Kwantyfikacja spożycia makroskładników odżywczych w termogenetycznym badaniu przesiewowym neuronów przy użyciu larw Drosophila

Summary

Opisany tutaj jest protokół, który umożliwia kolorymetryczną kwantyfikację ilości jedzenia spożywanego w określonym przedziale czasu przez larwy Drosophila melanogaster wystawione na działanie diety o różnej jakości makroskładników. Testy te są przeprowadzane w kontekście neuronalnego badania termogenetycznego.

Abstract

Zachowania związane z żerowaniem i odżywianiem pozwalają zwierzętom na dostęp do źródeł energii i składników odżywczych niezbędnych dla ich rozwoju, zdrowia i sprawności. Badanie neuronalnej regulacji tych zachowań jest niezbędne do zrozumienia fizjologicznych i molekularnych mechanizmów leżących u podstaw homeostazy żywieniowej. Wykorzystanie genetycznie sterowalnych modeli zwierzęcych, takich jak robaki, muchy i ryby, znacznie ułatwia tego typu badania. W ostatniej dekadzie muszka owocowa Drosophila melanogaster została wykorzystana jako potężny model zwierzęcy przez neurobiologów badających neuronalną kontrolę zachowań żywieniowych i żerowania. Choć niewątpliwie cenne, większość badań dotyczy dorosłych much. W tym miejscu opisujemy protokół, który wykorzystuje prostszy układ nerwowy larw do badania substratów neuronalnych kontrolujących zachowania żywieniowe, gdy larwy są narażone na diety różniące się zawartością białka i węglowodanów. Nasze metody opierają się na ilościowym kolorymetrycznym teście żywieniowym bez wyboru, przeprowadzonym w kontekście neuronalnego badania przesiewowego aktywacji termogenetycznej. Jako odczyt wykorzystano ilość pokarmu spożywanego przez larwy w odstępie 1 godziny, gdy były wystawione na działanie jednej z trzech diet znakowanych barwnikami, które różnią się stosunkiem białka do węglowodanów (P: C). Skuteczność tego protokołu wykazano w kontekście neurogenetycznego badania przesiewowego u larw Drosophila, identyfikując potencjalne populacje neuronów regulujące ilość spożywanego pokarmu w dietach o różnej jakości makroskładników. Udało nam się również sklasyfikować i pogrupować badane genotypy w klasy fenotypowe. Oprócz krótkiego przeglądu obecnie dostępnych metod w literaturze, omówiono zalety i ograniczenia tych metod, a także przedstawiono pewne sugestie dotyczące tego, w jaki sposób protokół ten może zostać dostosowany do innych konkretnych eksperymentów.

Introduction

Wszystkie zwierzęta polegają na zbilansowanej diecie, aby zdobyć niezbędne ilości składników odżywczych do przetrwania, wzrostu i reprodukcji¹. Na wybór tego, co i ile jeść, wpływa wiele czynników związanych ze stanem wewnętrznym zwierzęcia, takich jak poziom sytości i warunki środowiskowe, takie jak jakość jedzenia^2,3,4,5. Białko i węglowodany to dwa główne makroskładniki, a ich zbilansowane spożycie jest niezbędne do podtrzymania procesów fizjologicznych zwierząt. Dlatego zrozumienie mechanizmów neuronalnych kontrolujących zachowania żywieniowe i utrzymanie zrównoważonego spożycia tych makroskładników odżywczych jest niezwykle istotne. Dzieje się tak, ponieważ na cechy historii życia, takie jak długość życia, płodność i zdrowie metaboliczne, bezpośredni wpływ ma poziom spożycia białka^6,7,8,9,10.

