Artykuł metodologiczny

Usprawnione pobieranie próbek i hodowla pelagicznych larw kosmopolitycznych (Oikopleura dioica)

DOI:

10.3791/61279

⸱

16 czerwca 2020

 ,  ,  ,  , 
1Okinawa Institute of Science and Technology Graduate University, 2Francis Crick Institute, 3UCL Genetics Institute, Department of Genetics, Evolution and Environment, University College London

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oikopleura dioica to organizm modelowy osłonic w różnych dziedzinach biologii. Opisujemy metody pobierania próbek, identyfikację gatunków, konfigurację hodowli i protokoły hodowli zwierząt i paszy dla glonów. Zwracamy uwagę na kluczowe czynniki, które przyczyniły się do wzmocnienia systemu kultury oraz omawiamy możliwe problemy i rozwiązania.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oikopleura dioica to planktoniczny strunowca o wyjątkowej zdolności filtrowania, szybkim czasie generacji, zachowanym wczesnym rozwoju i zwartym genomie. Z tych powodów jest uważany za użyteczny organizm modelowy do morskich badań ekologicznych, ewolucyjnej biologii rozwoju i genomiki. Ponieważ badania często wymagają stałego dopływu zasobów zwierzęcych, przydatne jest stworzenie niezawodnego, łatwego w utrzymaniu systemu hodowli. Tutaj opisujemy krok po kroku metodę tworzenia kultury O. dioica. Opisujemy, w jaki sposób wybrać potencjalne miejsca pobierania próbek, metody pobierania, identyfikację docelowych zwierząt oraz konfigurację systemu hodowli. Udzielamy porad dotyczących rozwiązywania problemów w oparciu o własne doświadczenia. Zwracamy również uwagę na kluczowe czynniki, które pomagają utrzymać solidny system hodowli. Chociaż przedstawiony tutaj protokół hodowli jest zoptymalizowany pod kątem O. dioica, mamy nadzieję, że nasza technika pobierania próbek i konfiguracja hodowli zainspirują nowe pomysły na utrzymanie innych delikatnych bezkręgowców pelagicznych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Organizmy modelowe odegrały kluczową rolę w rozwiązywaniu wielu problemów biologicznych, w tym związanych z rozwojem, genetyką i fizjologią. Co więcej, dodatkowe organizmy modelowe ułatwiają nowe odkrycia, a zatem mają kluczowe znaczenie dla lepszego zrozumienia natury1,2. Zooplankton morski to zróżnicowane grupy organizmów, które odgrywają ważną rolę w ekosystemach oceanicznych3,4,5,6. Pomimo swojej liczebności i znaczenia ekologicznego, galaretowate organizmy, takie jak osłonice planktonowe, są często niedostatecznie reprezentowane w badaniach nad bioróżnorodnością planktonu, ponieważ ich przezroczystość i kruchość sprawiają, że zbieranie i identyfikacja w terenie są trudne7,8. Dostosowane techniki pobierania próbek i hodowla laboratoryjna pozwalają na dokładniejszą obserwację zwierząt in vitro, co przyczyniło się do pogłębienia wiedzy w zakresie biologii osłonic planktonowych9,10,11,12.

Larwy (Wyrostki robaczkowe) to klasa swobodnie pływających osłonic morskich, obejmująca około 70 opisanych gatunków na całym świecie8,13. Ponieważ są jedną z najliczniejszych grup w zbiorowiskach zooplanktonu14,15,16,17, larwy stanowią główne źródło pożywienia dla większych organizmów planktonowych, takich jak larwy ryb18,19. W przeciwieństwie do workowatych - siedzących osłonic - larw zachowują morfologię podobną do kijanki i pozostają planktoniczne przez całe życie20. Każde zwierzę żyje w samodzielnie zbudowanej, skomplikowanej strukturze filtracyjnej, zwanej domem. Gromadzą cząstki stałe w swoich domach, tworząc prądy wodne poprzez falujący ruch swoich ogonów21. Zapchane domy są wyrzucane w ciągu dnia, niektóre z nich tworzą agregaty węglowe i ostatecznie opadają na dno morskie22; Tak więc larwy odgrywają główną rolę w globalnym przepływie węgla23. Według doniesień większość gatunków żyje w strefie pelagicznej w obrębie górnych 100 m słupa wody13; jednak wiadomo, że gigantyczna larwa Bathochordaeus zamieszkuje głębokości 300 m24. Badanie przeprowadzone na Bathochordaeus w Monterey Bay w Kalifornii ujawniło, że zwierzęta te służą również jako biologiczny wektor mikroplastików, co sugeruje potencjalne znaczenie w zrozumieniu roli wyrostka robaczkowego w pionowym transporcie i dystrybucji mikroplastików w oceanach25.

Oikopleura dioica, gatunek larw, przyciągnął uwagę w ostatnich latach jako organizm modelowy ze względu na kilka niezwykłych cech. Jest powszechnie zgłaszany we wszystkich oceanach świata. Jest szczególnie obfity w wodach przybrzeżnych26, co umożliwia łatwe pobieranie próbek z brzegu. Długotrwała, stabilna hodowla jest możliwa zarówno przy użyciu naturalnej, jak i sztucznej wody morskiej27,28,29. Czas generacji zależny od temperatury wynosi zaledwie 4-9 dni w warunkach laboratoryjnych. Ma wysoką płodność, a każda samica jest w stanie wyprodukować > 300 jaj przez cały rok. Jako osłonica zajmuje ważną pozycję filogenetyczną dla zrozumienia ewolucji strunowców30,31. Przy 70 Mb O. dioica ma najmniejszy zidentyfikowany genom spośród wszystkich strunowców32. Wśród larw O. dioica jest jak dotąd jedynym opisanym gatunkiem niehermafrodytycznym33.

Pierwsza udana hodowla O. dioica z mikroalgami hodowanymi w laboratorium została zgłoszona przez Paffenhöfer34. Oryginalny protokół hodowli wykorzystujący silniki synchroniczne i łopatki został opracowany przez Fenaux i Gorsky35, a następnie przyjęty przez wiele laboratoriów. Niedawno Fujii et al.36 zgłosili hodowlę O. dioica w sztucznej wodzie morskiej, solidny system hodowli i kolekcję terenową zostały opisane przez Bouquet et al.27, a zoptymalizowany protokół dla uproszczonego, przystępnego cenowo systemu został zgłoszony przez Marti-Solans et al.29. Oprócz tradycyjnego systemu hodowli Oikopleura, nowo zgłoszony projekt z podwójnym zbiornikiem hodowlanym ma również potencjał do hodowli Oikopleura sp.37.

Przedstawiamy szczegółowy protokół inicjacji monokultury O. dioica oparty na kombinacji protokołów opracowanych przez główne grupy badawcze Oikopleura w Międzynarodowym Centrum Morskiej Biologii Molekularnej Sars27, Uniwersytet w Barcelonie29, Osaka University28oraz nasze własne obserwacje. We wcześniej opublikowanych protokołach hodowli szczegółowe informacje dotyczące składu pożywek glonów, technik pobierania próbek z brzegu i identyfikacji Oikopleura zostały opisane tylko z grubsza, pozostawiając wiele niejasności. Tutaj, za pomocą informacji wizualnych zawartych w protokole wideo, zebraliśmy wszystkie krytyczne informacje potrzebne do stworzenia kultury O. dioica od podstaw w prosty sposób, krok po kroku. Opisujemy, jak odróżnić O. dioica od innego powszechnie opisywanego gatunku, O. longicauda, co jest jednym z najtrudniejszych kroków. Chociaż istniejące systemy hodowli mają zastosowanie do uprawy O. dioica na całym świecie, podkreślamy znaczenie dostosowania protokołu w oparciu o lokalne warunki środowiskowe. Prezentowane informacje łączą w sobie powszechnie publikowane dane, a także wiedzę zdobytą poprzez doświadczenie. Obecny protokół idealnie nadaje się dla badaczy zainteresowanych stworzeniem kultury od podstaw.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. O. placówka hodowlana dioica

