Celem tego badania było opracowanie mysiego modelu gojenia się ran po oparzeniach. Oparzenie termiczne wywołano na skórze grzbietowej myszy za pomocą podgrzanego mosiężnego szablonu. Spaloną tkankę oczyszczono i pokryto przeszczepem skóry pobranym z ogona genetycznie podobnej myszy dawcy.
Artykuł metodologiczny
Mysi model rany oparzeniowej zrekonstruowany za pomocą allogenicznego przeszczepu skóry
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Trywialne, powierzchowne rany goją się bez komplikacji dzięki pierwotnej intencji. Rany głębokie, takie jak oparzenia pełnej grubości, goją się z zamiarem wtórnym i wymagają chirurgicznego oczyszczenia i przeszczepu skóry. Pomyślna integracja przeszczepu dawcy z łożyskiem rany biorcy zależy od terminowej rekrutacji komórek odpornościowych, silnej odpowiedzi angiogennej i tworzenia nowej macierzy zewnątrzkomórkowej. Opracowywanie nowych środków terapeutycznych, które są ukierunkowane na niektóre kluczowe procesy związane z gojeniem się ran, jest utrudnione ze względu na brak wiarygodnych modeli przedklinicznych ze zoptymalizowaną obiektywną oceną zamykania ran. W tym miejscu opisujemy niedrogi i powtarzalny model eksperymentalnej rany oparzeniowej o pełnej grubości, zrekonstruowanej za pomocą allogenicznego przeszczepu skóry. Rana jest indukowana na powierzchni grzbietowej znieczulonych myszy wsobnych typu dzikiego z tła BALB/C i SKH1-Hrhr. Oparzenie wytwarza się za pomocą mosiężnego szablonu o średnicy 10 mm, który jest wstępnie podgrzewany do 80 °C i dostarczany pod stałym ciśnieniem przez 20 s. Strup oparzeniowy jest wycinany 24 godziny po urazie i zastępowany przeszczepem pełnej grubości pobranym z ogona genetycznie podobnej myszy dawcy. Do zabiegu nie jest wymagany specjalistyczny sprzęt, a techniki chirurgiczne są proste do naśladowania. Metoda może być bez wysiłku wdrożona i odtworzona w większości środowisk badawczych. Z modelem wiążą się pewne ograniczenia. Ze względu na trudności techniczne nie jest możliwe pobranie cieńszych przeszczepów skóry o dzielonej grubości. Opisana przez nas metoda chirurgiczna pozwala na rekonstrukcję ran oparzeniowych za pomocą pełnogrubych przeszczepów skóry. Może być stosowany do przeprowadzania przedklinicznych badań terapeutycznych.
Wprowadzenie
Chirurgiczne oczyszczanie i przeszczepianie skóry są powszechnymi praktykami klinicznymi stosowanymi w leczeniu ran przewlekłych1, rany po oparzeniach2, oraz rany ostre, takie jak rany pourazowe3. Przeszczep skóry odnosi się do zabiegu chirurgicznego, który polega na usunięciu zdrowej skóry z jednej części ciała i przeniesieniu jej do innej. Przeszczepy dawców zastępują utraconą tkankę i stanowią strukturalne rusztowanie dla migracji i wzrostu komórek. Po integracji z miejscem biorczym, przeszczepy skóry zastępują utraconą barierę skórną, zapewniając ochronę przed inwazją drobnoustrojów, szkodliwym wpływem środowiska zewnętrznego i nadmierną utratą wilgoci4. Udana integracja przeszczepu skóry zależy od kilku czynników. Należą do nich odpowiednia odpowiedź immunologiczna w obecności infekcji bakteryjnych i szybkie ustąpienie stanu zapalnego, silna angiogeneza w miejscu rany i utworzenie zespoleń naczyniowych między łożem biorcy a dawcą graft5. Gdy przeszczep zaczyna ulegać degradacji, rezydentne komórki skóry właściwej muszą zostać zastąpione komórkami zdolnymi do wytwarzania nowej macierzy zewnątrzkomórkowej. W tym samym czasie keratynocyty naskórka muszą przeczołgać się po nowo wytworzonej macierzy, aby utworzyć neo-naskórek i ponownie nabłonkować ranę. Jest zatem oczywiste, że efektywna migracja komórek z łoża biorcy do przeszczepu dawcy jest kolejnym czynnikiem decydującym o pomyślnym wprowadzeniu przeszczepu. Biorąc pod uwagę ogromną liczbę czynników związanych z gojeniem się ran6, które mogą być niemożliwe do kontrolowania w badaniach na ludziach ze względu na ograniczenia etyczne, konieczne są modele przedklinicznego eksperymentalnego przeszczepu skóry. Opracowanie przedklinicznych modeli gojenia się ran oparzeniowych i związanego z tym przeszczepu skóry będzie miało istotne znaczenie dla zrozumienia złożonych mechanizmów zaangażowanych w naprawę tkanki skórnej i będzie miało zasadnicze znaczenie dla testowania nowych środków terapeutycznych. Modele gojenia się ran in vitro nie są w stanie dokładnie naśladować złożoności tkanki skórnej. Modele zwierzęce in vivo są niezastąpionym narzędziem badawczym w zrozumieniu mechanizmów związanych z naprawą tkanek.
