegle do powierzchni zjeżdżalni, aby zapewnić dobrą widoczność. Ponadto intensywność oświetlenia można zwiększyć lub zmniejszyć, aby zwiększyć kontrast między strukturami mózgu i zapewnić przejrzystość podczas montażu.
   4. Umieść małą kroplę PBS po obu stronach pożywki montażowej zawierającej mózgi. Umieść jedno szkiełko nakrywkowe na każdej kropli, a ostatnie szkiełko nakrywkowe na mózgach. Prawa i lewa krawędź górnego szkiełka nakrywkowego powinny spoczywać na dwóch pozostałych szkiełkach nakrywkowych (Rysunek 1A).
      UWAGA: Przed umieszczeniem szkiełka nakrywkowego na mózgach należy zbudować most. Mózgi larw mają grubość około 200 μm, a zatem, aby zachować integralność tkanki, tworzy się most, który zwiększa odległość między szkiełkiem nakrywkowym a powierzchnią szkiełka.
   5. Uszczelnij krawędzie mostu lakierem do paznokci, aby zabezpieczyć zamontowane mózgi.
   6. Zobrazuj mózgi za pomocą mikroskopii konfokalnej.

2. Przygotowanie dorosłych mózgów do obrazowania konfokalnego

1. Sekcje
   UWAGA: Sekcje mózgu dorosłego są trudniejsze niż mózgi larw i wymagają ostrożnego obchodzenia się. Zdecydowanie zaleca się użycie co najmniej jednej pary ultracienkich kleszczy (Dumont #55) do tej części protokołu.
   1. Znieczulij muchy CO₂ za pomocą igły lub poduszki muchowej i umieść je na chusteczce laboratoryjnej lub ręczniku papierowym na lodzie (aby utrzymać je w znieczuleniu).
   2. Dodać 400 μl PBS do wszystkich trzech dołków szklanego naczynia. Użyj kleszczy, aby delikatnie chwycić jedną dorosłą muchę za skrzydła i umieść ją w pierwszym dołku naczynia.
   3. Użyj pary kleszczy trzymanych w niedominującej ręce, aby przytrzymać klatkę piersiową muchy przy podstawie studni. Dominującą ręką delikatnie oderwij głowę od reszty ciała.
   4. Przenieś głowę do drugiej studzienki. Często głowa będzie unosić się w PBS i może być trudna w obsłudze. Użyj kleszczy, aby przytrzymać go przy podstawie studni za pomocą trąbki.
   5. Oderwij obszar naskórka między oczami za pomocą obu kleszczy. Ponieważ mózg znajduje się tuż pod naskórkiem, bądź tak delikatny, jak to możliwe, aby zapobiec uszkodzeniu leżącej pod spodem tkanki. Kontynuuj odklejanie naskórka po kawałku, aż mózg zostanie odsłonięty. Usuń wszelkie tkanki dodatkowe (tj. siatkówkę, tchawicę, worki powietrzne), które mogą pozostać przyczepione do mózgu.
      UWAGA: Usunięcie siatkówki zostało opisane w poprzednich protokołach^22,24, ale blaszkę można również oddzielić od reszty płata wzrokowego. Jest to przydatne dla tych, którzy chcą badać rdzeń lub kompleks zrazika, ponieważ blaszka znajduje się na powierzchni i może utrudniać wizualizację tych innych neuropils płata wzrokowego podczas obrazowania. Aby usunąć blaszkę, użyj pary ostrych kleszczy, aby delikatnie pociągnąć za wgłębienie między blaszką a rdzeniem neuropils. Blaszka powoli zacznie odklejać się od rdzenia. Powtarzaj ten ruch, aż cała blaszka zostanie usunięta. Podczas tego procesu ważne jest, aby utrzymać mocny uścisk mózgu. Użyj innej pary kleszczy, aby przytrzymać mózg przy podstawie naczynia, ustawiając go tak, aby górna i dolna część centralnego mózgu idealnie pasowały między końcówkami kleszczy. Mocny chwyt wokół centralnej części mózgu zapobiegnie niepożądanemu uszkodzeniu płata wzrokowego.
   6. Przenieś czysty mózg do trzeciej studzienki. Powtarzaj kroki 2.1.2\u20122.1.6 aż do uzyskania wystarczającej liczby mózgów lub upływu maksymalnego okresu preparacji wynoszącego 30 minut.
   7. Usunąć PBS z trzeciego dołka i dodać 500 μl roztworu utrwalającego. Upewnij się, że mózgi nie wysychają tutaj ani podczas żadnych etapów mycia, ponieważ doprowadzi to do fluorescencji tła w obrazach konfokalnych. Przykryj naczynie szkiełkiem podstawowym i pozwól mózgom inkubować się w stałym stanie przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
   8. Po utrwaleniu umyj mózgi 400 μl PBT, 5 razy.
      UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać. Mózgi można przykryć szkiełkiem podstawowym i folią laboratoryjną i pozostawić w praniu na 2–3 dni w temperaturze 4 °C. Dla badaczy, którzy są nowicjuszami w systemie, może być łatwiej pozostawić tkankę dodatkową w mózgu przed i w trakcie fiksacji. Pozwoli to naukowcom zmaksymalizować liczbę próbek mózgu uzyskanych w danym okresie sekcji. Po utrwaleniu i umyciu tkanki, mózgi można dokładnie oczyścić przed dodaniem roztworu przeciwciała pierwotnego. Dorosłe mózgi z tkanką dodatkową mają tendencję do unoszenia się na wodzie, a zatem ryzykują wysuszenie. W rezultacie, zaleca się użycie pary kleszczy, aby ostrożnie zebrać wszystkie mózgi w środku naczynia po dodaniu roztworu utrwalającego i oczyścić mózgi natychmiast po utrwaleniu.
