Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Ciągły pomiar szumu biologicznego u Escherichia coli za pomocą mikroskopii poklatkowej

3.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61290

⸱

27 kwietnia 2021

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Technion - Israel Institute of Technology

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ta praca przedstawia metodę mikroskopową, która umożliwia obrazowanie na żywo pojedynczej komórki Escherichia coli w celu analizy i kwantyfikacji stochastycznego zachowania obwodów syntetycznych genów.

Streszczenie

Opracowany tutaj protokół oferuje narzędzie umożliwiające komputerowe śledzenie podziału Escherichia coli i poziomów fluorescencyjnych przez kilka godzin. Proces rozpoczyna się od badań przesiewowych pod kątem kolonii, które przeżywają na minimalnej ilości pożywki, przy założeniu, że tylko Escherichia coli posiadająca prawidłowy plazmid będzie w stanie rozwijać się w określonych warunkach. Ponieważ proces budowy dużych obwodów genetycznych, wymagający złożenia wielu części DNA, jest trudny, składniki obwodów są często rozmieszczone między wieloma plazmidami o różnej liczbie kopii, co wymaga użycia kilku antybiotyków. Mutacje w plazmidzie mogą niszczyć transkrypcję genów oporności na antybiotyki i ingerować w zarządzanie zasobami w komórce, prowadząc do martwicy. Wybraną kolonię umieszcza się na szalce Petriego ze szklanym dnem, a kilka płaszczyzn ostrości wybiera się do śledzenia mikroskopowego zarówno w jasnym polu, jak i w domenach fluorescencyjnych. Protokół utrzymuje ostrość obrazu przez ponad 12 godzin w warunkach początkowych, których nie można regulować, co stwarza kilka trudności. Na przykład martwe komórki zaczynają gromadzić się w polu ostrości soczewek po kilku godzinach obrazowania, co powoduje gromadzenie się toksyn oraz rozmycie i zanik sygnału. Wyczerpanie składników odżywczych wprowadza nowe procesy metaboliczne i utrudnia pożądaną odpowiedź obwodu. Temperatura eksperymentu obniża skuteczność induktorów i antybiotyków, co może jeszcze bardziej zaszkodzić wiarygodności sygnału. Minimalny żel medialny kurczy się i wysycha, w wyniku czego ostrość optyczna zmienia się z czasem. Opracowaliśmy tę metodę, aby przezwyciężyć te wyzwania w przypadku Escherichia coli, podobnie jak w przypadku wcześniejszych prac nad opracowaniem analogicznych metod dla innych mikroorganizmów. Ponadto metoda ta oferuje algorytm do ilościowego określania całkowitego szumu stochastycznego w niezmienionych i zmienionych komórkach, stwierdzając, że wyniki są zgodne z przewidywaniami analizatora przepływu, na co wskazuje podobny współczynnik zmienności (CV).

Wprowadzenie

Biologia syntetyczna to multidyscyplinarna dziedzina, która pojawiła się w ciągu ostatniej dekady i ma na celu przełożenie zasad projektowania inżynierskiego na racjonalne projektowanie biologiczne1,2,3, w celu osiągnięcia integracji i przetwarzania wielu sygnałów w żywych komórkach w celu zrozumienia podstawowych nauk ścisłych4,5, zastosowania diagnostyczne, terapeutyczne i biotechnologiczne6,7,8,9,10. Nasza zdolność do ilościowego określania odpowiedzi wejścia-wyjścia obwodów syntetycznych genów została zrewolucjonizowana przez ostatnie postępy w technologii pojedynczych komórek, w tym analizator przepływu i obrazowanie żywych komórek przy użyciu zautomatyzowanej mikroskopii poklatkowej11. Analizator przepływu jest często używany do pomiaru odpowiedzi tych obwodów w stanie ustalonym1,12, a mikroskopia odwrócona jest używana do pomiaru dynamicznej odpowiedzi obwodów syntetycznych genów na poziomie pojedynczej komórki3. Na przykład jedna z wczesnych prac w biologii syntetycznej obejmowała budowę sieci oscylatorów genetycznych w żywych komórkach przy użyciu pętli ujemnego sprzężenia zwrotnego z opóźnieniem3. Później zastosowano obwody oscylatorów genetycznych, aby zrozumieć kontrolę metaboliczną w dynamicznym środowisku żywych komórek4. Zautomatyzowana mikroskopia poklatkowa jest jedną z metod charakteryzowania takich obwodów. Stawiamy hipotezę, że komórki gospodarza, Escherichia coli, synchronizują się podczas tworzenia mikrokolonii, co pozwala na pomiar sygnału i obliczanie szumu bez śledzenia dokładnych relacji matka-córka.

