Artykuł metodologiczny

Model epileptogenezy w organotypowych kulturach warstwowych kory nosa i hipokampa

DOI:

10.3791/61330

⸱

18 marca 2021

 ,  ,  , 
1Instituto de Farmacologia e Neurociências, Faculdade de Medicina da Universidade de Lisboa, 2Instituto de Medicina Molecular João Lobo Antunes, Faculdade de Medicina da Universidade de Lisboa

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisujemy przygotowanie organicznych plastrów kory nosa i hipokampa. Przy stopniowym i kontrolowanym pozbawianiu surowicy, plastry te przedstawiają ewoluujące zdarzenia podobne do padaczki i mogą być uważane za model epileptogenezy ex vivo. System ten stanowi doskonałe narzędzie do monitorowania dynamiki spontanicznej aktywności, a także do oceny progresji cech neurozapalnych w całym przebiegu epileptogenezy.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Organotypowe kultury warstwowe są powszechnie używane do modelowania zaburzeń mózgu i są uważane za doskonałe platformy do oceny potencjału neuroprotekcyjnego i terapeutycznego leku. Plastry organotypowe są przygotowywane z eksplantowanych tkanek i reprezentują złożone wielokomórkowe środowisko ex vivo. Zachowują trójwymiarową cytoarchitekturę i lokalne środowisko komórek mózgowych, utrzymują łączność neuronalną i wzajemną interakcję neuron-glej. Plastry organotypowe hipokampa są uważane za odpowiednie do zbadania podstawowych mechanizmów epileptogenezy, ale badania kliniczne i modele zwierzęce padaczki sugerują, że kora nosa, składająca się z kory okołożołądkowej i śródwęchowej, odgrywa istotną rolę w powstawaniu napadów.

Tutaj opisujemy przygotowanie organicznych plastrów kory nosa i hipokampa. Zapisy spontanicznej aktywności z obszaru CA3 pod perfuzją z pełną pożywką wzrostową, w temperaturze fizjologicznej i przy braku manipulacji farmakologicznych, wykazały, że wycinki te przedstawiają ewoluujące zdarzenia podobne do padaczkowych w czasie w kulturze. Zaobserwowano również zwiększoną śmierć komórek poprzez test wychwytu jodku propidyny i glejozę, ocenianą za pomocą immunohistochemii sprzężonej z fluorescencją. Przedstawione podejście eksperymentalne podkreśla wartość organotypowych kultur warstwowych kory nosa i hipokampa jako platformy do badania dynamiki i progresji epileptogenezy oraz do badań przesiewowych potencjalnych celów terapeutycznych dla tej patologii mózgu.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Padaczka, jedno z najbardziej rozpowszechnionych zaburzeń neurologicznych na świecie, charakteryzuje się okresowym i nieprzewidywalnym występowaniem zsynchronizowanej i nadmiernej aktywności neuronalnej w mózgu. Pomimo różnych dostępnych leków przeciwpadaczkowych (AED), jedna trzecia pacjentów z padaczką jest oporna na terapię1 i nadal doświadcza napadów padaczkowych i pogorszenia funkcji poznawczych. Co więcej, dostępne defibrylatory AED utrudniają poznanie ze względu na ich stosunkowo uogólnione działanie na aktywność neuronalną. Padaczka, którą trudno jest badać u ludzi, ze względu na liczne i niejednorodne urazy padaczkowe, długie okresy utajenia trwające od miesięcy do dziesięcioleci oraz mylące efekty leczenia przeciwdrgawkowego po pierwszym spontanicznym napadzie.

Identyfikacja potencjalnych środków terapeutycznych do leczenia epilepsji stała się możliwa dzięki zwierzęcym modelom padaczki: 1) modele genetyczne, które wykorzystują genetycznie predysponowane zwierzęta, u których napady występują spontanicznie lub w odpowiedzi na bodziec sensoryczny; 2) modele napadów padaczkowych wywołanych stymulacją elektryczną; oraz 3) farmakologiczne modele indukcji napadów, które wykorzystują m.in. pilokarpinę (agonistę receptora muskarynowego), kainian (agonista receptora kainianowego) lub 4-aminopirydynę (bloker kanału potasowego). Modele te odegrały kluczową rolę w zrozumieniu zmian w zachowaniu, a także mechanizmów molekularnych i komórkowych leżących u podstaw padaczki, a także doprowadziły do odkrycia wielu defibrylatorów AED2.

Preparaty ex vivo są również potężnym narzędziem do badania mechanizmów leżących u podstaw epileptogenezy i iktogenezy. Ostre wycinki hipokampa, które umożliwiają badania elektrofizjologiczne żywych komórek w okresie 6-12 godzin, oraz organtypowe wycinki hipokampa, które mogą być przechowywane w inkubatorze przez okres dni lub tygodni, były szeroko stosowane w badaniach aktywności padaczkowej3.

Organotypowe wycinki mózgu są przygotowywane z eksplantowanej tkanki i reprezentują fizjologiczny trójwymiarowy model mózgu. Wycinki te zachowują cytoarchitekturę interesującego nas regionu i obejmują wszystkie komórki mózgowe oraz ich komunikację międzykomórkową4. Najczęściej używanym regionem do długoterminowych hodowli organotypowych jest hipokamp, ponieważ region ten jest dotknięty utratą neuronów w wielu stanach neurodegeneracyjnych. Są one szeroko stosowane do modelowania zaburzeń mózgu i są uważane za doskonałe narzędzia do oceny potencjału neuroprotekcyjnego i terapeutycznego leku5,6. Modele epileptogenezy, udaru mózgu i toksyczności wywołanej przez Aβ opisano w wycinkach organotypowych hipokampa7,8,9,10. Chorobę Parkinsona badano w brzusznym śródmózgowiu i prążkowiu, a także w korze-ciele modzelowatym-prążkowiu-istocie czarnej, plastry organotypowe11. Organotypowe kultury warstw móżdżku naśladują wiele aspektów mielinizacji aksonów i funkcji móżdżku i są szeroko rozpowszechnionym modelem do badania nowych strategii terapeutycznych w stwardnieniu rozsianym12.

