Artykuł metodologiczny

Połączone anatomiczne i funkcjonalne śledzenie in vivo zakończeń glutaminianu w brzusznym obszarze nakrywki w hipokampie

3.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61282

⸱

9 września 2020

 ,  , 
1Department of Comparative Biomedical Sciences, Louisiana State University School of Veterinary Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Obecny protokół demonstruje prostą metodę śledzenia projekcji glutaminianu w brzusznym obszarze nakrywki (VTA) do hipokampa. Fotostymulację neuronów glutaminianu VTA połączono z zapisem CA1, aby zademonstrować, w jaki sposób zakończenia glutaminianu VTA modulują przypuszczalną szybkość wypalania CA1 w piramidzie in vivo.

Streszczenie

Optogenetyczna modulacja subpopulacji neuronów w mózgu pozwoliła badaczom na analizę obwodów neuronalnych in vivo i ex vivo. Stanowi to przesłankę do określenia roli typów neuronów w obwodzie neuronalnym i ich znaczenia w kodowaniu informacji w odniesieniu do uczenia się. Podobnie, metoda może być wykorzystana do zbadania fizjologicznego znaczenia dwóch lub więcej połączonych obszarów mózgu u zwierząt obudzonych i znieczulonych. Obecne badanie pokazuje, w jaki sposób neurony glutaminianu VTA modulują szybkość wypalania przypuszczalnych neuronów piramidowych w CA1 (hipokampie) znieczulonych myszy. Protokół ten wykorzystuje zależne od adenowirusa (AAV) znakowanie neuronów glutaminianu VTA w celu śledzenia presynaptycznych zakończeń glutaminianu VTA w warstwach hipokampa. Ekspresja kontrolowanej światłem opsyny (rodopsyny kanałowej; hChR2) i białka fluorescencyjnego (eYFP) przenoszonego przez wektor AAV umożliwiła śledzenie następcze zakończeń glutaminianu VTA i fotostymulację ciał komórek neuronalnych glutaminianu VTA (w VTA). Ostre elektrody krzemowe o wysokiej impedancji umieszczono w CA1 w celu wykrycia wielojednostkowych i jednojednostkowych odpowiedzi na fotostymulację VTA in vivo. Wyniki tego badania pokazują zależny od warstwy rozkład presynaptycznych zakończeń glutaminianu VTA w hipokampie (CA1, CA3 i DG). Ponadto fotostymulacja neuronów glutaminianu VTA zwiększyła szybkość wystrzeliwania i pękania przypuszczalnych jednostek piramidowych CA1 in vivo.

Wprowadzenie

W ciągu ostatniej dekady opracowano szereg narzędzi genetycznych w celu zwiększenia specyficzności modulacji typu neuronu i mapowania złożonych sieci neuronowych1. Warto zauważyć, że wirusy neurotropowe z wrodzoną zdolnością do infekowania i replikacji w komórkach neuronalnych zostały wykorzystane do ekspresji lub ablacji określonych białek w podtypach neuronów. W przypadku zawierania białek fluorescencyjnych lub genetycznie kodowanych wskaźników aktywności synaptycznej, transfekowane wektory AAV oznaczają i wyznaczają sieci neuronowe w różnych regionach mózgu2,3. Wybór promotora w konstrukcie AAV kieruje ekspresją wektora w typach neuronów z pewnym poziomem swoistości (ekspresja zależna od promotora). Jednak dzięki rekombinacji Cre-lox konstrukcje AAV są wdrażane z większą swoistością do znakowania neuronów4,5,6,7. Warto zauważyć, że fotoaktywowane opsyny mikrobiologiczne i białka fluorescencyjne upakowane w wektory AAV mogą ulegać ekspresji w różnych podtypach neuronów8 i są idealne do obrazowania, śledzenia obwodów typu neuron i fotomodulacji9,10.

AAV konstrukty stereotaktycznie wstrzykiwane do obszaru mózgu (lub jądra) napędzają ekspresję białka reporterowego w końcówkach somy, dendrytu i aksonów. Neuronalna ekspresja AAV zawierającego gen reporterowy (eYFP) ułatwia znakowanie ciał komórek neuronów i anatomiczne śledzenie projekcji do i z innych obszarów mózgu11,12,13,14. Konstrukty AAV-eYFP przenoszące opsynę sterowaną światłem (np. hChR2) mogą być wykorzystywane jako narzędzie do obrazowania6,15 i opartego na stymulacji fizjologicznego śledzenia projekcji neuronalnych do docelowych obszarów mózgu in vivo16. W zależności od serotypu AAV, kierunek znakowania neuronów może być następczy lub wsteczny11,12. Wcześniejsze badania wykazały, że AAV5 przemieszcza się przewstecznie w neuronach12. Tak więc fotostymulacja ciał komórkowych eksprymujących hChR2 wywołuje efekty presynaptyczne w innych częściach mózgu (target)17.

