Artykuł metodologiczny

Założenie i utrzymanie gnotobiotycznych karaluchów amerykańskich (Periplaneta americana)

5.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61316

⸱

28 maja 2021

 ,  , 
1Department of Microbiology, University of Georgia

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół jest używany do tworzenia i utrzymywania gnotobiotycznych karaluchów amerykańskich (Periplaneta americana) poprzez powierzchniową sterylizację jaj (oothecae) przed wykluciem. Te gnomiotyczne owady zawierają pionowo przenoszone endosymbionty Blattabacterium, ale mają akseniczne jelita.

Streszczenie

Zwierzęta gnotobiotyczne są potężnym narzędziem do badania kontroli struktury i funkcji mikrobiomu. Przedstawiono protokół zakładania i utrzymywania gnotobiotycznych karaluchów amerykańskich (Periplaneta americana). Podejście to obejmuje wbudowane kontrole sterylności w celu bieżącej kontroli jakości. Owady gnotobiotyczne są tutaj definiowane jako karaluchy, które nadal zawierają swój pionowo przenoszony endosymbiont (Blattabacterium), ale brakuje im innych drobnoustrojów, które normalnie znajdują się na ich powierzchni i w przewodzie pokarmowym. W ramach tego protokołu pojemniki na jaja (oothecae) są usuwane z (niesterylnej) kolonii hodowlanej i sterylizowane powierzchniowo. Po zebraniu i wysterylizowaniu ooteki inkubuje się w temperaturze 30 °C przez około 4-6 tygodni na agarze do infuzji mózgowo-sercowej (BHI), aż do wyklucia się lub usunięcia z powodu zanieczyszczenia. Wyklute nimfy przenosi się do kolby Erlenmeyera zawierającej podłogę BHI, sterylną wodę i sterylną karmę dla szczurów. Aby upewnić się, że nimfy nie są siedliskiem drobnoustrojów, które nie są w stanie rosnąć na BHI w danych warunkach, dodatkowy środek kontroli jakości wykorzystuje polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych (RFLP) do testowania drobnoustrojów nieendosymbiotycznych. Nimfy gnotobiotyczne wygenerowane przy użyciu tego podejścia mogą być inokulowane prostymi lub złożonymi zbiorowiskami drobnoustrojów i wykorzystywane jako narzędzie w badaniach mikrobiomu jelitowego.

Wprowadzenie

Zwierzęta gnotobiotyczne okazały się nieocenionymi narzędziami do badań mikrobiomu1,2,3. Zwierzęta wolne od zarazków i o zdefiniowanej florze pozwoliły na wyjaśnienie interakcji gospodarz-mikroorganizm, w tym odpowiedzi immunologicznych gospodarza, dojrzewania nabłonka jelitowego i metabolizmu gospodarza1,4,5,6,7. Zwierzęta gnotobiotyczne zaszczepione uproszczoną społecznością pomogły również w pełniejszym zrozumieniu interakcji mikroorganizm-mikroorganizm w społeczności jelitowej, w szczególności w rozwikłaniu wzajemnych relacji między karmieniem i antagonistycznymi relacjami8,9,10,11. Obecnie preferowanym systemem modelowym do badań nad mikrobiomem jelitowym ssaków jest model mysi. Chociaż system ten odegrał kluczową rolę w odkryciach opisanych powyżej, kluczowym mankamentem są związane z nim koszty. Specjalistyczny sprzęt i wysoko wykwalifikowani technicy są niezbędni do założenia i utrzymania zakładu gnotobiotycznego. To, w połączeniu z dodatkową dbałością, która musi być poświęcona każdemu aspektowi utrzymania zwierząt gnotobiotycznych, powoduje, że hodowla zwierzęcia gnotobiotycznego jest od dziesięciu do dwudziestu razy wyższa niż w przypadku standardowego modelu zwierzęcego12. Ze względu na wysokie koszty wielu badaczy może nie być w stanie pozwolić sobie na gnotobiotyczny model mysiego. Ponadto, chociaż modele mysie mogą być najpowszechniej akceptowanym wyborem w badaniach, które mają przełożyć się na zdrowie człowieka, nadal istnieje wiele fizjologicznych i morfologicznych różnic między ludzkimi i mysimi jelitami13. Najwyraźniej żaden pojedynczy model nie wystarczy, aby odpowiedzieć na stale rosnącą liczbę pytań dotyczących wielu aspektów mikrobiomu jelitowego.

Modele owadów są tańszą alternatywą ze względu na ich niższe koszty utrzymania w porównaniu do gatunków ssaków. Szeroko zakrojone badania nad wolnymi od zarazków i gnotobiotykami na różnych gatunkach owadów doprowadziły do opracowania wielu powszechnie stosowanych modeli. Komary i Drosophila są powszechnymi modelami pracy wolnej od zarazków ze względu na ich znaczenie dla chorób globalnych i wykonalności genetycznej14,15. Innym wyłaniającym się modelem jest system pszczoły miodnej (Apis mellifera), biorąc pod uwagę jego znaczenie w badaniach nad zapylaniem i społecznością16. Jednak wiele z tych powszechnie używanych owadów nie ma złożoności taksonomicznej obserwowanej w zbiorowiskach jelitowych ssaków17, co ogranicza ich zdolność do modelowania interakcji wyższego rzędu. Nie tylko całkowita różnorodność drobnoustrojów znajdujących się w jelitach karaluchów amerykańskich jest bardziej podobna do ssaków, ale wiele drobnoustrojów obecnych w jelitach karaluchów należy do rodzin i gromad, które są powszechnie występujące w mikrobiocie jelitowej ssaków i ludzi18. Tylne jelito karalucha jest również funkcjonalnie analogiczne do jelita grubego ssaków, ponieważ jest to komora fermentacyjna gęsto wypełniona bakteriami, które pomagają w ekstrakcji składników odżywczych19,20. Wreszcie, wszystkożerna natura karaluchów pozwala na różnorodność reżimów dietetycznych, które nie byłyby możliwe w przypadku dietetyków.

Karaluchy amerykańskie mogą być użytecznym modelem do zrozumienia społeczności mikroorganizmów jelitowych w organizmach wyższych, ale status karalucha jako szkodnika sprawia, że ten system jest również istotny dla zwalczania szkodników21. Wykorzystanie podstawowej wiedzy na temat wpływu społeczności jelitowej na zdrowie i fizjologię karaluchów pomaga w opracowywaniu nowych technik zwalczania szkodników.