Jednak badania kliniczne i modele zwierzęce epilepsji sugerują, że kora nosowa, złożona z kory okołonosowej i śródwęchowej, odgrywa rolę w generowaniu napadów13. W ten sposób ustalono model epileptogenezy w warstwach organotypowych kory nosa i hipokampa14. Pod wpływem stopniowego i kontrolowanego pozbawiania surowicy, organotypowe plastry kory nosa-hipokampa przedstawiają ewoluujące zdarzenia podobne do padaczkowych, w przeciwieństwie do analogicznych plastrów zawsze trzymanych w pożywce zawierającej surowicę.

W epilepsji, podobnie jak w wielu ostrych i przewlekłych chorobach ośrodkowego układu nerwowego, neurocentryczne widzenie nie wyjaśnia mechanizmów leżących u podstaw początku i postępu choroby. Dowody kliniczne i eksperymentalne wskazują na zapalenie mózgu, w którym mikroglej i astrocyty odgrywają istotną rolę, jako jeden z kluczowych czynników przyczyniających się do procesu padaczkowego. Eksperymenty farmakologiczne na zwierzęcych modelach padaczki sugerują, że efekty przeciwpadaczkowe można osiągnąć poprzez ukierunkowanie na szlaki prozapalne, a obecnie zapalenie nerwów jest uważane za nową opcję rozwoju podejść terapeutycznych dla padaczki15.

Tutaj dokładnie opisujemy przygotowanie kultur organotypowych w warstwach kory nosowej i hipokampa, a także szczegóły dotyczące rejestrowania spontanicznej aktywności epileptiformalnej z nich. Podkreślamy, że system ten naśladuje kilka neurozapalnych aspektów padaczki, dzięki czemu nadaje się do zbadania roli komórek glejowych i zapalenia nerwów w tej patologii. Co więcej, stanowi łatwą w użyciu platformę do badań przesiewowych potencjalnych podejść terapeutycznych w leczeniu padaczki.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prawo portugalskie i wytyczne Unii Europejskiej (2010/63/UE) były przestrzegane we wszystkich procedurach dotyczących ochrony zwierząt do celów naukowych. Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Organ ds. Dobrostanu Zwierząt iMM (ORBEA-iMM) oraz właściwy organ krajowy (DGAV – Direção Geral de Alimentação e Veterinária).

1. Przygotowanie plastrów kory nosowej i hipokampa

UWAGA: Do przygotowania wycinków kory nosowej i hipokampa używa się szczurów P6-7 Sprague-Dawley.