Tutaj, AAV (serotyp 5) z promotorem CaMKIIα został użyty do ekspresji eYFP (reporter) i hChR2 (opsyna) w neuronach glutaminianu VTA i projekcjach aksonalnych. Wyniki tego badania pokazują zależny od warstwy rozkład zakończeń presynaptycznych glutaminianu VTA w regionach hipokampa CA1, CA3 i DG. Ponadto fotostymulacja neuronów glutaminianu VTA zwiększyła szybkość wypalania wielojednostkowego i jednojednostkowego CA1 in vivo w porównaniu z wartościami wyjściowymi. Protokół ten wykorzystuje niedrogie narzędzia i dostępne na rynku oprogramowanie, które może poprawić jakość danych uzyskanych z eksperymentów śledzenia obwodów neuronowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury eksperymentalne i postępowania ze zwierzętami zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Szkoły Medycyny Weterynaryjnej Uniwersytetu Stanowego Luizjany.

1. Zwierzę doświadczalne

  1. Użyj 5-6 tygodniowych myszy.
  2. Trzymaj 3–5 zwierząt w klatce w standardowych warunkach 12 godzin naprzemiennego cyklu światła i ciemności. Jedzenie i wodę należy zapewnić ad libitum.

2. Kraniotomia i przygotowanie zwierząt

UWAGA: Ta sekcja opisuje procedury przed- i okołooperacyjne dla mysiej kraniotomii. Stosować standardowy aparat stereotaktyczny i odpowiednie współrzędne (przednio-tylne: AP, przyśrodkowo-boczne: ML i grzbietowo-brzuszne: DV). Zapoznaj się z atlasem mózgu myszy, aby określić współrzędne interesującego obszaru mózgu.

  1. Znieczulić myszy przez dootrzewnowe wstrzyknięcie koktajlu ketaminy (100 mg / kg) / ksylazyny (10 mg / kg). Wykonaj test szczypania palca u nogi, aby upewnić się, że nie ma czucia przed rozpoczęciem operacji.
    UWAGA: Alternatywnie na tym etapie można również zastosować znieczulenie izofluranem z odpowiednią komorą nosową.
  2. Delikatnie przymocuj głowę zwierzęcia do aparatu stereotaktycznego.
    UWAGA: Podczas tego procesu należy zachować ostrożność przy zwierzętach. Sprawdź również częstość oddechów i inne parametry życiowe przed przystąpieniem do operacji. Pozwól zwierzęciu odpocząć przez ~7 minut, aby zmniejszyć stres.
    1. Umieść poduszkę grzewczą na ramie stereotaktycznej tak, aby leżało na niej ciało zwierzęcia. Pomoże to utrzymać temperaturę ciała i utrzymać zwierzę w cieple przez cały czas trwania zabiegu. Zachowaj poduszkę grzewczą do opieki pooperacyjnej i rekonwalescencji.
  3. Użyj maszynki do strzyżenia, aby usunąć włosy ze skóry głowy i oczyść skórę roztworem jodu.
    1. Zastosuj miejscowo lidokainę, aby zablokować czucie na skórze głowy.
    2. Użyj skalpela, aby wykonać nacięcie w linii środkowej skóry głowy rozciągające się od okolicy czołowej do potylicznej.
    3. Oczyść obszar nacięcia roztworem jodu, a następnie odsłoń kalwarię.
      UWAGA: Niewielką ilość 3% roztworu nadtlenku wodoru można zastosować w celu usunięcia okostnej z kalwarii. Zwiększy to widoczność punktów orientacyjnych (bregma i lambda) oraz szwów.
    4. Korzystając z atlasu stereotaktycznego mózgu myszy, określ współrzędne AP i ML względem bregmy.
    5. W przypadku wstrzyknięcia VTA należy umieścić ultracienką strzykawkę z końcem (np. strzykawkę Neuros) we współrzędnych AP: -3,08 mm/ML: 0,5 mm względem bregmy.
    6. Za pomocą narzędzia wiertarskiego wywiercić otwór o średnicy 1 mm (kraniotomia) w czaszce w oznaczonym miejscu współrzędnych AP/ML.
      UWAGA: Ten krok wymaga znacznego poziomu ostrożności. Podczas wiercenia należy wywierać minimalny nacisk, aby wiertło nie zmiażdżyło tkanki mózgowej. W obecnym badaniu wiertło miało średnicę 0,8 mm, a prędkość wiercenia ustawiono na 15 000 obr./min.
      UWAGA: Jeśli do czyszczenia nacięcia lub kalwarii użyto nadtlenku wodoru, przed wierceniem należy zapewnić całkowite usunięcie roztworu lub pozostawić do całkowitego wyschnięcia.