2. Immunohistochemia
   1. Przeprowadzić badania immunohistochemiczne zgodnie z opisem dla mózgów larw w punkcie 1.2.
   2. Użyteczne przeciwciała pierwszorzędowe z DSHB obejmują te, które są wymienione w protokole immunohistochemii larw w punkcie 1.2. Pełna lista przeciwciał i odpowiadających im rozcieńczeń znajduje się w Tabeli Materiałów.
      UWAGA: Należy zachować szczególną ostrożność podczas etapów mycia mózgów dorosłych, ponieważ mogą one unosić się na powierzchni roztworu do płukania i ryzykować wyschnięciem po bokach studzienki po usunięciu roztworu (co doprowadzi do fluorescencji tła). Dobrą praktyką jest trzymanie pipety w jednej ręce, aby dodać lub odciągnąć płyn, a w drugiej parze kleszczy, aby mózg był zanurzony.
3. Montażu
   1. Przed etapem montażu wykonaj końcowe mycie za pomocą PBS (zamiast PBT). PBS powoduje, że mózgi stają się lekko lepkie, co pozwala im pozostać w pożądanej orientacji podczas montowania.
   2. Usuń końcowe pranie i zastąp je trzema kroplami fluorescencyjnego nośnika montażowego. Umieść kroplę nośnika montażowego na środku szkiełka mikroskopowego.
   3. Przenieś mózgi ze studni do kropli na zjeżdżalni za pomocą kleszczy. Aby uniknąć uszkodzenia płatów wzrokowych i zapobiec wysychaniu tkanki, ostrożnie odzyskaj mózg za pomocą działania kapilarycznego. Powoli zamknij parę kleszczy wokół mózgu, aż niewielka objętość płynu zawierającego mózg zostanie wciągnięta między końcówki.
      UWAGA: Podczas przenoszenia mózgu na szkiełko należy uważać, aby nie zamknąć kleszczy, ponieważ spowoduje to uszkodzenie mózgu. Alternatywnie do transferu mózgów można użyć pipety P200. Odetnij koniec końcówki, aby poszerzyć otwór i wstępnie spłucz PBT, aby zapobiec przywieraniu mózgów do wnętrza końcówki.
   4. Zamontuj mózgi zgodnie z poniższymi strategiami (Rysunek 2A).
      1. Przednia strona do góry
         UWAGA: Aby zobrazować neurony blaszki i rdzenia, ustaw mózg przednią stroną do góry (Rysunek 2B). Można to osiągnąć, badając anatomię i krzywiznę centralnych płatów czułkowych.
         1. Za pomocą kleszczy delikatnie obróć mózg na bok, aby zbadać zarówno przednią, jak i tylną stronę. Zauważ, że po przedniej stronie krzywizna mózgu jest wyraźna, a płaty czułkowe wystają lekko na zewnątrz od środka.
      2. Tylna strona do góry
         1. Ustaw mózgi tak, aby tylna (płaska) strona była skierowana do góry, a płaty czułkowe były skierowane w dół (Rysunek 2C).
            UWAGA: Spowoduje to zbliżenie zrazika i płytki zrazika do powierzchni obrazowania i jest idealne dla osób zainteresowanych wizualizacją neuronów kompleksu zrazika.
      3. Widok poziomy
         UWAGA: Aby zobrazować wszystkie neuropile płata nerwu wzrokowego jednocześnie, użyj strategii montażu poziomego (Rysunek 2G). W tej orientacji ciała komórek neuronalnych, trajektorie aksonów i arboryzacje dendrytyczne mogą być wizualizowane w tej samej płaszczyźnie.
         1. Początkowo ustaw mózg przednią stroną do góry. Za pomocą igły wolframowej delikatnie przechyl mózg o 90° w górę, tak aby usiadł na stronie grzbietowej z płatami czułkowymi skierowanymi na zewnątrz. Sprawdź, czy zarówno przednia, jak i tylna strona mózgu są widoczne w tej orientacji.
   5. Zamiast mostka nakrywkowego użyj gliny, aby podnieść szkiełko nakrywkowe ze zjeżdżalni. Użycie gliny pozwala na ponowne zamontowanie mózgów po obrazowaniu (opisanym w sekcji dyskusji).
      1. Umieść mały kawałek gliny na każdym rogu szkiełka nakrywkowego. Upewnij się, że każdy kawałek gliny ma stosunkowo tę samą grubość. Kawałki gliny powinny mieć grubość od 0,5 do 1 mm. Delikatnie umieść szkiełko nakrywkowe na mózgach i lekko dociśnij rogi. Szkiełko nakrywkowe powinno natychmiast złapać płyn i utworzyć uszczelkę. Slajd jest teraz gotowy do obrazowania.
         UWAGA: W celu długotrwałego przechowywania szkiełka zaleca się uszczelnienie szkiełka nakrywkowego lakierem do paznokci i przechowywanie w temperaturze 4 °C z dala od światła.