Wykorzystanie prostszych, łatwiejszych do opanowania organizmów, które wykazują ewolucyjnie zachowane nawyki żywieniowe ze złożonymi zwierzętami, w tym ssakami, jest niezbędne dla tego typu badań. Co ważne, te prostsze modele zwierzęce stanowią dobrą okazję do analizy złożonych zagadnień biologicznych w kosztownym, etycznie i technicznie bardziej efektywnym kontekście. W ostatnich dziesięcioleciach Drosophila, ze swoim potężnym zestawem narzędzi genetycznych, skomplikowanym i stereotypowym zachowaniem oraz zachowaną architekturą obwodowych i odżywczych mechanizmów wyczuwania składników odżywczych u ssaków, była owocnym modelem dla neurobiologów behawioralnych¹¹. Ostatecznie mamy nadzieję, że dzięki zrozumieniu, w jaki sposób przyjmowanie pokarmu jest regulowane u tego zwierzęcia, z prostszym układem nerwowym, będziemy mogli zacząć rozplątywać nieprawidłowości neuronalne leżące u podstaw zaburzeń odżywiania u ludzi.

Badanie substratów neuronalnych do zachowań żywieniowych jest głęboko uzależnione od możliwości jednoczesnego mierzenia spożycia pokarmu przez zwierzęta przy jednoczesnym manipulowaniu ich aktywnością neuronalną. Ze względu na minimalne ilości spożywanego pokarmu, ilościowe określenie ilości pokarmu spożywanego przez muchy jest niezwykle trudne, a wszystkie obecnie dostępne metody mają znaczne ograniczenia. W związku z tym złotym standardem jest stosowanie kombinacji uzupełniających się metodologii¹². Dorosłe muchy były historycznie faworyzowane jako model genetyczny i behawioralny. Niemniej jednak, larwy Drosophila oferują również możliwości badania substratów neuronalnych kodujących zachowania żywieniowe. Ośrodkowy układ nerwowy (OUN) larwalny, składający się z około 12 000 neuronów, jest znacznie mniej złożony niż u dorosłego osobnika, który zawiera około 150 000 neuronów. Ta mniejsza złożoność jest nie tylko liczbowa, ale także funkcjonalna, ponieważ zachowania larw opierają się na prostszych funkcjach lokomotywy i systemach sensorycznych. Pomimo pozornej prostoty ich układu nerwowego, larwy nadal wykazują pełne zachowania żywieniowe, a niektóre metody ilościowego określania spożycia pokarmu u larw Drosophila zostały opisane5^,13,14,15. Łącząc się z manipulacjami aktywności neuronalnej, larwy Drosophila mogą stanowić bardzo podatny model do zrozumienia neuronalnej regulacji przyjmowania pokarmu.

Dostępny tutaj jest szczegółowy protokół ilościowego określania spożycia pokarmu przez larwy narażone na diety o różnej jakości makroskładników. Diety, tak zwane diety równoważące makroskładniki, różniły się zawartością białka i węglowodanów, szczególnie w odniesieniu do stosunku białka do węglowodanów (P:C): 1:1 (dieta bogata w białko), 1:4 (dieta pośrednia) i 1:16 (dieta uboga w białko), jak pokazano na Rysunek 1A. Krótko mówiąc, ustalono ilościowy test żywienia bez wyboru przy użyciu tych trzech diet opartych na izokalorycznych drożdżach sacharozowych (SY) barwionych niebieskim barwnikiem spożywczym. Ponieważ ekstrakt drożdżowy i sacharoza były używane jako źródła białka i węglowodanów, a oba zawierają węglowodany, różnice w proporcjach P:C uzyskano poprzez zmianę równowagi tych dwóch składników, jak opisano wcześniej¹⁶ i jak wskazano w Rysunek 1B. Schematyczny przegląd protokołu, pokazujący główne etapy eksperymentalne, jest dostępny w Rysunek 2.

Ten protokół został stworzony w celu zbadania roli określonych populacji neuronów w regulacji poziomu pokarmu larw w dietach o różnych proporcjach P:C oraz w kontekście termogenetycznego badania przesiewowego neuronów. Wykorzystano dobrze scharakteryzowane narzędzie neurogenetyczne z rodziny TRP (Transient Receptor Potential): Drosophila Transient Receptor Potential channel (dTRPA1), który jest kanałem kationowym bramkowanym temperaturą i napięciem, umożliwiającym wyzwalanie potencjałów czynnościowych, gdy temperatura otoczenia wzrośnie powyżej 25 °C¹⁷. Aby uzyskać ekspresję transgenu dTRPA1, wykorzystaliśmy linie Gal4 oparte na regionach cis-regulatorowych z genomu Drosophila, ustalonych w laboratorium Rubin, w kontekście projektu FlyLight w Janelia Research Campus^18,19.

