Artykuł metodologiczny

Modelowanie pierwotnych guzów kości i przerzutów do kości z implantacją przeszczepu guza litego do kości

DOI:

10.3791/61313

⸱

9 września 2020

 ,  , 
1Department of Pathology and O'Neal Comprehensive Cancer Center, University of Alabama at Birmingham, 2Surgical Discovery Centre, Department of Veterinary Medicine, University of Cambridge

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Modele przerzutów do kości nie rozwijają przerzutów równomiernie ani ze 100% częstością. Bezpośrednie wstrzyknięcie do komórek nowotworowych kości może spowodować embolizację płuc. Przedstawiamy naszą technikę modelowania pierwotnych guzów kości i przerzutów do kości z wykorzystaniem implantacji przeszczepu guza litego do kości, prowadzącej do powtarzalnego wszczepienia i wzrostu.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pierwotne guzy kości lub przerzuty do kości z guzów litych powodują bolesne zmiany osteolityczne, osteoblastyczne lub mieszane osteolityczno-osteoblastyczne. Zmiany te upośledzają strukturę kości, zwiększają ryzyko złamań patologicznych i pozostawiają pacjentów z ograniczonymi możliwościami leczenia. Pierwotne guzy kości dają przerzuty do odległych narządów, przy czym niektóre typy mogą rozprzestrzeniać się na inne miejsca szkieletowe. Jednak ostatnie dowody sugerują, że w przypadku wielu guzów litych komórki rakowe, które rozprzestrzeniły się do kości, mogą być głównym źródłem komórek, które ostatecznie dają przerzuty do innych układów narządów. Większość mysich modeli syngenicznych lub ksenoprzeszczepów pierwotnych guzów kości obejmuje dokostne (ortotopowe) wstrzyknięcie zawiesin komórek nowotworowych. Niektóre zwierzęce modele przerzutów do szkieletu z guzów litych zależą również od bezpośredniego wstrzyknięcia do kości, podczas gdy inne próbują odtworzyć dodatkowe etapy kaskady przerzutów do kości poprzez wstrzyknięcie komórek donaczyniowo lub do narządu guza pierwotnego. Jednak w żadnym z tych modeli przerzuty do kości nie rozwijają się niezawodnie lub z częstością 100%. Ponadto wykazano, że bezpośrednie wstrzyknięcie komórek nowotworowych do kości wiąże się z potencjalną embolizacją guza płuca. Te zatorowe komórki nowotworowe wszczepiają się, ale nie rekapitulują kaskady przerzutowej. Opisaliśmy mysi model kostniakomięsaka, w którym świeże lub kriokonserwowane fragmenty guza (składające się z komórek nowotworowych i zrębu) są wszczepiane bezpośrednio do bliższej części kości piszczelowej przy użyciu minimalnie inwazyjnej techniki chirurgicznej. U tych zwierząt rozwinęło się powtarzalne wszczepienie, wzrost, a z czasem osteoliza i przerzuty do płuc. Technika ta jest na tyle wszechstronna, że może być stosowana do modelowania przerzutów do kości guza litego i może z łatwością wykorzystywać przeszczepy składające się z jednego lub wielu typów komórek, komórek zmodyfikowanych genetycznie, ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjenta i / lub znakowanych komórek, które można śledzić za pomocą obrazowania optycznego lub zaawansowanego. Tutaj demonstrujemy tę technikę, modelując pierwotne guzy kości i przerzuty do kości za pomocą implantacji przeszczepu guza litego do kości.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mysie modele chorób ludzkich i zwierzęcych stają się coraz bardziej popularne w badaniach biomedycznych. Użyteczność używania myszy w tym kontekście polega na tym, że ich anatomia i fizjologia są bardzo podobne do ludzi. Mają stosunkowo krótki okres ciąży i czas w życiu poporodowym, aby osiągnąć dojrzałość, i są w dużej mierze związane ze stosunkowo niskimi kosztami i łatwością utrzymania, chociaż rosnące koszty rozwoju lub zakupu wiążą się z większym stopniem modyfikacji genetycznej, niedoborem odporności i/lub humanizacją1. Stosowanie szczepów wsobnych skutkuje w dużej mierze jednolitą populacją zwierząt przed włączeniem do badania. Pełna wiedza na temat ich genomu sugeruje wysoki stopień podobieństwa do ludzi. Ortologiczne cele molekularne dla wielu procesów chorobowych zostały zidentyfikowane w genomie myszy i obecnie istnieje obszerna biblioteka odczynników specyficznych dla myszy, które są łatwo dostępne. W związku z tym dają one możliwość przeprowadzenia analizy o stosunkowo wysokiej przepustowości w szybszy i tańszy sposób w porównaniu z większymi modelami zwierzęcymi1. Ponadto, wraz z pojawieniem się strategii edycji genetycznej, która pozwala na nadekspresję lub delecję niektórych genów, zarówno globalnie, jak i w sposób specyficzny dla typu komórki i/lub konstytutywnie lub w sposób indukowalny, stanowią one bardzo biologicznie użyteczny system modelowy do badania chorób ludzi i zwierząt2.