Na gryzoniach opracowano kilka metod techniki przeszczepu skóry, które naśladują chirurgiczne wycinanie i rekonstrukcję ran oparzeniowych7,8,9. Jednak większość wcześniej opisanych procedur nie wywołała oparzenia termicznego przed przeszczepem skóry. Zamiast rany oparzeniowej indukowano ranę wycinającą pełnej grubości, którą następnie zrekonstruowano za pomocą alloprzeszczepu skóry o pełnej grubości7. Różne anatomiczne punkty orientacyjne, takie jak ucho, ogon i grzbiet, zostały wykorzystane do pobrania skóry dawcy u gryzoni7,8. Opisano różne techniki mocowania i stabilizacji przeszczepu, w tym "technikę bez szwów"9, sutures7 i klej chirurgiczny10,11,12.
Celem tego badania było opracowanie mysiego modelu rany oparzeniowej pełnej grubości, który odzwierciedlałby obecny złoty standard w leczeniu oparzeń, który obejmuje wycięcie nieżywotnej tkanki i przeszczep skóry. Oparzenie termiczne wywołano na grzbietowej powierzchni myszy za pomocą podgrzanego mosiężnego szablonu. Strup oparzeniowy został wycięty i zastąpiony przeszczepem o pełnej grubości pobranym z ogona myszy dawcy. Ten eksperymentalny model ma trzy kluczowe zalety. Po pierwsze, więcej niż jedna rana oparzeniowa może zostać wywołana na grzbiecie myszy biorcy, a cztery przeszczepy skóry dawcy mogą zostać pobrane z jednego ogona myszy dawcy. Oznacza to, że kilka eksperymentalnych i kontrolnych terapii może być potencjalnie porównanych przy użyciu tych samych zwierząt biorcy i dawcy. W zależności od pożądanej drogi podawania, leczenie kontrolne może obejmować miejscowe lub ogólnoustrojowe podanie nośnika lub kontrolę placebo (np. miejscowe stosowanie maści, podskórne, dootrzewnowe lub dożylne wstrzyknięcie roztworu). Po drugie, czas leczenia i punkt końcowy eksperymentu mogą być kontrolowane. Po trzecie, model ten opiera się na rekonstrukcji ran przy użyciu przeszczepów pełnej grubości pobranych z ogona, o których wiadomo, że mają większe prawdopodobieństwo pomyślnego włączenia do miejsca dawczego w porównaniu ze skórą pobraną z back13. Może to wynikać z mniejszej liczby komórek Langerhansa naskórka, które odgrywają kluczową rolę w immunobiologii skóry i są związane z odrzuceniem przeszczepu skóry14.
Proponowany model gojenia ran i integracji przeszczepów może być z powodzeniem zastosowany do myszy transgenicznych i nokautujących. Wykorzystanie genetycznie zmodyfikowanych myszy pomoże w wyjaśnieniu ról, jakie niektóre geny mogą odgrywać podczas gojenia się ran. Można również rozważyć egzogenne zastosowanie miejscowych preparatów na rany lub podskórne podanie przeciwciał terapeutycznych w miejscu urazu.