Chociaż opisany tutaj protokół został ustalony w kontekście ekranu aktywacji, może być łatwo dostosowany przez eksperymentatora do innych konkretnych potrzeb lub zainteresowań, a mianowicie do przeprowadzenia ekranu tłumienia za pomocą wrażliwego na temperaturę tłumika neuronów ShibireTS²⁰, jako alternatywa dla dTRPA1. Ta i inne adaptacje są omówione w sekcjach protokołu i dyskusji.

Protocol

1. Przygotowanie diety sacharozowo-drożdżowej (SY)

1. Zważ wszystkie suche składniki (agar, drożdże, sacharoza) do zrównoważenia makroskładników odżywczych i diety hodowlanej L3. Ilości w gramach dla każdego ze składników potrzebnych do przygotowania 1 litra żywności są wskazane w Rysunek 1B.
   UWAGA: Weź pod uwagę, że do napełnienia szalki Petriego o średnicy 60 mm potrzeba około 13 ml pokarmu.
2. Rozpuść wszystkie składniki w sterylnej wodzie destylowanej (użyj około 50% całkowitej objętości wody potrzebnej do przygotowania potrawy) i mieszaj podłoże przez 5-10 min.
3. Autoklaw przez 50 min.
4. Po pozostawieniu pożywek do ostygnięcia, dodaj do diety roztwory nipaginy i kwasu propionowego o końcowym stężeniu (v/v) odpowiednio 3% i 0,3%. Do diet równoważących makroskładniki odżywcze dodaj niebieski barwnik spożywczy do końcowego stężenia (v/v) 1%. Uzupełnij całkowite objętości wodą destylowaną.
5. Ostrożnie wlej diety spożywcze na szalki Petriego o średnicy 60 mm, tak aby ilość wlanego pokarmu była w przybliżeniu taka sama na każdej z płytek. Oznacz talerze stosunkami P:C diet.
   UWAGA: Przygotuj diety równoważące makroskładniki odżywcze w dniu testu karmienia. Jeśli nie jest to możliwe, przygotowane diety należy przechowywać w temperaturze 4 °C w szczelnie zamkniętym pojemniku przez okres nie dłuższy niż 3 dni. Dłuższe okresy przechowywania sprawiają, że dieta jest zbyt sucha i twarda, a larwy nie mogą zakopać się w podłożu.

2. Krzyżówka genetyczna linii rodzicielskich

UWAGA: Użyj systemu Gal4/UAS²¹, aby skonfigurować krzyżówki genetyczne. W tym protokole, w celu aktywacji funkcji neuronalnych w określonych populacjach neuronów, wykorzystano dziewicze samice UAS dTRPA1 line¹⁷ i skrzyżowano je z samcami z linii Janelia Gal4 (Rysunek 2A). Zastosowana kontrola genetyczna była potomstwem krzyżówki linii dTRPA1 i "pustej linii GAL4", która przenosi Gal4 w wektorze użytym do wygenerowania kolekcji Rubin Gal4, ale bez obecnego fragmentu regulatorowego (attP2)²². Aby promować tłumienie neuronów, zamiast dTRPA1 można użyć linii UAS kodującej ShibireTS²⁰.

1. Ustaw klatki do pobierania zarodków o średnicy 60 mm z płytkami diety hodowlanej L3, uzupełnionymi aktywną pastą drożdżową.
2. Przenieś dorosłe dziewicze samice UAS dTRPA1 i samce Janelia Gal4 w wieku 5-8 dni do klatek do pobierania zarodków i pozwól na krycie przez 24-48 godzin, w temperaturze 25 °C, przy wilgotności 60% i cyklu jasno-ciemnym 12:12 (Rysunek 2A). W przypadku klatek do pobierania zarodków o średnicy 60 mm należy użyć około 100 dziewiczych samic i 30 samców na krzyżówkę.
3. Pod koniec okresu krycia należy usunąć i wyrzucić płytki diety L3 używane w krzyżówkach genetycznych. Zastąp je świeżymi płytkami z dietą odchowu L3 w celu przeprowadzenia składania jaj i oceny stanu larw.