Rak to jedna z dziedzin, w której modele myszy mają wielką użyteczność. Genetyczne mysie modele raka opierają się na modulacji ekspresji onkogenów lub genów supresorowych nowotworów, samodzielnie lub w połączeniu, aby komórki mogły przejść transformację onkogenną. Wykonuje się również wstrzyknięcie pierwotnych lub ustalonych linii komórek nowotworowych myszom. Wprowadzenie linii komórkowych lub tkanek pochodzących od ludzi lub innych gatunków zwierząt, w tym myszy, pozostaje najpowszechniej stosowanym modelem raka in vivo. Najczęściej stosuje się komórki i tkanki różnych gatunków (ksenoprzeszczepy) u myszy z obniżoną odpornością2. Jednak użycie komórek lub tkanek nowotworowych przeszczepu allogenicznego, w których zarówno gospodarz, jak i biorca należą do tego samego gatunku, pozwala na interakcję z nienaruszonym układem odpornościowym w połączeniu z tym samym szczepem myszy gospodarza w systemach syngenicznych3.

Pierwotne guzy kości lub przerzuty do kości z guzów litych powodują bolesne zmiany osteolityczne, osteoblastyczne lub mieszane osteolityczno-osteoblastyczne3,4. Guzy te upośledzają strukturę kości, zwiększając ryzyko złamań patologicznych i pozostawiając pacjentów z ograniczonymi możliwościami leczenia. Pierwotne guzy kości dają przerzuty do odległych narządów, przy czym niektóre typy mogą rozprzestrzeniać się na inne miejsca szkieletowe. U pacjentek z rakiem piersi kość jest najczęstszym miejscem pierwszego przerzutu i najczęstszym pierwszym miejscem prezentacji choroby przerzutowej5,6. Ponadto rozsiane komórki nowotworowe (DTC) są obecne w szpiku kostnym przed rozpoznaniem i przewidują rozwój przerzutów w innych narządach7. Dlatego uważa się, że komórki rakowe obecne w kościach są źródłem komórek, które ostatecznie dają przerzuty do innych układów narządów. Istnieje wiele mysich modeli przerzutów do guzów litych, u których przerzuty rozwijają się głównie w płucach i węzłach chłonnych, a w zależności od rodzaju guza i techniki iniekcji, potencjalnie inne układy narządów3. Brakuje jednak mysich modeli przerzutów do kości, które niezawodnie, powtarzalnie wytwarzają przerzuty do szkieletu specyficzne dla danego miejsca i rozwijają przerzuty do kości, zanim myszy osiągną kryteria wczesnego usuwania z pierwotnego obciążenia guzem lub przerzutów do innych narządów. Opisaliśmy model kostniakomięsaka pierwotnego guza kości, który opiera się na chirurgicznym wszczepieniu alloprzeszczepu guza litego do bliższej części kości piszczelowej myszy8. Guzy kości powstały u 100% myszy, a u 88% rozwinęły się przerzuty do płuc. Ta częstość występowania przerzutów przekracza to, co jest powszechnie zgłaszane klinicznie u ludzi (~20-50%), ale jest bardzo interesująca, ponieważ płuca są najczęstszym miejscem przerzutów kostniakomięsaka9,10,11. Chociaż model ten jest korzystny w modelowaniu pierwotnych guzów kości, ma również duże zastosowanie w modelowaniu przerzutów do kości z innych osteotropowych guzów litych, takich jak nowotwory piersi, płuc, prostaty, tarczycy, wątroby, nerek i przewodu pokarmowego.