3. Wstrzyknięcie koktajlu AAV

UWAGA: Ta sekcja opisuje proces wstrzykiwania AAV do VTA dorosłych myszy C57BL/6 (23–27 g). Opisana metoda może być stosowana do wstrzykiwania AAV w dowolny obszar mózgu przy użyciu standardowego aparatu stereotaktycznego i odpowiednich współrzędnych. Aby zademonstrować ten protokół, eYFP i hChR2 uległy ekspresji w neuronach glutaminianu VTA za pomocą transfekcji za pośrednictwem AAV5 pod promotorem CaMKIIα (Figura 1). Na tym etapie można również zastosować rekombinację Cre-lox.

  1. Zamontuj strzykawkę z ultracienką, igłą (32 G; pojemność 5 μl z dokładnością 100 nL) do wstrzykiwacza. Zamocuj uchwyt strzykawki na mikromanipulatorze.
    UWAGA: Do tej procedury użyto ręcznego uchwytu strzykawki z kalibracją 1,6 nL. Można również użyć automatycznego wtryskiwacza.
  2. Napełnić strzykawkę wodą podwójnie destylowaną, aby oczyścić i przetestować przepływ płynu.
  3. Rozmrozić porcje koktajlu AAV (serotyp 5) na lodzie. AAV najlepiej przechowywać w temperaturze -80 °C, aby utrzymać miano wirusa i dobrą ekspresję.
  4. Napełnić zamontowaną strzykawkę 1 000 nL roztworu AAV (10 mM w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanem (PBS), pH 7,4). Dozować 10 nl roztworu AAV w celu potwierdzenia przepływu płynu przed opuszczeniem igły do miejsca wstrzyknięcia.
  5. Użyj mikromanipulatora, aby stereotaktycznie opuścić igłę na żądaną głębokość (współrzędna DV). Po opuszczeniu igły na żądaną głębokość, należy pozostawić strzykawkę na miejscu przez 10 minut przed wstrzyknięciem.
    UWAGA: W przypadku tej procedury igła została opuszczona do VTA na głębokości (DV) 4,5 mm od powierzchni pialnej mózgu. W przypadku innych obszarów mózgu użyj odpowiedniej współrzędnej grzbietowo-brzusznej (patrz atlas mózgu myszy).
  6. Wstrzyknąć 600–800 nL AAV do VTA. Objętość wstrzyknięcia może być dostosowana w zależności od wielkości miejsca docelowego.
    1. Dostarczyć roztwór AAV z szybkością 60 nL/min (odstęp 3 minuty).
    2. Aby wyrazić eYFP i hChR2 w neuronach glutaminianu VTA i projekcjach, wstrzyknij AAV-CaMKIIα-ChR2-eYFP.
      UWAGA: Metoda rekombinacji Cre-lox może być również stosowana w zależności od celu eksperymentu.
    3. Pozostawić igłę na miejscu przez 15 minut po wstrzyknięciu AAV. Zmniejszy to dyfuzję i przepływ wsteczny.
  7. Wyjąć igłę strzykawki, a następnie zszyć nacięcie, aby zamknąć ranę.
  8. Podawaj antybiotyki i analgezję w ramach opieki pooperacyjnej. Umieść mysz na ciepłych, wyściełanych platformach i monitoruj zwierzę aż do przebudzenia.
    UWAGA: Po 3 tygodniach od wstrzyknięcia ekspresję AAV można zaobserwować poprzez fluorescencyjną detekcję białka reporterowego (eYFP) w wycinkach mózgu myszy. Również eksperymenty fotostymulacyjne można przeprowadzić po 3 tygodniach (Rysunek 2).

4. Konfiguracja do nagrań neuronowych in vivo z optogenetyką

UWAGA: Ta sekcja opisuje etapy ostrego zapisu neuronalnego z optogenetycznym śledzeniem obwodu mózgu (projekcja neuronu glutaminianu VTA do CA1). W razie potrzeby przed rozpoczęciem tego kroku sprawdź system (amplifier i połączenia) pod kątem zakłóceń elektrycznych i problemów z uziemieniem. Wykonanie tego kroku w klatce Faradaya może pomóc w wyeliminowaniu szumów elektrycznych w nagraniu.