Szum jest fundamentalnym, nieodłącznym aspektem systemów biologicznych, często pochodzącym z wielu źródeł. Rozważmy na przykład reakcje biochemiczne obejmujące sygnały pochodzące z transportu dyskretnych nośników losowych, takie jak dyfuzja białek13. Sygnały te rozchodzą się z losowymi fluktuacjami14. Innymi źródłami hałasu są dostępność zasobów, podział komórek i zmiany warunków środowiskowych, takich jak temperatura, wilgotność i ciśnienie. Sygnały biologiczne, które rozchodzą się w obwodach syntetycznych genów, często mają bardzo niski stosunek sygnału do szumu (SNR), co zakłóca działanie takich obwodów. Dlatego projektowanie obwodów genetycznych pozostaje jednym z najtrudniejszych aspektów inżynierii genetycznej15. Na przykład, w przeciwieństwie do większości podejść, które obliczają tylko średnią ekspresję genu (mierzoną dla całej populacji komórek), wariancja mierzonego sygnału jest brana pod uwagę w celu zaprojektowania przewidywalnego zachowania za pomocą syntetycznych sieci genów12. W związku z tym poziomy zmienności lub szumu w ekspresji białek odgrywają dominującą rolę w projektowaniu i wydajności analogowych i cyfrowych obwodów genowych1,16,17.

Opracowano wiele podejść do ilościowego określania zmienności między komórkami, w tym w Escherichia coli3,7,18. Metody te są często wykorzystywane do badania aktywacji genów i szlaków metabolicznych, jednak z mniejszym naciskiem na badanie stochastycznej dynamiki szumu, takie jak pomiar i rozplątywanie określonych źródeł hałasu, szczególnie w przypadku obwodów genetycznych w żywych komórkach, gdzie jest to fundamentalne wyzwanie19,20,21. Kilka czynników, zarówno odziedziczonych po samym obwodzie (wewnętrznie), jak i pochodzących z komórek gospodarza (zewnętrznych), może zakłócić ciągłą wydajność obwodów genetycznych. W tym artykule opracowaliśmy protokół, który ma na celu ilościowe określenie całkowitego szumu w komórkach Escherichia coli, w tym wewnętrznych i zewnętrznych źródeł hałasu6,22. Określając ilościowo całkowity szum, a następnie oceniając klasę SNR23, można ulepszyć konstrukcję obwodów genowych. Metodę tę można zmodyfikować tak, aby mierzyć niezależne źródła szumu oddzielnie, monitorując kilka białek fluorescencyjnych6,20. W przypadku opisanego tutaj protokołu utrzymujemy warunki środowiskowe dobrze kontrolowane i stale mierzymy aktywność komórek bez wpływu czynników zewnętrznych. Mierzymy sygnał z białek fluorescencyjnych w pojedynczych komórkach w czasie i jednocześnie obrazujemy je pod substratem agarozowym. Uzyskane obrazy są analizowane przy użyciu niestandardowego programu MATLAB laboratorium.

Idealnie, ciągły pomiar aktywności białek fluorescencyjnych w czasie rzeczywistym wewnątrz komórki dostarczy dokładnych danych poprzez wzrost i podział komórek. Pozyskanie takich danych jest jednak trudne. Wynika to z degradacji białek fluorescencyjnych, znanej jako fotowybielanie7, gdy są one wystawione na promieniowanie w procesie wzbudzenia. Co więcej, komórki Escherichia coli są również wrażliwe na wzbudzenie, co może prowadzić do fototoksyczności7. Obie kwestie ograniczają liczbę ramek do zdjęć, które można nabyć, oraz czas między nabyciami. Kluczową rolę odgrywają również substraty i rodzaje pożywek (np. bulion lizogeniczny), które są używane do wzrostu komórek podczas obrazowania. Zdecydowanie zalecamy użycie minimalnej ilości pożywki, która minimalizuje niefluorescencyjne tło i wydłuża czas podziału komórek.

