Rozwarstwienie, immunohistochemia i montaż mózgów larw i dorosłych osobników Drosophila w celu wizualizacji płata wzrokowego

Urfa Arain; Priscilla Valentino; Ishrat  Maliha Islam; Ted Erclik

doi:10.3791/61273

Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Rozwarstwienie, immunohistochemia i montaż mózgów larw i dorosłych osobników Drosophila w celu wizualizacji płata wzrokowego

5.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61273

⸱

28 kwietnia 2021

Urfa Arain¹ , Priscilla Valentino¹ , Ishrat Maliha Islam¹ , Ted Erclik¹

¹Departments of Biology and Cell & Systems Biology, University of Toronto - Mississauga

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje trzy kroki przygotowania płatów wzrokowych larw i dorosłych Drosophila do obrazowania: 1) preparacje mózgu, 2) immunohistochemia i 3) montaż. Nacisk położono na krok 3, ponieważ do wizualizacji określonych struktur płatów optycznych wymagane są różne orientacje montażowe.

Streszczenie

Płat wzrokowy Drosophila, składający się z czterech neuropils: blaszki, rdzenia, zrazika i płytki zrazikowej, jest doskonałym systemem modelowym do badania mechanizmów rozwojowych, które generują różnorodność neuronów i napędzają tworzenie obwodów. Biorąc pod uwagę jego złożoną trójwymiarową organizację, analiza płata wzrokowego wymaga zrozumienia, w jaki sposób jego dorosłe neuropils i larwalne przodki są ustawione względem siebie i centralnego mózgu. W tym miejscu opisujemy protokół preparacji, barwienia immunologicznego i montowania mózgów larw i dorosłych do obrazowania płata nerwu wzrokowego. Szczególny nacisk położono na zależność między orientacją montażu a organizacją przestrzenną płata optycznego. Opisujemy trzy strategie montażu u larwy (przednia, tylna i boczna) oraz trzy u dorosłego (przednia, tylna i pozioma), z których każda zapewnia idealny kąt obrazowania dla odrębnej struktury płata wzrokowego.

Wprowadzenie

System wzrokowy Drosophila, składający się z oka złożonego i leżącego pod nim płata wzrokowego, był doskonałym modelem do badania rozwoju i funkcji obwodów nerwowych. W ostatnich latach w szczególności płat wzrokowy stał się potężnym systemem, w którym można badać procesy neurorozwojowe, takie jak neurogeneza i okablowanie obwodów¹^,²^,^3,⁴^,^5,⁶^,⁷^,⁸. Składa się z czterech neuropils: blaszki, rdzenia, zrazika i płytki zrazikowej (dwie ostatnie tworzą kompleks zrazika)¹^,²^,³^,⁴^,⁵^,⁶. Fotoreceptory z oka celują w neurony blaszki i rdzenia, które przetwarzają bodźce wzrokowe i przekazują je do neuropils kompleksu zrazika¹^,²^,³^,⁴^,⁵^,⁶. Neurony projekcyjne w kompleksie zrazika następnie wysyłają informacje wizualne do centrów przetwarzania wyższego rzędu w centralnym mózgu¹^,⁵^,⁹. Złożona organizacja płata wzrokowego, wymuszona potrzebą utrzymania retinotopii i przetwarzania różnych rodzajów bodźców wzrokowych, sprawia, że jest to atrakcyjny system do badania, w jaki sposób budowane są wyrafinowane obwody neuronowe. Warto zauważyć, że rdzeń ma uderzające podobieństwa zarówno pod względem organizacji, jak i rozwoju z neurosiatkówką, która od dawna jest modelem rozwoju obwodów nerwowych kręgowców³^,⁸.

Rozwój płata wzrokowego rozpoczyna się podczas embriogenezy, z wyszczególnieniem ~35 komórek ektodermalnych, które tworzą placode wzrokowy²^,⁴^,5^,⁶^,⁷^,⁸. Po wykluciu się larwy placode wzrokowy dzieli się na dwie odrębne zawiązki: 1) zewnętrzne centrum proliferacji (OPC), które generuje neurony blaszki i zewnętrznego rdzenia oraz 2) wewnętrzne centrum proliferacji (IPC), które generuje neurony wewnętrznego rdzenia i kompleksu płatowego⁴^,5^,⁶^,¹⁰. U larwy drugiego stadium rozwoju komórki neuroepitelialne OPC i IPC zaczynają przekształcać się w neuroblasty, które następnie generują neurony za pośrednictwem komórek macierzystych zwojów pośrednich⁴^,⁵^,¹¹^,¹². Neuroblasty płata wzrokowego są wzorowane na ograniczonych przestrzennie i czasowo czynnikach transkrypcyjnych, które działają razem, aby generować różnorodność neuronalną u ich potomstwa^11,^12,¹³^,¹⁴. W poczwarce obwody neuropils płata wzrokowego są łączone poprzez koordynację kilku procesów, w tym programowanej śmierci komórki¹¹^,¹⁵, migracja neuronalna¹²^,¹⁶, celowanie aksonalne/dendrytyczne¹⁰^,¹⁷, tworzenie synaps¹⁸^,¹⁹ i neuropil rotations¹⁰^,¹⁷.

Tutaj opisujemy metodologię, za pomocą której larwy i dorosłe mózgi są preparowane, barwione immunologicznie i montowane do obrazowania płata wzrokowego. Biorąc pod uwagę jego złożoną trójwymiarową organizację, analiza płata wzrokowego wymaga zrozumienia, w jaki sposób jego dorosłe neuropils i larwalne przodki są ustawione względem siebie i centralnego mózgu. W związku z tym kładziemy szczególny nacisk na to, jak orientacja montażu odnosi się do organizacji przestrzennej struktur płata wzrokowego. Opisujemy trzy strategie montażu dla mózgów larw (przedni, tylny i boczny) oraz trzy dla mózgów dorosłych (przedni, tylny i poziomy), z których każda zapewnia optymalny kąt do obrazowania określonej populacji progenitorów płata wzrokowego lub neuropilu.