  1. Konfiguracja kultury i przygotowanie podłoża
    1. W dniu poprzedzającym hodowlę należy przygotować wymagane podłoża i umieścić je w temperaturze 4 °C.
    2. Przygotuj pożywkę preparacyjną: 25 mM glukozy w zrównoważonym roztworze soli Geya (GBSS).
    3. Przygotuj pożywkę: 50% Opti-MEM, 25% HBSS, 25% surowica końska (HS), 25 mM glukozy, 30 μg/ml Gentamycyny.
    4. Przygotuj pożywkę podtrzymującą: Neurobaseal-A (NBA), 2% B27, 1 mM L-glutaminy, 30 μg/ml Gentamycyny, HS (15%, 10%, 5% i 0%).
  2. Pobieranie mózgów
    1. Tuż przed rozpoczęciem hodowli dodać 1,1 ml pożywki do każdego dołka płytki 6-dołkowej za pomocą pipety P1000 i umieścić ją w temperaturze 37 °C.
    2. Umieść cały sprzęt (mikroskop preparacyjny, rozdrabniacz tkanek, lampę sekcyjną, narzędzia preparacyjne, elektrody, płytki, wkładki i bibuły filtracyjne) w komorze bezpieczeństwa biologicznego i sterylizuj w świetle UV przez 15 minut.
    3. Dostosuj grubość plastra do 350 μm.
    4. Wyjmij GBSS z lodówki. Dodaj 5 ml GBSS do sześciu szalek Petriego. Na jedno zwierzę przypada sześć szalek Petriego.
    5. Poddaj eutanazji szczeniaka szczura. Wykonaj dekapitację za pomocą ostrych nożyczek u podstawy pnia mózgu zwierzęcia.
    6. Umyj głowę zwierzęcia trzy razy w zimnym GBSS i zabierz ją do szafki bezpieczeństwa.
  3. Izolacja tkanek i przygotowanie plastrów
    1. Mocno włóż ostre kleszcze do oczodołów, aby przytrzymać głowę.
    2. Cienkimi nożyczkami przetnij skórę/skórę głowy wzdłuż linii środkowej, zaczynając od otworu kręgowego w kierunku płatów czołowych i odłóż na bok.
    3. Przeciąć w ten sam sposób czaszkę i wzdłuż poprzecznej szczeliny mózgowej (przestrzeń między mózgiem a móżdżkiem). Za pomocą zakrzywionych długich kleszczy rozsuń go.
    4. Wyrzuć opuszki węchowe szpatułką. Usuń mózg z głowy i umieść go w lodowatym GBSS z powierzchnią grzbietową skierowaną do góry (Ryc. 1A).
    5. Włóż cienkie kleszcze do móżdżku i idź wzdłuż linii środkowej, a szpatułka bardzo ostrożnie otwiera każdą półkulę (Ryc. 1B).
    6. Za pomocą kleszczyków o krótkiej krzywiźnie ostrożnie usuń nadmiar tkanki pokrywającej hipokamp, nie dotykając struktury hipokampa. Następnie za pomocą szpatułki przetnij poniżej każdego hipokampa (Rysunek 1C).
    7. Podnieś jedną półkulę i umieść ją hipokampem skierowanym do góry na bibule filtracyjnej. Powtórz procedurę z drugą półkulą i umieść ją równolegle do pierwszej, w bibule filtracyjnej. Połóż bibułę filtracyjną na rozdrabniaczu tkanek, tak aby półkule były prostopadłe do ostrza, i pokrój półkule na plastry 350 μm (Rysunek 1D).
    8. Umieść pokrojoną tkankę na szalce Petriego z zimnym GBSS (Ryc. 1E).
    9. Ostrożnie oddziel plastry za pomocą elektrod z okrągłą końcówką (Rysunek 1F). Zachowaj tylko plastry z nienaruszoną strukturalnie korą nosa i hipokampem. Obszary DG i CA powinny być idealnie zdefiniowane, podobnie jak kora śródwęchowa i okołośródbowa (Rysunek 1G).
    10. Umieść każdy plasterek na wkładce (Rysunek 1H-I), za pomocą szpatułki i elektrody z okrągłą końcówką. Usuń nadmiar pożywki preparacyjnej wokół każdej plastry za pomocą pipety P20 (Rysunek 1J). Cztery wycinki kory nosa i hipokampa można hodować w jednej wstawce (Rysunek 1K).
  4. Utrzymanie kultury
    1. Zmieniaj podłoże co drugi dzień.
    2. Rozgrzać podłoże w temperaturze 37 °C.
    3. Wyjmij płytki z inkubatora. Podnieś każdą wkładkę, przytrzymując plastikową krawędź kleszczami (Rysunek 1L).
    4. Użyj wolnej ręki, aby zassać podłoże ze studni. Umieść wkładkę z powrotem w studzience i dodaj 1 ml za pomocą pipety P1000 świeżo podgrzanego podłoża (Rysunek 1M). Powtórz tę czynność dla wszystkich wkładek. Upewnij się, że między membraną a medium nie są uwięzione pęcherzyki powietrza.

UWAGA: Plastry podobne do epilepsji są poddawane stopniowemu i kontrolowanemu pozbawianiu surowicy w pożywce. Począwszy od 9 Days In Vitro (DIV), wycinki są utrzymywane w NBA bez HS14.

figure-protocol-1
Rycina 1: Szczegółowa procedura przygotowania wycinków organotypowych kory nosa i hipokampa. (A) Usuń mózg z głowy i umieść go w lodowatym GBSS z powierzchnią grzbietową skierowaną do góry. (B) Włóż kleszcze do móżdżku. Otwórz mózg przez linię środkową i usuń nadmiar tkanki nad hipokampem. (C) Za pomocą szpatułki naciętej poniżej hipokampa, jak wskazują strzałki. (D) Umieścić oba hipokampy skierowane do góry i równolegle do siebie na bibule filtracyjnej i wyciąć plastry 350 μm na rozdrabniaczu tkanek. (E) Umieść pokrojony hipokamp w lodowatym GBSS. (F) Oddziel plastry za pomocą szklanych elektrod z okrągłymi końcówkami. (G) Wybierz tylko te plasterki, które przedstawiają nienaruszoną korę nosa i hipokamp. (H, I) Za pomocą okrągłej elektrody szklanej z końcówką wepchnij każdy plasterek do szpatułki i umieść go na wkładce. (J) Usuń GBSS otaczający plasterek. (K) Umieść cztery plasterki w każdej wkładce. (L) Aby zmienić pożywkę, należy podnieść wkładkę i zassać pożywkę szklaną pipetą. (M) Dodać świeżą pożywkę, umieszczając pipetę między wkładką a ściankami płytki 6-dołkowej. Upewnij się, że pod plastrami nie ma pęcherzyków powietrza. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

2. Zapisy elektrofizjologiczne

UWAGA: Zapisy elektrofizjologiczne zostały przeprowadzone w organotypowych warstwach kory nosa i hipokampa na 7, 14 i 21 DIV w komorze typu interfejsowego. Nagrania uzyskano za pomocą wzmacniacza, zdigitalizowano i przeanalizowano za pomocą oprogramowania. Wszystkie nagrania były filtrowane pasmowo-przepustowo (ośmiobiegunowy filtr Bessela przy 60 Hz i filtr Gaussa przy 600 Hz).