Ponadto, próbka musi być przygotowana z uwzględnieniem następujących wymagań: (1) Niska szybkość podziału komórek pozwala na rzadsze ekspozycje w celu dokładnego zobrazowania cyklu podziału i zmniejszenia prawdopodobieństwa fototoksyczności i fotowybielania. Ustawiamy czas akwizycji na około połowę przewidywanego czasu mitozy (2) Niska gęstość komórek na początku eksperymentu pozwala na lepszą jednorodność i możliwość śledzenia podziału. Na gęstość komórek ma wpływ współczynnik rozcieńczenia komórek Escherichia coli, który jest istotnym parametrem dla powodzenia tego protokołu i musi być określany dla każdego laboratorium. W celu ustalenia stosunku, każdy nowy szczep Escherichia coli lub pożywka powinna być wyposażona w wykresy szybkości wzrostu (rysunek uzupełniający 1). Odpowiedni stosunek został osiągnięty, jeśli komórki mogą rosnąć bez dodatkowego wstrząsania po krótkiej inkubacji od początkowej gęstości około600 nm = 0,1. Komórki w tej fazie będą się dzielić tylko w zależności od temperatury otoczenia (3) Ograniczenie ruchu komórek: ruch komórek silnie zależy od twardości substratu (podkładki agarozowej). Twardość podłoża zależy od ilości agarozy całkowitej i czasu krzepnięcia żelu. Żeli nie można pozostawić do zestalenia się na noc w temperaturze pokojowej, ponieważ Escherichia coli przejdzie mitozę. Inne czynniki wpływające na stabilność podłoża to ilość wody w próbce i wilgotność. Dodatkowe zagadnienia zostały szczegółowo omówione w Reprezentatywnych wynikach. Protokół ten zawiera wiele szczegółów i stopniowo przechodzi z jednego kroku do drugiego. Protokół zapewnia długą stabilność podczas eksperymentów obrazowych i zapewnia podstawowe narzędzie do przetwarzania obrazu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie mediów i kultury

  1. Przygotować roztwór podstawowy 1000x karbenicyliny (50 mg / ml) lub odpowiedniego antybiotyku.
    1. . Odważyć 0,5 g karbenicyliny. Dodać 10 ml sterylnegoH2O. Całkowicie rozpuścić.
    2. Wysterylizuj bulion karbenicyliny przez filtr strzykawkowy 0,22 μm. Podwielokrotnić roztwór antybiotyku i przechowywać w temperaturze -20 °C.
  2. Aby przygotować płytki bulionu lizogennego (LB), wymieszaj 5 g tryptonu, 5 g NaCl, 2,5 g ekstraktu drożdżowego i 7,5 g agaru Bacto z 0,5 l sterylnegoH2O. Autoklaw roztwór w temperaturze 121 °C przez 20 min.
    1. Częściowo zanurzyć stopioną mieszaninę żelu w łaźni wodnej o temperaturze 50 °C. Dodać 1 000 μl karbenicyliny (50 mg/ml).
    2. Przygotuj szalki Petriego w sterylnym środowisku. Pozostaw talerze do zastygnięcia przed włożeniem ich do lodówki.
  3. W przypadku pożywek o minimalnej ilości M9 należy przygotować oddzielne roztwory podstawowe następujących składników: 5 soli M9 (56,4 g/l), 2 M glukozy i 2% kasaminokwasów wolnych od biotyny. Autoklawować roztwory w temperaturze 121 °C przez 20 min.
  4. Aby przygotować 5 płytek Petriego, wymieszaj 1125 mg niskotopliwego agaru i 400 mg agaru z 89,2 ml minimalnej ilości pożywki (1x M9). Dodać 10 ml 2% casamino acidów (2% [vol/vol]) do kolby Erlenmeyera o pojemności 250 ml.
    UWAGA: Upewnij się, że pożywka została wylana na wewnętrzne wargi kolby.
  5. Podgrzewaj roztwór w kuchence mikrofalowej w krótkich seriach od 3 do 4 sekund. Powtarzaj, aż roztwór będzie klarowny.
    UWAGA: Upewnij się, że nie osiągniesz temperatury wrzenia.
  6. Umieścić kolbę Erlenmeyera o pojemności 250 ml w gorącej łaźni wodnej (60 °C) w celu dalszego wymieszania przez dyfuzję i pozostawić do ostygnięcia, aż jej temperatura spadnie do około 45-50 °C.
  7. Rozpal płomień przy stole do nalewania talerzy.
  8. Dodaj szybko wszystkie roztwory w następującej kolejności:
    800 μL 50% glicerolu (0,4% [obj./ob.])
    100 μl tiaminy (B1)
    1100 μL glukozy (2M)
    100 μl karbenicyliny (50 mg/ml).
  9. Zamieszaj kolbą Erlenmeyera, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie wszystkich składników w agarze .
  10. Otwórz po jednym talerzu na raz obok płomienia i zacznij nalewać.
    1. Pozostaw płytki na stole na kilka minut, aż do początkowego zestalenia.
    2. Odwróć płytki do góry nogami, aby zapobiec kapaniu kondensatu wody na żel.
    3. Pozostaw płytki do zestalenia się w temperaturze pokojowej na około 2 godziny.
    4. Po zestaleniu się i wyschnięciu płytki można je przechowywać w temperaturze 4 °C przez około 3 miesiące.