  1. System filtracji wody (Rysunek 1)
    1. Zbieraj naturalną wodę morską z portu na głębokości 2-3 m. Przepuść wodę morską przez filtr piaskowy (wielkość porów 1,4 mm) i przetransportuj do wspólnego zbiornika w laboratorium. Użyj filtra kanistrowego do cyrkulacji wody w celu utrzymania jakości wody we wspólnym zbiorniku.
    2. W pomieszczeniu hodowlanym zainstaluj wieloetapowy system filtrów składający się ze zbiornika o pojemności 100 l z pompą z napędem magnetycznym, filtrów z wkładem polipropylenowym 5 μm i 1 μm oraz sterylizatora UV (100 V) (Rysunek 1).
    3. Przenieś wodę morską ze wspólnego zbiornika do zbiornika zbiornika w pomieszczeniu hodowlanym. Przepuść wodę morską przez jednostkę filtrującą 25 μm (Rysunek 1A,B) przed wejściem do zbiornika zbiornika w pomieszczeniu hodowlanym. Cyrkuluj wodę morską przez filtry 5 i 1 μm przez noc, aby dokładnie usunąć cząsteczki, które mogłyby potencjalnie utrudnić rozwój zwierząt.
      UWAGA: Dodatkowy filtr o większym rozmiarze oczek (25-50 μm) jest przydatny, aby zapobiec zatykaniu się większych cząstek filtrów nabojowych o mniejszych rozmiarach oczek. Przefiltrowana woda morska (fSW) jest gotowa do użycia następnego dnia rano.
  2. Jednostka hodowli Oikopleura (Rysunek 2)
    1. Trzymaj zwierzęta w okrągłych, przezroczystych plastikowych zlewkach o pojemności 5 lub 10 litrów.
    2. Umieść zlewki hodowlane na stabilnym, dwupoziomowym regale ze stali nierdzewnej (dł. x szer. x wys. = 150 cm x 45 cm x 90 cm) z przezroczystą akrylową płytą o grubości 5 mm.
    3. Umieść białe lampy fluorescencyjne pod akrylową powierzchnią, aby oświetlić zwierzęta od dna zlewek.
    4. Umieść plastikowy arkusz za zlewkami. płachta tworzy kontrast i poprawia wizualizację przezroczystych zwierząt.
    5. Podłączyć synchroniczne silniki elektryczne do akrylowych łopatek (dł. x wys. = 8 cm x 27 cm) (plik uzupełniający 2). Zawieś łopatki w zlewkach hodowlanych na równoległych szynach biegnących wzdłuż regału ( Rysunek 2A).
    6. Włącz silniki, aby wytworzyć delikatny ruch okrężny w zlewkach przy 15 obr./min.
      UWAGA: Zwierzęta w swoich domach z celulozy mają neutralną pływalność; Jednak cyrkulacja wody pomaga utrzymać jaja, larwy i pokarm glonów w zawieszeniu i równomiernym rozprowadzeniu w zlewkach hodowlanych.
  3. Automatyczna pompa dozująca (opcjonalnie)
    UWAGA: Automatyczny agregat żywieniowy zmniejsza zapotrzebowanie na personel, szczególnie w weekendy.
    1. Skalibruj objętość dozowanej cieczy z automatycznej pompy dozującej zgodnie z instrukcjami producenta.
    2. Użyj probówek o pojemności 50 ml jako zbiorników na glony.
    3. Wywierć dwa otwory 5 mm w nakrętkach probówek o pojemności 50 ml, aby przejść przez rurki powietrzne. Podłącz jedną rurkę do standardowej pompy powietrza w akwarium, aby wprowadzić pęcherzyki powietrza, a drugą rurkę do portu wlotowego pompy dozującej (Rysunek 2B).
      UWAGA: Wprowadzenie cienkiego strumienia pęcherzyków powietrza pomaga zapobiegać osadzaniu się glonów na dnie rurek.
    4. Zaprogramuj czas i objętość paszy dla glonów, która ma być dozowana w danym dniu.
  4. Stacja glonów
    1. Za pomocą regału (dł. x szer. x wys. = 90 cm x 46 cm x 115 cm) umieścić cztery kolby okrągłodenne o pojemności 1 l zawierające robocze kultury glonów (patrz krok 2.1).
    2. Podświetl wstecznie kultury robocze, umieszczając lampy fluorescencyjne za kolbami.
    3. Kolby uszczelnić gumowymi korkami z dwoma otworami.
    4. Przełóż jednorazową pipetę o pojemności 1 ml przez gumowy korek. Użyj rurki powietrznej, aby podłączyć pipetę do pompy powietrza w akwarium. Wprowadzić strumień pęcherzyków powietrza do kolby.

2. Pokarm z mikroalg

  1. Inicjowanie kultur glonów
    UWAGA: Utrzymuj trzy zestawy kultur (hodowle podstawowe, sub- i robocze) dla trzech gatunków mikroglonów, Chaetoceros calcitrans, Isochrysis sp., Rhinomonas reticulata i jednego gatunku sinic, Synechococcus sp. Stado i subkultury są używane jako kopie zapasowe. Kultura robocza służy do codziennego karmienia.
    1. Przygotować odczynniki niezbędne do hodowli mikroglonów i sinic (Tabela 1).
    2. Aby rozpocząć hodowlę podstawową, należy wlać w autoklawie (121 °C, 25 min) 60 – 80 ml fSW w kolbie Erlenmeyera o pojemności 100 ml. Aseptycznie zaszczepić określoną ilość zmodyfikowanego Conway medium27 i mikroalg (Tabela 2). Na przykład, aby zaszczepić kulturę podstawową C. calcitrans, należy wlać w autoklawie 60 ml wody morskiej, aseptycznie zaszczepić po 30 μl witaminy i roztworu A, 15 μl krzemianu sodu, 60 μl streptomycyny i 30 μl C. kalcitran z poprzedniej kultury podstawowej.
      UWAGA: R. reticulata zmienia kolor z czerwonawo-różowego na pomarańczowo-brązowy pod wpływem zbyt dużej ilości światła. Odsuń je od światła, gdy zaczną zmieniać kolor z przezroczystego na jasnoróżowy.
    3. Hodowlę osadu należy utrzymywać w inkubatorze o temperaturze 17 °C przy ciągłym naświetleniu. Po około 10 dniach kultura zmienia kolor, wskazując na wzrost glonów (Rysunek 3). Gdy pojawią się kolory, przenieś je do 4 °C w celu długotrwałego przechowywania do 1 miesiąca.
    4. Na czystej ławie należy aseptycznie zaszczepić subkulturę z kultury podstawowej (Tabela 2). Inkubować w temperaturze 17 °C przy ciągłym naświetleniu. Po pojawieniu się kolorów glonów kontynuuj przechowywanie ich w inkubatorze do 2 tygodni.
    5. Zaszczepić kulturę roboczą z subkultury (Tabela 2). Uszczelnić kolbę gumową nasadką i włożyć jednorazową pipetę o pojemności 1 ml. Przenieść kolbę do stacji glonów i utrzymywać w temperaturze pokojowej z 8-godzinnym fotoperiodem. Zasilanie ze stałym napowietrzaniem. Odnawiaj kulturę pracy co 4 dni.
    6. Mieszaj bulion i subkultury dwa razy dziennie, mieszając.
      UWAGA: Długotrwałe przechowywanie kultur glonów na pożywkach stałych i kriokonserwacja są możliwe odpowiednio do 3 miesięcy i 1 roku29.
  2. Tworzenie krzywych wzrostu glonów (opcjonalnie)
    UWAGA: Dokładna ocena ilości paszy jest ważna dla utrzymania stabilnej kultury O. dioica. Stworzyliśmy krzywe wzrostu dla dwóch podstawowych gatunków glonów, Chaetoceros calcitrans i Isochrysis sp.
    1. Przygotować kultury robocze C. calcitrans i Isochrysis sp. (tabela 2).
    2. Dla każdego gatunku kultury roboczej pobrać próbkę trzy razy oddzielnie i zmierzyć absorbancję przy długości fali 660 nm za pomocą spektrofotometru. Proszę wykonać średnie pomiary trzech egzemplarzy z każdej kultury roboczej.
    3. Postępując zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi automatycznego licznika komórek, przygotuj próbki glonów do liczenia. Policz każdą próbkę trzy razy. Weź średnią z trzech zliczeń, aby określić całkowitą liczbę komórek obecnych w każdej próbce.
    4. Kontynuuj liczenie codziennie, aż zostanie zarejestrowanych około 50 średnich pomiarów.
    5. Utwórz krzywe wzrostu dla obu gatunków glonów (Rysunek 4).