Celem tej metody jest nakreślenie wyczerpującego opisu zakładania i utrzymywania gnotobiotycznych karaluchów amerykańskich (Periplaneta americana), ale ten protokół może być wykorzystany do generowania nimf dowolnego jajorodnego karalucha. Obejmuje metodę wydajnego, nieinwazyjnego zbierania dojrzałych oothecae oraz nieniszczącą technikę monitorowania statusu gnotobiotycznego owadów22,23,24. Podczas gdy poprzednie metody pozyskiwania i utrzymywania karaluchów gnotobiotycznych opisują kolekcję ootheca23,24,25,26,27, dojrzałość ootheca jest interpretowana w kategoriach wskazówek specyficznych dla gatunku (w Blattella germanica22,24,25), lub nie jest wyraźnie opisany27,28, co utrudnia implementację osobom niezaznajomionym z systemem. Ponieważ opisana tutaj metoda wykorzystuje naturalnie upuszczone oothecae, błąd przedwczesnego usuwania jaj nie jest widoczny. Protokół ten zawiera zarówno zależne od kultury, jak i niezależne od kultury metody kontroli jakości, a metoda zależna od kultury nie wymaga składania ofiar z owadów. Wreszcie, metoda ta łączy informacje z wielu badań nad karaluchami gnotobiotycznymi, aby stworzyć jeden, kompleksowy protokół ze wszystkimi informacjami niezbędnymi do osiągnięcia i utrzymania karaluchów gnotobiotycznych.

Protokół

1. Przygotowanie materiałów

  1. Utrzymanie hodowli karaluchów
    UWAGA: Istnieje wiele sposobów na hodowlę tych wytrzymałych owadów. Szczegóły dotyczące zapewniania schronienia i wody mogą się różnić w zależności od dostępnych materiałów (np. kartonów na jajka zamiast tekturowych tub). Poniższy protokół sterylizacji będzie działał w przypadku każdej konfiguracji zbiornika magazynowego.
    1. Rozłóż wystarczającą ilość ściółki z wiórów drzewnych w akwarium o pojemności 37,85 l (10 galonów), aby przykryć dno zbiornika około 1 calem ściółki. Przygotuj obudowę, przycinając (płaską) tekturę na 2 cale x 4 na kawałki. Włóż kawałki kartonu do tekturowych tub (np. tubek po papierze toaletowym) i ułóż rurki na jednym końcu zbiornika (Rysunek 1).
    2. Rozsmaruj cienką warstwę wazeliny na górnych dwóch calach wnętrza zbiornika, aby zapobiec ucieczce owadów.
      UWAGA: Upewnij się, że wnętrze rogów zbiornika jest odpowiednio pokryte.
    3. Dodaj karaluchy, przenosząc (zajęte) tekturowe tuby z poprzedniego zbiornika, potrząsając nimi, aby uwolnić ich mieszkańców. Do każdego transferu przenieś 100-200 karaluchów w różnym wieku i mieszanej płci. Dodaj karmę dla psów (20-30 sztuk), monitoruj ilość karmy dla psów w zbiorniku i uzupełnij, gdy będzie niska.
    4. Ustaw naczynie na wodę.
      1. Napełnij mały plastikowy pojemnik na żywność wielokrotnego użytku wodą podwójnie destylowaną (ddH2O). Wytnij gąbki celulozowe i otwory w pokrywie pojemnika na żywność do mniej więcej tego samego rozmiaru.
        UWAGA: Gąbki celulozowe zapobiegają utonięciu karaluchów w naczyniu na wodę.
    5. Włóż gąbki do otworów w pokrywce i umieść pokrywkę na napełnionym pojemniku. Umieść pojemnik w zbiorniku i napełnij, gdy będzie niski. Przykryj zbiornik bawełnianą szmatką i zabezpiecz go elastyczną opaską.
    6. Gdy zbiorniki zaczynają gromadzić nadmierne ilości zwłok i tusz owadów, zakładaj nowe zbiorniki i przenoś karaluchy.
      UWAGA: Zbiorniki są zazwyczaj przenoszone co 6 miesięcy. Wszelkie pozostałe karaluchy/jaja w wycofanych z eksploatacji zbiornikach magazynowych są poddawane eutanazji przez zamrażanie w temperaturze -20 °C przez 1 godzinę, a następnie zawartość zbiornika zapasowego jest przenoszona do worka autoklawu i sterylizowana w autoklawie (1 godzina, cykl grawitacyjny) przed usunięciem. Zbiorniki magazynowe są sterylizowane 2% wybielaczem między użyciami.
  2. Dezynfekcja dodatkowego kontenera.
    UWAGA: Ten pojemnik nie zawiera filtra, ale zamiast tego umożliwia swobodną wymianę powietrza.
    1. Spryskaj wnętrze pokrywki i spodu 2% wybielaczem i pozostaw do namoczenia przez 10 minut. Wytrzyj wybielacz czystym ręcznikiem papierowym.
    2. Spryskaj wnętrze pokrywy i spód 70% etanolem i wytrzyj do sucha czystym ręcznikiem papierowym. Załóż pokrywę do czasu użycia.
  3. Wykonaj skosy BHI i kolby do wysiadywania jaj i trzymania nimf.
    1. Przygotuj BHI zgodnie z instrukcją na opakowaniu, dodając 2% agaru. Gotuj roztwór BHI-agar aż do jego sklarowania.
    2. W przypadku skosów przenieść 5 ml porcji do szklanych probówek i nakrętki o wymiarach 18 mm x 150 mm. Sterylizacja w autoklawie (czas sterylizacji = 20 min, cykl płynny). Umieść autoklawowane rurki pod kątem 45°, aby ostygły do skosów. Po zestaleniu wstaw do lodówki do czasu użycia, aby zapobiec wysychaniu.
    3. W przypadku kolb przenieść 10 ml podwielokrotności ugotowanego roztworu BHI-agar do kolb Erlenmeyera o pojemności 250 ml w celu całkowitego pokrycia dna kolby. Przykryj kolbę folią i sterylizuj w autoklawie (20 min, cykl płynny). Pozostawić autoklawowane kolby do ostygnięcia i schłodzić do lodówki do czasu użycia, aby zapobiec wysychaniu.
      UWAGA: Do tej konfiguracji nie jest wymagany filtr powietrza. Osłona foliowa jest wystarczająca, aby umożliwić wymianę gazową, jednocześnie zapobiegając zanieczyszczeniu z otwartego przepływu powietrza.
  4. Sterylizuj w autoklawie: autoklawowalna karma dla szczurów podzielona na połówki (~1/2 cala) w zlewce pokrytej folią (czas sterylizacji = 1 godzina, cykl grawitacyjny), ddH2O w zakorkowanej butelce (czas sterylizacji = 20 min, cykl płynny) i kleszcze w zlewce pokrytej folią (czas sterylizacji = 20 min, cykl grawitacyjny).
    UWAGA: Nie przepełniaj zlewki na szczury. Granulki pęcznieją w autoklawie.
  5. Załóż zbiornik na "oddział położniczy".
    UWAGA: Ten zbiornik zawiera te same materiały, co zbiorniki magazynowe (tekturowe tuby, naczynia na wodę z gąbkami, karma dla psów, ściółka z wiórów drzewnych; patrz Rysunek 1) i powinien być opróżniony z karaluchów, chyba że zostanie przekazany do zbierania oothecae (patrz sekcja 2).
  6. Nawilżyć inkubator, przygotowując zlewkę pełną przesyconego roztworu chlorku sodu (NaCl). Przygotować ten roztwór, dodając 37 g NaCl na 100 ml ddH2O i mieszając aż do rozpuszczenia.
    UWAGA: Zazwyczaj 500 ml nasyconego roztworu soli zwykle nawilża inkubator o wymiarach komory 51 cm x 46 cm x 46 cm (wys. x szer. x gł.) przez około miesiąc, zanim trzeba będzie dodać więcej wody.