2. Budowa szczepów bakteryjnych i plazmidów

UWAGA:Obwód genetyczny składa się z jednej części; Zielone Białko Fluorescencyjne (GFP) napędzane przez promotor PtetO, co powoduje konstytutywną ekspresję. Wszystkie plazmidy w tej pracy zostały skonstruowane przy użyciu podstawowych technik klonowania molekularnego i zostały przekształcone w Escherichia coli 10β, przy użyciu standardowego protokołu szoku cieplnego24. Ostateczny konstrukt został przekształcony w szczep Escherichia coli MG1655 typu dzikiego w celu przetestowania.

  1. Przekształć żądany plazmid w komórki Escherichia coli MG1655 za pomocą standardowego protokołu szoku cieplnego24.
  2. Hoduj przekształcone komórki na płytce agarowej LB przez noc w temperaturze 37°C.
    UWAGA: Możliwe jest przechowywanie szalek Petriego od kroku 2.2 do 3 dni do użytku pod mikroskopem.
  3. Zaszczepić pojedynczą kolonię w 5 ml bulionu LB uzupełnionego odpowiednimi antybiotykami w szklanej probówce.
  4. Hodować komórki w temperaturze 37 °C z prędkością wytrząsania 250 obr./min w inkubatorze przez 2 godziny, aż ciecz stanie się mętna.
  5. Przygotować 1 ml roztworu rozcieńczającego w następujący sposób:
    892 μL minimalnej ilości podłoża (1x M9)
    8 μl 50% glicerolu (0,4% [obj./ob.])
    100 μL 2% Casaminokwasów (0,2% [wt/vol])
    1 μl tiaminy (B1)
    11 μL glukozy (2 m)
    1 μl odpowiednich antybiotyków
    1. Wymieszaj i odwiruj.
  6. Rozcieńczyć kulturę komórkową (1:30) od kroku 2.4 do probówki o pojemności 2 ml, dodając 30 μl wzrostu Escherichia coli do 1000 μl roztworu rozcieńczającego (krok 2.5).
  7. Inkubować probówkę przez 1 godzinę z wytrząsaniem (250 obr./min) w temperaturze 37 °C.
  8. Wyhoduj 40 μL - 60 μL na płytkach M9 przygotowanych w kroku 1.10. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez noc.
    UWAGA: Gęstość optyczna (OD600nm) dla galwanizacji powinna wynosić około 0,1.
  9. Na ławce należy umieścić maksymalnie trzy dolne płyty ze szkła o średnicy 35 mm.
    UWAGA: Upewnij się, że szkło płytki ma odpowiednią grubość dla używanych soczewek mikroskopu.
  10. Przygotuj kulturę do wysiewu na płytkach żelowych, powtórz kroki od 2.3 do 2.6 dla kolonii z płytki przygotowanej w kroku 2.9 pomiary mikroskopowe.
  11. Przygotuj następujący roztwór, aby uzyskać trzy płytki mikroskopowe.
    1. Podgrzej łaźnię wodną do temperatury 60 °C.
    2. Zmieszać 112,5 mg niskotopliwego agaru i 40 mg agaru z 8,92 ml minimalnej pożywki (1x M9) i dodać 1 ml 2% casamino acidów (0,2% [vol/vol]) do 25 ml kolby Erlenmeyera.
      UWAGA: Upewnij się, że pożywka została wylana na wewnętrzne wargi kolby.
  12. Podgrzewaj roztwór w kuchence mikrofalowej w krótkich seriach trwających od 2 do 3 sekund. Powtarzaj, aż roztwór będzie klarowny.
    UWAGA: Upewnij się, że nie osiągniesz temperatury wrzenia.
  13. Umieścić kolbę Erlenmeyera o pojemności 25 ml w gorącej łaźni wodnej (60 °C) w celu dalszego mieszania przez dyfuzję i pozostawić do ostygnięcia na ławce, aż jej temperatura spadnie do około 45-50 °C.