Ze względu na trudności techniczne, przeszczepy skóry o podzielonej grubości, składające się z naskórka i części skóry właściwej, są trudne do uzyskania u myszy. Wiadomo, że przeszczepy skóry o pełnej grubości składające się z naskórka i skóry właściwej o pełnej grubości wymagają dobrze unaczynionego łożyska rany w celu pomyślnej integracji. Brak możliwości pobrania przeszczepów skóry o podzielonej grubości u myszy może być uważany za ograniczenie tego modelu. Utrwalenie przeszczepu skóry do łożyska rany biorcy osiągnięto poprzez zastosowanie kleju chirurgicznego, który wiąże się z mniejszym urazem i szybką degradacją w porównaniu z innymi sposobami utrwalania tkanek15. Wcześniejsze badania wykazały, że szycie wiąże się z silniejszym utrwaleniem tkanek niż klej chirurgiczny po 24 godzinach od zabiegu chirurgicznego15, co można uznać za wadę zabiegu. Jednak w późniejszych punktach czasowych wytrzymałość biomechaniczna ran leczonych za pomocą kleju chirurgicznego staje się porównywalna do szwów15 i lepsza niż mocowanie zszywek16. Po utrwaleniu tkanek za pomocą kleju chirurgicznego, rany należy przykryć opatrunkiem. Chociaż rany na powierzchni grzbietowej myszy są trudne do dotarcia przez zwierzę, z drugiej strony opatrunek na ranę jest łatwy do manipulowania i usunięcia przez zwierzę. Częste zmiany opatrunków na rany mogą być uzasadnione.
Hipotermia wywołana znieczuleniem u małych gryzoni jest dobrze udokumentowanym zjawiskiem17. Hipotermia jest skutkiem ubocznym tej procedury, która powoduje komplikacje i potencjalnie zagraża zarówno zdrowiu zwierząt, jak i jakości danych. Dlatego ta metoda gwarantuje wdrożenie strategii zarządzania temperaturą, zwłaszcza jeśli stosowane są bezwłose SKH1-Hrhr.
Najbardziej znaczącym ograniczeniem używania myszy do naśladowania zamykania ran u ludzi jest różnica między anatomią a fizjologią skóry. Rany myszy goją się głównie poprzez skurcze, podczas gdy rany ludzkie goją się poprzez tworzenie ziarniny tkanki i ponowne nabłonkowanie18. Aby uwzględnić tę rozbieżność, obecny model może być modyfikowany i używany w połączeniu z pierścieniem szynującym ściśle przylegającym do rany, aby zapobiec skurczowi skóry19. Biorąc pod uwagę pewne zalety i wady tego protokołu in vivo, model ten może służyć jako narzędzie do badania pewnych procesów związanych z gojeniem się ran, które są niemożliwe do zbadania in vitro.
Protokół
Wszystkie eksperymenty zostały zatwierdzone przez Francuski Departament Szkolnictwa Wyższego i Badań (numer badania: 122162017111616517670v2 i DAP180012). Wszystkie myszy po przybyciu były trzymane pojedynczo w plastikowych klatkach i pozwolono im na 7-dniowy okres aklimatyzacji przed badaniem. W pomieszczeniu dla zwierząt utrzymywano cykl 12/12 godzin światło/ciemność (światła włączane o 07:00). Jedzenie i woda z kranu były dostarczane ad libitum. Myszy BALB/c i SKH1-Hrhr były karmione tradycyjną dietą opartą na pszenicy/soi. Wraz z materiałem do budowy gniazda zapewniono ściółkę z trocin.
1. Przygotowanie sprzętu
- Przygotuj urządzenie do spalania do zabiegu i ustaw je na 80 °C za pomocą regulatora temperatury (Rysunek 1A). Sprawdź temperaturę mosiężnego szablonu (Rysunek 1B,C) za pomocą kamery termowizyjnej na podczerwień.
- Upewnij się, że manometr cyfrowy działa prawidłowo.
- Przykryj scenę serwetą chirurgiczną i wyreguluj wysokość stołu (Rysunek 1A).
2. Przedoperacyjna i śródoperacyjna opieka nad zwierzętami
- Zdobądź myszy BALB/c i SKH1-Hrhr w wieku 6-8 tygodni.
- Zawiesinę paracetamolu w stężeniu 3 mg/ml należy dodać do wody pitnej i podawać 12 godzin przed zabiegiem i do 72 godzin po zabiegu.
- Za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml i igły 26 G buprenorfinę podawać podskórnie w dawce 0,05 μg/g 30 minut przed zabiegiem i co 6 godzin przez pierwsze 72 godziny po zabiegu.