  1. Po 3 tygodniach od wstrzyknięcia AAV znieczulić myszy przez dootrzewnowe wstrzyknięcie uretanu (0,2 mg / kg).
    UWAGA: Uretan jest rakotwórczy i należy obchodzić się z nim ostrożnie podczas noszenia odzieży ochronnej. Również podanie znieczulenia uretanowego w tym stężeniu jest niemożliwe do przeżycia.
  2. Umieść głowę zwierzęcia na ramie stereotaktycznej, jak opisano wcześniej (krok 2.2, Rysunek 3A). Wykonaj kraniotomię, aby odsłonić oponę twardą (Ryc. 3A). Użyj narzędzia wiertarskiego (rozmiar wiertła: 0,8 mm, prędkość: 15 000 obr./min), aby usunąć część kości ciemieniowej.
    1. Kraniotomia powinna mieć szerokość około 3 mm x 4 mm. Nałóż krople sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (aCSF) na ten obszar, aby zapobiec wysuszeniu.
  3. Pod mikroskopem preparacyjnym (cyfrowym) użyj wygiętej końcówki igły (27 G), aby wyciąć odsłoniętą oponę twardą. Uważaj, aby nie rozerwać delikatnego pokrycia pialnego i tkanek korowych w tym obszarze.
  4. Wywiercić otwór w kości potylicznej (rozmiar końcówki: 0,8 mm, prędkość: 10 000 obr./min), aby przytrzymać uziemiającą (śruba krzyżakowa z stożkowym; M0,6 x 2,0 mm).
  5. Podłącz przewód uziemiający ze stali nierdzewnej.
    UWAGA: Można również stosować inne rodzaje przewodów (Rysunek 3b).
  6. Do połączonej fotostymulacji (VTA) i rejestracji neuronowej (CA1) należy użyć wieloszynowego aparatu stereotaktycznego wyposażonego w ultraprecyzyjne (10 μm lub 1 μm) mikromanipulatory. Zamontuj światłowód i rejestrującą sondę neuronową odpowiednio na mikromanipulatorze o zasięgu 10 μm i 1 μm.
    1. W razie potrzeby użyj adaptera sondy czołowej (Rysunek 3c).
      UWAGA: W obecnym protokole 32-kanałowy stopień główny został wyposażony w adapter do przechowywania 4-kanałowej elektrody nagrywającej (Rysunek 3d). Przewód uziemiający ze stali nierdzewnej został przylutowany do portu uziemienia adaptera.
  7. Przy współrzędnych AP: -3,08 mm ML: 0,5 mm opuść światłowód o średnicy 400 μm do VTA.
    1. Przed opuszczeniem światłowodu podłącz tulejkę do światłowodowego (z tulejką ze stali nierdzewnej lub ceramiczną) połączonego ze źródłem LED sprzężonym ze światłowodem.
      UWAGA: Upewnij się, że intensywność światła i ostrość są ustawione zgodnie z potrzebami. Wybór źródła światła LED powinien odpowiadać opsynom, na które są celowane. W tym przypadku do fotoaktywacji hChR2 użyto sterownika LED o długości fali 470 nm (niebieskie światło) (Rysunek 4a).
    2. Aby zsynchronizować impuls świetlny z zapisem neuronowym, podłącz sterownik LED i cyfrowy port IN kontrolera nagrywania do impulsera logiki tranzystorowo-tranzystorowej (TTL) (Rysunek 4b). Można to osiągnąć za pomocą rozdzielacza BNC.
      UWAGA: Zastosowanie impulsera TTL zapewnia elastyczność cyfrowego ustawiania żądanej częstotliwości i czasu trwania ciągu impulsów. W obecnym protokole impulsy świetlne o długości 10 ms były wyzwalane przy 50 Hz18. Aby sterować TTL sterownikiem LED, przełącz sterownik na "spust". W tym trybie natężenie światła można regulować, obracając "pokrętło". Częstotliwość stymulacji można dostosować do zmiennych eksperymentalnych i może wynosić od 1 do 100 Hz. Do śledzenia obwodów neuronowych zalecana jest częstotliwość stymulacji >20 Hz.
    3. Wyreguluj pokrętło, aby określić efektywną intensywność, która może wygenerować odpowiedź bez wytwarzania artefaktów fotoelektrycznych. W razie potrzeby zmień położenie światłowodu, aby wyeliminować artefakty19.
      UWAGA: Sterownik LED używany w obecnym protokole wytwarza moc światła ~21,8 mW.

5. Zapis neuronowy

  1. Użyj ostrej sondy neuronowej z trzpieniem o grubości 15–50 μm, o długości co najmniej 5 mm.
    UWAGA: Nagrywanie z głębokich struktur mózgu będzie wymagało sond neuronowych z dłuższym trzonkiem. W niniejszej pracy wykorzystano sondę o długości trzpienia 20 mm.
  2. Podłącz stopień główny wzmacniacza do kontrolera nagrywania za pomocą szeregowego interfejsu peryferyjnego (SPI). Sprawdź kolor diod LED na portach kontrolera nagrywania. Zielone i żółte diody LED wskazują prawidłowe napięcie na podłączonej płytce wzmacniacza. Czerwona dioda LED sygnalizuje działającą kontrolę stopnia głowicy programowej (Rysunek 5b).
  3. Za pomocą mikromanipulatora umieść miejsca styku elektrody w piramidalnej warstwie ogniwa CA1 (AP: -1,94 mm, ML: +1,0 mm, DV: +1,1 do 1,2 mm).
    UWAGA: Światłowód i elektrodę można umieścić w innych pożądanych obszarach mózgu w celu fotostymulacji i rejestrowania.