3. Przygotowanie larw trzeciego stadium rozwojowego (L3)

1. Przenieść pokryte dorosłe muchy na świeże płytki z dietą odchowu L3 i pozwolić na składanie jaj przez 3-4 godziny, w temperaturze 25 °C (Rysunek 2B). Upewnij się, że wszystkie płytki są oznaczone genotypem, stosunkiem P:C diety i datą złożenia jaj.
   UWAGA: Aby zaoszczędzić czas, składanie jaj należy wykonywać bezpośrednio w paszy odchowawczej L3, co pozwala uniknąć dodatkowego obchodzenia się z jajami. W przypadku badań genetycznych na małą skalę, optymalizację składania jaj można uzyskać poprzez zastosowanie płytek agarowych z sokiem jabłkowym.
2. Pod koniec okresu składania jaj wyjmij talerze z klatek i przykryj je plastikowymi pokrywkami. W przypadku, gdy ekstrakt drożdżowy jest używany do uzupełnienia płytek odchowawczych L3, należy upewnić się, że wszystkie resztki drożdży zostały usunięte pod koniec składania jaj. Jest to ważne, aby uniknąć nierównomiernego żerowania podczas wzrostu larw.
   UWAGA: Kryte dorosłe osobniki można przenieść na świeże płytki z dietą odchowową L3, dzięki czemu przeprowadza się więcej składania jaj i można uzyskać więcej eksperymentalnych larw. Kolejne składanie jaj może odbywać się z tymi samymi dorosłymi osobnikami w ciągu jednego tygodnia roboczego.
3. Oszacuj liczbę jaj na płytce i utrzymuj gęstość larw na maksymalnie 200 zarodków na płytce. Oszacowanie to można przeprowadzić, licząc liczbę zarodków w jednej czwartej płytki.
   UWAGA: Przepełniona płytka opóźni rozwój larw i wpłynie na zachowania żywieniowe larw.
4. Inkubuj płytki hodowlane L3 w temperaturze 18 °C (dopuszczalna temperatura), wilgotności 60% i cyklu 12:12 jasno-ciemność i pozwól larwom rosnąć przez 9 dni (Rysunek 2B).
5. Dziewiątego dnia po złożeniu jaj (AEL) zebrać trzy grupy po 10 L3 z każdego z genotypów (oraz dla kontrprób), które mają zostać poddane badaniu. Dodatkowo zbierz grupy po 10 L3 do kontroli "żywności bez barwnika". Upewnij się, że pobieranie larw odbywa się w równoważnych porach dnia wykorzystywanych do składania jaj (np. jeśli składanie jaj miało miejsce między 10 a 14, zbierz larwy w tym samym okresie 9 dni AEL) i jest wykonywane, tak delikatnie, jak to możliwe, za pomocą kleszczy #5 lub kleszczy do wagi piórkowej. Bezpośrednio przenieść larwy, jak wskazano w następnym kroku (3.6).
   UWAGA: Zwierzęta kontrolne "pokarm o zerowym barwniku" to larwy, które w teście żywieniowym otrzymują pokarm bez niebieskiego barwnika. Kontrola ta jest niezbędna do usunięcia absorbancji tła ekstraktów larwalnych.
6. Przenieś zebrane larwy doświadczalne do plastikowych naczyń zawierających 1 ml wody. Upewnij się, że zbierane są L3, a nie L2, postępując zgodnie ze wskazówkami podanymi w Rysunek 3.
   UWAGA: Zbieranie L3 do plastikowych łodzi zawierających wodę lub 1x sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) jest ważne, aby utrzymać larwy dobrze nawodnione przed rozpoczęciem testu karmienia. Jest to szczególnie ważne, jeśli w tym samym czasie pobieranych jest kilka eksperymentalnych grup L3 z różnych genotypów. Śledź kolejność odbioru dla każdej grupy, aby zminimalizować różnice w czasie trwania deprywacji żywności dla każdej grupy. Użycie plastikowych łódek na tym etapie ułatwia opcjonalny krok 4.3, ponieważ umożliwia larwom unoszenie się bezpośrednio do łaźni wodnej.