- Za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml i igły 26 G podać lidokainę do grzbietu myszy i 2-3 mm dystalnie do obszaru rany oparzeniowej. Lidokainę wstrzyknąć podskórnie w dawce 0,05 μg/g 15 minut przed indukcją rany oparzeniowej.
- Znieczulenie myszy za pomocą dootrzewnowego wstrzyknięcia ksylazyny w dawce 10 mg/kg i ketaminy 100 mg/kg. Do wykonania wstrzyknięcia należy użyć strzykawki o pojemności 1 ml i igły o pojemności 26 g.
- Krytyczny krok: Umieść znieczuloną mysz na podgrzewanej podkładce i utrzymuj mysz w cieple, aby zapobiec hipotermii przez pierwsze 30 minut po indukcji znieczulenia i przez co najmniej 15 minut po powrocie do zdrowia po znieczuleniu. Oprócz podgrzewanej podkładki do regulacji temperatury ciała można stosować inne modalności, w tym lampy grzewcze, krążące ciepłe płyny lub powietrze oraz wstępnie podgrzane zbiorniki ciepła.
- Nałóż żel nawilżający na oczy myszy, aby zapobiec odwodnieniu rogówki.
- Użyj odruchu wycofania szczypania palców u stóp, aby ocenić głębokość znieczulenia.
- Za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml i igły 26 G podać 200 μl roztworu Ringera z mleczanami uzupełnionego 5% dekstrozą. Płyn zastępczy należy podać podskórnie natychmiast po indukcji znieczulenia i 6 godzin po zabiegu, aby zapobiec odwodnieniu.
3. Pełna indukcja ran oparzeniowych
- Ogol znieczuloną mysz maszynką do strzyżenia włosów.
- Nałóż krem do depilacji na grzbietową powierzchnię myszy na 1 minutę. Zetrzyj krem za pomocą sterylnej gazy i oczyść obszar kawałkiem wilgotnej gazy. Osusz skórę gazą, aż wyschnie.
- Umieść mysz na stoliku pokrytym serwetą chirurgiczną i przesuń stolik w górę, bliżej podgrzanego mosiężnego szablonu.
- Nałóż okrągły mosiężny szablon na tył myszy (80 °C przez 20 s) przy stałym nacisku 0,15 N (Rysunek 2).
- Krok krytyczny: Natychmiast po indukcji oparzenia umieść znieczulone zwierzę na podgrzewanej podkładce, aby zapobiec hipotermii i utrzymać mysz w cieple podczas i po zabiegu. Po wyzdrowieniu ze znieczulenia przywróć mysz z powrotem do klatki.
- Krytyczny krok: Zapewnij puree dietę na podłodze klatki przez pierwsze 72 godziny po zabiegu chirurgicznym. Myszy czasami niechętnie sięgają do rurki spijającej, aby napić się wody po urazie spowodowanym oparzeniem.
4. Pobieranie przeszczepu dawcy
- Wykonaj podłużne nacięcie skalpelem w górnej części ogona myszy dawcy i delikatnie usuń skórę za pomocą kleszczy chirurgicznych.
- Umieść skórę ogona na sterylnej szalce Petriego wypełnionej 10 ml sterylnego 0,9% roztworu soli fizjologicznej. Za pomocą linijki odmierz poszczególne przeszczepy i pokrój skórę ogona na kawałki, z których każdy mierzy 15 mm, za pomocą skalpela.
- Po przygotowaniu przeszczepy skóry należy przechowywać w 0,9% roztworze soli fizjologicznej w temperaturze 4 °C przez maksymalnie 2 godziny.
5. Wycięcie chirurgiczne i przeszczep skóry
- Dwadzieścia cztery godziny po indukcji oparzenia przygotuj mysz do znieczulenia przez wdychanie izofluranu. Umieść mysz w komorze indukcyjnej i wywołaj znieczulenie za pomocą 5% izofluranu w 100% tlenu przy natężeniu przepływu 4 l/min. Aby utrzymać znieczulenie podczas zabiegu, należy stosować 2% izofluranu w dawce 2 l/min.
- Umieść serwetę chirurgiczną na myszy i wytnij okno, aby odsłonić pole operacyjne. Stosując technikę aseptyczną, przetrzyj ranę najpierw powidonem-jodem, a następnie 70% alkoholem.
- Delikatnie podnieś spaloną tkankę pęsetą chirurgiczną i wytnij wszystkie martwicze i niezdolne do życia tkanki sterylnymi nożyczkami chirurgicznymi i pęsetą. Usuń warstwę panniculus carnosus z tkanki podskórnej, aby stworzyć stabilne łóżko biorcze.