  1. Przygotowanie do konfiguracji
    1. Przygotuj 50 ml pożywki NBA z 1 ml witaminy B27 i 250 μl L-glutaminy. Rozgrzać się w temperaturze 37 °C.
    2. Ustaw konfigurację elektrofizjologii w zamkniętym obiegu. Sprawdź, czy natężenie przepływu wynosi 2 ml/min.
    3. Otwórz zawór skrzyni ładunkowej (5% CO2/95% O2) i sprawdź poziom wody w układzie.
    4. Umieść bibułę filtracyjną w komorze zapisu interfejsu, aby spuścić nadmiar medium, a bibułę do czyszczenia obiektywu pod ramką, aby dostarczyć medium do plasterka.
    5. Włącz regulator temperatury, wzmacniacze i mikromanipulator.
    6. Poczekaj, aż temperatura w komorze interfejsu ustabilizuje się na poziomie 37 °C przed rozpoczęciem zapisów.
    7. Przygotować sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy (aCSF: 124 mM NaCl, 3mM KCl, 1,2 mM NaH2PO4, 25 mM NaHCO3, 10 mM glukozy, 2 mM CaCl2, 1 mMMgSO4 o pH 7,4) i użyć go do napełnienia szklanej elektrody za pomocą strzykawki. Umieść go w elektrodzie odbiorczej.
  2. Nagrania spontanicznej aktywności
    1. Gdy temperatura się ustabilizuje, wyjmij płytkę z inkubatora i odetnij jeden plasterek z wkładki bardzo ostrym ostrzem. Umieść go w talerzu o średnicy 60 mm z kroplą pożywki. Zabierz go do komory nagrywania interfejsu.
    2. Umieść plasterek w komorze interfejsu z hipokampem w prawym dolnym rogu. Umieść elektrodę odbiorczą w warstwie ogniwa piramidalnego CA3.
    3. Przejdź do protokołu ciągłej akwizycji i nagrywaj przez 30 minut.

3. Test wychwytu PI

UWAGA: Śmierć komórki została oceniona poprzez monitorowanie wychwytu przez komórki barwnika fluorescencyjnego jodku propidyny (PI). PI jest związkiem polarnym, który wnika do komórek z uszkodzonymi błonami komórkowymi i oddziałuje z DNA emitując czerwoną fluorescencję (absorbancja 493 nm, emisja 630 nm). Ponieważ PI nie jest przepuszczalny dla żywych komórek, służy do wykrywania martwych komórek w populacji.

  1. Inkubacja PI
    1. Przygotować w pożywce świeże rozcieńczenie PI w stosunku 1:10.
    2. W celu wykonania testu wychwytu PI wyjmij płytkę z inkubatora i ostrożnie podnieś wkładkę. Dodać 13 μl PI do pożywki za pomocą pipety P20, uzyskując końcowe stężenie 2 μM. Powoli mieszać płytkę przed ponownym włożeniem wkładki na miejsce. Upewnij się, że pod plastrami nie ma bąbelków.
    3. Umieść plastry z powrotem w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 2 godziny.
    4. Postępuj zgodnie z protokołem immunohistochemicznym, jak opisano w następnym rozdziale. Przykryj płyty aluminium, ponieważ PI jest wrażliwy na światło.

4. Immunohistochemia

UWAGA: W immunohistochemii przeciwciało specyficzne dla neuronu, jak również przeciwciała zdolne do rozróżniania spoczynkowych i reaktywnych fenotypów mikrogleju i astrocytów, zostały użyte do oceny stopnia śmierci neuronów i glejozy w organotypowych wycinkach przypominających korę nosa i hipokamp

.
  1. Utrwalanie tkanek
    1. Wyjąć płytkę z inkubatora i zassać pożywkę. Utrwal plastry 4% paraformaldehydem (PFA) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, dodając 1 ml PFA poniżej i powyżej plastrów za pomocą pipety P1000.
    2. Usuń PFA i dodaj 1 ml PBS. Dodaj również PBS poniżej i powyżej plasterków.
    3. Przechowywać plastry w temperaturze 4 °C, w PBS, do czasu dalszego użycia. Zawsze umieszczaj parafilm wokół płytek, aby uniknąć wyschnięcia.
  2. Etapy barwienia immunologicznego
    1. Umyj dwukrotnie, za każdym razem po 10 minut, 1 ml PBS.
    2. Przygotować roztwór przepuszczalny/blokujący zawierający 1% Triton-X100, 10% HS i 10% BSA w PBS. Przygotuj 5% roztwór BSA.
    3. Narysuj dwa prostokąty za pomocą hydrofobowego pisaka (Rysunek 2A). Wytnij plastry z wkładki (Rysunek 2B) bardzo ostrym ostrzem. Umieść dwie plastry na szkiełku (Rysunek 2C) i dodaj 140 μl roztworu przepuszczalnego/blokującego na wierzch każdej plastry, używając pipety P200. Inkubować przez 3 godziny w temperaturze pokojowej.
    4. Rozcieńczyć pierwszorzędowe przeciwciała do rozcieńczenia roboczego w 5% BSA w PBS. Inkubować z przeciwciałami pierwszorzędowymi przez noc w temperaturze 4 °C.
    5. Inkubować z przeciwciałami drugorzędowymi przez 4 godziny w temperaturze pokojowej. Od tego kroku należy chronić płytkę przed światłem, ponieważ pracuje się z fluoroforami.
    6. Umieść 50 μl kropli roztworu Hoechst na wierzchu każdego plasterka i inkubuj przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
    7. Myć między inkubacjami. Zawsze myj trzy razy, za każdym razem przez 10 minut, za pomocą PBS-T.
    8. Usuń Hoechst i umyj zgodnie z zaleceniami.
    9. Dodaj 50 μl podłoża montażowego na wierzch każdego plasterka. Przykryj szklanym szkiełkiem nakrywkowym i otocz lakierem do paznokci (Rysunek 2D).
    10. Pozostaw do wyschnięcia w temperaturze pokojowej przez 24 godziny.
    11. Wizualizuj barwienie immunologiczne pod mikroskopem konfokalnym. Poplamione plastry przechowywać w temperaturze -20 °C.