6. Ustawienia wzmacniacza i filtra

  1. Podłącz kontroler nagrywania amplifier system do komputera przez port USB 3.0. Podłącz stopień główny do amplifier za pomocą SPI. Uruchom oprogramowanie kontrolera. Jeśli nie zostanie prawidłowo podłączony, system wyświetli komunikat "nie znaleziono urządzenia".
  2. Kliknij przycisk Uruchom, aby wyświetlić aktywność w kanałach. Każdy przebieg jest wykreślany jako napięcie (oś y) w funkcji czasu (oś x). W zależności od obszaru zainteresowania dostosuj skalę napięcia i czasu, aby dostosować wyświetlanie przebiegu.
  3. Jeśli aktywnych jest tylko kilka kanałów, wyłącz nieużywane kanały, aby zmniejszyć rozmiar pliku na dysku.
  4. Ustaw częstotliwość próbkowania i częstotliwości odcięcia, edytując parametry przepustowości w oprogramowaniu do akwizycji. W przypadku nagrywania pojedynczego urządzenia ustaw górną i dolną częstotliwość odcięcia odpowiednio na 300 Hz i 5,000 Hz. Zmień częstotliwość próbkowania wzmacniacza na 30 kS/s.
    UWAGA: Wybranie wysokiej częstotliwości próbkowania spowoduje uzyskanie większego rozmiaru pliku.
  5. Przed nagrywaniem sprawdź integralność kanałów elektrod, mierząc impedancję przy 1,000 Hz. Można to zrobić, uruchamiając funkcję w interfejsie użytkownika (oprogramowanie sterownika). Kanał roboczy powinien mieć wartość impedancji mieszczącą się w zakresie od 0,1 do 5 MΩ.
  6. Jeśli wyjście audio (głośnik) jest podłączone do portu ANALOG OUT, wyreguluj wzmocnienie i tłumik, aby uzyskać optymalny dźwięk skokowy.
  7. Aby wyświetlić znacznik ciągu impulsów TTL w nagraniu impulsowym, włącz wyświetlanie znacznika DIGITAL IN. Aby zarejestrować znacznik czasu ciągu impulsów, włącz wyświetlanie kanału DIGITAL IN przed głównym eksperymentem.
    UWAGA: Zwykle jest więcej niż jeden kanał "DIGITAL IN" (1 lub 2). Upewnij się, że BNC od impulsera TTL jest podłączony do portu "DIGITAL IN", który jest wybrany do wyświetlania w oprogramowaniu kontrolera nagrywania.
  8. Aby wyświetlić przebieg spajka w czasie rzeczywistym, otwórz okno lunety spajka i ustaw próg za pomocą kliknięcia myszą.
  9. Sprawdź poziom hałasu, monitorując średnią kwadratową (RMS w μV). W przypadku czystego zapisu wartości szczytowych preferowane jest, aby próg skoku neuronalnego wynosił co najmniej 5x RMS.
  10. Po zakończeniu instalacji wybierz format wyjściowy pliku.
    UWAGA: W tym przypadku skok neuronowy CA1 został zarejestrowany w formacie .rhd. Inne formaty plików (.rhs i .dat) można również wybrać tak, aby odpowiadały formatom plików dopuszczalnym przez oprogramowanie analityczne.

7. Zapis optogenetyczny in vivo i ustawienia

  1. Otwórz oprogramowanie do sterowania impulsami (TTL), które wyświetla różne regulowane parametry impulsów. Wybierz odpowiedni port COM w oprogramowaniu. Ustaw parametry impulsu, dostosowując ustawienia pociągu i grupy.
    UWAGA: Warunek impulsu należy określić, biorąc pod uwagę zmienne eksperymentalne i projekt.
  2. W oprogramowaniu kontrolera wzmacniacza kliknij przycisk Uruchom, aby wykryć skoki neuronalne w hipokampie lub pożądanym obszarze mózgu. W razie potrzeby dostosuj głębokość elektrody, aby wykryć żywotne i aktywne neurony.
  3. Po wykryciu aktywności napięcia zewnątrzkomórkowego obserwuj skoki wartości wyjściowej przez 15 minut i monitoruj parametry życiowe zwierzęcia. Przetestuj również impuls świetlny, aby wykryć wrażliwe neurony w CA1 lub pożądanym anatomicznym regionie docelowym.
    UWAGA: Sprawdź, czy nie ma artefaktów fotoelektrycznych i wyeliminuj, dostosowując natężenie światła lub położenie światłowodu.
  4. Rejestruj podstawową aktywność przez ~10 minut przed wyzwoleniem impulsu świetlnego o żądanej częstotliwości (Rysunek 5a,b). Pozwoli to na porównanie szybkości strzelania lub serii z oświetleniem i bez.
    UWAGA: W obecnym badaniu aktywność wyjściową rejestrowano przez 10 minut bez oświetlenia, a następnie oświetlenie przy 50 Hz (film 1).