Konfokalne obrazy larw i dorosłych płatów nerwu wzrokowego zamontowanych w orientacjach opisanych w protokole są przedstawione w Rysunek 1 i Rysunek 2.

Rysunek 1 pokazuje schematy i reprezentatywne konfokalne wycinki mózgów larw umieszczone w orientacji przedniej, tylnej i bocznej. W orientacji przedniej nabłonek OPC (DE-kadheryna), neuroblasty rdzenia (martwy >βgal) i neurony blaszki (jamnik) pojawiają się na powierzchni jako pasma komórek, które owijają się wokół mózgu (ryc. 1B, D). OPC jest przestrzennie uformowany wzdłuż osi grzbietowej/brzusznej przez różnicową ekspresję czynników transkrypcyjnych6,11,12. Vsx1 oznacza centralny OPC (cOPC), Optix oznacza główny OPC (mOPC), a Rx jest wyrażane w tylnym OPC (pOPC), który reprezentuje końcówki półksiężyca11,12,25. Mocowanie przednie jest idealne do wizualizacji cOPC, ponieważ ten obszar półksiężyca leży na powierzchni w tej orientacji (Rysunek 1D). W tej orientacji neurony blaszki są również widoczne po bocznej stronie płata. Głębiej w mózg wzdłuż osi z widoczne stają się dodatkowe obszary OPC, a także inne struktury (Rysunek 1E,F). W środkowym punkcie stosu z widoczny jest nabłonek mOPC wraz z odpowiednimi neuroblastami i neuronami (Ryc. 1E). Dodatkowo, obszar proksymalny IPC (p-IPC) i czop zrazika, które dają początek neuronom zrazika i płytki zrazika6,13,26, są widoczne w tych pośrednich wycinkach. Najgłębsze plasterki z przedstawiają drugą stronę mózgu, gdzie znajdują się końcówki pOPC (Rysunek 1F). Powierzchowny wierzchołek IPC (s-IPC) jest również obecny w tych najgłębszych warstwach13.