2. Kolekcja oothecae

  1. Przenieś samice (w dowolnej liczbie, stosownie do planowanych eksperymentów) niosące oothecae (Rysunek 2) ze zbiornika podstawowego na "oddział położniczy", używając kleszczy do przesuwania tekturowych probówek, które zawierają ciężarne samice.
    1. Jeśli tuba z tektury zawiera wiele owadów oprócz ciężarnej samicy, najpierw wytrząśnij rurkę do dodatkowego plastikowego pojemnika otoczonego wazeliną, a następnie zachęć docelowego owada do samodzielnego wdrapania się z powrotem do tekturowej tuby.
  2. Przenieś samice z powrotem do zbiornika podstawowego, gdy upuszczą swoje oothecae. Wyciągnij oothecae ze ściółki w zbiorniku za pomocą kleszczy.
    UWAGA: Oothecae są często upuszczane w ciągu 24 godzin od przeniesienia samicy.

3. Czyszczenie oothecae

  1. Dodać oothecae do probówki wirówkowej o pojemności 5 ml zawierającej 3 ml dodecylosiarczanu sodu (SDS). Wir przez 10 s. Powtórzyć drugi etap mycia za pomocą probówki wirówkowej zawierającej świeżą SDS.
    UWAGA: Na 3 ml karty charakterystyki można użyć do pięciu oothecae.
  2. Używając delikatnej chusteczki do pracy, delikatnie wyszoruj powierzchnię każdej ootheca, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia. Można dodać więcej kart charakterystyki, aby pomóc w dokładnym czyszczeniu. Umieść oczyszczone oothecae w łódce wagowej, aż będą gotowe do sterylizacji.
    UWAGA: Protokół może zostać w tym miejscu wstrzymany, ale pozostawienie oothecae w środowisku o niskiej wilgotności przez dłuższy czas (od dni do tygodni) spowoduje ich odwodnienie i utratę żywotności.

4. Sterylizacja i inkubacja oothecae

  1. Podwielokrotność sterylnej wody do płukania po sterylizacji. Dla każdej ootheki, która ma być sterylizowana, napełnij dwie probówki wirówkowe o pojemności 1,5 ml 1 ml sterylnej wody.
  2. Dodać 10 μl stężonego (32%) roztworu podstawowego kwasu nadoctowego do 3,2 ml ddH2O w probówce wirówkowej o pojemności 5 ml, aby uzyskać 0,1% roztwór do sterylizacji. Zakryj i odwróć kilka razy, aby wymieszać.
    UWAGA: Kwas nadoctowy jest szkodliwy w kontakcie ze skórą lub płucami. Rozcieńczyć w dygestorium.
    UWAGA: Należy to zrobić tego samego dnia, co sterylizacja. Wcześniejszy roztwór rozcieńczony szybko się rozkładnie, a zatem nie zostanie odpowiednio wysterylizowany. Aż pięć oczyszczonych ooteki można wysterylizować w 3,2 ml rozcieńczonego kwasu.
  3. Umieść (do pięciu) oczyszczonych oothecae w 0,1% roztworze kwasu nadoctowego na 5 minut. Odwróć probówkę kilka razy co 60 s.
  4. W okapie z przepływem laminarnym użyj sterylnych kleszczyków, aby przenieść każdą oothekę do osobnej probówki wirówkowej z podaną sterylną wodą do płukania (krok 4.1). Odwróć kilka razy, aby wymieszać. Powtórz dla drugiego płukania, a następnie przenieś każdą spłukaną oothekę na własny skos BHI za pomocą sterylnych kleszczy.
  5. Umieść skosy w wysterylizowanym pojemniku wtórnym. Przenieść pojemnik do nawilżanego inkubatora w temperaturze 30 °C na 4−5 tygodni do wyklucia.
    UWAGA: Skosy mogą być trzymane pionowo przez mały stojak na probówki lub średnią/małą zlewkę.
  6. Regularnie sprawdzaj skosy (1-2 razy w tygodniu). Jeśli na agarze pojawi się wzrost kolonii grzybów lub bakterii, usuń zanieczyszczony skos. Kiedy zbliża się czterotygodniowy punkt czasowy, codziennie sprawdzaj skosy.
    UWAGA: Po wykluciu nimfy mogą przetrwać do kilku tygodni na samym BHI, ale nie będą rosły optymalnie.

5. Utrzymanie nimf gnotobiotycznych

  1. W okapie z przepływem laminarnym przenieść w asepcie granulkę wysterylizowanej karmy dla szczurów do przygotowanej kolby BHI (z kroku 1.3.3) za pomocą sterylnych kleszczyków. W celu kontroli sterylności umieścić kolbę w pojemniku wtórnym w inkubatorze o temperaturze 30 °C na 24 godziny i nie używać, jeśli pojawi się wzrost.
  2. Dodać nimfy do kolby BHI ze sterylnym granulem spożywczym. Wytrząśnij je ze skosu BHI i pozwól im wpaść do kolby w kapturze z przepływem laminarnym.
    UWAGA: Nimfy nie mają przyczepności na szklanych ściankach probówki. Potrząsanie rurką, aby strącić je ze skosu, a następnie przechylenie rurki, aby umożliwić im zsunięcie się po szklance do kolby, jest skuteczne. Chociaż nimfy mogą być przenoszone za pomocą kleszczy, ryzyko śmiertelnych obrażeń jest wysokie.
  3. Nimfy wodne z 300 μl sterylnej wody raz w tygodniu w okapie z przepływem laminarnym, pipetując bezpośrednio na dno BHI kolby.
  4. Gdy kał nimfy zacznie pokrywać dno BHI, przenieś do nowej kolby BHI, dodając wysterylizowaną karmę dla szczurów 24 godziny wcześniej (w celu sprawdzenia sterylności), jak w kroku 5.1.