3. Terenowa kolekcja dzikich Oikopleura spp.

  1. Zmodyfikowana siatka planktonowa (Rysunek 5)
    UWAGA: Kluczem do udanego pobierania próbek Oikopleura spp. jest powolne holowanie sieci planktonowej z obciążonym, niefiltrującym workiem włoka. Rysunek 5 przedstawia schemat zmodyfikowanej sieci planktonowej.
    1. Zastąp worek włoka w ręcznej sieci planktonowej zmodyfikowaną zakręcaną butelką do mycia o pojemności 500 ml.
    2. Wywierć otwór o średnicy 3 cm w zakrętce butelki do mycia o średnicy 4 cm, aby woda i zwierzęta mogły dostać się do worka włoka.
    3. Załóż nakrętkę butelki na końcu siatki planktonowej. Owiń go szczelnie taśmą elektryczną. Zabezpiecz nasadkę dodatkowo za pomocą węża ze stali nierdzewnej clamp.
    4. Przymocuj ciężarek o wadze 70 g na zewnątrz zmodyfikowanego worka włoka za pomocą opasek zaciskowych.
    5. Przymocuj smycz bezpieczeństwa, aby dodatkowo zabezpieczyć worek włoka.
  2. Wybór miejsc zbiórki (Rysunek 6)
    UWAGA: Wszystkie pobrane próbki zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Bezpieczeństwa Pracy w Terenie OIST. Mogą występować sezonowe wahania w obecności Oikopleura spp. w zależności od lokalizacji (Ryc. 6). Należy unikać pobierania próbek bezpośrednio po ekstremalnych zdarzeniach pogodowych, takich jak silne ulewy.
    1. Skorzystaj z widoku satelitarnego na stronie internetowej z mapą, aby zidentyfikować potencjalne miejsca pobierania próbek. Skupiliśmy się na portach i pomostach rybackich, do których można łatwo dojechać samochodem i które znajdują się w zatokach lub w pobliżu zrzutów oceanicznych, gdzie plankton ma tendencję do gromadzenia się: port Ishikawa w Kin Bay, Okinawa, Japonia (GPS: 26°25'39.3"N 127°49'56.6"E).
    2. Odwiedź potencjalne miejsca pobierania próbek, aby ocenić dostępność brzegu i bezpieczeństwo każdego miejsca. W razie potrzeby uzyskaj pozwolenie na odbiór od władz lokalnych.
  3. Procedura pobierania próbek
    1. Zarzuć sieć planktonową do morza i pozwól, aby worek włoka opadł 1-2 m poniżej powierzchni wody.
    2. Przeciągnij siatkę poziomo ręcznie na 50-100 cm s-1. Kontynuuj holowanie, chodząc tam iz powrotem przez 2-5 minut. Dostosuj czas holowania do obfitości fitoplanktonu w porcie, z krótszym holowaniem, gdy fitoplanktonu jest więcej.
      UWAGA: Larwy są delikatnymi zwierzętami. Szybkie holowanie lub wielokrotne zarzucanie sieci może spowodować uszkodzenie zwierząt uwięzionych w worku włoka.
    3. Delikatnie podnieś siatkę. Powoli przenieść zawartość worka włoka do okrągłej szklanej butelki o pojemności 500 ml. Całkowicie napełnij butelkę na próbkę wodą morską, aby uniknąć pęcherzyków powietrza.
      UWAGA: Obecność Oikopleura spp. można potwierdzić, oglądając butelki z próbkami na czarnym tle. Większość zwierząt porzuca swoje domy podczas zbierania. Dlatego do identyfikacji na poziomie gatunku potrzebna jest obserwacja mikroskopowa.
    4. Powtarzać pobieranie próbek do momentu zebrania trzech butelek o pojemności 500 ml.
    5. Zmierz zasolenie, temperaturę i chlorofil a za pomocą profilera CTD, aby zarejestrować zakres parametrów fizycznych, w których zwierzęta występują naturalnie.
    6. Zbierz 10-15 l powierzchniowej wody morskiej do wiadra, aby zaaklimatyzować zwierzęta w warunkach laboratoryjnych.

4. Izolacja i identyfikacja zwierząt (Rysunek 7, Rysunek 8)

  1. Oikopleura spp. identyfikacja
    UWAGA: Inne organizmy planktoniczne, które na pierwszy rzut oka mogą przypominać Oikopleura spp., to chaetognaths, Fritillaria spp., nicienie, larwy ryb z woreczkami żółtkowymi i larwy Ciona spp.
    1. Aby zaaklimatyzować zwierzęta do warunków laboratoryjnych, przenieś każdą próbkę o pojemności 500 ml do 10-litrowej zlewki zawierającej 1:1 powierzchniowej wody morskiej z miejsca pobierania próbek i przefiltrowanej wody morskiej (fSW) utrzymywanej w laboratorium (Rysunek 7A,B). Dostosować objętość zlewki do 5-10 l w zależności od stężenia próbki planktonu.
      UWAGA: Jeśli próbka planktonu zawiera niepożądane zanieczyszczenia, przepuść przez filtr zgrubny (rozmiar oczek ~600 μm) przed przeniesieniem do zlewki o pojemności 10 l.
    2. Użyj łopatki przymocowanej do synchronicznego silnika elektrycznego (15 obr./min) i utrzymuj plankton w zawieszeniu przez noc (krok 1.2.5).
    3. Zidentyfikuj Oikopleura spp., szukając zwierząt o długości 1-2 mm w kształcie kijanek, falujących ogonami w kulistym, półprzezroczystym domu. Niektóre zwierzęta mogą tymczasowo swobodnie pływać bez domów. Delikatnie przenieś ~5 zwierząt na pustą szalkę Petriego za pomocą pipety z końcem.
    4. W celu identyfikacji rodzaju eksmituj zwierzęta z ich domów, delikatnie szturchając dom pipetą transferową.
    5. Obserwuj bezdomne zwierzęta pod mikroskopem ciemnego pola 20-40x i potwierdź Oikopleura spp (Ryc. 8).
  2. O. dioica identyfikacja
    UWAGA: O. dioica można wizualnie zidentyfikować po obecności w pełni dojrzałych samców i samic lub dwóch dużych komórek podstrunowych znajdujących się na dystalnej połowie ich ogonów. Odległość między dwiema komórkami podstrunowcami może się różnić u poszczególnych osób.
    1. Następnie sprawdź, czy istnieje w pełni dojrzała Oikopleura z gonadą wypełnioną jajami (Ryc. 8A) lub plemnikami (Ryc. 8B). Jeśli zwierzę posiada tylko jaja lub plemniki, należy przejść do kroku 4.2.3, ponieważ jest to O. dioica, jedyny opisany gatunek niehermafrodytyczny.
    2. Jeśli zwierzę jest niedojrzałe (Rysunek 8C), poszukaj dwóch komórek podstrunowych na końcu ogona (Ryc. 8D).
    3. Gdy gatunek zostanie potwierdzony, przenieś go na nową szalkę Petriego. Czynności 4.1.3–4.2.2 należy powtarzać aż do momentu, gdy na poziomie gatunku zostanie potwierdzonych 10–20 osobników.
      UWAGA: Dla łatwiejszej identyfikacji, znieczulij zwierzęta na szalce Petriego zawierającej 0,015% metanosulfonianu trikainy (MS222) w fSW.
    4. Jeśli nie zostaną znalezione żadne O. dioica, trzymaj zlewki w zawieszeniu przez dodatkowy dzień lub dwa. Może istnieć niedojrzały O. dioica, który będzie nadal rósł i stanie się łatwiejszy do wykrycia. Jeśli po tygodniu nie pojawi się żaden próbka, należy wyrzucić próbkę i spróbować ponownie pobrać próbę.