4. Aktywacja termogenetyczna i test żywienia bez wyboru

UWAGA: Zaleca się przeprowadzanie testów żywieniowych mniej więcej o tej samej porze dnia, aby zminimalizować możliwe różnice związane z rytmem okołodobowym. Ponadto zawsze przeprowadzaj eksperymenty kontrolne (potomstwo linii "pustej Gal4" skrzyżowane z UAS dTRPA1 i larwy "bezbarwnego pokarmu"), równolegle z interesującymi genotypami.

1. Ustawić inkubator na 30 °C (temperatura niedopuszczalna) i utrzymywać wysoki poziom wilgotności (co najmniej 65%), aby uniknąć odwodnienia larw podczas testu.
2. Przed rozpoczęciem oznaczania karmienia należy zrównoważyć temperaturę płytek testowych, ogrzewając je w temperaturze 30 °C przez 30 minut.
3. (Opcjonalnie) Szok termiczny eksperymentalnych larw przez 2 minuty w łaźni wodnej o temperaturze 37 ° C. Wykonaj ten krok ze zwierzętami w plastikowych łodziach z balastem zawierających trochę wody.
   UWAGA: Celem tego etapu jest intensyfikacja aktywacji neuronów poprzez promowanie wypalania neuronów od początku testu karmienia.
4. Trzymaj w pogotowiu wiele timerów na 1 godzinę. Liczba timerów, które należy zastosować, zależy od liczby badanych grup eksperymentalnych oraz od poziomu umiejętności eksperymentatora w obchodzeniu się z larwami.
   UWAGA: Użycie wielu timerów ma kluczowe znaczenie dla utrzymania spójnego czasu trwania testu dla wszystkich genotypów.
5. Ostrożnie spuść wodę z plastikowych łódek i za pomocą zwilżonej miękkiej szczotki delikatnie przenieś grupy L3 z łodzi na środek płytek testowych. Załóż pokrywki talerzy z powrotem i uruchom minutnik dla każdej płytki (lub grupy talerzy), aby utrzymać dokładne 1-godzinne sesje karmienia.
6. Pozwól larwom żerować przez 1 godzinę, w temperaturze 30 °C, w ciemności (Rysunek 2C).
   UWAGA: Wydajność testu w ciemności jest ważna dla kontrolowania różnic w sygnałach wizualnych w różnych dietach, ponieważ diety będą różnić się tonami, nawet jeśli zawierają takie samo stężenie barwnika.
7. Przerwij test karmienia, przenosząc płytki do łaźni lodowej. Dociśnij lód tak mocno, jak to możliwe, aby zapewnić stabilną powierzchnię dla talerzy.
   UWAGA: Niskie temperatury będą sprzyjać końcowi karmienia, hamując zachowania związane z kopaniem i kopaniem. Większość larw po kilku minutach wynurzy się na talerze z jedzeniem, ułatwiając ich powrót do zdrowia w kolejnych krokach.