6. Kontrola jakości sterylności

  1. Usunąć jedną nimfę z kolby BHI w celu złożenia jej w ofierze w celu kontroli jakości statusu gnotobiotyków niezależnej od kultury za pomocą polimorfizmu długości fragmentu restrykcyjnego (RFLP). Aby to zrobić, wlej nimfę do sterylnej probówki wirówkowej (podobnie jak w przypadku transferu nimfalnego z kroku 5.1) lub umieść sterylny drewniany aplikator w kolbie i poczekaj, aż nimfa zacznie się po niej wspinać, a następnie przenieś ją do probówki wirówkowej.
  2. Dodaj 0,5 ml 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) do nimfy w probówce wirówkowej i homogenizuj sterylnym mikrotłuczkiem, aż wszystkie duże kawałki zostaną rozdrobnione. Dobrze wirować.
  3. Ekstrahować DNA z homogenatu nimfy za pomocą zestawu do ekstrakcji DNA bakterii (tabela materiałów) w następujący sposób.
    1. Odwirować homogenizowaną nimfę przez 10 minut przy 5 000 x g i usunąć supernatant. Rozgrzej wytrząsarkę termiczną do 37 °C.
    2. Dodaj 100 μl 1x Tris-EDTA i odwiruj, aby całkowicie zawiesić granulkę. Dodać 10 μl lizozymu i wymieszać, a następnie wykonać 30-minutową inkubację (bez wstrząsania) w podgrzanym do 37 °C wytrząsarce termicznej.
    3. Dodać 25 mg szklanych kulek do próbek i wirować z maksymalną prędkością przez 5 minut. Rozgrzej wytrząsarkę termiczną do 55 °C.
    4. Pozwól, aby kulki opadły przed przeniesieniem supernatantu do nowej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml ze 100 μl buforu proteinazy K i 20 μl proteinazy K. Vortex dokładnie wymieszać.
    5. Inkubować z wytrząsaniem przy 600 obr./min w wytrząsarce termicznej o temperaturze 55 °C przez 60 minut. Wirować przy 10 000 x g przez 2 minuty i przenieść supernatant do nowej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml. Rozgrzać wytrząsarkę termiczną do temperatury 65 °C. Rozpocząć wstępne podgrzewanie buforu elucyjnego w piecu do hybrydyzacji o temperaturze 65 °C.
    6. Dodaj 220 μl 100% etanolu. Wir z maksymalną prędkością przez 20 s. Rozdrobnić widoczny osad, pipetując 10 razy w górę i w dół.
    7. Wprowadzić kolumnę DNA do probówki zbiorczej o pojemności 2 ml i przenieść do niej próbkę, łącznie z osadem, który mógł się uformować. Wirować przy 10 000 x g przez 1 minutę, wyrzucić filtrat z probówki zbiorczej i wymienić probówkę zbiorczą.
    8. Dodać 500 μl buforu wiążącego do kolumny i odwirować przy 10 000 x g przez 1 minutę. Wyrzucić filtrat z probówki zbiorczej i wymienić probówkę zbiorczą.
    9. Dodać 700 μl buforu do przemywania DNA do kolumny i odwirować przy 10 000 x g przez 1 min. Wyrzucić filtrat z probówki zbiorczej i wymienić probówkę zbiorczą. Powtórz dla drugiego kroku prania.
    10. Odwiruj pustą kolumnę przez 2 minuty w celu jej wysuszenia, a następnie przenieś kolumnę do nowej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml. Dodać 50 μl podgrzanego buforu elucyjnego bezpośrednio do matrycy kolumny DNA i inkubować w temperaturze 65 °C przez 5 minut.
    11. Wirować przy 10 000 x g przez 1 minutę do wymycia. Określić ilościowo wyekstrahowane DNA w filtracie za pomocą spektrofotometrii lub fluorometrii.
  4. Amplifikacja i trawienie całego genu 16S. Wizualizacja fragmentów za pomocą elektroforezy żelowej.
    1. Użyj 12,5 μl 2x mieszanki wzorcowej, 0,5 μl każdego startera 1492R (5′-GGTTACCTTGTTACGACTT) i 27F (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG), 5 ng DNA i wody molekularnej, aby uzyskać całkowitą objętość reakcji 25 μL.
    2. Uruchom następujący program termocyklera: 94 °C przez 60 s, następnie 35 cykli po 94 °C przez 30 s, 50 °C przez 45 s, 68 °C przez 90 s, a następnie 68 °C przez 5 s.
    3. Oczyść produkt reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) za pomocą zestawu do oczyszczania DNA (tabela materiałów).
      1. Dodać 120 μl buforu oczyszczającego do produktu PCR i odwirować do wymieszania. Krótko odwirować, aby zebrać kropelki wewnątrz pokrywki. Wprowadzić kolumnę DNA do probówki zbiorczej o pojemności 2 ml, przenieść płyn do przygotowanej kolumny i odwirować przy ≥13 000 x g przez 1 min.
      2. Wyrzucić filtrat i wymienić probówkę zbiorczą. Dodać 700 μl buforu do przemywania DNA i odwirować w ilości ≥13 000 x g przez 1 min. Wyrzucić filtrat i wymienić probówkę zbiorczą. Powtórz dla drugiego kroku prania.
      3. Odwirować pustą kolumnę przez 2 minuty w celu wyschnięcia i przenieść kolumnę do nowej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml. Dodać 50 μl podgrzanego buforu elucyjnego bezpośrednio do matrycy kolumny DNA i inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 minuty.
      4. Wirować przy 10 000 x g przez 1 minutę do wymycia. Określić ilościowo wyekstrahowane DNA w filtracie za pomocą spektrofotometrii lub fluorometrii.
    4. Dodać 1 μg oczyszczonego produktu PCR do 5 μl buforu wytrawiającego, 10 jednostek RsaI i wody molekularnej, aby uzyskać całkowitą objętość reakcji 50 μl. Mieszać pipetując w górę i w dół i inkubować w temperaturze 37 °C przez 60 minut.
    5. Oddzielić strawiony produkt za pomocą elektroforezy żelowej, uruchamiając 20 μl strawionego DNA na 2% żelu agarozowym. Wizualizacja żelu w celu potwierdzenia statusu gnotobiotycznego.
      UWAGA: Owady gnotobiotyczne powinny powodować powstawanie prążków przy 402 pz, 201 pz i rozmazie od 163 do 148 pz, w oparciu o sekwencję 16S rDNA endosymbionta, Blattabacterium. Wszelkie dodatkowe prążki widoczne w żelu wskazują na skażające gatunki drobnoustrojów.

7. Aseptyczne śledzenie wzrostu nimfalnego

  1. Zapisz długość ciała, aby śledzić wzrost nimfal, mierząc owady przez półprzezroczyste dno BHI kolby.
    UWAGA: Nimfy można umieszczać w temperaturze 4 °C na 15 minut, aby spowolnić ich ruch, co ułatwi ich pomiar.

Wyniki

Zbiorniki macierzyste są przygotowane zgodnie z przedstawionym na Rysunku 1 schematem. Samice „ciężarne” rozpoznaje się po przytwierdzonej do tylnej części odwłoka oothece, jak pokazano na Rysunku 2. Inkubacja oothec na agarze BHI umożliwia nieniszczącą kontrolę jakości gnotobiotycznej. W niektórych przypadkach sterylizacja nie udaje się i wokół oothec pojawia się wzrost mikroorganizmów, co widać na Rysunku 3B. Takie ootheki należy usunąć i wyrzucić. W naszych badaniach odnotowano średnią 10% stopień niepowodzenia sterylizacji (n = 51). Ootheki wykluwają się średnio 34 dni po sterylizacji, pod warunkiem braku wzrostu na podłożu, co przedstawiono na Rysunku 3A. Zaobserwowaliśmy typowy odsetek wyklucia na poziomie 41% (n = 46) dla wysterylizowanych, niekontaminowanych oothec, przy średnio 1 nimf na jedną oothekę. Większe nimfy są przenoszone do kolb z BHI przykrytych folią, jak pokazano na Rysunku 4. Folia zapobiega kontaminacji, a nimfy mają miejsce do wzrostu. Do potwierdzenia statusu gnotobiotycznego wykorzystuje się RFLP 16S rDNA z homogenizatu nimfy. Zaobserwowano, że nimfy gnotobiotyczne rosną wolniej niż ich niesterylnym odpowiedniki, co przedstawiono na Rysunku 5. Rysunek 6 prezentuje wyniki dla owadów gnotobiotycznych oraz standardowych (niesterylnych) nimf.