Uzasadnieniem dla rozwoju tego modelu było opracowanie alternatywy dla tradycyjnego iniekcji dokostnicznej, zazwyczaj do bliższej części kości piszczelowej lub dystalnej kości udowej, aby modelować pierwotne guzy kości lub przerzuty do kości12. Naszym głównym celem było złagodzenie znanego ograniczenia tej techniki, tj. embolizacji guza płuca. Powoduje to wszczepienie tych zatorowych komórek nowotworowych i "sztuczne przerzuty", które nie rekapitulują całej kaskady przerzutów z ustalonego pierwotnego guza kości, który daje przerzuty do płuc8,13. Miałoby to również miejsce, gdyby stwierdzone przerzuty do kości rozprzestrzeniły się na odległe miejsce. Ponadto technika ta została również opracowana w celu stworzenia modelu przerzutów do kości, który zapewniłby większą częstość występowania przeszczepów i wzrostu guzów w kościach i w jednolitym miejscu w porównaniu z technikami iniekcyjnymi ortotopowymi lub wewnątrznaczyniowymi. Model ten ma wyraźną przewagę nad opisanymi technikami. Model ten polega na kontrolowanym, konsekwentnym dostarczaniu komórek nowotworowych do kości. Pozwala również uniknąć sztucznych przerzutów do płuc po embolizacji płuc i ustanawia wyjściową jednolitą populację badaną. W tym modelu istnieje korzyść z guzów specyficznych dla miejsca bez ryzyka wczesnych kryteriów usunięcia wynikających z guzów pierwotnych lub przerzutów do innych narządów. Wreszcie, model ten ma dużą użyteczność do modyfikacji, w tym do wykorzystania ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów.

Prezentowany model ma podobieństwa do bezpośredniego wstrzykiwania zawiesiny komórkowej do kości po podejściu chirurgicznym, po którym następuje wstrzyknięcie przez korę lub dostarczenie do jamy szpiku po wykonaniu małego defektu w korze (z lub bez rozwiercenia jamy rdzeniowej)8,14,15,16,17. Jednak wszczepienie alloprzeszczepu guza sprawia, że technika ta jest wyraźnie inna. Dlatego celem niniejszego artykułu było zademonstrowanie tego modelu pierwotnych guzów kości i przerzutów do kości z guzów litych, który pokonuje wiele ograniczeń wcześniej opisanych modeli. Grupy badawcze z doświadczeniem w hodowli komórek, modelach mysich, anestezjologii i chirurgii myszy oraz anatomii myszy są dobrze przygotowane do odtworzenia naszej techniki modelowania pierwotnych guzów kości lub przerzutów do kości u myszy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie opisane eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami i użytkowania Uniwersytetu Cambridge, Cambridge, Wielka Brytania.

1. Przygotowanie linii komórkowych

  1. Hoduj linie komórkowe zgodnie ze standardowymi protokołami hodowli komórkowych laboratorium dla tradycyjnej hodowli komórkowej lub wstrzykiwania myszom. Standardowe protokoły stosowane w tym przypadku to wzrost w zmodyfikowanej pożywce Eagle's firmy Dulbecco, zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), L-glutaminę i penicylinę/streptomycynę (zwaną dalej kompletną pożywką wzrostową).
    UWAGA: W tym eksperymencie komórki kostniakomięsaka Abramsa są używane u myszy Balb / c Foxn1 nu / nu. Do badań nad rakiem piersi wykorzystuje się komórki 4T1 u myszy Balb / c i komórki EO771 u myszy C57BL / 6.
  2. Hodować komórki w wentylowanych kolbach do hodowli tkankowych lub 6-dołkowych płytkach do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C w 5% CO2 .
  3. Przejdź przez linię komórkową będącą przedmiotem zainteresowania i przygotuj komórki do wstrzyknięcia, gdy komórki osiągną zbieg powszechnie stosowany przy wstrzykiwaniu tych komórek myszom.

2. Zwierzęta

  1. Myszy Balb/c Foxn1 nu/nu należy stosować w wieku co najmniej 6-8 tygodni do podskórnego wytwarzania guza, aby upewnić się, że zwierzęta są poza fazą szybkiego wzrostu i osiągnęły dorosłość i dojrzałość kostną.
  2. Użyj myszy płci męskiej lub żeńskiej. Zrób wyjątki przy wyborze linii komórkowych reagujących na hormony (np. komórki raka piersi u samic myszy i komórki raka prostaty u samców myszy).
  3. Do eksperymentów z ksenoprzeszczepami należy użyć nagich myszy z niedoborem odporności w oparciu o to, że linia komórkowa jest niekompatybilna z nienaruszonym układem odpornościowym myszy w normalnych warunkach.
  4. W przypadku eksperymentów z przeszczepami allogenicznymi z wykorzystaniem mysich linii komórkowych jest to również zalecane w oparciu o różne tła genetyczne i immunologiczne myszy. Jednak do eksperymentów syngenicznych należy używać zwierząt tego samego szczepu, co linia komórkowa będąca przedmiotem zainteresowania.
  5. Zwierzęta domowe o standardowym zagęszczeniu w zależności od polityki hodowlanej instytucji.