5. Ekstrakcja barwnika spożywczego

1. Przygotuj 2 ml mikroprobówek dla każdej grupy 10 badanych L3, zawierających w przybliżeniu taką samą ilość szklanych kulek o średnicy 0,5 mm (wystarczającą do wypełnienia dolnej części mikroprobówki) i 300 μl lodowatego metanolu. Trzymaj mikroprobówki w chłodzie, używając chłodziarki stołowej.
   UWAGA: Metanol jest wysoce łatwopalny i toksyczny. Postępuj zgodnie ze wszystkimi procedurami bezpieczeństwa zalecanymi do obchodzenia się z tym odczynnikiem, w tym pracy w dobrze wentylowanym pomieszczeniu i noszenia rękawic nitrylowych.
   UWAGA: Stosowanie metanolu jest ważne dla utrwalenia próbek larw i uniknięcia reakcji melanizacji w naskórku.
2. Używając #5 lub kleszczy do masek piórkowych, ostrożnie odzyskaj grupy 10 L3 z płytek testowych do karmienia i przenieś je na pokrywki płytek testowych zawierających trochę wody. Opłucz larwy, aby usunąć wszelkie resztki jedzenia z ich ciał, jednocześnie delikatnie dotykając larw, aby uniknąć obrażeń. Prowadzi się zapis liczby odzyskanych larw dla każdego genotypu na kontrpróbę, tak aby można było określić ilościowo średnią ilość pokarmu pobranego przez larwę.
   UWAGA: Zranione larwy należy wyrzucić, ponieważ będą miały melanizowany naskórek, który nie nadaje się do kwantyfikacji kolorymetrycznej.
3. Przenieść grupy L3 do mikroprobówek o objętości 2 ml przygotowanych w 5.1.
4. Poddać lizie tkanki larwalne w celu wyekstrahowania barwnika pokarmowego z jelit metodą lizy mechanicznej przy użyciu lizera tkankowego i szklanych kulek dodanych w kroku 5.1. (Jeśli lyzer tkankowy nie jest dostępny, użyj tłuczka homogenizującego). Preferencyjnie wykonaj ten krok w temperaturze 4 °C (Rysunek 2D).
   UWAGA: Czas trwania tego kroku będzie zależał od używanego sprzętu. Przy użyciu konwencjonalnego lizera tkankowego wystarczająca jest 1 minuta ekstrakcji. W przypadku ograniczeń czasowych protokół może zostać wstrzymany na końcu tego kroku i kontynuowany później. Próbki należy przechowywać w temperaturze -20 °C.
5. Przenieś ekstrakty do czystych mikroprobówek o pojemności 1,5 ml, bezpośrednio odwracając mikroprobówki o pojemności 2 ml na nowe mikroprobówki o pojemności 1,5 ml. Jeśli zostanie to wykonane delikatnie, większość szklanych kulek pozostanie na dnie mikroprobówki o pojemności 2 ml.
6. Usunąć resztki komórkowe, odwirowując ekstrakty, z maksymalną prędkością przez 10 minut, w temperaturze 4 °C.
7. Zebrać supernatanty do oczyszczenia mikroprobówek o pojemności 1,5 ml. Jeśli szczątki komórkowe są nadal widoczne w supernatantach, powtórz kroki 5.6 i 5.7.

6. Kwantyfikacja kolorymetryczna spożycia żywności

1. Przygotować roztwory wzorcowe w celu wygenerowania krzywej kalibracyjnej, wykonując seryjne rozcieńczenia 1:2 w metanolu wyjściowego roztworu niebieskiego barwnika. Jako ślepą próbę należy używać tylko metanolu. Stężenie norm zależy od poziomu spożycia pokarmu przez zwierzęta.
   UWAGA: W przypadku prezentowanego tu ekranu pilotażowego, ze względu na to, że stężenia barwnika uzyskane dla ekstraktów larwalnych mieściły się w zakresie od 0,02 do 1,93 μL/ml, zastosowano krzywą wzorcową uzyskaną poprzez pomiar absorbancji 8 seryjnych rozcieńczeń roztworu barwnika niebieskiego o stężeniu 2 μL/ml w metanolu. W razie potrzeby zwiększyć lub zmniejszyć stężenie tych roztworów, w zależności od stężenia barwnika w próbkach doświadczalnych.
2. Przenieść 100 μl próbek doświadczalnych (otrzymanych w kroku 5.7), wzorców i ślepej próby (krok 6.1) do dołków 96-dołkowej mikropłytki i zmierzyć absorbancję przy 600 nm, używając czytnika płytek (Rysunek 2E). Aby usunąć absorbancję tła, należy zmierzyć absorbancję ekstraktów otrzymanych od larw karmionych pokarmem bez niebieskiego barwnika jako "zero" dla ekstraktów z larw ("kontrola żywności bez barwnika").
3. Wygeneruj krzywą wzorcową i skoreluj wartości absorbancji uzyskane dla próbek z każdej doświadczalnej grupy larwalnej z ilością pobranego pokarmu (objętość w ml). Znajdź średnie spożycie pokarmu na larwę, biorąc pod uwagę liczbę larw zebranych dla każdej grupy w kroku 5.2

Results

Larwy Drosophila regulują spożycie białka kosztem spożywania nadmiaru węglowodanów²³ (schemat w Rysunek 2E). W rzeczywistości ta priorytetyzacja spożycia białka została zaobserwowana u wielu innych zwierząt i nazywa się dźwignią białka^24,25.