- Umieść przeszczep skóry na świeżo przygotowanym łożysku rany. Delikatnie pociągnij otaczającą skórę w kierunku przeszczepu skóry za pomocą pęsety chirurgicznej. Nałóż trochę kleju chirurgicznego, aby przymocować przeszczep do łożyska rany i delikatnie dociśnij, aby wyrównać krawędzie skóry. Etap krytyczny: Rozmiar łożyska rany musi być nieco większy niż rozmiar przeszczepu skóry, aby zapewnić pomyślne wszczepienie.
- Pozwól myszy dojść do siebie po znieczuleniu. Krytyczny krok: Umieść mysz na podgrzewanej podkładce. Utrzymuj mysz w cieple podczas i po zabiegu, aby zapobiec hipotermii.
- Na przeszczepioną ranę nałożyć obojętny opatrunek z gazy parafinowej i adhezyjny opatrunek wtórny.
- Umieść mysz w osobnej klatce. Krytyczny krok: Zapewnij trochę puree diety na podłodze klatki przez pierwsze 72 godziny po zabiegu chirurgicznym i monitoruj codziennie.
- Dostarczaj zabawki i wzbogacaj środowisko.
6. Obrazowanie cyfrowe i pobieranie ran pośmiertnych
- Sfotografuj rany aparatem cyfrowym poprzez umieszczenie linijki obok rany (Rysunek 3).
- W końcowym punkcie eksperymentu poddaj zwierzęta eutanazji poprzez wystawienie na dwutlenek węgla i zwichnięcie szyjki macicy. Etap krytyczny: Nadmierne ciągnięcie skóry podczas zwichnięcia szyjki macicy może uszkodzić przeszczep .
- Podczas sekcji zwłok chirurgicznie wyciąć rany oparzeniowe grzbietowej powięzi za pomocą nożyczek. Rany przecięte na pół. Napraw połowę w 10% buforowanej formaliny i proces do histologii i immunohistochemii. Drugą połowę należy szybko zamrozić w ciekłym azocie w celu ekstrakcji RNA i ilościowego określenia ilości białka i przechowywać w temperaturze -80 °C.
7. Histologia skóry, immunohistochemia i wizualizacja kolagenu
- Próbki skóry należy zatopić w parafinie, przyciąć na odcinki o wielkości 4 μm i umieścić na dodatnio naładowanych szkiełkach.
- Użyj szkiełek przebarwionych hematoksyliną i eozyną, aby ocenić szybkość ponownego nabłonkowania (% pierwotnej rany). Obszar rany, który jest pokryty neo-naskórkiem, może być wyrażony jako procent całej rany (Ryc. 4). Użyj aplikacji mikroskopu cyfrowego i oprogramowania ImageJ, aby przeprowadzić analizę mikroskopową przekrojów.
- Użyć skrawków histologicznych (o grubości 4 μm) przygotowanych z tkanki utrwalonej w formalinie i zatopionej w parafinie i poddać je immunohistochemii.
- Aby ocenić ekspresję kolagenu I i fibronektyny w ranach, należy zastosować przeciwciała pierwotne i inkubować przez 1 godzinę. Wykrywanie można przeprowadzić za pomocą specyficznych dla gatunku przeciwciał drugorzędowych sprzężonych z peroksydazą chrzanową (HRP) lub fosfatazą alkaliczną (AP).
- Reaguj sekcjami z jednym z nich: (i) HRP,3,3'-diaminobenzydyna (DAB) lub (ii) AP, Bond Polymer Refine Red (Tabela materiałów), co daje jaskrawoczerwony kolor (Rysunek 5). Zeskanuj przekroje za pomocą przyrządu i przeanalizuj za pomocą aplikacji mikroskopu cyfrowego i ImageJ.
- Aby umożliwić ocenę histologiczną odkładania się kolagenu, należy wykonać barwienie trichromowe na skrawkach histologicznych za pomocą dostępnego w handlu zestawu.
- Do wizualizacji włókien kolagenowych użyj mikroskopii wielofotonowej i techniki generowania drugiej harmonicznej (Rysunek 5). Użyj mikroskopu wielofotonowego do obrazowania tkanek zgodnie z wcześniejszym opisem20. Użyj lasera Ti:Sapphire o środkowej długości fali przy 810 nm jako źródła lasera do generowania sygnałów fluorescencyjnych wzbudzonych drugą harmoniczną i dwufotonową (TPEF).