3. Guzy podskórne

  1. Zbierz linie komórkowe z hodowli przez trypsynizację i ponownie zawieś w sterylnym roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS).
  2. Ocenić żywotność komórek i określić gęstość komórek metodą wykluczania błękitu trypanowego. Użyj hemocytometru lub automatycznego licznika komórek, aby policzyć komórki. Minimalna żywotność komórek wynosząca 90% ma być używana do wstrzykiwania myszom w celu wytworzenia guzów podskórnych.
  3. Dostosuj gęstość komórek, aby wstrzyknąć 1-2 x 105 komórek w końcowej objętości od 0,1 do 0,15 ml (100 do 150 μl) sterylnego PBS. Utrzymuj komórki na lodzie do momentu wstrzyknięcia.
  4. Alternatywnie, granulki należy rozdrabniać przez odwirowanie przy 800 x g przez 5 minut. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić granulowane komórki w nierozcieńczonym sterylnym podłożu z membraną podstawną, aby uzyskać 1-2 x 105 komórek w końcowej objętości od 0,1 do 0,15 ml (100 do 150 μl). Trzymaj komórki na lodzie do czasu dalszego użycia.
  5. Znieczulenie myszy do stosowania w celu podskórnego wzrostu guza za pomocą izofluranu w znieczuleniu tlenowym. Stosować dawkę indukcyjną 5% izofluranu w 2 l/min tlenu i dawkę podtrzymującą 2-3% izofluranu w 2 l/min tlenu. Sprawdź, czy nie ma mrugania lub odruchów pedałowania, zanim przejdziesz dalej.
    UWAGA: Izofluran jest środkiem znieczulającym podawanym wziewnie. Używaj izofluranu w dobrze wentylowanym pomieszczeniu z odpowiednimi systemami oczyszczania i swobodnego zbierania gazów. Należy skonsultować się z personelem weterynaryjnym w celu opracowania planu indukcji, utrzymania i monitorowania znieczulenia oraz upewnić się, że personel laboratoryjny został odpowiednio przeszkolony w zakresie monitorowania znieczulenia i obchodzenia się z wziewnymi środkami znieczulającymi.
  6. Usuń włosy z grzbietowej części klatki piersiowej lub brzucha znieczulonych myszy za pomocą roztworu do depilacji lub maszynki do strzyżenia elektrycznego. Preferowane jest rozwiązanie do depilacji, aby zminimalizować potencjalne urazy skóry. Pomiń ten krok, jeśli używasz atymicznych nagich myszy.
  7. Oczyść przygotowany obszar wacikiem z 70% etanolu przed wstrzyknięciem zawiesiny komórek.
  8. Za pomocą strzykawki tuberkulinowej o pojemności 1 ml z igłą o sile 27 G wstrzyknąć komórki podskórnie w obszar grzbietowy klatki piersiowej lub brzucha, tak aby ruch łopatek nie miał na nie wpływu. Alternatywnie, wstrzyknąć komórki podskórnie jako zawiesinę do dostępnej w handlu macierzy zewnątrzkomórkowej.
    UWAGA: Wstrzyknięcie do dostępnej na rynku macierzy zewnątrzkomórkowej ograniczy migrację zawiesiny komórkowej w przestrzeni podskórnej, ponieważ matryce te krzepną w temperaturze pokojowej.
  9. Odzyskaj myszy na poduszce grzewczej w indywidualnych klatkach do czasu rozpoczęcia chodzenia. Myszy można następnie umieścić w normalnych klatkach z czystą, suchą ściółką.
  10. Monitoruj wielkość guza podskórnego pokrywającego grzbietową klatkę piersiową lub brzuch za pomocą suwmiarki i mierz masę ciała co tydzień, aby upewnić się, że guzy podskórne nie owrzodzą lub myszy spełniają kryteria wczesnego usuwania, zgodnie z ustaleniami komitetu ds. opieki nad zwierzętami i ich wykorzystania. Zaleca się maksymalny rozmiar guza 15 mm w dowolnym wymiarze, aby zmniejszyć ryzyko owrzodzenia skóry lub martwicy guza centralnego.
    UWAGA: Zapoznaj się z lokalnymi wytycznymi, aby określić maksymalny dopuszczalny rozmiar/objętość guza.
  11. Eutanazja myszy z guzami podskórnymi po trzech do czterech tygodniach przez wdychanie CO2 , a następnie zwichnięcie szyjki macicy. Postępuj zgodnie z akceptowalnymi zasadami instytucji dotyczącymi eutanazji myszy.
  12. Zbierz guzy podskórne przy użyciu aseptycznej techniki chirurgicznej. Wysterylizuj skórę pokrywającą guz, jak poprzednio, 70% etanolem po usunięciu włosów (jeśli dotyczy). Naciąć skórę pokrywającą guz za pomocą ostrza skalpela #15 (z rękojeścią ostrza skalpela lub bez). Ostro wypreparuj guz z otaczających przyczepionych tkanek miękkich za pomocą sterylnych nożyczek chirurgicznych.
  13. Umieść guz na 6-dołkowych płytkach do hodowli tkankowej zawierających kompletną pożywkę wzrostową i zmiel na wiele małych fragmentów o określonym rozmiarze (~ 0,6 mm x 0,6 mm x 0,6 mm – 0,25 mm,3 do 1 mm x 1 mm x 1 mm – 1 mm3) za pomocą ostrza skalpela #15 (z rękojeścią ostrza skalpela lub bez).
  14. Utrzymuj fragmenty guza w sterylnej, kompletnej pożywce wzrostowej w temperaturze pokojowej do czasu implantacji piszczelowej. W przypadku linii komórkowych, które przenoszą lucyferazy lub fluorescencyjne geny reporterowe, należy użyć obrazowania bioluminescencyjnego lub fluorescencyjnego ex vivo, aby potwierdzić żywotność guza przed implantacją piszczelową myszom.
  15. W celu kriokonserwacji umieść wiele fragmentów w tym samym kriowiale w kompletnym pożywce wzrostowej uzupełnionej 20% FBS i 10% dimetylosulfotlenku (DMSO). Zamrażać stopniowo za pomocą komercyjnego systemu kriokonserwacji w temperaturze –80 °C i przechowywać przez długi czas w ciekłym azocie. Zachowaj fragmenty guza do późniejszej analizy, ale nie do przyszłej implantacji, poprzez szybkie zamrażanie przy użyciu zanurzenia w ciekłym azocie. Zamrożone fragmenty guza należy przechowywać przez długi czas w temperaturze –80 °C.
    UWAGA: Wcześniej informowano, że zamrożone guzy nie będą się wszczepiać i rosnąć in vivo8.