Struktury i komórki znajdujące się na dole mózgu zamontowanego z przodu odpowiadają tym, które pojawiłyby się na powierzchni mózgu zamontowanego z tyłu. Ze względu na ich bliskość do obiektywu obrazowania, struktury płata wzrokowego znajdujące się najbliżej powierzchni mózgu lepiej rozdzielają się na obrazach konfokalnych w porównaniu z tymi znajdującymi się na dole. Na powierzchni występuje minimalne rozproszenie światła między tkanką a obiektywem. W głębszych partiach tkanki większe rozpraszanie światła prowadzi do słabszego sygnału fluorescencji. W związku z tym strategia montażu tylnego pozwala na optymalne warunki obrazowania do wizualizacji końcówek OPC lub brzusznego IPC (Rysunek 1F), podczas gdy strategia montażu przedniego jest lepiej odpowiednia do wizualizacji komórek blaszki lub cOPC (Rysunek 1D). Jeśli obszarem zainteresowania jest czop zrazikowy lub mOPC i jego potomstwo, odpowiednia jest każda orientacja montażu, ponieważ struktury te znajdują się w kierunku środka mózgu (Ryc. 1E).

Bocznie zamontowany płat mózgu larwalnego (Rysunek 1G) może być użyty do wizualizacji półksiężyców neuronalnych rdzenia, blaszki lub zrazika w jednej płaszczyźnie ogniskowej. Różne struktury mogą być wizualizowane na różnych głębokościach wzdłuż osi z. Na powierzchni widoczny jest półksiężyc blaszki (Eya) z półksiężycem zatyczki płatika umieszczonym między jego ramionami (Ryc. 1H). Sierp neuronalny rdzenia (Bsh, Eya i Svp) pojawia się w nieco głębszej pozycji z (Ryc. 1I). W pojedynczym plasterku z można uwidocznić cały półksiężyc neuronalny wzdłuż osi grzbietowo-brzusznej i przednio-tylnej. W związku z tym orientacja ta jest odpowiednia dla badacza zainteresowanego określeniem, gdzie jego gen zainteresowania jest wyrażany w odniesieniu do osi przestrzennych OPC.

Rysunek 2 pokazuje schematy i reprezentatywne konfokalne wycinki dorosłych mózgów umieszczone w orientacji przedniej, tylnej i poziomej. Blaszka została usunięta na tych zdjęciach, aby lepiej pokazać leżący pod spodem kompleks rdzenia i zrazika. Rdzeń, płat i płytka zrazika składają się z kory, która zawiera ciała komórek neuronalnych, oraz neuropilu, który składa się z arboryzacji aksonalnych i dendrytycznych. W orientacji przedniej (Ryc. 2B) kora rdzenia i neuropil znajdują się na powierzchni, podczas gdy w orientacji tylnej (Ryc. 2C) zrazik i płytka zrazika są pierwszymi obrazowanymi strukturami. Rysunek 2D\u2012F wyświetla reprezentatywne obrazy zamontowanego z przodu dorosłego płata wzrokowego w trzech pozycjach Z. Ponieważ rdzeń znajduje się na powierzchni przedniego mocowania (Ryc. 2D), kora rdzenia (Vsx1) jest natychmiast widoczna. Ciała komórkowe w korze rzutują swoje arboryzacje do neuropilu (oznaczonego przez Bruchpilota), który można uwidocznić w pośredniej pozycji z (Rysunek 2E). Na tym poziomie pojawia się również zrazik, położony prostopadle do rdzenia. W najgłębszym położeniu z widoczna jest płytka zrazika (Rysunek 2F). Tak więc naukowcy zainteresowani badaniem neuronów kompleksu zrazika powinni stosować orientację tylno-montażową, podczas gdy osoby zainteresowane blaszką i rdzeniem powinny zamontować swoje mózgi w orientacji przedniej.