5. Protokół uprawy O. dioica

  1. Inicjowanie monokultury O. dioica na podstawie próbki zebranej w terenie (Rysunek 7)
    UWAGA: Pokarm dla glonów jest przygotowywany codziennie z kultur roboczych, a każda zlewka monokulturowa jest karmiona trzy razy dziennie odpowiednio o 9 rano, 12 i 17 (patrz krok 5.2). Zwierzęta są utrzymywane w temperaturze 23 °C. W tych warunkach cykl życiowy Okinawa O. dioica wynosi 4 dni (Rysunek 7C).
    1. Aby zainicjować monokulturę O. dioica, wyizoluj 120 zwierząt i przenieś do nowej zlewki zawierającej 5 litrów świeżego fSW (Rysunek 7B,C).
    2. Następnego ranka szukaj w pełni dojrzałych samców z żółtymi gonadami i samic z jajami, które wyglądają jak złote kule (Ryc. 8A,B).
    3. Przygotować zlewkę tarłową, delikatnie przenosząc 15 samców i 30 samic do nowej zlewki zawierającej 2,5 l świeżego fSW za pomocą pipety o końcu 5 ml.
      UWAGA: Jeśli nie ma wystarczającej liczby samców i samic, przenieś jak najwięcej dorosłych osobników do zlewki zawierającej 1 l fSW i pozwól im złożyć ikrę w sposób naturalny. Aby zminimalizować stres fizyczny zwierząt podczas ręcznego przenoszenia, należy je powoli zasysać i uwalniać pod powierzchnią wody.
    4. Pozwól zwierzętom rozmnażać się naturalnie, aby zainicjować następne pokolenie. Larwy ogoniaste powinny pojawić się około 3 godziny po zapłodnieniu.
      UWAGA: Tarło odbywa się przez w pełni dojrzałe zwierzęta opuszczające swoje domy, pływające w kierunku wód powierzchniowych i uwalniające gamety. Udane zapłodnienie można potwierdzić, pobierając 5-10 ml wody morskiej z dna zlewki tarłowej i identyfikując jaja z rozszczepieniami pod mikroskopem.
    5. Pierwszego ranka po tarle (Dzień 1) w zlewce powinno pojawić się nowe pokolenie zwierząt z nadmuchanymi domkami. Za pomocą zlewki ręcznej o pojemności 500 ml delikatnie przenieść zawartość zlewki tarłowej do nowej zlewki zawierającej 7,5 l świeżego fSW (co daje w sumie 10 l). Wlewaj pod kątem, aby uniknąć rozpryskiwania.
    6. Drugiego ranka (dzień 2) należy ręcznie przenieść 150 zwierząt do nowej zlewki zawierającej 5 l świeżego fSW.
    7. Trzeciego ranka (dzień 3) ręcznie przenieś 120 zwierząt do nowej zlewki z 5 litrami świeżego fSW.
      UWAGA: Aby zsynchronizować rozwój zwierząt, ważne jest, aby wybrać osobniki o podobnych rozmiarach podczas ręcznego transferu w 2 i 3 dniu. Podczas jednego transferu można wyssać maksymalnie 10 zwierząt.
    8. Czwartego ranka (dzień 4) powinny pojawić się w pełni dojrzałe zwierzęta. Powtórz krok 5.1.3, aby zamknąć cykl życia.
      UWAGA: Automatyczną pompę paszową można ustawić tak, aby karmiła zwierzęta o godzinie 17:00 w weekendy bez obecności personelu zajmującego się hodowlą.
  2. Codzienne przygotowywanie pokarmu z glonów z kultury roboczej
    1. Zmierzyć absorbancję kultury roboczej przy 660 nm.
    2. Na podstawie Dziennej Tabeli Żywienia dowiedz się, ile komórek glonów należy nakarmić dla zwierząt o określonej wielkości (Tabela 3).
    3. Korzystając z krzywych wzrostu glonów (Rysunek 4), rozwiąż poniższe równania, aby obliczyć objętość pokarmu dla glonów (ml) wymaganą w danym dniu.
      1. Aby obliczyć objętość danej algi potrzebną na określony dzień i czas karmienia, użyj następującego równania:
        Wzór na równanie liniowe; Y_A = c + mx; wyrażenie algebraiczne; pojęcie matematyczne.
        Równanie ilustrujące pojęcie A=Vs(K/YA), stosowane w optymalizacji procesów lub analizie systemów.
        Wzór na stężenie glonów Y<sub>A</sub> = stężenie glonów [komórki/ml]; równania w badaniach naukowych.
        Równanie absorpcji glonów, x=absorpcja. glonów [nm], diagram do analizy danych spektroskopowych.
        Równanie równowagi statycznej, A = objętość potrzebnych gatunków glonów (ml), diagram edukacyjny.
        Wzór na objętość wody morskiej \( V_s \) w zlewce, naukowy diagram pomiarowy, analiza morska.
        Wzór na stężenie glonów K=stężenie glonów na karmienie [komórki/ml], równanie do badania ekologicznego.
        Gdzie YA to stężenie glonów w danym dniu, a A to objętość glonów potrzebna na karmienie. Ponadto liniowa zależność między Y A a x, wartości punktu przecięcia (c) i nachylenia (m) są pokazane w Rysunek 4. Patrz Tabela 3, aby zapoznać się z wartościami K.
      2. Na przykład, aby obliczyć objętość Isochrysis sp. potrzebną do karmienia o godzinie 9 rano zwierząt dnia 3 utrzymywanych w kulturze o pojemności 5 litrów i przy absorbancji glonów wynoszącej 0,234 (mierzonej przy 660 nm), obliczono, co następuje:
        Obliczanie równania: Y<sub>iso</sub> = 233526 + (1,9e+07) × 0,234 = 4679526
        Wzór na obliczanie objętości Isochrysis; równanie stężenia komórek; badania mikroskopowe.
        UWAGA: Przechowuj te równania w arkuszu kalkulacyjnym, aby dzienna ilość karmienia była automatycznie obliczana na podstawie pomiarów absorbancji, wielkości zwierząt i objętości wody morskiej do hodowli (plik uzupełniający 1).
    4. Przenieść obliczoną objętość glonów do probówek o pojemności 50 ml, odwirować przy 5000 x g przez 5 minut w temperaturze 20 °C.
    5. Usunąć supernatant. Napełnij probówki z powrotem do pierwotnej objętości świeżym fSW, zastępując stare podłoża z glonów.
    6. Przygotowane jedzenie przechowuj w lodówce, aż będzie gotowe do użycia przy następnym karmieniu. Wyrzuć stary pokarm dla glonów po przygotowaniu nowego pokarmu następnego ranka.
  3. Węgiel aktywny (opcjonalnie)
    UWAGA: Do każdej zlewki hodowlanej dodaje się 10 g węgla aktywnego, aby utrzymać jakość wody. Węgiel drzewny może być ponownie użyty do czterech razy. Powoli otwieraj worek na węgiel drzewny, aby zapobiec przedostawaniu się pyłu węglowego do zlewek hodowlanych.
    1. Przenieś ~700 g węgla aktywnego do pojemnika. Moczyć w słodkiej wodzie (FW) przez 48 godzin i pozwolić im osiąść na dnie.
    2. Spłucz FW, aby usunąć resztki pyłu węglowego.
    3. Gotuj węgiel drzewny w FW przez 15-20 minut. Zdejmij z ognia i pozostaw do ostygnięcia.
    4. Płucz, aż większość pyłu węglowego zostanie usunięta, a woda stanie się czysta.
    5. Czysty węgiel drzewny należy przechowywać w 2-litrowej zlewce zawierającej fSW. Przykryj zlewkę, aby zapobiec przedostawaniu się kurzu.
    6. Dodaj węgiel drzewny do każdej nowej zlewki przed przeniesieniem zwierząt.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oikopleura może być zbierana z łodzi lub z portu poprzez powolne, delikatne holowanie siatki planktonowej o oczkach 100 μm z niefiltrującym workiem włoka (Rysunek 5). Ze względu na delikatną naturę zwierząt ważne jest, aby unikać wszelkich ruchów, które mogłyby powodować stres fizyczny, takich jak nieostrożne obchodzenie się z siatką lub rozpryskiwanie z powodu uwięzionej kieszeni powietrznej w słoiku na próbkę.

Ważne jest, aby zrozumieć sezonowy wzorzec lokalnych populacji Oikopleura, jak również towarzyszące mu fluktuacje w fizycznych cechach wody w miejscu pobierania próbek. Pobieranie próbek w latach 2015-2019 wykazało stałą sezonową zmienność obecności O. dioica w portach Ishikawa i Kin na Okinawie (Rysunek 6). Temperatura powierzchniowej wody morskiej wydaje się być głównym czynnikiem. O. dioica był gatunkiem dominującym, gdy powierzchniowa woda morska osiągała ≥28 °C, a O. longicauda współistniała z O. dioica w temperaturach od 24 °C do 27 °C; jednak O. longicauda dominowała poniżej 23 °C (Ryc. 6A). Stopniowa zmiana zasolenia po kilku kolejnych dniach intensywnych opadów nie korelowała z liczebnością O. dioica (Ryc. 6B).