8. Analiza

  1. Przekonwertuj plik .rhd na format wyjściowy Nex5.
  2. Nazwa pliku procesu. Plik Nex5 w oprogramowaniu do sortowania offline do wykrywania pojedynczych jednostek rastrowych ciągów i przebiegów (Rysunek 5a–b).
    1. Wybierz żądany kanał z rozwijanego okna.
      UWAGA: Stale rejestrowane dane o spajkach można wyświetlić w osobnym oknie OFSS. Skalę czasu można również dostosować. Jeśli używana jest tetroda, OFSS można ustawić tak, aby sortował 4 kanały jako tetrodę.
    2. Ustaw poziom napięcia dla ekstrakcji przebiegu przekraczającego próg.
      UWAGA: Użyj co najmniej 5x RMS do prawidłowego wykrywania skoków.
    3. Wykrywaj przebiegi, a następnie sortuj wartości szczytowe za pomocą metody wyszukiwania doliny (automatycznie) lub metodą K-średnich (półautomatyczną). Tam, gdzie to konieczne, scal jednostki, które zajmują podobne obszary przestrzeni 3D-Principal Component Analysis (PCA).
    4. Eksport posortowany . Nex5 plików do dalszej analizy (Rysunek 5c–d).
      UWAGA: Wyniki analizy dla interwału między skokami, szybkości wystrzeliwania i szybkości serii można wyeksportować do innych platform analitycznych.

9. Wykrywanie fluorescencji ekspresji AAV

  1. Po nagraniu należy poddać zwierzę eutanazji w komorze izofluranowej.
  2. Przeprowadzić perfuzję przezsercową za pomocą 10 mM PBS (~10 ml), a następnie 4% paraformaldehydu buforowanego fosforanami (PB-PFA, ~10 ml).
  3. Usuń cały mózg w stanie nienaruszonym i utrwal go w 4% PB-PFA przez 48 godzin.
  4. Przenieść unieruchomiony mózg do 4% PB-PFA zawierającego 30% sacharozy w celu kriokonserwacji w temperaturze 4 °C. Po 72 godzinach pokrój mózg na sekcje w kriosacie i umieść plastry na szkiełku pokrytym żelatyną.
    UWAGA: W obecnym protokole sekcje zawierające zamkniętą część hipokampa (rostralną) zostały wybrane w celu zademonstrowania końcówek znakowanych AAV w DG, CA3 i CA1.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Śledzenie anterogradne

Ekspresję AAV zweryfikowano za pomocą obrazowania immunofluorescencyjnego białka reporterowego (eYFP) w VTA myszy C57BL/6 w 21. dniu po iniekcji (Rycina 2). Prawidłowe znakowanie anterogradne presynaptycznych projekcji glutaminergicznych z VTA do hipokampa potwierdzono również poprzez detekcję eYFP w warstwach DG, CA3 oraz CA1 (Rycina 6a–d; Film 2 i 3).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W ciągu ostatniej dekady znacznie rozwinęła się konstrukcja konstrukcji AAV. W związku z tym do szeregu serotypów AAV włączono więcej promotorów specyficznych dla neuronów w celu poprawy specyficzności transfekcji14. Łącząc geny białek fluorescencyjnych, transporterów, receptorów i kanałów jonowych, istnieją obecnie biblioteki AAV do obrazowania, neuromodulacji i wykrywania aktywności synaptycznej. W komercyjnie dostępnych konstruktach AAV połączenie genetycznie kodowanego fluoroforu i kanałów jon...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca jest finansowana przez CBS Bridging Grant przyznany OOM. OOM, PAA i AS zaprojektowały badanie i przeprowadziły eksperymenty. AS i PAA przeanalizowały wyniki. OOM i PAA przygotowały manuskrypt. Dziękujemy dr Karlowi Disserothowi (Uniwersytet Stanforda) za udostępnienie AAV do naszego użytku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
3% Nadtlenek wodoruFisher chemicznyH312
AAV-CaMKIIα-ChR2-eGYPAddgenePlasmid #26969
BNCAmazon
BNC SplitterAmazon
Ceramiczna dzielona tuleja łącząca do Ø Okucia 1,25 mm.Wiertarka ThorlabsADAL1-5
DremelLR 39098
Szkiełka powlekane żelatynąFisher scientificOBSLD01CS
Strzykawka Hamiltona (Neuros)WPI Inc.06H
Adapter stopnia czołowegoNeuronexusAdpt-Q4-OM32
Sonda krzemowa o wysokiej impedancjiNeuronexusQ1x1-tet-5mm-121-CQ4
Kontroler nagrywania INTAN 512chINTANRHD2000
Roztwór joduDynarex1425
IsofluranePiramalNDC 66794-017-25
KetamineSpectrumK1068
Sterownik LEDThorlabsLEDD1B
Źródło światła LED (470 nm)-niebieskie światłoThorlabsM470F3
MikromanipulatorNarishigeM0-203
ŚwiatłowódThorlabsCFMLC14L05
Śruba krzyżakowa z stożkowym (M0,6 X 2 mm)AmazonM0,6 X 2 mm
Przedwzmacniacz główny (32 kanały)INTANC3314
Rama stereotaktycznaKopf1530
TTL pulserPrizmatix4031
UretanowaSigmaU2500
KsylazynaAlfa AesarJ61430
SoftwareCompany Wersja
GraphpadPrism GraphPadSoftware wersja 8
Intan Recording ControllerIntantechwersja 2.07
NeuroexplorerNex Technologieswersja 5.215
Plexon Offline Spike SorterPlexon Incwersja 4.5
ACSF Skład:
sub>2 stale przepuszczany przez ACSF (ACSF; w mM 125 NaCl, 25 NaHCO3, 3 KCl, 1,25 NaH2PO4, 1 MgCl2, 2 CaCl2 i 25 glukozy).
natleniony ACSF o zawartości 95% tlenu/5% CO<

