Ten protokół opisuje trzy kroki przygotowania płatów wzrokowych larw i dorosłych Drosophila do obrazowania: 1) preparacje mózgu, 2) immunohistochemia i 3) montaż. Nacisk położono na krok 3, ponieważ do wizualizacji określonych struktur płatów optycznych wymagane są różne orientacje montażowe.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Rozwarstwienie, immunohistochemia i montaż mózgów larw i dorosłych osobników Drosophila w celu wizualizacji płata wzrokowego
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Płat wzrokowy Drosophila, składający się z czterech neuropils: blaszki, rdzenia, zrazika i płytki zrazikowej, jest doskonałym systemem modelowym do badania mechanizmów rozwojowych, które generują różnorodność neuronów i napędzają tworzenie obwodów. Biorąc pod uwagę jego złożoną trójwymiarową organizację, analiza płata wzrokowego wymaga zrozumienia, w jaki sposób jego dorosłe neuropils i larwalne przodki są ustawione względem siebie i centralnego mózgu. W tym miejscu opisujemy protokół preparacji, barwienia immunologicznego i montowania mózgów larw i dorosłych do obrazowania płata nerwu wzrokowego. Szczególny nacisk położono na zależność między orientacją montażu a organizacją przestrzenną płata optycznego. Opisujemy trzy strategie montażu u larwy (przednia, tylna i boczna) oraz trzy u dorosłego (przednia, tylna i pozioma), z których każda zapewnia idealny kąt obrazowania dla odrębnej struktury płata wzrokowego.
Wprowadzenie
System wzrokowy Drosophila, składający się z oka złożonego i leżącego pod nim płata wzrokowego, był doskonałym modelem do badania rozwoju i funkcji obwodów nerwowych. W ostatnich latach w szczególności płat wzrokowy stał się potężnym systemem, w którym można badać procesy neurorozwojowe, takie jak neurogeneza i okablowanie obwodów1,2,3,4,5,6,7,8. Składa się z czterech neuropils: blaszki, rdzenia....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Przygotowanie mózgów larwalnych do obrazowania konfokalnego
- Sekcje
UWAGA: Przed rozpoczęciem sekcji należy przygotować roztwory fix (4% formaldehydu w buforze fosforanowym soli fizjologicznej (PBS)) i PBT (0,1-0,3% Trytonu w PBS). Roztwór fix należy umieścić na lodzie podczas sekcji. Chociaż w tym protokole stosuje się utrwalacz paraformaldehydu (PFA), dla określonych epitopów opisano alternatywne strategie utrwalania (przy użyciu PLP20 lub PEM21). Do sekcji larw potrzebne są dwie pary kleszczy (Dumont #5 lub #55s). Zobacz tabelę materiałów, aby uzyskać więcej informacji.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Obrazy konfokalne płatów optycznych larw i osobników dorosłych, zamontowanych w orientacjach opisanych w protokole, przedstawiono na Rysunku 1 i Rysunku 2.
Rycina 1 przedstawia schematy i reprezentatywne przekroje konfokalne mózgów larwalnych ustawionych w orientacji przedniej, tylnej i bocznej. W orientacji montażu przedniego nabłonek OPC (DE-Cadherin), neuroblasty meduły (beznamiętny>βgal) o.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W tym protokole opisujemy metodę immunobarwienia mózgów larw i dorosłych Drosophila i montowania ich w kilku orientacjach. Podczas gdy metody barwienia mózgów larw i dorosłych zostały już wcześniej opisane 22,23,24,27,28, mniej uwagi poświęcono strategiom montażu w celu optymalnej wizualizacji określonych struktur płata wzrokowego 28.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.
Podziękowania
Chcielibyśmy podziękować Claude'owi Desplanowi za udostępnienie nam porcji przeciwciała Bsh. Przeciwciała monoklonalne DE-Cadherin, Jamnik, Eyes Absent, Seven-up i Bruchpilot uzyskano z Developmental Studies Hybridoma Bank, utworzonego przez NICHD NIH i utrzymywanego na Uniwersytecie Iowa, Wydział Biologii, Iowa City, IA 52242. Prace te zostały wsparte grantem NSERC Discovery Grant przyznanym T.E. Zjednoczone Emiraty Arabskie są wspierane przez stypendium NSERC Alexander Graham Bell Canada Graduate Scholarship. P.V. jest wspierany przez stypendium dla absolwentów Ontario.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 10x PBS | Bioshop | PBS405 | |
| 37% formaldehyd | Bioshop | FOR201 | |
| Alexa Fluor 488 (koza) wtórny | Invitrogen | A-11055 | stosować w 1:500 |
| Alexa Fluor 555 (mysz) wtórny | Invitrogen | A-31570 | używać w 1:500 |
| Alexa Fluor 647 (świnka morska) wtórna | Invitrogen | A-21450 | używać w 1:500 |
| Alexa Fluor 647 (szczur) wtórny | Invitrogen | A-21247 | używać w 1:500 |
| Szkiełka nakrywkowe | VWR | 48366-067 | |
| Kleszcze preparacyjne - #5 | Dumont | 11251-10 | |
| Kleszcze preparacyjne - #55 | Dumont | 11295-51 | |
| Naczynie preparacyjne | Corning | 722085 | |
| Suche chusteczki | Kimbery Clark | 34155 | |
| Pierwszorzędowe przeciwciało anty-Bgal kozie | biogenezy | w 1:1000 | |
| Pierwszorzędowe przeciwciało anty-Bsh świnki morskiej | Prezent od Claude'a Desplana | zastosowanie w 1:500 | |
| Pierwszorzędowe przeciwciało anty-Vsx1 świnki morskiej | Erclik i in. 2008 | zastosowanie w 1:1000 | |
| Folia laboratoryjna | Parafilm | PM-996 | |
| Probówki | do mikrowirówekSarstedt | 72.706.600 | |
| Szkiełka mikroskopowe | VWR | CA4823-180 | |
| Mysie przeciwciało pierwotne anty-dac | Badania rozwojowe Hybridoma Bank (DSHB) | mabdac2-3 | zastosowanie w 1:20 |
| Mysie przeciwciało pierwszorzędowe anty-eya | DSHB | eya10H6 | użycie w 1:20 |
| Mysz przeciwciało pierwszorzędowe anty-nc82 | DSHB | nc82 | użycie w 1:50 |
| Mysz przeciwciało pierwszorzędowe anty-SVP | DSHB | Stosowanie siedmiokrotnego 2D3 | w stosunku 1:100 |
| Glina polimerowa | Można użyć | ||
| Królik anty-GFP | Invitrogen | A-11122 | stosować w stosunku 1:1000 |
| Szczurze przeciwciało pierwszorzędowe anty-DE-Kadheryna | DSHB | DCAD2 | stosować w 1:20 |
| Medium montażowe Slowfade | Invitrogen | S36967 | Można również użyć podłoża montażowego Vectashield (cat# H-1000) |
| Triton-x-100 | Bioshop | TRX506 |
Bibliografia
- Fischbach, K. -F., Dittrich, A. P. M. The optic lobe of Drosophila melanogaster. I. A Golgi analysis of wild-type structure. Cell Tissue Research. 258, (1989).
- Hofbauer, A., Campos-Ortega, J. A. Prolif....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