Korzystając z procedur pobierania próbek opisanych powyżej, większość odzyskanych przez nas O. dioica była między 2 a 3 dniem ich 4-dniowego cyklu życia (Rysunek 7C). Dojrzałe samce były rozpoznawane po żółtym zabarwieniu gonad, podczas gdy samice gonady mieniły się złotem od jaj o średnicy 70-80 μm (Ryc. 8A,B). Niedojrzałe O. dioica zostały potwierdzone przez dwie komórki podstrunowe na ogonach (Ryc. 8D). Inny gatunek dominujący w tutejszych wodach, O. longicauda, miał podobną wielkość i morfologię. Użyliśmy następujących kryteriów, aby odróżnić O. longicauda od O. dioica38,39,40: brak komórek podstrunowych w ogonie, obecność velum w tułowiu i obecność gonady hermafrodyty (Ryc. 8E,F). Różne morfologie ogonów są również przydatne do odróżnienia O. longicauda od O. dioica. Kiedy nienaruszone nagie zwierzę bez domu było zorientowane bocznie, ogon O. longicauda był bardziej prosty i miał mniejszą krzywiznę, co nadawało mu "sztywniejszy" wygląd w porównaniu z ogonem O. dioica.

Trzy najważniejsze czynniki dla ustanowienia stabilnego systemu hodowli Oikopleura to (i) utrzymanie wysokiej jakości wody, (ii) określenie optymalnego reżimu żywienia oraz (iii) ustawienie zlewki tarłowej z wystarczającą liczbą samców i samic. Wprowadzenie wieloetapowego systemu filtracji (Rysunek 1) poprawiło jakość wody i stabilność hodowli. W przypadku sztucznej wody morskiej nie jest konieczny system filtracji; Jednak koszt, dostępność i wygoda naturalnej wody morskiej sprawiają, że jest to lepsza opcja dla laboratoriów położonych w pobliżu wybrzeża. Aby ustalić reżim żywienia, zalecamy pomiar krzywych wzrostu glonów, które mają zastosowanie do indywidualnych warunków laboratoryjnych, ponieważ temperatura i warunki świetlne znacznie się różnią. Połączyliśmy krzywe wzrostu z wcześniej opublikowanymi harmonogramami karmienia, aby zoptymalizować stężenia i skład paszy dla glonów27 (Rysunek 4). Przestrzegamy również ścisłego harmonogramu inokulacji glonów, aby utrzymać świeżą dostawę pokarmu dla glonów (Tabela 2). Zautomatyzowany system żywienia pozwala nam utrzymać spójny dzienny harmonogram żywienia bez obecności personelu zajmującego się hodowlą (Rysunek 2B).

Po osiągnięciu optymalnych warunków do picia wody morskiej i karmienia, ważne jest, aby zainicjować nowe pokolenia poprzez stworzenie zlewki tarłowej z 15 samcami i 30 samicami w 2,5 l fSW. Zapewnia to dobrą koncentrację zwierząt dnia 1 następnego ranka, która jest wystarczająca do odizolowania 150 zwierząt w dniu 2, 120 w dniu 3 i 45 dojrzałych osobników dorosłych w dniu 4 do tarła. Jeśli w dniu 4 nie ma wystarczającej liczby samców i samic, zbierz i przenieś jak najwięcej dojrzałych osobników do 1 litra fSW i pozwól im złożyć ikrę w sposób naturalny w nadziei, że będzie wystarczająco dużo larw do przeniesienia na następne pokolenie. Zgodnie z dostarczonym protokołem, cykl życia O. dioica wynosi 4 dni w temperaturze 23 °C (Rysunek 7C). Niezawodnie ustaliliśmy sześć niezależnych dzikich populacji O. dioica, z których wszystkie przetrwały ponad 20 pokoleń.

System filtracji wody; diagram; Zbiornik 100L, filtr 25μm, rurka akrylowa; Konfiguracja sterylizatora UV.
Rysunek 1: Schemat systemu filtracji wody morskiej.
(A i B) Woda morska jest wstępnie filtrowana przez jednostkę filtrującą 25 μm przed wejściem do zbiornika (C) Pompa z napędem magnetycznym służy do pobierania wody morskiej ze zbiornika. Woda morska jest następnie przepychana przez dwa filtry polipropylenowe i sterylizator UV przed powrotem do zbiornika zbiornika. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Schemat zautomatyzowanego systemu dozowania; Zestaw do dostarczania pokarmu dla glonów z silnikiem, rurkami i pipetą.
Ryc. 2: System hodowli O. dioica.
(A) Przegląd systemu hodowli (B) Zbliżenie silnika synchronicznego i zbiornika glonów dla automatycznej pompy dozującej. Średnice wewnętrzne rurki silikonowej A i B wynoszą odpowiednio 2 mm i 4 mm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Kolby z kolorowymi roztworami do eksperymentu chemicznego, oznaczone jako chemo, iso, syn, rhino.
Rycina 3: Kultury podstawowe O. dioica.
Od lewej - C. calcitrans, Isochrysis sp., Synechococcus sp. i R. reticulata po uprawie w temperaturze 17 °C w ciągłym świetle przez ~ 10 dni. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Wykres stężenia komórek w funkcji OD; żywotne komórki, równania liniowe, wartości R², porównanie gatunków.
Rysunek 4: Krzywa wzrostu glonów dla dwóch głównych gatunków pokarmowych, C. calcitrans i Isochrysis sp.
Wykresy punktowe gęstości optycznej (OD) przy 660 nm i całkowitych stężeniach komórek dla (A) C. calcitrans i (B) Isochrysis sp. Każdy punkt reprezentuje średnią z trzech pomiarów. Do określenia procentu żywotnych komórek i całkowitych stężeń komórek (komórek/ml) użyto licznika komórek. Pomiary prowadzono przez 20 dni (n = 47). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Schemat siatki planktonowej z siatką 100 μm, pierścieniem siatkowym 30 cm, długością 75 cm do pobierania próbek morskich.
Rycina 5: Zmodyfikowana siatka planktonowa do pobierania próbek z Oikopleura.
Część włoka trzymanej w ręku sieci planktonowej (oczka 100 μm) zastępuje się butelką do płukania o pojemności 500 ml. Do worka włoka przymocowany jest ciężarek o wadze 70 g. Do breloczka przymocowane jest około 5 m liny. Do worka dołączona jest smycz bezpieczeństwa, która dodatkowo zabezpiecza worek włoka. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Miesięczne wykresy zmian temperatury i zasolenia; Wskazano obecność i brak gatunków.
Rysunek 6: Sezonowość O. dioica na Okinawie.
Występowanie i nieobecność O. dioica i O. longicauda w odniesieniu do sezonowych zmian (A) temperatury i (B) zasolenia w portach w Ishikawa (26°25'39.3"N 127°49'56.6"E) i Kin (26°26'40.2"N 127°55'00.3"E) w latach 2015-2019. Każdy gatunek był rejestrowany jako obecny, jeśli ręcznie policzono więcej niż 50 zwierząt. Wykonano pomiary temperatury i zasolenia wód powierzchniowych. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Diagram pobierania próbek, izolacji i hodowli z danymi dotyczącymi cyklu życia Oikopleura w badaniach wodnych.
Rysunek 7: Schemat blokowy inicjacji monokultury O. dioica.
(A) Trzy próbki planktonu o objętości 500 ml pobiera się z miejsca pobierania próbek (B) Każdy słoik z próbką rozcieńcza się, a O. dioica izoluje się od reszty planktonu (C) Monokulturę O. dioica inicjuje się poprzez ręczne przeniesienie 120 zwierząt dnia 3 do nowej zlewki zawierającej 5 litrów świeżej przefiltrowanej wody morskiej (fSW). Ustaw zlewkę tarłową zawierającą 30 samic, 15 samców i 2,5 l świeżego fSW. Pierwszego ranka po tarle (Dzień 1) ostrożnie opróżnij zlewkę tarłową z nowym pokoleniem zwierząt do zlewki zawierającej 7,5 l świeżego fSW. Drugiego dnia po tarle (dzień 2) przenieść 150 zwierząt do zlewki zawierającej 5 l świeżego fSW. Trzeciego dnia po tarle (dzień 3) przenieść 120 zwierząt do zlewki zawierającej 5 l świeżego fSW. Ostatniego dnia (dzień 4) należy założyć nową zlewkę tarłową zawierającą 30 samic, 15 samców i 2,5 l świeżego fSW w ramach przygotowań do następnego pokolenia. Zwierzęta mają 4-dniowy cykl życia w temperaturze 23 °C. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rozwój larw ryb, obrazy mikroskopowe, zmiany morfologiczne, znakowane struktury ciała.
Rycina 8: Identyfikacja Oikopleura spp. (A-D: O. dioica, E i F: O. longicauda).
(A) Samica O. dioica z jajami (B) Samiec O. dioica z plemnikami (C) Widok boczny niedojrzałego O. dioica (D) Widok brzuszny niedojrzałego O. dioica z dwiema komórkami podstrunowymi oznaczonymi białymi strzałkami (E) Widok brzuszny dojrzałego O. longicauda niosącego jaja (strzałka 1) i plemniki (strzałka 2) (F) Widok boczny O. longicauda pokazujący velum (strzałka 3). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