Poziomo zamontowany płat wzrokowy jest osiągany, gdy mózg jest obrócony o 90° na bok od początkowej pozycji przedniej (Rysunek 2G). W tym ujęciu wszystkie neuropils i kora płata nerwu wzrokowego są widoczne w jednej płaszczyźnie (Rysunek 2H,I). Ta orientacja montażu jest zalecana do wizualizacji projekcji retinotopowych i projekcji neuronów, które celują w neuropils z wieloma płatami wzrokowymi.

Rysunek 1. Orientacje mocowania mózgu larw. (A) Schemat rysunkowy przedstawiający mózg larwalny larw w późnym stadium3-cim zamontowanym na szkiełku w trzech orientacjach. Orientacje można odróżnić od siebie na podstawie położenia brzusznego rdzenia nerwowego (VNC) w stosunku do płatów mózgu. (B) W przednim montażu VNC przechodzi przez górną część płatów mózgowych. W tej orientacji widoczne są neuroblasty rdzenia (NB), przedni nabłonek nerwowy OPC (NE) i neurony blaszki. (C) W tylnym mocowaniu VNC wystaje spod płatów mózgu. Ta orientacja pozwala na wizualizację zarówno tylnego (wierzchołkowego) rdzenia NB, jak i brzusznego IPC NE. (D\u2012F) Konfokalne obrazy mózgu larwalnego w 3.stadium z przodu wybarwionego dla markera OPC i IPC NE DE-Cadherin (niebieski), markera blaszki Dac (czerwony) i markera NB dpn>lacZ (β-gal) (zielony). D-F to plasterki Z od góry (D), środka (E) i dołu (F) tego samego stosu konfokalnego. (G) Schemat przedstawiający późno osadzony w3-cim stadium larwalnym mózg zamontowany w orientacji bocznej. (H, I) Konfokalne obrazy bocznie zamontowanego płata nerwu wzrokowego larwy w trzecimstadium rozwojowym wybarwione dla markera blaszki Eya (niebieski) oraz markerów neuronalnych blaszki i rdzenia Bsh (czerwony) i Svp (zielony). W tej orientacji półksiężyce neuronalne blaszki (H) i rdzenia (I) można uwidocznić wzdłuż całej osi grzbietowo-brzusznej i przednio-tylnej w jednej płaszczyźnie. H i I to plasterki Z od góry (H) i środka (I) tego samego stosu konfokalnego. Podziałka = 50 um. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2. Orientacje montażu mózgu u dorosłych. (A) Schemat kreskówkowy pokazujący mózgi dorosłych ludzi zamontowane na zjeżdżalni w trzech orientacjach. Orientacje można rozróżnić na podstawie położenia płatów antenowych. (B) W orientacji przedniej płaty czułkowe są skierowane do góry, a rdzeń neuropil znajduje się na powierzchni. (C) W orientacji tylnej mózg jest zamontowany z płatami czułkowymi skierowanymi w dół, a zrazik i płytka zrazika neuropils znajdują się na powierzchni. (D\u2012F) Konfokalne wycinki Z zamontowanego z przodu dorosłego mózgu oznaczone markerem neuronalnym rdzenia Vsx1 (magenta) i markerem neuropilu Brp (czerwony). D-F to plasterki Z od góry (D), środka (E) lub dołu (F) tego samego stosu konfokalnego. (G) Schemat mózgu dorosłego człowieka w orientacji poziomej, jaki można uzyskać poprzez zamontowanie mózgu na boku. (H) Konfokalny obraz poziomo zamontowanego mózgu zabarwionego Vsx1 (magenta) i Brp (czerwony). W tej orientacji montażowej wszystkie trzy płaty nerwu wzrokowego, neuropile i kora są widoczne w jednym wycinku Z. Ta orientacja jest idealna do wizualizacji morfologii neuronów płata wzrokowego w poprzek neuropils w jednej płaszczyźnie. (I) Konfokalny obraz poziomo zamontowanego mózgu znakującego neuron rdzenia (Dm4) za pomocą GFP (zielony) i neuropils za pomocą Brp (czerwony). Neurony Dm4 wysyłają arboryzacje do warstw 3 i 5 rdzenia neuropilowego. Podziałka = 50 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.