4. Chirurgiczne wszczepienie fragmentów guza podskórnego

  1. Przed implantacją chirurgiczną doprowadzić świeże lub kriokonserwowane fragmenty guza podskórnego do temperatury pokojowej w kompletnym pożywce wzrostowej.
  2. Znieczulić myszy ze szczepu będącego przedmiotem zainteresowania za pomocą izofluranu w znieczuleniu tlenowym, jak opisano w sekcji 3. Przed kontynuowaniem sprawdź, czy nie ma odruchów pedałowania. Buprenorfinę podawać podskórnie w dawce 0,02-0,05 mg/kg mc. w celu zapewnienia znieczulenia okołooperacyjnego. W razie potrzeby można to powtarzać co 6-8 godzin w okresie pooperacyjnym.
  3. Usuń włosy z prawego stawu kolanowego i bliższej części piszczeli kończyny tylnej za pomocą roztworu do depilacji, aby zminimalizować potencjalny uraz skóry.
  4. Przygotowany obszar wyszoruj chirurgicznym środkiem antyseptycznym. Najpierw wyszoruj wacikiem z 70% etanolu, a następnie wyszoruj naprzemiennie chlorheksydyną i peelingiem solnym.
  5. Wyobraź sobie bliższą kość piszczelową jako obszar dystalny do stawu kolanowego podczas zginania i rozciągania stawu.
  6. Wykonaj nacięcie o średnicy 3-4 mm na poziomie bliższej części kości piszczelowej na przyśrodkowej stronie kończyny za pomocą ostrza skalpela #15 (z rękojeścią ostrza skalpela lub bez). Naciąć skórę i tkankę podskórną, aby odsłonić korę przyśrodkową bliższej kości piszczelowej.
  7. Delikatnie dociśnij końcówką igły o masie 25 G, jednocześnie obracając końcówkę, aby utworzyć mały otwór w korze przyśrodkowej bliższej kości piszczelowej. Wykonaj ten otwór około 2 mm dystalnie do stawu kolanowego w punkcie równoodległym między korą piszczelową czaszki i ogona. Wybierz rozmiar igły w zależności od wielkości fragmentów guza.
  8. Użyj sterylnych kleszczy, aby podnieść i wprowadzić fragmenty guza do jamy rdzeniowej bliższej części kości piszczelowej. Użyj igły o wadze od 27 do 30 G, aby manipulować fragmentem guza w kanale szpikowym. W zależności od wielkości fragmentów guza, wszczepić co najmniej 0,5 mm3 całkowitej objętości guza do każdej kości piszczelowej. Może to wymagać implantacji 1 lub więcej fragmentów guza w zależności od wielkości utworzonych fragmentów guza.
    UWAGA: Modyfikacje mające na celu zapobieżenie lub ograniczenie przemieszczenia przeszczepu na zewnątrz kości polegałyby na umieszczeniu wosku kostnego lub cementu kostnego w ubytku kostnym lub piance żelowej lub podskórnym przeszczepie tłuszczu nad otworem w kości.
  9. Przymocuj krawędzie skóry za pomocą sterylnego płynnego kleju tkankowego lub pojedynczego szwu skórnego. Nie używaj klipsów do ran w tej witrynie. Należy zachować ostrożność podczas korzystania z obrazowania fluorescencyjnego w okresie pooperacyjnym, ponieważ zarówno kleje tkankowe, jak i szewy mogą ulegać fluorescencji.
  10. Odzyskaj myszy na poduszce grzewczej w indywidualnych klatkach do czasu rozpoczęcia chodzenia.