szt. Rozdział
OdczynnikiProdukty chemicznekwotaObjętość końcowa (ml)sterylizacjaMagazyn / Otwarte
Rozwiązanie ANa2EDTA45 gramów1000Autoklaw-20 °C / 4 °C
NaNO3Opakowanie 100 gramów
H3BO333,6 gr
NaH2PO420 gramów
MnCl2·4H2O0,36 grama
FeCl3·6H2O1,3 gr
Rozwiązanie B1,0 ml
Rozwiązanie BZnCl22,1 grama1000Autoklaw4 °C / 4 °C
CoCl2·6H2O2,0 gr
(NH4)6Mo7O24·4H2O0,9 gr
CuSO4·5H2O2,0 gr
*Hcl--Ml
WitaminaTiamina (B1) ·HCl200 mg tabletki powlekania1000Autoklaw-20 °C / 4 °C
biotyna1 mg tabletki powlekania
Kobalamina (B12)1 mg tabletki powlekania
Krzemian soduNa2SiO35 proc.1000Filtr 0,22 μm4 °C / 4 °C
StreptomycynyC21H39N7O1225 mg/ml50Filtr 0,22 μm-20 °C / -20 °C

Tabela 1: Przepis na odczynniki niezbędne do utrzymania pokarmu dla glonów. Po rozpuszczeniu wszystkich substancji chemicznych wymienionych dla roztworu B, dodaje się HCl, aż roztwór stanie się klarowny bez zmętnienia. Wszystkie odczynniki są sterylizowane w autoklawie (120 °C, 25 min) lub przy użyciu filtra o długości 0,22 m. Wszystkie odczynniki, z wyjątkiem zapasów witamin, są sterylizowane po dodaniu określonej substancji chemicznej. W przypadku zapasów witamin najpierw przelej wodę w autoklawie, a następnie rozpuść wymienioną substancję chemiczną. Podane są temperatury przechowywania odczynników wyjściowych i otwartych.

Rozdział Rozdział Rozdział szt. szt. szt. szt. szt. szt. szt. szt.
Typ kulturyGlony spp.ASW (ml)witaminaRozwiązanie AKrzemian soduStreptomycynyGlony (ml) / Rodzaj kulturyInkubacja / Przechowywanieczęstotliwość
Kultura giełdowaChaeto601/20001/20001/4000
(Tylko Chaeto)		1/1000
(Wszyscy z wyjątkiem Syna)		0,03 / kolba17°C / 4°CDwutygodniowy
ISO600,03 / kolba
nosorożecRozdział 800,06 / kolba
Syn600,03 / kolba
SubkulturaChaeto5001/20001/20001/4000
(Tylko Chaeto)		1/1000
(Wszyscy z wyjątkiem Syna)		10 / magazyn17°C / 17°Ctygodniowo
ISO50010 / magazyn
nosorożec50020 / magazyn
Syn50010 / magazyn
Kultura pracyChaeto4001/20001/20001/4000
(Tylko Chaeto)		1/1000
(Wszyscy z wyjątkiem Syna)		100 / subRM / RMCo 4 dni
ISO400100 / sub
nosorożec400150 / sub
Syn400100 / sub

Tabela 2: Instrukcja dotycząca utrzymania trzech typów hodowli glonów. Dodać określoną ilość suplementów do kolb zawierających autoklawowaną wodę morską. Zaszczepić każdą kolbę określoną ilością kultury glonów. Inkubuj i przechowuj kultury glonów w określonych temperaturach. Zaszczepić nową kulturę i subkulturę z poprzedniej kultury podstawowej oraz nową kulturę pracy z poprzedniej subkultury. Zaszczepiaj nową kulturę podstawową, subkulturę i kulturę pracy odpowiednio co dwa tygodnie, tydzień i cztery dni. Harmonogram ten zapewnia wystarczającą ilość pokarmu dla około 10 zlewek kultury O. dioica. Utrzymuj 2-3 zestawy każdego typu hodowli glonów jako kopie zapasowe. RM – temperatura pokojowa.

szt. szt. osób szt. szt. szt. szt. szt. szt. szt. szt. szt. szt. szt. szt. szt.
dzieńGlony spp.9 i 17godz. 12
1Chaeto——
ISO1000Rok 2000
Syn20 00040 000
2Chaeto1000Rok 2000
ISORok 2000Rok 2000
nosorożec10001000
3Chaeto30004000
ISO30004000
nosorożec15001500
4Chaeto1000Rok 2000
ISO1000Rok 2000
nosorożec10001000

Tabela 3: Stężenie glonów na karmienie- zmodyfikowane na podstawie Bouquet et al.27. Stężenia glonów (komórki mL-1) i gatunki glonów używane do codziennego karmienia podczas 4-dniowego cyklu życia Okinawa O. dioica.

Plik uzupełniający 1: Codzienny wykres żywienia. Dzienne ilości pokarmu dla każdej zlewki hodowlanej są obliczane automatycznie po wprowadzeniu dziennych pomiarów absorbancji glonów (OD), wielkości zwierząt (dzień) i objętości wody morskiej (obj. SW) w każdej zlewce hodowlanej. Krzywe wzrostu R. reticulata i Synechococcus sp. zostały zaadaptowane z Bouquet et al.27. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 2: Jak podłączyć silnik synchroniczny do akrylowego wiosła. Mocno przykręć łopatkę do silnika za pomocą klucza imbusowego. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby ułatwić elastyczność w zakładaniu hodowli O. dioica, ważne jest zrozumienie naturalnego środowiska zwierząt. Dane sezonowe dostarczają informacji o zakresach parametrów fizycznych, które można wykorzystać do określenia warunków hodowli laboratoryjnej. Pomaga również w zrozumieniu sezonowych wahań liczebności zwierząt. Na Okinawie O. dioica jest najbardziej niezawodnie spotykany od czerwca do października. Jednak w Zatoce Tokijskiej szczyt populacji przypada na luty i październik41 roku. Chociaż hodowla O. dioica jest często zgłaszana w temperaturze 20 °C lub niższej 27,28,29, O. dioica z Okinawy wykazuje lepszą przeżywalność w temperaturach powyżej 20 °C; Można to wytłumaczyć faktem, że minimalna temperatura powierzchniowej wody morskiej na Okinawie wynosi ~20 °C (rys. 6). Na liczebność O. dioica mogą mieć również wpływ zakwity fitoplanktonu42 i liczebność drapieżników43,44. Niezależnie od tego, gdzie zbierane są O. dioica, zrozumienie sezonowości lokalnych populacji maksymalizuje szansę na pobranie próbek i sukces hodowlany.

Biorąc pod uwagę odpowiednią porę roku i lokalizację, pobieranie próbek netto jest skutecznym sposobem zbierania dużych ilości Oikopleura przy minimalnym wysiłku. Siatki planktonowe o mniejszym rozmiarze oczek (60-70 μm) mogą być również używane do zbierania wszystkich stadiów zwierząt. W pełni dojrzałe zwierzęta rzadko znajdują się w sieci, być może ze względu na ich kruchość pod koniec cyklu życia. W związku z tym identyfikację gatunków, a następnie pobieranie próbek, uzyskuje się poprzez obserwację mikroskopową komórek podstrunowcowych. Dojrzałe osobniki zwykle pojawiają się jeden lub dwa dni po pobraniu próbki, ponieważ zwierzęta nadal rosną w laboratorium. Chociaż pobieranie próbek netto jest skuteczne, w innych okolicznościach mogą być konieczne alternatywne metody pobierania próbek. Na przykład pobieranie próbek netto w pobliżu obszarów miejskich może gromadzić duże ilości fitoplanktonu, co utrudnia wyizolowanie Oikopleury. W takich przypadkach zaleca się proste pobieranie próbek z wiadra w celu pobrania próbek wody powierzchniowej z morza lub z łodzi z obszarów poza portem. Wyniki pokazały, że stopniowa zmiana zasolenia spowodowana kolejnymi dniami opadów deszczu nie wpłynęła na liczebność O. dioica; Należy jednak unikać pobierania próbek z brzegu bezpośrednio po ekstremalnych zdarzeniach pogodowych, takich jak cyklony tropikalne. Zdarzenia te powodują nagłe i drastyczne zmiany biogeochemiczne w osłoniętym zbiorniku wodnym45,46. Spływ wód burzowych może przenosić zanieczyszczenia, osady i nadmiar składników odżywczych, które zwiększają zmętnienie i obniżają jakość wody47. Plankton filtrujący, taki jak Oikopleura, może być szczególnie podatny na te zmiany ze względu na swój sposób odżywiania się i ograniczoną mobilność. W takiej sytuacji zalecamy odroczenie pobrania próbek o kilka dni, aż lokalne warunki powrócą do normy.