Choć test ten nie wykrył dotąd kontaminacji w przypadku braku pozytywnego wyniku hodowli, krok ten był rutynowo wykonywany podczas krytycznych eksperymentów w celu wykluczenia obecności zanieczyszczeń w postaci mikroorganizmów wrażliwych na tlen lub wymagających. W przypadku karaczanów gnotobiotycznych zaobserwowano wolniejszy wzrost w porównaniu z owadami standardowymi/niesterylnymi.

Przygotowanie siedliska dla świerszczy z wykorzystaniem tekturowych rurek i gąbek do utrzymywania wilgotności powierzchni ściółki.
Rycina 1: Konfiguracja hodowli stokowej karaluchów.
W przeciwległym końcu zbiornika widoczne są ułożone w stosy tekturowe rurki. Pokarm i woda znajdują się w pobliżu przedniej części zbiornika. Bawełniana tkanina okrywająca oraz gumka zostały usunięte w celu zapewnienia widoczności. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Widok grzbietowy karalucha z wystającą otteką, ilustrujący składanie jaj.
Rysunek 2: „ciężarna” karaluch amerykański.
Strzałka wskazuje ootekę. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Badanie zachowania karaluchów, fermentacja drożdży z przynętą w probówkach, schemat porównawczy eksperymentu.
Rysunek 3: Obrazy pomyślnie wylężonych nimf gnotobiotycznych oraz nieskutecznie wysterylizowanych ototek na skosach BHI.
Ooteki poddano sterylizacji i inkubacji zgodnie z opisem w niniejszym protokole.ABrak wzrostu drobnoustrojów na skosie BHI wskazuje, że owady są wolne od organizmów zdolnych do hodowli.BOoteki na skosach, na których doszło do powstania kolonii, należy utylizować jako zanieczyszczone. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Eksperyment fermentacyjny z wykorzystaniem kolb Erlenmeyera, zamkniętych w celu zapewnienia warunków beztlenowych, wzrost drobnoustrojów.
Rycina 4: Aparatura do hodowli gnotobiotycznej.
Owady przechowywane są w sterylnych kolbach zamkniętych pokrywką z folii, aby zapobiec kontaminacji. Pojemnik zewnętrzny (zielona pokrywka) jest sterylizowany 2% roztworem wybielacza, a następnie 70% etanolem. Przepływ powietrza w pojemniku zewnętrznym nie jest ograniczony. Aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury, kliknij tutaj.

Wykres wzrostu nimf w zależności od wieku; warunki sterylne i niesterylne. Analiza wykresu punktowego.
Rysunek 5: Reprezentatywne dane dotyczące tempa wzrostu z porównaniem długości ciał nimf gnotobiotycznych i niesterylnych. Obie grupy owadów karmiono autoklawowaną dietą dla gryzoni. Owady gnotobiotyczne (tutaj: n = 105) utrzymywano na podłożu BHI zgodnie z opisem. Owady niesterylne (tutaj: n = 50) żyły w kolbach z autoklawowaną ściółką z wiórów drewnianych, z małymi naczyniami z wodą. Nimfy niesterylne rosły w średnim tempie 0,059 mm/dobę, podczas gdy nimfy gnotobiotyczne rosły w tempie 0,028 mm/dobę (p < 0.0001). Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

Elektroforeza w żelu wykazująca fragmenty bakteryjnego 16S rRNA oraz wzory prążkowania, drabinka 10 bp.
Rysunek 6: Reprezentatywny obraz żelu z wynikami RFLP dla kontroli jakości.
Amplikony pełnego genu 16S poddano trawieniu enzymem RsaI. DNA do PCR wyekstrahowano z homogenizowanych nimf w 1x PBS. Ścieżki „G nymph” odpowiadają nimfom gnotobiotycznym, natomiast ścieżki „conv nymph” odpowiadają konwencjonalnym, niesterylnym odpowiednikom. Na podstawie wirtualnego trawienia restrykcyjnego endosymbiont (Blattabacterium) powinno wykazywać prążki o rozmiarach 402 bp, 206 bp i 163 bp, wraz z rozmazem prążków pomiędzy 163 bp a 148 bp. Owad gnotobiotyczny powinien wykazywać jedynie Blattabacterium wzór prążków. Oczekuje się, że mieszana społeczność bakteryjna wykaże smugę prążków o różnych rozmiarach, oznaczoną tutaj jako „inne fragmenty 16S bakterii”. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

Dyskusja

Inne metody opisujące powstawanie gnotobiotycznych karaluchów albo nie opisywały zbierania oothecae, albo wykorzystywały punkty odniesienia specyficzne dla innych gatunków karaluchów, aby wskazać, kiedy oothecae mogą zostać usunięte z matki 23,25,26. Pierwotnie, oothecae były zbierane z ściółki z wiórów drzewnych w zbiornikach magazynowych, co skutkowało bardzo niskimi wskaźnikami wylęgu (~10%) w porównaniu z niesterylizowanymi oothecae (47%)29. Wynika to prawdopodobnie z faktu, że niewyklute oothecae gromadzą się z czasem w klatce stadnej i nie ma możliwości zweryfikowania wieku lub żywotności ootheca. Wdrożenie podejścia "oddział położniczy" pozwala na pobieranie świeżo zdeponowanych ooteków w znanym wieku. To dodatkowo ułatwia planowanie eksperymentów, ponieważ badacz może przewidzieć prawdopodobny czas wylęgu poszczególnych oothecae. Kolejna modyfikacja w stosunku do wstępnych i opublikowanych protokołów obejmuje inkubację ootek i nimf w półzamkniętych komorach zawierających również przesycony roztwór chlorku sodu. Obecność roztworu utrzymuje wilgotność względną na poziomie około 75%30. Ooteki są rutynowo inkubowane w temperaturze 30 °C, co, jak wykazano, minimalizuje liczbę dni potrzebnych do inkubacji, jednocześnie maksymalizując żywotność zarodków i liczbę nimf produkowanych na ootheca31. Po wykluciu nimfy gnotobiotyczne są rutynowo hodowane na stole w laboratoryjnej temperaturze pokojowej i warunkach otoczenia, chociaż komory o kontrolowanej wilgotności są ponownie wykorzystywane do krytycznych eksperymentów. Po wprowadzeniu tych zmian w zbieraniu i inkubacji ootheca, wskaźniki wylęgu wzrosły do około 41% (n = 51), nie wliczając ootek usuniętych z powodu zanieczyszczenia. Potencjalną drogą do dalszej optymalizacji wskaźników wylęgu może być wydłużenie czasu między pobraniem ootheki a sterylizacją. Naskórek pojemnika na jaja może nie być w pełni garbowany przy pierwszym uwolnieniu32 i dlatego może być przepuszczalny dla roztworów stosowanych podczas sterylizacji w ciągu 24 godzin od upuszczenia.