figure-protocol-2
Rysunek 2: Specyficzna procedura testu immunohistochemicznego. (A) Za pomocą hydrofobowego pisaka narysuj dwa kwadraty na szkiełku. (B) Wytnij kawałek wkładki, który zawiera plasterek. (C) Umieść każdy plasterek w kwadratach narysowanych pisakiem hydrofobowym i rozpocznij etap przepuszczalności/blokowania. (D) Po zakończeniu protokołu zakończ umieszczając plastry w podłożu montażowym, przykrywając szklanym szkiełkiem nakrywkowym i otaczając je lakierem do paznokci. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Na podstawie poprzednich opisów analizy sygnału padaczkowego w organotypowych wycinkach hipokampa, międzynapadowe wyładowania padaczkowe są tutaj definiowane jako napadowe wyładowania, które są wyraźnie odróżniane od aktywności tła, z nagłą zmianą polaryzacji i występujące przy niskiej częstotliwości (<2 Hz). Wyładowania napadowe trwające dłużej niż 10 s i występujące z większą częstotliwością (≥2 Hz) charakteryzują się aktywnością padaczkową. Jeśli zdarzenie ictal wystąpi w ciągu 10 sekund po poprzednim, te dwa zdarzenia są uważane za tylko jedno zdarzenie ictal.

Warstwy organotypowe kory nosa i hipokampa na poziomie 7 DIV (Rysunek 3A) przedstawiają mieszaną aktywność międzynapadową i podobną do iktalu. W 14 DIV (Rysunek 3B), spontaniczna aktywność charakteryzuje się wyładowaniami ictal, które ewoluują do przytłaczającej aktywności ictal w 21 DIV, ze zdarzeniami ictal trwającymi >1 min (Rysunek 3C).

figure-results-1
Rycina 3: Spontaniczna aktywność padaczkowa wycinków organotypowych kory nosa i hipokampa. Reprezentatywne elektrograficzne zdarzenia podobne do napadów, zarejestrowane z obszaru CA3 w komorze typu interfejsowego, po (A) 7 DIV, (B) 14 DIV i (C) 21 DIV. Szczegóły napadu są pokazane na niższych śladach. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

PI test wychwytu, a następnie immunohistochemia przeciwko markerowi neuronalnemu NeuN, mający na celu identyfikację śmierci neuronalnej. Wychwyt PI przez neurony ziarniste i piramidowe zaobserwowano w 7 wycinkach DIV (strzałki w Figura 4A), ale liczba neuronów PI+ wzrosła przy 14 DIV (strzałki w Figura 4B), potwierdzając zwiększoną śmierć neuronów z progresją epileptogenezy.

figure-results-2
Rycina 4: Reprezentatywne obrazy organicznych wycinków kory nosa i hipokampa barwionych NeuN i PI. Obrazy dojrzałych neuronów barwionych NeuN i komórek PI-dodatnich uzyskano w (A) 7 DIV i (B) 14 DIV, na konfokalnym mikroskopie laserowym z obiektywem 20x. Wyświetlane są powiększone obrazy obszarów przerywanych. Strzałki wskazują neurony śmierci (na pomarańczowo). Podziałka skali, 50 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Podwójne barwienie Iba1, razem z CD68, zostało użyte do oceny fenotypu mikrogleju. Iba1 jest markerem mikrogleju/makrofagów, podczas gdy CD68 jest białkiem lizosomalnym ulegającym ekspresji w wysokich poziomach przez reaktywny mikroglej i w niskich poziomach przez spoczynkowy mikroglej. Przy 7 warstwach DIV rozgałęziony mikroglej o niskiej ekspresji CD68 (strzałki w Figura 5A) są liczniejsze niż reaktywny mikroglej Iba1 + / CD68 + (groty strzałek w Figura 5A), podczas gdy przy 14 DIV, we wszystkich obszarach hipokampa, Iba1 + / CD68 + krzaczasty/ameboidalny mikroglej M1 (groty strzałek w Rysunek 5B) przewyższają mikroglej o niskim wyrazie CD68 (strzałki w Rysunek 5B). W 14 DIV można wskazać niektóre komórki Iba1 + / CD68 + o wyglądzie hiperrozgałęzienia (otwarte groty strzałek w Ryc. 5B), co może sugerować występowanie przeciwzapalnego fenotypu M2 mikrogleju. Kwestia ta wymaga jednak dalszych badań.

Ostatnie badania wykazały, że różne inicjujące uszkodzenia OUN mogą wywołać co najmniej dwa typy reaktywnych astrocytów, A1 i A2, przy czym astrocyty A1 są neurotoksyczne16. Podtyp astrocytów A1 charakteryzuje się zwiększoną ekspresją dopełniacza C316,17,18. Dopełniacz C3, który odgrywa kluczową rolę w aktywacji układu dopełniacza, generuje C3b, który jest dalej degradowany do iC3b, C3dg i C3d19. W związku z tym do oceny astroglejozy zastosowano podwójne barwienie GFAP i C3d. Przy 7 DIV ekspresja C3d jest ledwo wykrywalna (Figura 6A), podczas gdy w 14 wycinkach DIV można zaobserwować przerostowe astrocyty GFAP+/C3d+ (groty strzałek w Figura 6B), co sugeruje postępującą aktywację astrocytów A1.