Wprowadzenie wielostopniowego systemu filtracji jest niezbędne do utrzymania małych, filtrujących organizmów, takich jak O. dioica. Wykorzystując słabo przefiltrowaną wodę morską (na przykład siatkę 25 μm w poprzednim systemie hodowli), kultura była często niestabilna, zwłaszcza latem, potencjalnie ze względu na większą obfitość fitoplanktonu. Chociaż niektóre fitoplanktony są korzystne dla wzrostu O. dioica , inne wytwarzają biotoksyny, które mogą powodować nieprawidłowy rozwój zarodków O. dioica 48. Ponadto wysokie stężenie okrzemek, takich jak Chaetoceros spp., jest potencjalnie szkodliwe dla wzrostu O. dioica, ponieważ mogą posiadać długie szczeciny, które mogą zatykać kurnik i uniemożliwiać efektywne żerowanie49. Często obserwowaliśmy, jak domy małych zwierząt są zapychane przez C. calcitrans setae; dlatego teraz karmimy C. calcitrans tylko zwierzętami w 2. dniu i starszych (Tabela 3).

Chociaż nie stanowiło to tutaj problemu, długotrwała hodowla O. dioica na małą skalę może doświadczyć nagłych spadków liczebności populacji z powodu wąskiego gardła genetycznego; w takich przypadkach Martí-Solans i wsp.29 zalecają dodawanie nowych dzikich osobników do kultury co 20 pokoleń.

System hodowli Oikopleura jest elastyczny. Stabilną kulturę można ustanowić w ciągu tygodnia. Długotrwała hodowla O. dioica jest możliwa przy skromnym budżecie przy użyciu niespecjalistycznego sprzętu. Dzienny wysiłek wymagany do utrzymania 5-10 zlewek Oikopleura wynosi na ogół mniej niż 2 godziny przy 2 osobach. O. dioica może być również utrzymywana w sztucznej wodzie morskiej, co jest korzystne dla osób bez dostępu do naturalnej wody morskiej28. Długotrwałe przechowywanie pokarmu z glonów jest możliwe dzięki zastosowaniu hodowli ciał stałych i kriokonserwacji29. Co więcej, plemniki O. dioica mogą być kriokonserwowane i pozostają żywotne przez ponad rok50. Wszystkie te czynniki oznaczają, że kultury można łatwo odtworzyć. Wreszcie, wcześniejsze doświadczenia z przypadkowym hodowlą Pleurobrachia sp. może sugerować, że system hodowli opracowany dla Oikopleura może potencjalnie zostać rozszerzony na szerszą społeczność delikatnych organizmów pelagicznych.

O. dioica nadal dostarcza potężnych informacji na temat różnych dziedzin biologii. Zrozumienie lokalnej sezonowości, skrupulatny system hodowli i kilka oddanych osób pozwalają na stworzenie skutecznej kultury przy niewielkim wysiłku. System hodowli Oikopleura zapewnia podstawowe zasoby do badania szerokiego zakresu dziedzin biologicznych związanych z ekologią, rozwojem, genomiką i ewolucją tego wyjątkowego morskiego strunowca.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autor nie ma nic do zadeklarowania.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jesteśmy wdzięczni Garthowi Ilsleyowi za jego wsparcie w ustanowieniu systemu kultury. Doceniamy wkład Ritsuko Suyamy i Sylvaina Guillota we wczesne pobieranie próbek i identyfikację gatunków. Specjalne podziękowania należą się Hiroki Nishidzie, Takeshiemu Onumie i Tatsuyi Omotezako za ich hojne wsparcie i wskazówki przez cały czas, w tym za początkowe ustanowienie lokalnego systemu hodowli oraz dzielenie się zwierzętami i kulturą mikroglonów. Dziękujemy również Danielowi Chourroutowi, Jean-Marie Bouquet, Anne Aasjord, Cristianowi Cañestro i Alfonso Ferrándezowi-Roldánowi za podzielenie się swoją wiedzą na temat pobierania próbek i hodowli. Jai Denton, Charles Plessy i Jeffrey Jolly dostarczyli bezcennych informacji zwrotnych na temat rękopisu. Charlotte West sformułowała uogólnione równanie do obliczania glonów. Na koniec dziękujemy OIST za dofinansowanie, Mary Collins i Komitetowi Bezpieczeństwa Pracy w Terenie OIST za porady dotyczące bezpiecznych procedur pobierania próbek, personelowi warsztatu mechanicznego OIST za budowę sprzętu do hodowli i pobierania próbek oraz Koichi Toda za dostarczanie wody morskiej.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Węgiel aktywnySigmaC2764-2.5KG
Aluminiowe koło pasoweRainbow Products10604-10607
BiotynaSigmaB4501-100MG
Kwas borowyWako021-02195
Kobalamina (B12)SigmaV2876-100MG
Sześciowodny chlorek kobaltu(II)Wako036-03682
Siarczan miedzi(II) pięciowodnyWako039-04412
Hydrat wersenianu disodowegoWako044-29525
Tetrahydrat heptamolibdenianu heksaamonuWako019-03212
Klucz sześciokątnyAnexNo.6600
Kwas solnyWako080-01066
Żelazo(III) sześciowodny chlorekWako091-00872
Programowalna automatyczna pompa dozująca JebaoDP-4
Pompa magnetycznaREI-SEARMD-201
Czterowodny chlorek manganu(II)Wako134-15302
Polipropylenowy filtr z wkładem nawiniętymAdvantecTCW-10N-PPS
TCW-5N-PPS
TCW-1N-PPS Bezśrubowa listwa zaciskowa
SATO PARTSSL4500
Prosta siatka planktonowaRIGO, Japonia5512-C
Metakrzemian soduSigma307815-1KG
Azotan soduWako195-02545
Fosforan sodu jednozasadowy bezwodnyMP Biomedicals194740
Sól siarczanu streptomycynySigmaS6501-25G
Synchroniczny silnik elektrycznySerwoD5N6Z15M
Chlorowodorek tiaminyWako201-00852
Sterylizator UVIwakiUVF-1000
ChlorekMP Biomedicals194858