Protokół sterylizacji przy użyciu 0,1% kwasu nadoctowego został zaadaptowany z Doll et al.25. Inne badania udokumentowały alternatywne techniki sterylizacji oothecae23,26. Wskaźniki zanieczyszczenia opierają się na nieniszczącej metodzie inkubacji oothecae na skosie BHI. Takie podejście jest bardzo korzystne, ponieważ pozwala na szybką identyfikację i usunięcie zakażonych oothecae. Większość poprzednich protokołów bada organizmy zdolne do hodowli poprzez posiew kału lub homogenatu nimfy na pożywce bakteriologicznej i sprawdzenie wzrostu 22,23,25,27,28,33. W co najmniej jednym przypadku metoda badania statusu gnotobiotyków nie została w pełni opisana26. Z wyjątkiem Claytona, który dodał małą płytkę pożywki do badania sterylności do butelek hodowlanych24, poprzednie metody22,23 umieszczały owady gnotobiotyczne na pożywkach bakteriologicznych tylko przez krótki okres czasu, aby wstępnie ocenić protokół sterylizacji.

Dalsze trzymanie powstałych nimf na pożywce BHI jako wbudowany środek kontroli jakości pozwala na monitorowanie ich statusu gnotobiotycznego w czasie półrzeczywistym - technika niespotykana w większości poprzednich metod22,23. Jest to szczególnie przydatne w przypadku długoterminowych eksperymentów, które wymagają dostępu do nimf gnotobiotycznych. Jeśli dno BHI pod nimfami wydaje się być zanieczyszczone rozwojem bakterii lub grzybów, kolbę należy wyrzucić. Ten rodzaj zanieczyszczenia zwykle występuje podczas odsłaniania kolb w celu pojenia nimf, ale może również powstać z kału w przypadku niedostatecznie wysterylizowanych oothecae lub żywności. Zastosowanie okapu z przepływem laminarnym podczas podlewania poprawia stopień zanieczyszczenia spowodowanego odsłanianiem kolb.

Ponieważ nie wszystkie organizmy zanieczyszczające mogą rozwijać się tlenowo na pożywce BHI, wymagana jest dodatkowa, niezależna od kultury metoda badania sterylności. Jednym z potencjalnych podejść jest mikroskopia27, ale podejście to może być pracochłonne. Inne protokoły wykorzystują techniki oparte na sekwencjach do wykrywania organizmów, które mogą wymykać się kulturze 14,23,27,28. Takie podejścia są jednak często kosztowne i trudne do zinterpretowania, ponieważ na wyniki wysokoprzepustowego sekwencjonowania może łatwo wpłynąć zanieczyszczenie odczynników o niskim poziomie34 i przeskakiwanie kodów kreskowych35. Zamiast tego opracowano nowe podejście, które wykorzystuje amplifikację PCR genu 16S rRNA w połączeniu z polimorfizmem długości fragmentu restrykcyjnego w celu wizualizacji zarówno endosymbionta, jak i wszelkich zanieczyszczających symbiontów jelitowych. Technika ta obejmuje wewnętrzną kontrolę PCR, ponieważ gen 16S Blattabacterium został zsekwencjonowany, a jego wzór prążkowania powinien być obecny zarówno u owadów gnotobiotycznych, jak i niesterylnych. Ponieważ wzorzec restrykcyjny endosymbionta można przewidzieć na podstawie sekwencjigenomu 36, nie ma potrzeby sekwencjonowania amplikonów lub fragmentów restrykcyjnych, chyba że pożądana jest identyfikacja jakiegokolwiek zanieczyszczenia. Obecna wersja tego protokołu wymaga poświęcenia nimfy w celu PCR/RFLP, ale technika ta może być również stosowana na kale jako środek nieniszczący. Nie będzie jednak zawierał wbudowanej kontroli, ponieważ kał nie powinien zawierać dużo Blattabacterium.

Dodatkowym, łatwo modyfikowalnym, ale kluczowym elementem hodowli zwierząt gnotobiotycznych jest dieta. Podczas gdy agar BHI może służyć jako tymczasowe źródło pożywienia dla owadów, stwierdzono, że powoduje znaczne deficyty wzrostu wśród nimf, gdy jest używany jako jedyne źródło pożywienia przez dłuższy czas. Chociaż wypróbowano różne diety, autoklawowalna karma dla szczurów jest zalecana jako rutynowa dieta w celu utrzymania owadów gnotobiotycznych. Diety, które nie zostały opracowane specjalnie do sterylizacji, były często trudne do całkowitego wyjałowienia, a wiele sterylnych lub autoklawowalnych diet zwierząt laboratoryjnych wykazywało szybki wzrost grzybów w niesterylnych warunkach. Ta tendencja do degradacji w niesterylnych warunkach sprawiła, że nie nadawały się do wykorzystania w eksperymentach bezpośrednio porównujących owady gnotobiotyczne i niegnotobiotyczne. Zalecana dieta pozwala na stosowanie spójnej diety między nimfami gnotobiotykami i standardowymi, ułatwiając porównanie cech – takich jak tempo wzrostu – między obiema grupami.

Jak zaobserwowaliinni27, nimfy gnotobiotyczne rosną wolniej niż ich niesterylne odpowiedniki. Porównanie długości ciała nimf gnotobiotycznych (n = 105) i niesterylnych (n = 50) karmionych tą samą, autoklawizowaną dietą gryzoni i utrzymywanych w temperaturze pokojowej pokazuje, że nimfy niesterylne rosną średnio 0,059 mm/dzień, podczas gdy nimfy gnotobiotyczne rosną 0,028 mm/dzień (p < 0,0001) (ryc. 5). Wykazano, że obecność mikrobioty jelitowej u P. americana zmienia tempo metabolizmu owadów37 i uważa się, że społeczności jelitowe w ogóle wpływają na wchłanianie składników odżywczych38,39. Przyczyny te potwierdzają obserwowane różnice w tempie wzrostu nimf gnotobiotycznych i niesterylnych.

Możliwym ograniczeniem tej techniki jest to, że nimfy gnotobiotyczne mogą nie osiągnąć dojrzałości płciowej, ponieważ najstarsze bezpłodne kohorty mają więcej niż 10 miesięcy i osiągnęły dopiero siódme stadium rozwojowe (z 10; 11 to dorosłość) w przybliżeniu długości ciała40. Te najstarsze kohorty nie są na autoklawie szczurzym, ale zamiast tego jedzą napromieniowaną karmę dla szczurów, dietę, która zawiera zbyt dużo wilgoci, aby karmić niesterylne kohorty bez nadmiernego wzrostu pleśni. Stwierdzono, że niesterylne nimfy na diecie niesterylizowanej karmy dla psów osiągają dorosłość po 9-10 miesiącach w warunkach laboratoryjnych (temperatura i wilgotność pokojowa). Kohorty nimf gnotobiotycznych i niesterylnych na wspólnej, autoklawizowanej karmie dla szczurów mają obecnie mniej niż 7 miesięcy, szacuje się, że owady niesterylne są w siódmym stadium (średnia: 16,7 mm), podczas gdy owady bezpłodne są oceniane na piąte stadium (średnia: 11,2 mm). W związku z tym nie możemy na razie zweryfikować, czy nasze gnotobiotyczne karaluchy mogą się z powodzeniem rozmnażać. Biorąc jednak pod uwagę łatwość, z jaką można ustalić nowe kohorty gnotobiotyczne przy użyciu tego podejścia, metoda ta jest bardzo obiecująca nawet w przypadku braku udowodnionej reprodukcji owadów gnotobiotycznych.