Wyniki pokazują postępującą aktywację mikrogleju i astrocytów w trakcie epileptogenezy, naśladując zdarzenia opisane u pacjentów z padaczką i w modelach zwierzęcych tej patologii.

figure-results-3
Rycina 5: Reprezentatywne obrazy organicznych warstw kory nosowej i hipokampa barwionych Iba1 i CD68. Obrazy mikrogleju barwionego Iba1 i CD68 oraz jąder barwionych Hoechsta uzyskano w (A) 7 DIV i (B) 14 DIV, na konfokalnym mikroskopie laserowym z obiektywem 20x. Wyświetlane są powiększone obrazy obszarów przerywanych. Strzałki wskazują na mikroglej spoczynkowy Iba1+/CD68-, groty strzałek wskazują na krzaczasty/ameboidalny mikroglej Iba1+/CD68+, a otwarte groty strzałek wskazują na hiperrozgałęziony mikroglej Iba1+/CD68+. Podziałka skali, 50 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rycina 6: Reprezentatywne obrazy organiczno-kolorowych wycinków kory nosa i hipokampa barwionych GFAP i C3d. Obrazy astrocytów barwionych GFAP i C3d oraz jąder barwionych Hoechsta uzyskano w (A) 7 DIV i (B) 14 DIV, na konfokalnym mikroskopie laserowym z obiektywem 20x. Wyświetlane są powiększone obrazy obszarów przerywanych. Groty strzałek wskazują na reaktywne astrocyty A1 GFAP+/C3d+ (na żółto). Podziałka skali, 50 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zwierzęce modele padaczki odegrały kluczową rolę w odkryciu wielu defibrylatorów AED, jednak wymagają one wielu zwierząt, a większość z nich jest czasochłonna ze względu na utajony okres wystąpienia napadów. Niska indukcja magnezu aktywności padaczkowej w ostrych wycinkach hipokampa została również gruntownie zrewidowana w literaturze3, ale ostre plastry mają żywotność 6-12 godzin, co uniemożliwia ocenę długoterminowych zmian. Plastry organotypowe mogą być utrzymywane w kulturze przez kilka dni do tygodni, co pozwala przezwyciężyć krótki czas żywotności ostrych plastrów, a modele epileptogenezy w organotypowych wycinkach hipokampa zaproponowano 3,7,8.

Tutaj opisujemy przygotowanie plastrów organotypowych, składających się z kory nosa i hipokampa. Przygotowanie tych plastrów zajmuje 15-20 minut na zwierzę, począwszy od złożenia ofiary ze zwierzęcia do umieszczenia plastrów na wkładkach, i można uzyskać 6-8 plastrów na półkulę. Należy zachować szczególną ostrożność podczas otwierania półkuli w celu odsłonięcia hipokampa oraz podczas wyjmowania tkanki z bibuły filtracyjnej po pokrojeniu. Nadmiar tkanki powyżej hipokampa może również zagrozić integralności plastra podczas krojenia.

Warstwy organotypowe kory nosa i hipokampa przedstawiają ewoluującą aktywność podobną do padaczkowej, przypominającą padaczkę in vivo. Po tygodniu w kulturze większość wycinków przedstawia mieszaną aktywność międzycząsteczkową i ictalową, która z czasem w kulturze przechodzi w wydarzenia wyłącznie podobne do ictal. Do tej pory odnotowaliśmy kilka wyładowań międzynapadowych w plastrach w ciągu 2-3 tygodni. W tym systemie aktywność podobna do padaczkowej wydaje się rozwijać szybciej niż w organtypowych wycinkach hipokampa. Można to przypisać obecności kory nosowej, która zachowuje większość funkcjonalnych danych wejściowych do hipokampa. Aby w pełni rozwiązać ten problem, obecnie przeprowadzana jest pełna charakterystyka sygnałów padaczkowych wykazywanych przez te wycinki w czasie, takich jak liczba i czas trwania zdarzeń zakaźnych, wraz z ich amplitudą i częstotliwością.

System ten może być utrzymywany w hodowli przez ponad trzy tygodnie i naśladuje wiele molekularnych korelatów padaczki, takich jak śmierć neuronów, aktywacja mikrogleju i astrocytów oraz zwiększona produkcja cytokin prozapalnych14, co pozwala na długoterminową charakterystykę tych aspektów. Jest to również łatwa w użyciu platforma do badań przesiewowych, na której można wdrażać interwencje farmakologiczne ukierunkowane na określone szlaki komórkowe i testować potencjalne cele terapeutyczne. Niewątpliwie, przedstawiony tu system może przyczynić się do dalszego wyjaśnienia mechanizmów epileptogenezy.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby podziękować Jednostce Bioobrazowania Instituto de Medicina Molecular João Lobo Antunes, za wszystkie sugestie dotyczące pozyskiwania obrazów.