- Użyj wiązki laserowej wyposażonej w obiektyw o mocy 25x/0,95 W, aby zebrać i wzbudzić generację drugiej harmonicznej (SHG) i TPEF. Wykrywanie sygnałów zgodnie z wcześniejszym opisem21 przez detektory NDD PMT. Korzystaj z oprogramowania do skanowania laserowego, sterowania i akwizycji obrazu.
Wyniki
Wyniki wykazują, że opracowany protokół jest prostą metodą, która pozwala na indukcję pełnej grubości rany oparzeniowej u myszy. Oparzenia indukuje się przy użyciu wstępnie podgrzanego mosiężnego szablonu (Rysunek 1A-C). Obszar oparzenia przejawia się jako okrągła rana z białym strupem i strefą hiperemiczną. Wielkość rany oparzeniowej jest nieco większa 24 godziny po urazie oparzeniowym w wyniku dobrze opisanego zjawiska znanego jako progresja urazu oparzeniowego, co prawdopodobnie wynika z ostrego stanu zapalnego22. Po wycięciu, rany oparzeniowe są rekonstruowane za pomocą allogenicznego przeszczepu skóry (Rysunek 3). W 7. dniu po urazie oparzeniowym rany ulegają unaczynieniu5, co jest oznaką udanego przyjęcia przeszczepu. Keratynocyty naskórka migrują z sąsiedniej skóry biorcy w celu zamknięcia rany i wypełnienia luki między dwoma krawędziami rany. Analiza mikroskopowa przekrojów ran barwionych H i E wykazała, że długość neo-naskórka staje się istotnie większa w 7. dniu po urazie oparzeniowym w porównaniu z 3. dniem po urazie (Rysunek 4B). Przed przeprowadzeniem dużego badania wysoce zaleca się, aby badacze wykonali badanie pilotażowe, które umożliwia zbadanie nowej interwencji, ocenę wykonalności oraz identyfikację modyfikacji metody w celu zapewnienia powtarzalności. Efekty istotne statystycznie są trudne do wykrycia w mniejszych próbach, natomiast zwiększenie liczebności próby jest jednym ze sposobów na zwiększenie mocy statystycznej testu. Na przykład, aby wykryć istotną statystycznie różnicę (p < 0,05) w tempie reepitelializacji rany (Rysunek 4) między grupami, liczebność próby powinna wynosić od sześciu do ośmiu myszy na grupę. Wszystkie eksperymenty należy powtórzyć co najmniej dwukrotnie. W miarę jak komórki produkujące macierz, takie jak fibroblasty, migrują z tkanki biorcy do przeszczepu, kluczowe składniki macierzy zewnątrzkomórkowej, w tym kolagen I i fibronektyna, wykazują wysoką ekspresję w nowo powstałej macierzy (Rysunek 5).
Rysunek 1: Układ urządzenia do wypalania. (A) Rozmieszczenie i konfiguracja urządzenia do wypalania. Urządzenie do wypalania jest podłączone do kontrolera temperatury oraz do manometru cyfrowego w celu monitorowania ciśnienia. Urządzenie do wypalania jest zawieszone nad regulowaną platformą – płaską powierzchnią, na której umieszcza się myszy w celu indukowania oparzenia. (B-C) Powiększenie mosiężnego szablonu używanego do indukowania oparzeń ran. (C) Średnica mosiężnego szablonu wynosi 1 cm. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 2: Schematyczne przedstawienie poszczególnych etapów niezbędnych do odtworzenia modelu eksperymentalnego opisanego w niniejszym artykule. Procedura składa się z trzech głównych etapów: (i) indukcja rany oparzeniowej przy użyciu wstępnie podgrzanego mosiężnego szablonu; (ii) chirurgiczne wycięcie nieżywotnej tkanki martwiczej 24 godziny po oparzeniu; (iii) chirurgiczna rekonstrukcja rany z wykorzystaniem pełnowarstwowego allogenicznego przeszczepu skóry pobranej od myszy dawcy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 3: Makroskopowy widok zrekonstruowanych oparzeń u myszy. Reprezentatywne obrazy cyfrowe ran oparzeniowych zrekonstruowanych za pomocą allogenicznych przeszczepów skóry w dniach 0, 1, 3 i 7 po urazie oparzeniowym. Linijka na obrazach jest w milimetrach. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 4: Wygląd mikroskopowy ran w 3. i 7. dobie po oparzeniu.Przekroje ran barwione H&E w 3. i 7. dobie po oparzeniu. Długość neoepidermy (linia przerywana) jest znacznie większa w ranach w 3. dobie (A) w porównaniu do ran w 7. dobie (B). Na obrazach (A) i (B) pasek skali wynosi 100 µm. (C) Graficzna prezentacja procentowego stopnia reepitelializacji rany. Zostało to ocenione poprzez pomiar długości neoepidermy w 3. i 7. dobie po oparzeniu i wyrażone jako procent całkowitej długości rany. Wyniki przedstawiają średnią ± S.E.M. (n = 6 myszy w grupie 3. doby; n = 6 myszy w grupie 7. doby, *p < 0.05; test t Studenta). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 5: Ocena macierzy zewnątrzkomórkowej i wizualizacja kolagenu I.Reprezentatywne obrazy analizy immunohistochemicznej ran myszy w 7. dniu, barwione na (A) kolagen oraz (B) fibronektynę. Zwróć uwagę na intensywne czerwone barwienie w wydłużonych, wrzecionowatych komórkach dodatnich pod kątem kolagenu I. Zwróć uwagę na brązowe barwienie w komórkach dodatnich pod kątem fibronektyny w skórze właściwej ran w 7. dniu. Pasek skali = 50 µm na wszystkich obrazach. W częściach (A) i (B) litera e oznacza naskórek, a litera d oznacza skórę właściwą. (C) Wizualizacja włókien kolagenowych i histologiczna ocena odkładania kolagenu. (D) Reprezentatywny obraz kolagenu TPEF/SHG ran myszy w 7. dniu. Jednoczesna akwizycja TPEF/SHG z wykorzystaniem polaryzacji kołowej; sygnały SHG zostały selektywnie przetworzone w celu uzyskania binarnego rozkładu SHG po zastosowaniu progu. Obrazy TPEF (zielone) i obrazy SHG (białe) zostały poddane pseudokolorowaniu i nałożone na siebie. Pasek skali = 50 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.
Dyskusja
Zgodnie z klasyfikacją grubości oparzeń23, oparzenia pełnej grubości charakteryzują się widocznym zajęciem całej grubości skóry i pewnej części tkanki podskórnej. Ten rodzaj rany może się goić tylko przez skurcz lub przeszczep skóry2. Nieodłącznym ograniczeniem metody opisanej w tym artykule jest to, że z ogona myszy pobrano tylko przeszczepy o pełnej grubości, w przeciwieństwie do przeszczepów o podzielonej grubości, które są często stosowane w warunkach klinicznych. Wynikało to z trudności technicznych, ponieważ skóra myszy jest zbyt cienka, aby uzyskać przeszczepy o podzielonej grubości. Należy podkreślić, że przeszczepy pełnej grubości wymagają dobrze unaczynionego łożyska rany, podczas gdy przeszczepy skóry o podzielonej grubości są w stanie przetrwać w miejscach dawczych o mniejszym unaczynieniu24. Wcześniejsze badania wykazały, że rana oparzeniowa wywołana na grzbiecie myszy była związana z silnym tworzeniem się nowego układu krwionośnego5. Sugeruje to, że dobrze unaczyniony obszar, taki jak grzbiet myszy, może być uważany za anatomiczny punkt orientacyjny do indukcji ran oparzeniowych.
Głębokość rany po oparzeniu jest ważnym czynnikiem, który należy wziąć pod uwagę. Głębokość rany po oparzeniu musi być taka sama u poszczególnych myszy. Powtarzalność głębokości rany oparzeniowej zależy od temperatury mosiężnego szablonu, ciśnienia i czasu trwania ekspozycji na ciepło. Głębokość rany oparzeniowej należy zweryfikować histologicznie. Ważne jest, aby pamiętać, że nadmierny nacisk lub długotrwałe narażenie skóry na podgrzany mosiężny szablon może uszkodzić leżącą pod spodem tkankę. Tkanka otaczająca kręgosłup, w tym elementy ośrodkowego i obwodowego układu nerwowego, jest wrażliwa na ciepło, a w przypadku uszkodzenia może spowodować paraliż tylnej nogi.