5. Ocena punktu szeregowego i końcowego

  1. Znieczulenie myszy za pomocą izofluranu w znieczuleniu tlenem, jak opisano wcześniej.
  2. Oceń nieinwazyjny wzrost guza piszczelowego za pomocą cotygodniowej radiografii cyfrowej, bioluminescencji lub obrazowania fluorescencyjnego (jeśli używasz komórek eksprymujących lucyferazy lub fluorescencyjnego genu reporterowego). Pomiary suwmiarki kończyny w miejscu implantacji można również wykonać u wybudzonych myszy.
  3. Oprócz tradycyjnego monitorowania myszy z nowotworem (masa ciała, poziom aktywności, częstość oddechów, pielęgnacja, postawa, odżywianie i zachowanie) monitoruj myszy co tydzień pod kątem oznak kulawizny kończyn tylnych, obrzęku i infekcji miejsca operowanego.
  4. Monitoruj ranę chirurgiczną skóry przez pierwsze 10-14 dni pod kątem nadmiernego zaczerwienienia, obrzęku, drenażu i rozejścia się rany, aż rana skóry się zagoi. Po 4-5 tygodniach oceń myszy zgodnie z oceną wyników badania, czy to żywe, czy po eutanazji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pozytywny wynik byłby związany z wszczepieniem guza i postępującym wzrostem guza w czasie. W zależności od typu nowotworu, wzrost guza śródkostnego może być związany z postępującą kulawizną kończyn tylnych, ale wiele guzów nie powoduje kulawizny pomimo objawów towarzyszącej choroby kości. Udane wszczepienie zostało udokumentowane za pomocą zaawansowanego obrazowania, w którym wystąpiłyby postępujące zmiany radiologiczne, μCT lub μMRI w bliższej części kości piszczelowej związane z fenotypem kości interesującej linii komó...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten raport dokumentuje nasz model tworzenia pierwotnych guzów kości lub przerzutów do kości po dopiszczelowej implantacji alloprzeszczepu guza. Uważamy, że w tym procesie należy złożyć się na kilka kluczowych etapów. Należy ustalić bezpieczną płaszczyznę znieczulenia zarówno dla podskórnego wstrzyknięcia zawiesiny komórek nowotworowych, jak i dopiszczelowego umieszczenia powstałych fragmentów guza. Należy sterylnie przygotować miejsce operowane zarówno do usunięcia podskórnego przeszczepu allogenicznego, jak i do podania...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dr Hildreth został sfinansowany przez NIH w ramach nagrody numer K01OD026527. Za treść odpowiadają wyłącznie autorzy i niekoniecznie reprezentują oficjalne poglądy NIH.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy doceniają krytyczny wkład dr Beth Chaffee, DVM, PhD, DACVP w rozwój tej techniki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
#15 ostrze do skalpelaHenry Schein Ltd.75614Brak
6-dołkowe płytki do hodowli tkankowychThermo Fisher Scientific10578911Służy do mielenia kawałków guza. Może być również stosowany do hodowli komórkowych
Linia komórkowa kostniakomięsaka AbramsaNie dotyczyNie dotyczyBrak
Aparat do znieczulenia z parownikiem izofluranu i butlą (butlami) tlenuVetEquip901805Brak
Waga dla zwierzątKent ScientificSCL- 1015Brak
BALB/c nago mouse (nu/nu)Charles River Ltd.NA6-8 tygodni życia. Samce lub samice myszy
Cement kostnyDepuy Synthes160504Opcjonalne zastosowanie zamiast wosku kostnego
Wosk kostnyEthiconW31GOpcjonalnie
BuprenorphineAnimalcare Ltd.Nie dotyczyBuprecare 0,3 mg/ml Roztwór do wstrzykiwań dla psów i kotów
Stacja eutanazji dwutlenkiem węglaNIENie dotyczy Należy zapewnić w pomieszczeniu dla zwierząt