Podsumowując, protokół ten zapewnia wszechstronne narzędzie, które pozwala badaczom mikrobiomu prowadzić własny, tani "obiekt" gnotobiotyczny przy użyciu powszechnych materiałów laboratoryjnych. Podejście to może być wykorzystane do generowania gnotobiotycznych karaluchów do eksperymentów badających rolę mikrobioty w kształtowaniu zachowania, odporności, rozwoju i reakcji na stresgospodarza 21,26,27. Te gnotobiotyczne owady mogą być również inokulowane społecznościami syntetycznymi lub ksenobiotycznymi, a następnie wykorzystywane jako obiekty do badań mikrobiomu jelitowego23,28. Co więcej, elementy tego podejścia, w tym wykorzystanie komór inkubacyjnych wyłożonych pożywkami bakteriologicznymi jako wbudowanej kontroli sterylności, można uogólnić na inne systemy modelowe i mogą ułatwić rutynowe utrzymanie zwierząt gnotobiotycznych w mniejszych obiektach.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Ta publikacja była wspierana przez National Institute of General Medical Sciences of the National Institutes of Health pod numerem nagrody R35GM133789. Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i niekoniecznie reprezentują one oficjalne stanowisko National Institutes of Health. Autorzy chcieliby podziękować Joseyowi Dyerowi za śledzenie wskaźników sterylizacji, wskaźników wylęgu i tempa wzrostu gnotobiotycznych karaluchów.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
2X master mixNew England BioLabsM0482OneTaq MasterMix
Autoklawowalna karma dla szczurówZeiglerNIH-31 Zmodyfikowany zestaw do ekstrakcji DNA z
DNAOmega Bio-TekD-3350E.Z.N.A. Bakteryjne DNA; zawiera lizozym, szklane kulki, proteinazę K, (proteinaza K, wiązanie, mycie, elucja), kolumny DNA, 2-ml bufor wiążący probówkę zbiorczą
Omega Bio-TekPD099zawarty w zestawie do ekstrakcji DNA bakteryjnego Omega Biotek (bufor "HBC")
bulion do infuzji mózgowo-sercowej (BHI)Research Products InternationalB11000
Delikatne chusteczki do zadańKimWipeJS-KCC-34155-PKKimWipes
Omega Bio-TekD6492Zestaw E.Z.N.A. Cycle Pure; Można również użyć D6493; zawiera (oczyszczające, myjące, elucji)
bufor elucyjnyOmega Bio-TekPDR048zawarty w zestawie do ekstrakcji DNA bakteryjnego Omega Biotek zestaw do ekstrakcji DNA
Omega Bio-Tekn/aw zestawie do ekstrakcji DNA bakteryjnego Omega Biotek
Piec do hybrydyzacjiUVP95-0330-01pieca do hybrydyzacji do wstępnego podgrzewania buforu elucyjnego, ale prawdopodobnie można by również użyć kąpieli wodnej używana
szafa bezpieczeństwa biologicznego z przepływem laminarnymNuAire, Inc.Protokół NU-425-400określa to jako "kaptur z przepływem laminarnym" dla zwięzłości
lizozymuOmega Bio-Tekn/azawarty w zestawie do ekstrakcji DNA bakteryjnego Omega Biotek
roztwór podstawowy kwasu nadoctowego (32%)Sigma-Aldrich269336
Wazelinan/a
bufor proteinazy KOmega Bio-TekPD061zawarty w zestawie do ekstrakcji bakteryjnego DNA firmy Omega Biotek ("bufor TL")
bufor oczyszczającyOmega Bio-TekPDR042zawarty w zestawie CyclePure firmy Omega Biotek (bufor "CP")
RsaINew England BioLabsR0167Zawiera bufor (do wytrawiania)
Pojemnik wtórnynie dotyczynie dotyczydobrze sprawdza się do tego plastikowy pojemnik z pokrywką (taki jak Kritter Keeper) (25 cm długości x 15 cm szerokości x 22 cm wysokości); powinien być wystarczająco duży, aby zmieścić skosy BHI i
spektrofotometrThermoFisherND-2000Informacje katalogowe dotyczą
wytrząsarki termicznejEppendorfEP5386000028Thermomixer R
Tris-EDTAFisherBP1338-110 nm Tris, 1 mM EDTA, bufor płuczący pH 8
Omega Bio-TekPDR044zawarte w zestawie do ekstrakcji DNA bakteryjnego Omega Biotek (bufor do płukania DNA)
Ściółka z wiórów drzewnychP.J. Murphy Forest ProductsSani-Chips
autobakteryjnym Zestaw do oczyszczania DNA bakterii używamy do probówek NanoDrop2000