Ten projekt otrzymał dofinansowanie z programu Unii Europejskiej Horyzont 2020 w zakresie badań i innowacji na podstawie umowy o grant nr 952455, Fundação para a Ciênciae Tecnologia (FCT) w ramach projektu PTDC/MEDFAR/30933/2017 oraz Faculdade de Medicina da Universidade de Lisboa.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Probówka wirówkowa 50 ml, stożkowe dnoCorning430829
70% etanoluManuel Vieira, LdaUN1170
WzmacniaczAxon InstrumentsAxoclamp 900A
WzmacniaczAxon InstrumentsDigidata 1440A
Anti-C3d (koza)R& D SystemsAF2655Rozcieńczyć w stosunku 1:1000
Anti-CD68 (mysz)Abcamab31630-125ugRozcieńczyć w stosunku 1:250
Anti-GFAP (mysz)Milipore SASMAB360Rozcieńczyć w stosunku 1:500
Anti-Iba1 (królik)Abcamab108539Rozcieńczyć w stosunku 1:600
Anti-NeuN (królik)Werfen16712943SRozcieńczyć w stosunku 1:500
Sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy (aCSF)Domowy
B-27&handel; Suplement (50X), bez surowicyThermo Fisher Scientific17504-044
Ostrza do rękojeści skalpelaFine Science Tools10011-00
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)NZYTechMB046025% BSA służy do rozcieńczania przeciwciał pierwotnych. Dodaj 0,5 g BSA do 10 ml PBS.
System komór do wycinków mózgu/tkanekWarner Instruments
Dwuwodny chlorek wapniaMerck Millipore1.02382.0500
Wkładki do hodowli komórkowych, 30 mm, hydrofilowe PTFEMilipore SASPICM03050
Źródło zimnego światłaSCHOTTKL 300 LED
Konfokalny mikroskop laserowyZeissLSM 710
Konwencjonalny inkubatorThermo Scientific HeraeusBB15, linia funkcyjnaustawiona na 37 & deg; C i 5% CO2
D(+)-Monohydrat glukozyMerck Millipore1.08342.1000
D-(+)-Roztwór glukozy, 45% w wodzieSigmaG8769
di-sodowy wodorofosforan dwuwodnyMerck Milipore1.06580.1000
Mikroskop preparacyjny/lupaMEIJI TECHNO CO. LTD
122285IgG (H+L) przeciw kozom osła sprzężona z Alexa Fluor 568InvitrogenA11057Rozcieńczony w stosunku 1:200
IgG (H+L) przeciw mysim osłom sprzężony z Alexa Fluor 488InvitrogenA21202Rozcieńczony w stosunku 1:200
IgG przeciw myszom osła (H+L) sprzężony z Alexa Fluor 568InvitrogenA10037Rozcieńczony w stosunku 1:200
IgG przeciw królikom osła (H+L) sprzężony z Alexa Fluor 488InvitrogenA21206Rozcieńczyć w stosunku 1:500
IgG przeciwko królikom osłom (H+L) sprzężony z Alexa Fluor 568InvitrogenA10042Rozcieńczony w stosunku 1:500
Dumont #5 Kleszcze drobne Biologie InoxFine Science Tools11254-20
Dumont #5 Kleszcze Standard InoxFine Science Tools11251-20
Dumont #7 Kleszcze Standard DumoxelFine Science Tools11271-30
Dumont Medical #7S Kleszcze Short Curve InoxFine Science Tools11273-22
Roztwór podstawowy gentamycyny, 50 mg/mlThermo Fisher Scientific15750-037
Gey' s Zrównoważony roztwór soli (GBSS)Przemysł biologiczny01-919-1A Elektrody szklane
Produkty naukoweGB150F-10Okrągłe końcówki domowej roboty
Szklane pipety Pasteura, 230 mmVWR International612-1702
Hank' s Zrównoważony roztwór soli (HBSS)Thermo Fisher Scientific24020-091
Hoechst 33342InvitrogenH1399Roztwór podstawowy o stężeniu 2 mg/ml w
PBS Surowica końska, inaktywowana termicznie (HS)Thermo Fisher Scientific26050-088
Kwas solnyMerck Milipore1.09057.1000
Długopis hydrofobowyDakoS200230-2
INCU-Line IL10VWR390-0384
Komora interfejsuWarner InstrumentsBSC-HT Haas Top
Iris Spatula Zakrzywionenarzędzia do nauki o10092-12
Labculture Klasa II Szafa bezpieczeństwa biologicznegoHERASafeHS 12
Papier do czyszczenia soczewekTIFFEN
Roztwór L-glutaminy 200 mM (Q)Thermo Fisher Scientific25030-024
Siarczan magnezu siedmiowodnyMerck Millipore1.05886.0500
Mikrorurka 0,5 mL, PPSARSTEDT72,699
Mikrorurka 1,5 mL, PPSARSTEDT72.690.001
Mikrorurka 2,0 mL, PPSARSTEDT72.691
MikromanipulatorySutter InstrumentMP-285
Miroscope Okulary nakrywkowe, 24 mm x 60 mmMarienfeld102242
Lakier do paznokciCliché
Neurobasal-A Medium (NBA)Thermo Fisher Scientific10888-022
Opti-MEM® I Medium o obniżonej surowicyThermo Fisher Scientific31985-047
Paraformaldehyd, proszekVWR Chemicals2,87,94,295
Pompa perystaltycznaGilsonM312
Bufor fosforanowy soli fizjologicznej (PBS)Domowej roboty. PBS z 0,5% Tween-20 (PBS-T) służy do mycia plastrów podczas testu immunohistochemicznego.
Wzorcowe roztwory fosforanów, PO43- w wodzieBDH ARISTAR452232C
Zestaw pipetGilsonP2, P10, P20, P100, P200, P1000
Platinum 5 ostrzyGillette
Chlorek potasuSigma-AldrichP5405-250g
Jodek propidyny (PI)Sigma-AldrichP4170-25MGRoztwór podstawowy o stężeniu 1 mg/ml w wodzie.
Bibuła filtracyjna jakościowa, celuloza, klasa 1, 55 mmWhatman1001-055Średnia retencja 11µ m
Bibuła filtracyjna jakościowa, celuloza, klasa 1, 90 mmWhatman1001-090Średnia retencja 11&mikro;
m Rękojeść skalpelaFine Science Tools91003-12
Strzykawka insulinowa z końcówką bez igły 1 mlSOL-M161000
Chlorek soduVWR Chemicals27800.360
Diwodorofosforan sodu jednowodnyMerck Millipore1.06346.1000
Wodorowęglan soduMerck Millipore1.06329.1000
Wodorotlenek sodu‎Merck Milipore535C549998
StymulatorAstro Med Inc GRASS Grupa produktówS48 Stymulator
Nożyczki studenckie Proste SharpSharp 12cmFine Science Tools91402-12
SuperFrost Plus™ Szkiełka adhezyjneThermo Fisher ScientificJ1800AMNZ
Sterylne naczynie do hodowli tkankowych 60 x 15 mmpowłoką TC CorningCORN430166
Sterylne płytki 6-dołkowe z powłoką TCKontroler temperatury CorningCORN3516
MEDICAL SYSTEMS CORP.TC-102
Rozdrabniacz do tkanekMickle Laboratory Engineering CO. LTD.MTC/2Ustaw na 350 μ m
Triton X-100BDH14630
Tween-20SigmaP2287
wysokiej jakości z