Korzystając z tej silnej reakcji behawioralnej na karmienie, zaprojektowano ekran oparty na zachowaniu, mający na celu zidentyfikowani...

Discussion

Dzięki temu protokołowi można przetestować zdolność larw pod wpływem aktywacji termogenetycznej określonych populacji neuronów do regulowania poziomu spożycia białka i węglowodanów, dwóch głównych makroskładników, po wystawieniu na dietę o różnym składzie P:C. Metoda ta została przetestowana w kontekście wstępnych badań przesiewowych larw, których celem była identyfikacja populacji neuronów związanych z kontrolą spożycia pokarmu w dietach o różnej jakości makroskładników. Praca ta przyczynia się również do wykazania, że ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mikroprobówki 1,5 ml	Sarstedt AG & Co.	72.690.001
10xPBS	Nytech	MB18201
2,0 ml mikroprobówki	Sarstedt AG & Co.	72.695.500
60 mm szalki Petriego	Greiner Bio-one, Austria	628161
96-dołkowe mikropłytki	Santa Cruz Biotechnology	SC-204453
Agar	Pró-vida, Portugalia
Chłodziarka stołowa	Nalgene, USA	Labtop Cooler 5115-0032
Niebieski barwnik spożywczy	Rayner, Billingshurst, Wielka Brytania
Pożywki do rozbijania komórek	Scientific Industries, Inc.	888-850-6208	(koraliki szklane 0,5 mm)
Łodzie do naczyń	Santa Cruz Biotechnology	SC-201606
Klatka do pobierania zarodków na szalki Petriego 60 mm	Flystuff, Scientific Laboratory Supplies, Wielka Brytania	FLY1212 (59-100)
Kleszcze piórkowe	BioQuip Products, USA	4750
Pokarm na muchy do konserwacji			zapasów1 l karmy zawiera: 10 g agaru, 100 g ekstraktu drożdżowego, 50 g sacharozy, 30 ml nipaginu, 3 ml kwasu propionowego
Kleszcze #5	Dumont	0108-5-PS	Standardowe końcówki, INOX, 11cm
Inkubator	LMS Ltd, UK	Series 2, Model 230	Do termogenetycznego testu żywieniowego (30? C)
Inkubator	Percival Scientific, USA	DR36NL	Do etapowania larw (19? C)
Linie Janelia		Badawczy Janelia	Szczegółowe informacje w Tabeli 2
		równoważące makroskładniki Skład	i informacje o wartości odżywczej na rysunku 1
Metanol	VWR	Numer CAS: 67-56-1
Nipagin (4-hydroksybenzoesan metylu)	Sigma-Aldrich	H5501
Rękawice nitrylowe	VWR, USA
Wirówka z chłodzeniem	Eppendorf, Niemcy	5804 R / Numer seryjny: 5805CI364293
Rubin Gal4 ines	Janelia Research Campus		Stoks dostępne w Bloomington Drosophila Stock Center
ShibireTS UAS line	Bloomington Drosophila Stock Center	Numer BDSC: 66600	Dostarczone przez Carlos Ribeiro Group
Miękkie szczotki			Do sortowania znieczulonych muszek owocowych
Czytnik płytek spektrofotometru	Thermo Fisher Scientific	Multiskan Go 51119300
Mikroskop stereoskopowy	Nikon	1016625
Sacharoza	Sidul, Portugalia
Dieta			Skład i informacje o wartości odżywczej na rysunku 1
Timer
Ubijak do tkanek / kulek	MP Biomedicals, USA	FastPrep-24 6004500
TRPA1 Linia UAS	Bloomington Drosophila Stock Center	Numer BDSC: 26264	Wyraża TrpA1 pod kontrolą UAS; może być używany do eksperymentalnej aktywacji neuronów w wieku 25 ? C
Kąpiel wodna	Sheldon Manufacturing Inc., USA	W20M-2 / 03068308 / 9021195
Ekstrakt drożdżowy	Pró-vida, Portugalia		51% białka, 15% węglowodanów