3. Przygotowanie płatków agarozowych

  1. Czysta ławka z 70% etanolem. Rozciągnij taśmę na oczyszczonej ławce. Upewnij się, że taśma jest gładka i wypoziomowana.
  2. Przygotuj dwa szkiełka nakrywkowe: jedno na taśmie, a drugie w pobliżu. Przygotuj pokrywę.
  3. Wyjąć kolbę (przygotowaną w kroku 2.14) z łaźni wodnej, wytrzeć zewnętrzną część kolby do czysta i pozostawić do ostygnięcia, aż jej temperatura spadnie do około 45-50 °C.
  4. Aby przygotować roztwór żelu, szybko wymieszaj wszystkie roztwory w następującej kolejności:
    80 μL 50% glicerolu (0,4% [obj./obj.])
    1 ml 2% casaminokwasów (0,2% [wag./obj.])
    10 μl tiaminy (B1)
    110 μL glukozy (2 M)
    10 μl odpowiednich antybiotyków.
  5. Wlej 1,5 ml żelu na szkiełko nakrywkowe i przykryj go drugim kawałkiem, tworząc "kanapkę".
  6. Włóż Erlenmeyera z powrotem do gorącej kąpieli wodnej. Przykryj kanapkę pokrywką i ustaw minutnik na 20 minut.
  7. W tym samym czasie inkubować probówkę z kroku 2.11 przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem (250 obr./min)
  8. Po 20 minutach odwróć kanapkę (krok 3.5), przykryj ją i odstaw na 1 godz<. /> UWAGA: Aby uzyskać lepsze wyniki, pozostaw "kanapkę" do odpoczynku w temperaturze 4 °C na czas kroku 3.8.
  9. Wysiewać nasiona bakterii Escherichia coli z kroku 3.7, pipetując próbkę na szalkę o średnicy 35 mm.
    UWAGA: Pipetowanie 6 μl komórek w postaci oddzielnych małych kropli daje najlepsze wyniki.
  10. Pozostaw krople do wyschnięcia na co najmniej 15 minut i do 30 minut.
  11. Odsłoń zestalony żel kanapki z kroku 3.8, odsuwając szkiełko nakrywkowe.
  12. Pokrój kanapkę na małe pojedyncze podkładki za pomocą stempla lub końcówki do biopsji.
  13. Oprzyj go delikatnie na próbce (krok 3.9). Pozostaw naczynie na 20 minut na ławce.

4. Przygotowanie próbki do obrazowania mikroskopowego

  1. Wyjąć kolbę z łaźni wodnej z punktu 3.6. Wytrzeć zewnętrzną część kolby do czysta i ostudzić do temperatury pokojowej (25 °C).
    UWAGA: Wyjmij kolbę w kroku 4.1 na około 3 minuty przed końcem odliczania.
  2. Wlewaj 3 ml żelu stale na obwód płytki okrężnymi ruchami. Pozostaw na kilka minut do stężenia.
  3. Uszczelnij płytki taśmą i przebij kilka otworów igłą 25 G. Odwróć wszystkie naczynia, aby zapobiec kapaniu kondensatu wody na żel.
  4. Inkubować wszystkie szalki w temperaturze 4 °C przez 30 minut, aby umożliwić pełne zestalenie, jednocześnie zapobiegając mitozie komórek.
    UWAGA: Pozostawić próbki w temperaturze 4 °C do kolejnych pomiarów, nie dłużej niż jeden dzień.
  5. Uruchom mikroskop zgodnie z instrukcjami producenta.
  6. Znajdź początkową ostrość za pomocą obiektywu o najniższym wzmocnieniu i włącz system automatycznego ustawiania ostrości (AFS).
  7. W razie potrzeby użyj oleju, utopij obiektyw w oleju i ostrożnie go rozprowadzając, przesuwając płytkę za pomocą kontrolera platformy (nie ręcznie), a AFS będzie mógł zostać ponownie włączony.
  8. Użyj przekroju względnego w kierunku Z, zgodnie z domyślną sugestią dla przekrojów stopnia Z.
    UWAGA: Wykonywaliśmy zdjęcia jasnego pola co 5 minut, a obrazy fluorescencyjne co 20 minut. Czasami ostrość musi zostać dostosowana w ciągu pierwszych 30 minut. Wstępne podgrzewanie obudowy inkubatora mikroskopu i oleju podczas chłodzenia próbki ma tendencję do zmniejszania początkowej utraty ostrości.