Bibliografia

  1. Yi, P., Li, L. The germfree murine animal: An important animal model for research on the relationship between gut microbiota and the host. Veterinary Microbiology. 157 (1-2), 1-7 (2012).
  2. Nature Biotechnology. Laying better plans for mice. Nature Biotechnology. 31 (4), 263-263 (2013).
  3. Nicklas, W., Keubler, L., Bleich, A. Maintaining and Monitoring the Defined Microbiota Status of Gnotobiotic Rodents. ILAR Journal. 56 (2), 241-249 (2015).
  4. Faith, J. J., Ahern, P. P., Ridaura, V. K., Cheng, J., Gordon, J. I. Identifying Gut Microbe-Host Phenotype Relationships Using Combinatorial Communities in Gnotobiotic Mice. Science Translational Medicine. 6 (220), 11(2014).
  5. Moon, C., et al. Vertically transmitted faecal IgA levels determine extra-chromosomal phenotypic variation. Nature. 521 (7550), 90-93 (2015).
  6. Eun, C. S., et al. Induction of Bacterial Antigen-Specific Colitis by a Simplified Human Microbiota Consortium in Gnotobiotic Interleukin-10-/- Mice. Infection and Immunity. 82 (6), 2239-2246 (2014).
  7. Cherbuy, C., et al. Microbiota matures colonic epithelium through a coordinated induction of cell cycle-related proteins in gnotobiotic rat. American Journal of Physiology: Gastrointestinal and Liver Physiology. 299 (2), 348-357 (2010).
  8. Van Den Abbeele, P., et al. Arabinoxylans and inulin differentially modulate the mucosal and luminal gut microbiota and mucin-degradation in humanized rats. Environmental Microbiology. 13 (10), 2667-2680 (2011).
  9. Stecher, B., Berry, D., Loy, A. Colonization resistance and microbial ecophysiology: using gnotobiotic mouse models and single-cell technology to explore the intestinal jungle. FEMS Microbiology Reviews. 37 (5), 793-829 (2013).
  10. Sugahara, H., et al. Probiotic Bifidobacterium longum alters gut luminal metabolism through modification of the gut microbial community. Scientific Reports. 5 (1), 13548(2015).
  11. Martín, R., Bermúdez-Humarán, L. G., Langella, P. Gnotobiotic Rodents: An In Vivo Model for the Study of Microbe-Microbe Interactions. Frontiers in Microbiology. 7, 409(2016).
  12. Mallapaty, S. Gnotobiotics: getting a grip on the microbiome boom. Lab Animal. 46 (10), 373-377 (2017).
  13. Nguyen, T. L. A., Vieira-Silva, S., Liston, A., Raes, J. How informative is the mouse for human gut microbiota research. Disease Models & Mechanisms. 8 (1), 1-16 (2015).
  14. Correa, M. A., Matusovsky, B., Brackney, D. E., Steven, B. Generation of axenic Aedes aegypti demonstrate live bacteria are not required for mosquito development. Nature Communications. 9 (1), 4464(2018).
  15. Trinder, M., Daisley, B. A., Dube, J. S., Reid, G. Drosophila melanogaster as a High-Throughput Model for Host–Microbiota Interactions. Frontiers in Microbiology. 8, 751(2017).
  16. Zheng, H., Steele, M. I., Leonard, S. P., Motta, E. V. S., Moran, N. A. Honey bees as models for gut microbiota research. Lab animal. 47 (11), 317-325 (2018).
  17. Engel, P., Moran, N. A. The gut microbiota of insects - diversity in structure and function. FeMS Microbiology Reviews. 37 (5), 699-735 (2013).
  18. Tinker, K. A., Ottesen, E. A. The Core Gut Microbiome of the American Cockroach, Periplaneta americana, Is Stable and Resilient to Dietary Shifts. Applied and Environmental Microbiology. 82 (22), 6603-6610 (2016).
  19. Zurek, L., Keddie, B. A. Contribution of the colon and colonic bacterial flora to metabolism and development of the american cockroach Periplaneta americana L. Journal of Insect Physiology. 42 (8), 743-748 (1996).
  20. Cruden, D. L., Markovetz, A. J. Microbial aspects of the cockroach hindgut. Archives of Microbiology. 138, 131-139 (1984).
  21. Pietri, J. E., Tiffany, C., Liang, D. Disruption of the microbiota affects physiological and evolutionary aspects of insecticide resistance in the German cockroach, an important urban pest. PLoS ONE. 13 (12), 0207985(2018).
  22. Benschoter, C., Wrenn, R. Germfree techniques for establishment and maintenance of a colony of aseptic German cockroaches. Annals of the Entomological Society of America. 65 (3), 641-644 (1972).
  23. Tegtmeier, D., Thompson, C. L., Schauer, C., Brune, A. Oxygen Affects Gut Bacterial Colonization and Metabolic Activities in a Gnotobiotic Cockroach Model. Applied and Environmental Microbiology. 82 (4), 1080-1089 (2016).
  24. Clayton, R. A simplified method for the culture of Blattella germanica under aseptic conditions. Nature. 184 (4693), 1166-1167 (1959).
  25. Doll, J. P., Trexler, P. C., Reynolds, L. I., Bernard, G. R. The Use of Peracetic Acid to Obtain Germfree Invertebrate Eggs for Gnotobiotic Studies. American Midland Naturalist. 69 (1), 231(1963).
  26. Wada-Katsumata, A., et al. Gut bacteria mediate aggregation in the German cockroach. Proceedings of the National Academy of Science. 112, 15678-15683 (2015).
  27. Jahnes, B. C., Herrmann, M., Sabree, Z. L. Conspecific coprophagy stimulates normal development in a germ-free model invertebrate. PeerJ. 7, 6914(2019).
  28. Mikaelyan, A., Thompson, C. L., Hofer, M. J., Brune, A. Deterministic Assembly of Complex Bacterial Communities in Guts of Germ-Free Cockroaches. Applied Environmental Microbiology. 82 (4), 1256-1263 (2016).
  29. Katoh, K., et al. Group-housed females promote production of asexual ootheca in American cockroaches. Zoological Letters. 3, 3(2017).
  30. Greenspan, L. Humidity fixed points of binary saturated aqueous solutions. Journal of Research of the National Bureau of Standards. 81 (1), 89-96 (1976).
  31. Bressan-Nascimento, S., Oliveira, D. M. P., Fox, E. G. P. Thermal requirements for the embryonic development of Periplaneta americana (L.) (Dictyoptera: Blattidae) with potential application in mass-rearing of egg parasitoids. Biological Control. 47 (3), 268-272 (2008).
  32. Nation, J. L. Insect Physiology and Biochemistry, Second Edition. , Taylor & Francis. Philadelphia, PA. (2008).
  33. House, H. L. Nutritional studies with Blattella germanica (L.) reared under aseptic conditions I. Equipment and technique. The Canadian Entomologist. 81 (5), 94-100 (1949).
  34. Stinson, L. F., Keelan, J. A., Payne, M. S. Identification and removal of contaminating microbial DNA from PCR reagents: impact on low-biomass microbiome analyses. Letters in Applied Microbiology. 68 (1), 2-8 (2018).
  35. Kircher, M., Sawyer, S., Meyer, M. Double indexing overcomes inaccuracies in multiplex sequencing on the Illumina platform. Nucleic Acids Research. 40, 3(2011).
  36. Sabree, Z. L., Kambhampati, S., Moran, N. A. Nitrogen recycling and nutritional provisioning by Blattabacterium, the cockroach endosymbiont. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of the America. 106 (46), 19521-19526 (2009).
  37. Ayayee, P. A., Ondrejech, A., Keeney, G., Muñoz-Garcia, A. The role of gut microbiota in the regulation of standard metabolic rate in female Periplaneta americana. PeerJ. 6, 4717(2018).
  38. Krajmalnik-Brown, R., Ilhan, Z. E., Kang, D. W., DiBaise, J. K. Effects of gut microbes on nutrient absorption and energy regulation. Nutrition in clinical practice : official publication of the American Society for Parenteral and Enteral Nutrition. 27 (2), 201-214 (2012).
  39. Rowland, I., et al. Gut microbiota functions: metabolism of nutrients and other food components. European Journal of Nutrition. 57 (1), 1-24 (2018).
  40. Gier, H. T. Growth rate in the cockroach Periplaneta americana (Linn). Annals of the Entomological Society of America. 40, 303-317 (1947).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Karaluchy gnotobiotycznesterylizacja ototekpod o e Brain Heart Infusionpolimorfizm d ugo ci fragment w restrykcyjnychkomora z laminarnym przep ywem powietrzap ukanie steryln wodsk ad mikrobiomuendosymbiont Blattabacteriumbadania mikrobiomu jelitowego
Założenie i utrzymanie gnotobiotycznych karaluchów amerykańskich (Periplaneta americana)
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.