Inkubator do hodowli komórkowych ustawiony na 37 & deg; C i 5% dwutlenek węglaHeraeusVariousBrak
Peeling chirurgiczny z chlorheksydynąVetoquinol411412Brak
Kriowiale (2 ml)Thermo Scientific Nalgene5000-0020Opcjonalnie, jeśli kriokonserwują fragmenty guza
D-lucyferyna (świetlik), sól potasowaPerkin Elmer122799Opcjonalnie, jeśli linia komórkowa będąca przedmiotem zainteresowania ma bioluminescencyjny gen reporterowy
Suwmiarka cyfrowaMitutoyo500-181-30Może być ręczna
Cyfrowy gabinet mikroradiograficznyFaxitron Bioptics, LLCMX-20Opcjonalnie do oceny odpowiedzi kości na wzrost guza
Dimetylosulfotlenek (DMSO)Sigma Aldrich1371171000Opcjonalnie w przypadku kriokonserwacji fragmentów guza
Dulbecco' s zmodyfikowany Orzeł" s mediumThermo Fisher Scientific11965092Brak
Etanol (70%)Sigma Aldrich2483Brak
Płodowa surowica bydlęcaThermo Fisher Scientific26140079Brak
Kleszcze, DumontFine Science Tools, Inc.11200-33Brak
Zamrażarka (– 80 ° C)SanyoMDF-794COpcjonalnie w przypadku kriokonserwacji lub błyskawicznego zamrażania fragmentów guza
HemocytometrThermo Fisher Scientific11704939Może również korzystać z automatycznego licznika komórek, jeśli jest dostępny
Igły podskórne (rozmiar 27)Henry Schein Ltd.DIS55510Może również używać igieł 25G (DIS55509) i 30G (Katalog DIS599)
LódNie dotyczyNajlepiej małe kawałki w pojemniku do przechowywania strzykawki i zawiesiny komórek
Nożyczki do irysuFine Science Tools, Inc.14084-08Brak
IsofluraneHenry Schein Ltd.1182098Brak
System obrazowania bioluminescencyjnego/fluorescencyjnego IVIS Lumina IIIPerkin ElmerCLS136334Opcjonalnie, jeśli linia komórkowa będąca przedmiotem zainteresowania ma bioluminescencyjne lub fluorescencyjne geny reporterowe
L-glutaminaThermofisher scientifc25030081Brak
Ciekły azotBritish Oxygen CorporationNAOpcjonalnie w przypadku kriokonserwacji lub szybkiego zamrażania fragmentów guza
Ciekły azot Dewar, 5 litrówThermo Fisher ScientificTY509X1Opcjonalnie w przypadku kriokonserwacji fragmentów guza
Matrigel® Matrix GFR, bez LDEV, 5 mlCorning Life Sciences356230Opcjonalnie. Dostępny również w rozmiarze 10 ml (354230)
MikrowirówkaThermo Fisher Scientific75002549Ogniwa granulkowe o prędkości 1200 obr./min przez 5-6 minut
Mr. Frosty zamrażarkaFisher Scientific10110051Opcjonalnie w przypadku kriokonserwacji fragmentów guza
NAIR Balsam/olejek do usuwania włosówThermo Fisher ScientificNC0132811Alternatywnie można użyć elektrycznej maszynki do strzyżenia z drobnym ostrzem
Penicylina/streptomycynaSigma-AldrichP4333Brak
Rękojeść skalpela, #7 Krótkienarzędzia do nauki o dobrej kondycji, Inc.10007-12Preferencja użytkownika, o ile akceptuje ostrze skalpela #15
Podgrzewana podkładka dla małych zwierzątVetTechHE006Brak
StereomikroskopGT Vision Ltd.H600BV1Brak
Sterylna sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Thermo Fisher Scientific10010023Stosować do wstrzykiwań, a także jako część peelingu chirurgicznego, na przemian z chlorheksydyną
Klej tkankowy (sterylny)3M Corporation84-1469SBMożna alternatywnie użyć niewchłanialnego szwu skórnego (rozmiar 6-0)
Trypan niebieskiThermo Fisher Scientific5250061Brak
Trypsin-EDTAThermo Fisher Scientific 253000540,05%-0,25%
(1 ml z gradacją 0,1 ml)Becton Dickinson309659Końcówka poślizgowa preferowana zamiast Luer
Wentylowane kolby do hodowli tkankowych, T-75Corning Life SciencesCLS3290W razie potrzeby można również używać mniejszych lub większych kolb
DOTYCZY Użyj strzykawki tuberkulinowej