5. Analiza danych

UWAGA: Aby przetwarzać dane mikroskopowe, zaprojektowaliśmy oprogramowanie komputerowe w MATLAB. To oprogramowanie ułatwia identyfikację granic komórek na podstawie obrazów i segmentów tiff w jasnym polu oraz sortowanie komórek według obszaru. Dane wyjściowe tej analizy obrazu można wykorzystać jako maskę na fluorescencyjnych obrazach TIFF w celu określenia poziomów intensywności komórek i wyeliminowania artefaktów w domenie fluorescencyjnej, takich jak halo komórki, ze względu na ograniczenia rozdzielczości mikroskopu. Opracowane oprogramowanie zostało zainspirowane podobnymi pracami7,25,26,27,28,29,30 i zapewnia eleganckie rozwiązanie dostosowane do potrzeb laboratorium.

  1. Najpierw zdefiniuj następujące parametry w main_code.m.
    1. Zdefiniuj folder z obrazami akwizycji.
    2. Zdefiniuj przedział czasu obrazu - krok czasowy kanału jasnego pola w minutach.
    3. Zdefiniuj częstotliwość GFP - szybkość pozyskiwania obrazów GFP.
    4. Określ rozdzielczość mikroskopu (tj. ile pikseli równa się 1 μm).
    5. Zdefiniuj zakres histogramu kosza — zakres obszaru komórki.
      UWAGA: Proces klasyfikowania danych według obszaru komórki jest podobny do zasad bramkowania w analizie danych cytometrii przepływowej. Bramki umieszcza się wokół populacji komórek o wspólnych cechach, zwykle rozproszonych do przodu i rozproszonych bocznie, w celu wyizolowania i ilościowego określenia tych interesujących populacji. Mikroskopia pozwala na bramkowanie, badanie i ilościowe określanie kilku grup komórek.
    6. Zdefiniuj jądro konwolucyjne (3,3) - ten parametr wykrywa granice komórek poprzez globalne progowanie (count_cells.m).
      UWAGA: Ta konfiguracja jest potrzebna tylko w przypadku wymiany laboratorium lub mikroskopu. Oprogramowanie wymaga, aby wejściowy kanał jasnego pola był oznaczony indeksem c1, kanał fluorescencyjny oznaczony jako c2.
  2. Uruchom polecenie main_code.m, co spowoduje automatyczne uruchomienie wszystkich innych skryptów (count_cells.m, cell_growth_rate.m).
    1. Program automatycznie segmentuje obrazy w jasnym polu (patrz rysunek uzupełniający 2-4).
    2. Połącz obraz segmentacyjny z obrazem fluorescencyjnym (GFP), aby wyodrębnić poziom intensywności dla każdej komórki.
    3. Oblicz wykres liczby komórek w czasie i dopasuj zgodnie ze wzrostem wykładniczym.
    4. Oblicz średnią i odchylenie standardowe (STD) dla każdego zakresu obszaru komórki.
    5. Oblicz stosunek sygnału do szumu (SNR) dla każdego zakresu obszaru komórki.
    6. Wykreśl i dopasuj rozkład liczby komórek według intensywności.
    7. Oblicz współczynnik wariancji (CV) i porównaj z danymi z analizatora przepływu.