Bibliografia

  1. Lo, L., Anderson, D. J. A Cre-dependent, anterograde transsynaptic viral tracer for mapping output pathways of genetically marked neurons. Neuron. 72 (6), 938-950 (2011).
  2. Li, J., Liu, T., Dong, Y., Kondoh, K., Lu, Z. Trans-synaptic Neural Circuit-Tracing with Neurotropic Viruses. Neuroscience bulletin. , 1-12 (2019).
  3. Kuypers, H., Ugolini, G. Viruses as transneuronal tracers. Trends in neurosciences. 13 (2), 71-75 (1990).
  4. Atasoy, D., Aponte, Y., Su, H. H., Sternson, S. M. A FLEX switch targets Channelrhodopsin-2 to multiple cell types for imaging and long-range circuit mapping. Journal of Neuroscience. 28 (28), 7025-7030 (2008).
  5. Dragatsis, I., Zeitlin, S. A method for the generation of conditional gene repair mutations in mice. Nucleic acids research. 29 (3), 10(2001).
  6. Gradinaru, V., et al. Molecular and cellular approaches for diversifying and extending optogenetics. Cell. 141 (1), 154-165 (2010).
  7. Bernstein, J. G., Boyden, E. S. Optogenetic tools for analyzing the neural circuits of behavior. Trends in cognitive sciences. 15 (12), 592-600 (2011).
  8. Tye, K. M., Deisseroth, K. Optogenetic investigation of neural circuits underlying brain disease in animal models. Nature Reviews Neuroscience. 13 (4), 251(2012).
  9. Mei, Y., Zhang, F. Molecular tools and approaches for optogenetics. Biological Psychiatry. 71 (12), 1033-1038 (2012).
  10. Kohara, K., et al. Cell type-specific genetic and optogenetic tools reveal hippocampal CA2 circuits. Nature Neuroscience. 17 (2), 269(2014).
  11. Gombash, S. E. Adeno-Associated Viral Vector Delivery to the Enteric Nervous System: A Review. Postdoc Journal. 3 (8), 1-12 (2015).
  12. Haggerty, D. L., Grecco, G. G., Reeves, K. C., Atwood, B. Adeno-Associated Viral Vectors in Neuroscience Research. Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 17, 69-82 (2020).
  13. Montardy, Q., et al. Characterization of glutamatergic VTA neural population responses to aversive and rewarding conditioning in freely-moving mice. Science Bulletin. 64 (16), 1167-1178 (2019).
  14. Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. Optogenetics in neural systems. Neuron. 71 (1), 9-34 (2011).
  15. Chamberlin, N. L., Du, B., de Lacalle, S., Saper, C. B. Recombinant adeno-associated virus vector: use for transgene expression and anterograde tract tracing in the CNS. Brain Research. 793 (1-2), 169-175 (1998).
  16. Zingg, B., et al. AAV-mediated anterograde transsynaptic tagging: mapping corticocollicular input-defined neural pathways for defense behaviors. Neuron. 93 (1), 33-47 (2017).
  17. Wang, C., Wang, C., Clark, K., Sferra, T. Recombinant AAV serotype 1 transduction efficiency and tropism in the murine brain. Gene therapy. 10 (17), 1528(2003).
  18. Ahlgrim, N. S., Manns, J. R. Optogenetic Stimulation of the Basolateral Amygdala Increased Theta-Modulated Gamma Oscillations in the Hippocampus. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 13, 87(2019).
  19. Buzsaki, G., et al. Tools for probing local circuits: high-density silicon probes combined with optogenetics. Neuron. 86 (1), 92-105 (2015).
  20. Benardo, L. S., Prince, D. A. Dopamine action on hippocampal pyramidal cells. Journal of Neuroscience. 2 (4), 415-423 (1982).
  21. Davidow, J. Y., Foerde, K., Galvan, A., Shohamy, D. An Upside to Reward Sensitivity: The Hippocampus Supports Enhanced Reinforcement Learning in Adolescence. Neuron. 92 (1), 93-99 (2016).