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bryda, E. C. The Mighty Mouse: the impact of rodents on advances in biomedical research. Missouri Medicine. 110 (3), 207-211 (2013).
  2. Vandamme, T. F. Use of rodents as models of human diseases. Journal of Pharmacy and Bioallied Sciences. 6 (1), 2-9 (2014).
  3. Simmons, J. K., et al. Animal Models of Bone Metastasis. Veterinary Pathology. 52 (5), 827-841 (2015).
  4. Wolfe, T. D., et al. Effect of zoledronic acid and amputation on bone invasion and lung metastasis of canine osteosarcoma in nude mice. Clinical and Experimental Metastasis. 28 (4), 377-389 (2011).
  5. Wang, R., et al. The Clinicopathological features and survival outcomes of patients with different metastatic sites in stage IV breast cancer. BMC Cancer. 19 (1), 1091(2019).
  6. James, J. J., et al. metastases from breast carcinoma: histopathological - radiological correlations and prognostic features. British Journal of Cancer. 89 (4), 660-665 (2003).
  7. Pantel, K., Brakenhoff, R. H. Dissecting the metastatic cascade. Nature Reviews Cancer. 4 (6), 448-456 (2004).
  8. Chaffee, B. K., Allen, M. J. A clinically relevant mouse model of canine osteosarcoma with spontaneous metastasis. In Vivo. 27 (5), 599-603 (2013).
  9. Munajat, I., Zulmi, W., Norazman, M. Z., Wan Faisham, W. I. Tumour volume and lung metastasis in patients with osteosarcoma. Journal of Orthopaedic Surgery (Hong Kong). 16 (2), 182-185 (2008).
  10. Huang, X., et al. Risk and clinicopathological features of osteosarcoma metastasis to the lung: A population-based study. Journal of Bone Oncology. 16, 100230(2019).
  11. Li, W., Zhang, S. Survival of patients with primary osteosarcoma and lung metastases. Journal of BUON. 23 (5), 1500-1504 (2018).
  12. Campbell, J. P., Merkel, A. R., Masood-Campbell, S. K., Elefteriou, F., Sterling, J. A. Models of bone metastasis. Journal of Visualized Experiments. (67), e4260(2012).
  13. Maloney, C., et al. Intratibial Injection Causes Direct Pulmonary Seeding of Osteosarcoma Cells and Is Not a Spontaneous Model of Metastasis: A Mouse Osteosarcoma Model. Clinical Orthopedics and Related Research. 476 (7), 1514-1522 (2018).
  14. Dai, J., Hensel, J., Wang, N., Kruithof-de Julio, M., Shiozawa, Y. Mouse models for studying prostate cancer bone metastasis. BoneKey Reports. 5, 777(2016).
  15. Marques da Costa, M. E., et al. Establishment and characterization of in vivo orthotopic bioluminescent xenograft models from human osteosarcoma cell lines in Swiss nude and NSG mice. Cancer Medicine. 7 (3), 665-676 (2018).
  16. Raheem, O., et al. A novel patient-derived intra-femoral xenograft model of bone metastatic prostate cancer that recapitulates mixed osteolytic and osteoblastic lesions. Journal of Translational Medicine. 9, 185(2011).
  17. Sasaki, H., Iyer, S. V., Sasaki, K., Tawfik, O. W., Iwakuma, T. An improved intrafemoral injection with minimized leakage as an orthotopic mouse model of osteosarcoma. Analytical Biochemistry. 486, 70-74 (2015).
  18. Valastyan, S., Weinberg, R. A. Tumor metastasis: molecular insights and evolving paradigms. Cell. 147 (2), 275-292 (2011).
  19. Yu, C., et al. Intra-iliac Artery Injection for Efficient and Selective Modeling of Microscopic Bone Metastasis. Journal of Visualized Experiments. (115), e53982(2016).
  20. Kuchimaru, T., et al. A reliable murine model of bone metastasis by injecting cancer cells through caudal arteries. Nature Communications. 9 (1), 2981(2018).
  21. Haley, H. R., et al. Enhanced Bone Metastases in Skeletally Immature Mice. Tomography. 4 (2), 84-93 (2018).
  22. Lei, Z. G., Ren, X. H., Wang, S. S., Liang, X. H., Tang, Y. L. Immunocompromised and immunocompetent mouse models for head and neck squamous cell carcinoma. Onco Targets and Therapy. 9, 545-555 (2016).
  23. Lefley, D., et al. Development of clinically relevant in vivo metastasis models using human bone discs and breast cancer patient-derived xenografts. Breast Cancer Research. 21 (1), 130(2019).
  24. Tuveson, D., Clevers, H. Cancer modeling meets human organoid technology. Science. 364 (6444), 952-955 (2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Pierwotny nowotw r ko ciproksymalna cz ko ci piszczelowejguz podsk rnyosteolizaprzerzuty do p ucksenoprzeszczep pochodzenia pacjentawzrost guza piszczelowegoradiografia cyfrowa

Powiązane artykuły