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fisher, R. S., et al. Electrical stimulation of the anterior nucleus of thalamus for treatment of refractory epilepsy. Epilepsia. 51, 899-908 (2010).
  2. Loscher, W. Critical review of current animal models of seizures and epilepsy used in the discovery and development of new antiepileptic drugs. Seizure. 20, 359-368 (2011).
  3. Heinemann, U., Kann, O., Schuma, S. An overview of in vitro seizure models in acute and organotypic slices. Models of seizures and epilepsy. Pitkänen, A., Schwartzkroin, P. A., Moshé, S. L. , Elsevier Academic Press. Cambridge. 35-44 (2006).
  4. Sundstrom, L., Morrison, B., Bradley, M., Pringle, A. Organotypic cultures as tools for functional screening in the CNS. Drug Discovery Today: Targets. 10, 993-1000 (2005).
  5. Holopainen, I. E. Organotypic hippocampal slice cultures: a model system to study basic cellular and molecular mechanisms of neuronal cell death, neuroprotection, and synaptic plasticity. Neurochemical Research. 30, 1521-1528 (2005).
  6. Noraberg, J., et al. Organotypic hippocampal slice cultures for studies of brain damage, neuroprotection and neurorepair. CNS Neurological Disorders Drug Targets. 4, 435-452 (2005).
  7. Dyhrfjeld-Johnsen, J., Berdichevsky, Y., Swiercz, W., Sabolek, H., Staley, K. J. Interictal spikes precede ictal discharges in an organotypic hippocampal slice culture model of epileptogenesis. Journal of Clinical Neurophysiology. 27, 418-424 (2010).
  8. Chong, S. A., et al. Intrinsic Inflammation Is a Potential Anti-Epileptogenic Target in the Organotypic Hippocampal Slice Model. Neurotherapeutics. 15, 470-488 (2018).
  9. Li, Q., Han, X., Wang, J. Organotypic hippocampal slices as models for stroke and traumatic brain injury. Molecular Neurobiology. 53 (6), 4226-4237 (2016).
  10. Cho, S., Wood, A., Bowlby, M. R. Brain slices as models for neurodegenerative disease and screening platforms to identify novel therapeutics. Current Neuropharmacology. 5, 19-33 (2007).
  11. Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: a review. Neuroscience. 305, 86-98 (2015).
  12. Doussau, F., Dupont, J. L., Neel, D., Schneider, A., Poulain, B., Bossu, J. L. Organotypic cultures of cerebellar slices as a model to investigate demyelinating disorders. Expert Opinion on Drug Discovery. 12 (10), 1011-1022 (2017).
  13. Vismer, M. S., Forcelli, P. A., Skopin, M. D., Gale, K., Koubeissi, M. Z. The piriform, perirhinal, and entorhinal cortex in seizure generation. Frontiers in Neural Circuits. 9, 27(2015).
  14. Magalhães, D. M., Pereira, N., Rombo, D. M., Beltrão-Cavacas, C., Sebastião, A. M., Valente, C. A. Ex vivo model of epilepsy in organotypic slices - a new tool for drug screening. Journal of Neuroinflammation. 15, 203(2018).
  15. Ravizza, T., Balosso, S., Vezzani, A. Inflammation and prevention of epileptogenesis. Neuroscience Letters. 497 (3), 223-230 (2011).
  16. Liddelow, S. A., et al. Neurotoxic reactive astrocytes are induced by activated microglia. Nature. 541, 481-487 (2017).
  17. Wu, T. Complement C3 is activated in human AD brain and is required for neurodegeneration in mouse models of amyloidosis and tauopathy. Cell Reports. 28 (8), 2111-2123 (2019).
  18. Hartmann, K., et al. Complement 3+-astrocytes are highly abundant in prion diseases, but their abolishment led to an accelerated disease course and early dysregulation of microglia. Acta Neuropathologica Communications. 7, 83(2019).
  19. Nilsson, U. R., Funke, L., Nilsson, B., Ekdahl, K. N. Two conformational forms of target-bound iC3b that distinctively bind complement receptors 1 and 2 and two specific monoclonal antibodies. Upsala Journal of Medical Sciences. 116, 26-33 (2011).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Model epileptogenezyrejestracja aktywno ci spontanicznejpobieranie jodku propidiumanaliza immunohistochemicznamikroskopia konfokalnaanaliza Western blotPCR w czasie rzeczywistymzastosowanie testu ELISA

Powiązane artykuły