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Travis, J. Is It What We Know or Who We Know? Choice of Organism and Robustness of Inference in Ecology and Evolutionary Biology (American Society of Naturalists Presidential Address). The American Naturalist. 167 (3), 303-314 (2006).
  2. Jenner, R. A., Wills, M. A. The choice of model organisms in evo-devo. Nature Reviews Genetics. 8 (4), 311-314 (2007).
  3. Irigoien, X., Huisman, J., Harris, R. P. Global biodiversity patterns of marine phytoplankton and zooplankton. Nature. 429 (6994), 863-867 (2004).
  4. Wilson, S., Ruhl, H., Smith, J. Zooplankton fecal pellet flux in the abyssal northeast Pacific: A 15 year time-series study. Limnology and Oceanography. 58 (3), 881-892 (2013).
  5. Steinberg, D. K., Lomas, M. W., Cope, J. S. Long-term increase in mesozooplankton biomass in the Sargasso Sea: Linkage to climate and implications for food web dynamics and biogeochemical cycling. Global Biogeochemical Cycles. 26 (1), 1004(2012).
  6. Lombard, F., Kiørboe, T. Marine snow originating from appendicularian houses: Age-dependent settling characteristics. Deep Sea Research Part I: Oceanographic Research Papers. 57 (10), 1304-1313 (2010).
  7. Fenaux, R. The Biology of Pelagic Tunicates. Bone, Q. , Oxford University Press. 251-264 (1998).
  8. Hopcroft, R. R. Response of Marine Ecosystems to Global Change: Ecological Impact of Appendicularians. Gorsky, G., Youngbluth, M. J., Deibel, D. , Contemporaty Publishing International. 45-57 (2005).
  9. Walters, T. L., Gibson, D. M., Frischer, M. E. Cultivation of the Marine Pelagic Tunicate Dolioletta gegenbauri (Uljanin 1884) for Experimental Studies. Journal of Visualized Experiments. (150), e59832(2019).
  10. Deibel, D. Feeding mechanism and house of the appendicularian Oikopleura vanhoeffeni. Marine Biology. 93 (3), 429-436 (1986).
  11. Spada, F., et al. Molecular patterning of the oikoplastic epithelium of the larvacean tunicate Oikopleura dioica. Journal of Biological Chemistry. 276 (23), 20624-20632 (2001).
  12. Gorsky, G., Youngbluth, M. J., Deibel, D. Response of Marine Ecosystems to Global Change: Ecological Impact of Appendicularians. , Contemporaty Publishing International. 59-85 (2005).
  13. Tokioka, T. Studies on the distribution of appendicularians and some thaliaceans of the North Pacific, with some morphological notes. Publication of the Seto Marine Biological Laboratory. (8), 351-443 (1960).
  14. Alldredge, A. L. Discarded appendicularian houses as sources of food, surface habitats, and particulate organic matter in planktonic environments. Limnology and Oceanography. 21 (1), 14-24 (1976).
  15. Clarke, C., Roff, J. C. Abundance and biomass of herbivorous zooplankton off Kingston, Jamaica, with estimates of their annual production. Estuarine, Coastal and Shelf Science. 31 (4), 423-437 (1990).
  16. Hopcroft, R. R., Roff, J. C. Zooplankton growth rates: extraordinary production by the larvacean Oikopleura dioica in tropical waters. Journal of Plankton Research. 17 (2), 205-220 (1995).
  17. Hopcroft, R. R., Roff, J. C. Production of tropical larvaceans in Kingston Harbour, Jamaica: are we ignoring an important secondary producer. Journal of Plankton Research. 20 (3), 557-569 (1998).
  18. Mochioka, N., Iwamizu, M. Diet of anguilloid larvae: leptocephali feed selectively on larvacean houses and fecal pellets. Marine Biology. 125 (3), 447-452 (1996).
  19. Sakaguchi, S. O., et al. Morphological identity of a taxonomically unassigned cytochrome c oxidase subunit i sequence from stomach contents of juvenile chum salmon determined using polymerase chain reaction. Fisheries Science. 83 (5), 757-765 (2017).
  20. Fenaux, R. The Biology of Pelagic Tunicates. Bone, Q. , Oxford University Press. 25-34 (1998).
  21. Sato, R., Tanaka, Y., Ishimaru, T. House production by Oikopleura dioica (Tunicata, Appendicularia) under laboratory conditions. Journal of Plankton Research. 23 (4), 415-423 (2001).
  22. Flood, R., Deibel, D. The Biology of Pelagic Tunicates. Bone, Q. , Oxford University Press. 105-124 (1998).
  23. Alldredge, A. Response of Marine Ecosystems to Global Change: Ecological Impact of Appendicularians. Gorsky, G., Youngbluth, M. J., Deibel, D. , Contemporaty Publishing International. 309-326 (2005).
  24. Katija, K., Sherlock, R. E., Sherman, A. D., Robison, B. H. New technology reveals the role of giant larvaceans in oceanic carbon cycling. Science Advances. 3 (5), 1602374(2017).
  25. Katija, K., Choy, C. A., Sherlock, R. E., Sherman, A. D., Robison, B. H. From the surface to the seafloor: How giant larvaceans transport microplastics into the deep sea. Science Advances. 3 (8), 1700715(2017).
  26. Hidaka, K. Species composition and horizontal distribution of the appendicularian community in waters adjacent to the Kuroshio in winter-early spring. Plankton and Benthos Research. 3 (3), 152-164 (2008).
  27. Bouquet, J. M., et al. Culture optimization for the emergent zooplanktonic model organism Oikopleura dioica. Journal of Plankton Research. 31 (4), 359-370 (2009).
  28. Nishida, H. Development of the appendicularian Oikopleura dioica: culture, genome, and cell lineages. Development, Growth & Differentiation. 50, 239-256 (2008).
  29. Martí-Solans, J., et al. Oikopleura dioica culturing made easy: A Low-Cost facility for an emerging animal model in Evo Devo. Genesis. 53 (1), 183-193 (2015).
  30. Holland, L. Z. Tunicates. Current Biology. 26 (4), 146-152 (2016).
  31. Delsuc, F., Brinkmann, H., Chourrout, D., Philippe, H. Tunicates and not cephalochordates are the closest living relatives of vertebrates. Nature. 439 (7079), 965-968 (2006).
  32. Seo, H. C., et al. Miniature genome in the marine chordate Oikopleura dioica. Science. 294 (5551), 2506(2001).
  33. Fredriksson, G., Olsson, R. The subchordal cells of Oikopleura dioica and O. albicans (Appendicularia, Chordata). Acta Zoologica. 72 (4), 251-256 (1991).
  34. Paffenhöfer, G. A. The cultivation of an appendicularian through numerous generations. Marine Biology. 22 (2), 183-185 (1973).
  35. Fenaux, R., Gorsky, G. Nouvelle technique d'élevage des appendiculaires. Rapports et Procés-Verbaux des Réunions-Commission Internationale pour l'Exploration Scientifique de la Mer Méditerranée. 29, 291-292 (1985).
  36. Fujii, S., Nishio, T., Nishida, H. Cleavage pattern, gastrulation, and neurulation in the appendicularian, Oikopleura dioica. Development Genes and Evolution. 218 (2), 69-79 (2008).
  37. Patry, W. L., Bubel, M., Hansen, C., Knowles, T. Diffusion tubes: a method for the mass culture of ctenophores and other pelagic marine invertebrates. PeerJ. 8, 8938(2020).
  38. Fenaux, R. The classification of Appendicularia (Tunicata): history and current state. Memoires de I'Institut oceanographique. , (1993).
  39. Shiga, N. Illustrated Guide to Marine Plankton in Japan. Chihara, M., Murano, M. , Tokai University Press. 1393-1414 (1997).
  40. Gorsky, G., Castellani, C. Marine Plankton: A practical guide to ecology, methodology, and taxonomy. Castellani, C., Edwards, M. , Oxford University Press. 599-606 (2017).
  41. Sato, R., Ishibashi, Y., Tanaka, Y., Ishimaru, T., Dagg, M. J. Productivity and grazing impact of Oikopleura dioica (Tunicata, Appendicularia) in Tokyo Bay. Journal of Plankton Research. 30 (3), 299-309 (2008).
  42. Nakamura, Y., Suzuki, K., Suzuki, S. Y., Hiromi, J. Production of Oikopleura dioica (Appendicularia) following a picoplankton 'bloom'in a eutrophic coastal area. Journal of Plankton Research. 19 (1), 113-124 (1997).
  43. Nakamura, Y. Blooms of tunicates Oikopleura spp. and Dolioletta gegenbauri in the Seto Inland Sea, Japan, during summer. Hydrobiologia. 385 (1-3), 183-192 (1998).
  44. Uye, S. I., Ichino, S. Seasonal variations in abundance, size composition, biomass and production rate of Oikopleura dioica (Fol)(Tunicata: Appendicularia) in a temperate eutrophic inlet. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 189 (1-2), 1-11 (1995).
  45. Tsuchiya, K., et al. Phytoplankton community response and succession in relation to typhoon passages in the coastal waters of Japan. Journal of Plankton Research. 36 (2), 424-438 (2014).
  46. Lopez-Lopez, L., et al. Effects of typhoons on gelatinous carnivore zooplankton off Northern Taiwan. Cahiers de Biologie Marine. 53, 349-355 (2012).
  47. Ares, Á, et al. Extreme storm-induced run-off causes rapid, context-dependent shifts in nearshore subtropical bacterial communities. bioRxiv. , (2019).
  48. Torres-Águila, N. P., et al. Diatom bloom-derived biotoxins cause aberrant development and gene expression in the appendicularian chordate Oikopleura dioica. Communications Biology. 1 (1), 1-11 (2018).
  49. Troedsson, C., Frischer, M. E., Nejstgaard, J. C., Thompson, E. M. Molecular quantification of differential ingestion and particle trapping rates by the appendicularian Oikopleura dioica as a function of prey size and shape. Limnology and Oceanography. 52 (1), 416-427 (2007).
  50. Ouchi, K., Nishino, A., Nishida, H. Simple procedure for sperm cryopreservation in the larvacean tunicate Oikopleura dioica. Zoological Science. 28 (1), 8-11 (2011).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

System hodowlanyPrzygotowanie po ywki algowejPobieranie pr b za pomoc sieci planktonowejIdentyfikacja gatunk wPrzygotowanie beker w do tar aUtrzymanie jako ci wodyOptymalizacja re imu karmieniaPrzechowywanie d ugoterminoweOrganizm modelowy

Powiązane artykuły