  22. Hu, H. Reward and Aversion. Annual Review of Neuroscience. 39, 297-324 (2016).
  23. Kahn, I., Shohamy, D. Intrinsic connectivity between the hippocampus, nucleus accumbens, and ventral tegmental area in humans. Hippocampus. 23 (3), 187-192 (2013).
  24. Lisman, J. E. Relating hippocampal circuitry to function: recall of memory sequences by reciprocal dentate-CA3 interactions. Neuron. 22 (2), 233-242 (1999).
  25. Lisman, J. E., Grace, A. A. The hippocampal-VTA loop: controlling the entry of information into long-term memory. Neuron. 46 (5), 703-713 (2005).
  26. Broussard, J. I., et al. Dopamine Regulates Aversive Contextual Learning and Associated In Vivo Synaptic Plasticity in the Hippocampus. Cell Reports. 14 (8), 1930-1939 (2016).
  27. Hansen, N., Manahan-Vaughan, D. Dopamine D1/D5 receptors mediate informational saliency that promotes persistent hippocampal long-term plasticity. Cerebral Cortex. 24 (4), 845-858 (2014).
  28. Salvetti, B., Morris, R. G., Wang, S. H. The role of rewarding and novel events in facilitating memory persistence in a separate spatial memory task. Learning & Memory. 21 (2), 61-72 (2014).
  29. Ntamati, N. R., Luscher, C. VTA Projection Neurons Releasing GABA and Glutamate in the Dentate Gyrus. eNeuro. 3 (4), (2016).
  30. Yoo, J. H., et al. Ventral tegmental area glutamate neurons co-release GABA and promote positive reinforcement. Nature Communications. 7, 13697(2016).
  31. Funahashi, S. Working Memory in the Prefrontal Cortex. Brain Sciences. 7 (5), (2017).
  32. Luo, A. H., Tahsili-Fahadan, P., Wise, R. A., Lupica, C. R., Aston-Jones, G. Linking context with reward: a functional circuit from hippocampal CA3 to ventral tegmental area. Science. 333 (6040), 353-357 (2011).
  33. McNamara, C. G., Dupret, D. Two sources of dopamine for the hippocampus. Trends in Neurosciences. 40 (7), 383-384 (2017).
  34. McNamara, C. G., Tejero-Cantero, A., Trouche, S., Campo-Urriza, N., Dupret, D. Dopaminergic neurons promote hippocampal reactivation and spatial memory persistence. Nature Neuroscience. 17 (12), 1658-1660 (2014).
  35. Cardin, J. A., et al. Targeted optogenetic stimulation and recording of neurons in vivo using cell-type-specific expression of Channelrhodopsin-2. Nature Protocols. 5 (2), 247-254 (2010).
  36. Mei, Y., Zhang, F. Molecular tools and approaches for optogenetics. Biological Psychiatry. 71 (12), 1033-1038 (2012).
  37. Zingg, B., et al. AAV-Mediated Anterograde Transsynaptic Tagging: Mapping Corticocollicular Input-Defined Neural Pathways for Defense Behaviors. Neuron. 93 (1), 33-47 (2017).
  38. Zhang, F., et al. The microbial opsin family of optogenetic tools. Cell. 147 (7), 1446-1457 (2011).
  39. Aravanis, A. M., et al. An optical neural interface: in vivo control of rodent motor cortex with integrated fiberoptic and optogenetic technology. Journal of Neural Engineering. 4 (3), 143-156 (2007).
  40. Oron, D., Papagiakoumou, E., Anselmi, F., Emiliani, V. Two-photon optogenetics. Progress in Brain Research. 196, 119-143 (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Neurony glutaminergiczne VTAwarstwa CA1 hipokampaznakowanie zale ne od AAVstymulacja optogenetycznaledzenie anterogradoweelektrody o wysokiej impedancjirejestracja wielojednostkowaobrazowanie fluorescencyjnechirurgia stereotaksyjnaoptogenetyka in vivo

Powiązane artykuły