      UWAGA: Oprogramowanie poda jako dane wyjściowe końcowe obrazy segmentacji do dostosowania conv_kernel w nowym folderze "twójfolder/Segmentowany". Oprogramowanie poda jako dane wyjściowe wykresy w nowym folderze "twójfolder/Wykresy".
  3. Aby porównać eksperymenty, użyj compare_experiments.m.
    1. Zdefiniuj katalogi dla zapisanych wykresów i adres katalogu \CompareResult.
    2. Uruchom plik.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Oprogramowanie analizuje obrazy w polu jasnym, które są w kolorze biało-szarym i czarnym. Escherichia coli będzie wyglądać jak czarne wydłużone kształty na biało-szarym tle, a zakres dynamiki luminancji powinien wykazywać szczyt w centrum (Rysunek 1). Na obrazach fluorescencyjnych komórki mogą mieć niewielkie halo, jednak poszczególne komórki o wydłużonym kształcie nadal powinny być rozróżnialne. Zdarzenie mitotyczne powinno zostać wykryte po raz pierwszy po 30 minutach. Ostrość mik...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W niniejszej pracy opracowaliśmy protokół umożliwiający komputerowe śledzenie żywych komórek Escherichia coli, z uwzględnieniem podziałów komórkowych oraz poziomów fluorescencji w okresie wielu godzin. Protokół ten pozwala nam na ilościowe określenie stochastycznej dynamiki obwodów genetycznych w Escherichia coli poprzez pomiar CV i SNR w czasie rzeczywistym. W ramach tego protokołu porównaliśmy zachowania stochastyczne dwóch różnych obwodów, przedstawione na Rysunku 10. Wykazano, że pl...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy Panu Gilowi Gelbertowi (Wydział Inżynierii Elektrycznej, Technion) za pomoc przy kodzie MATLAB. Dziękujemy dr Ximing Li (Wydział Inżynierii Biomedycznej, Technion) za pomoc w weryfikacji tego artykułu. Badania te były częściowo wspierane przez Fundację Rodziny Neubauerów i izraelskie Ministerstwo Nauki, grant 2027345.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Czasza szklana 35mmmattekP35G-0,170-14-Co grubości odpowiadającej soczewce mikroskopu.
Agaroza Przygotowanie Lonza5004LB
AHL InduktorSigma-AldrichK3007
Bacto trypton BD - Becton, Dickinson i Spółka 211705LB przygotowanie
CarbInvitrogen10177-012antybiotyk
CarbFormediumCAR0025antybiotyk
Casaminokwasy BD - Becton, Dickinson i Spółka 223050minimalny roztwór podłoża
odwróconyeclipse Tinikon
GlukozaSigma-AldrichG5767minimalny roztwór podłoża
GlyserolBio-Lab000712050100minimalne podłoże
Immersol 518Fzeiss4449600000000olejek immersyjny
M9 roztwór soli Sigma-AldrichM6030minimalny roztwór podłoża
NaClBio-Lab214010LB przygotowanie
Szlachetny agarSigma-AldrichA5431minimalny substrat podłoża
taśma parafilmowaBemisPM-996określany jako taśma w tekście
Seaplaque GTG AgaroseLonza50111minimalne podłoże
podłoża tajamina B1Sigma-AldrichT0376 Rozwiązanie z minimalną ilością nośników
Ekstrakt drożdżowyBD - Becton, Dickinson and Company Przygotowanie 212750LB
mikroskop

Bibliografia

  1. Daniel, R., Rubens, J. R., Sarpeshkar, R., Lu, T. K. Synthetic analog computation in living cells. Nature. 497, 619-623 (2013).
  2. Yang, X. S. Y., L, A. B. Imaging Bacterial Molecules, Structures and Cells. Harwood, C., Jensen, G. , (2016).
  3. Joyce, G., Robertson, B. D., Williams, K. J. A modified agar pad method for mycobacterial live-cell imaging. Biomedcentral Research Notes. , (2011).
  4. Cotlet, M., Goodwin, P. M., Waldo, G. S., Werner, J. H. A comparison of the fluorescence dynamics of single molecules of a green fluorescent protein: One- versus two-photon excitation. ChemPhysChem. , (2006).
  5. Andersen, J. B., et al. New unstable variants of green fluorescent protein for studies of transient gene expression in bacteria. Applied and Environmental Microbiology. 64, 2240-2246 (1998).
  6. Barger, N., Litovco, P., Li, X., Habib, M., Daniel, R. Synthetic metabolic computation in a bioluminescence-sensing system. Nucleic Acids Research. , (2019).
  7. Young, J. W., et al. Measuring single-cell gene expression dynamics in bacteria using fluorescence time-lapse microscopy. Nature Protocols. , (2012).
  8. Swain, P. S., Elowitz, M. B., Siggia, E. D. Intrinsic and extrinsic contributions to stochasticity in gene expression. Proceedings of the National Academy of Science United States. , (2002).
  9. Elowitz, M. B., Levine, A. J., Siggia, E. D., Swain, P. S. Stochastic gene expression in a single cell. Science. , (2002).
  10. Baumgart, L., Mather, W., Hasty, J. Synchronized DNA cycling across a bacterial population. Nature Genetics. , (2017).
  11. Arriaga, E. A. Determining biological noise via single cell analysis. Analytical and Bioanalytical Chemistry. , (2009).
  12. Nielsen, A. A. K., et al. Genetic circuit design automation. Science. , (2016).
  13. Ozbudak, E. M., Thattai, M., Kurtser, I., Grossman, A. D., van Oudenaarden, A. Regulation of noise in the expression of a single gene. Nature Genetics. 31, 69-73 (2002).
  14. Pedraza, J. H., Van Oudenaarden, A. Noise propagations in gene networks. Science. , (2005).
  15. Jennifer, A. N. B., Christopher, A. V. Principles of genetic circuit design. Nature Methods. , (2014).
  16. Aoki, S. K., et al. A universal biomolecular integral feedback controller for robust perfect adaptation. Nature. , (2019).
  17. Hanna, H. A., Danial, L., Kvatinsky, S., Daniel, R. Cytomorphic Electronics with Memristors for Modeling Fundamental Genetic Circuits. 4545, (2020).
  18. de Jong, I. G., Beilharz, K., Kuipers, O. P., Veening, J. W. Live cell imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using automated time-lapse microscopy. Journal of Visualized Experiments. , (2011).
  19. Eling, N., Morgan, M. D., Marioni, J. C. Challenges in measuring and understanding biological noise. Nature Reviews Genetics. , (2019).
  20. Thattai, M., Van Oudenaarden, A. Attenuation of noise in ultrasensitive signaling cascades. Biophysical Journal. , (2002).
  21. Thattai, M., Van Oudenaarden, A. Intrinsic noise in gene regulatory networks. Proceedings of the National Academy of Science United States. , (2001).
  22. Rosenfeld, N., Young, J. W., Alon, U., Swain, P. S., Elowitz, M. B. Gene regulation at the single-cell level. Science. , (2005).
  23. Van Der Ziel, A. Noise in Measurements. , Wiley & Sons Inc. (1976).
  24. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular cloning: A laboratory manual. 2nd Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press. , (1989).
  25. Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: Image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biology. , (2006).
  26. Paintdakhi, A., et al. Oufti: An integrated software package for high-accuracy, high-throughput quantitative microscopy analysis. Molecular Microbiology. , (2016).
  27. Ducret, A., Quardokus, E. M., Brun, Y. V. MicrobeJ, a tool for high throughput bacterial cell detection and quantitative analysis. Nature Microbiology. , (2016).
  28. Stylianidou, S., Brennan, C., Molecular, S. B. N. SuperSegger: robust image segmentation, analysis and lineage tracking of bacterial cells - Stylianidou - 2016 - Molecular Microbiology. , Wiley Online Library. (2016).
  29. Balomenos, A. D., et al. Image analysis driven single-cell analytics for systems microbiology. Biomedcentral System Biology. , (2017).
  30. Smit, J. H., Li, Y., Warszawik, E. M., Herrmann, A., Cordes, T. Colicoords: A Python package for the analysis of bacterial fluorescence microscopy data. PLoS One. , (2019).
  31. Guido, N. J., et al. A bottom-up approach to gene regulation. Nature. , (2006).
  32. Beal, J. Signal-to-noise ratio measures efficacy of biological computing devices and circuits. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. , (2015).
  33. Marr, D., Hildreth, E. Theory of edge detection. Proceedings of the Royal Society - Biology Science. 207, 187-217 (1980).
  34. Otsu, N. Threshold selection method from gray-level histograms. IEEE Transactions Systems Man Cybernetics. , (1979).
  35. Soille, P. Morphological Image Analysis: Principles and Applications, Second edition. , (2000).
  36. Bradley, D., Roth, G. Adaptive Thresholding using the Integral Image. Journal of Graphics Tools. , (2007).
  37. Meyer, F. Topographic distance and watershed lines. Signal Processing. , (1994).
  38. Maurer, C. R., Qi, R., Raghavan, V. A linear time algorithm for computing exact Euclidean distance transforms of binary images in arbitrary dimensions. IEEE Transactions on Pattern Analysis and Machine. , (2003).
  39. Millo, R., Phillips, R. What is the maturation time for fluorescent proteins. Cell Biology by Numbers. , (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

obwody genetycznereporter fluorescencyjnymikroskopia konfokalnastosunek sygna u do szumupod o e minimalneprzesiewanie koloniiel agarozowy
Ciągły pomiar szumu biologicznego u Escherichia coli za pomocą mikroskopii poklatkowej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.