Chociaż śmiertelność pooperacyjna nie była bezpośrednio związana z zabiegiem chirurgicznym, niewielka liczba bezwłosych myszy SKH1-Hrhr, które są szczególnie wrażliwe na zimno, rozwinęła hipotermię i nie odzyskała sprawności po znieczuleniu ogólnym. Dlatego podczas wszystkich wydarzeń estetycznych należy zapewnić dodatkowe ciepło i wymagany jest stały nadzór podczas znieczulenia myszy.
Metoda opisana w tym badaniu nie była związana z zakażeniem miejsca operowanego. Należy jednak zastosować technikę aseptyczną, aby zapobiec przenoszeniu mikroorganizmów do rany operacyjnej w okresie okołooperacyjnym. Inokulacja rany mikroorganizmami bioluminescencyjnymi lub fluorescencyjnymi może być włączona do zabiegu. Technika ta może być przydatna w badaniu organizmów zakaźnych i ich patogenezy25. Na przykład egzogenne dodawanie lub wstrzykiwanie bakterii bioluminescencyjnych może umożliwić monitorowanie obciążenia mikrobiologicznego za pomocą obrazowania in vivo całych zwierząt25. Biorąc pod uwagę, że wiadomo, że włosy myszy zakłócają obrazowanie fluorescencji i bioluminescencji całego zwierzęcia in vivo, bezwłose myszy SKH1-Hrhr są idealnymi gospodarzami do badań z udziałem reporterów fluorescencyjnych lub bioluminescencyjnych.
Próbki tkanek rany mogą być pobierane w różnych punktach czasowych i przetwarzane do analizy histologicznej i immunohistochemicznej. Białko i RNA mogą być izolowane z biopsji skóry, a techniki biologii molekularnej mogą być stosowane do oceny ekspresji kluczowych cząsteczek zaangażowanych w gojenie się ran.
W niniejszej pracy opisano eksperymentalny model gojenia się ran oparzeniowych i allogenicznego wszczepienia skóry. Procedura ta może być modyfikowana i służyć jako model dla badań przedklinicznych.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez La Direction Générale de L'Armement, l'Agence de l'Innovation de Défense i École Polytechnique. Dziękujemy naszemu koledze, panu Yannowi Plantierowi z École Polytechnique, który podzielił się wiedzą i spostrzeżeniami, które w znacznym stopniu pomogły w produkcji pliku wideo. Autorzy dziękują Panu Benoit Peutemanowi i Pani Charlotte Auriau z INSERM Lavoisier (SEIVIL) US 33, Hôpital Paul Brousse, Villejuif za ich wiedzę specjalistyczną w zakresie dobrostanu zwierząt i opieki nad nimi, którą zapewnili w trakcie tego projektu.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 1 ml strzykawka | Terumo | SS + 01T1 | |
| 26 G igła | Terumo Agani | NN-2613R | 1/2'' - 0,45 X 12mm |
| 96X21 mm Szalka Petriego | Dutscher | 193199 | |
| Waga do ważenia zwierząt | Kern | EMB 5.2K5 | |
| BALB/c Mysz | Janvier labs | BALB/cAnNRj | 6-tygodniowe |
| podkładki piankowe do biopsji 30,2X25,4X2mm | Simport | M476-1 | |
| Bond polymer Refine Red | Leica Biosystems | DS9390 | |
| Blok mosiężny | BVG | specjalnie zaprojektowany | Okrągły o średnicy 10 mm |
| Buprenorfina (BUPRECARE) | Axience | FR/V/6328396 3/2011 | podawany podskórnie w dawce 0,05 μ g/ g |
| Aparat do spalania Kausistar 400 | Traç aMatrix | 34010 | |
| CaseViewer | 3DHISTECH Sp. z o.o. | 3Dhistech, Budapeszt, Węgry | |
| Przeciwciało Kolagen I | Abcam | ab34710 | Zalecane stężenie 1:50; 1:200 |
| D-(+)-glukoza (Dekstroza) | Sigma Aldrich | G-8769-100 ml | |
| DAB | Leica Biosystems | AR9432 | |
| Aparat cyfrowy | NIKON | D3400 | obiektyw: SIGMA 18-250mm F3.5-6.3 DC MACRO C45 |
| Krem do depilacji | Veet | ||
| Jednorazowe skalpele | Swann Morton | 6601 | |
| DPBS | PAN biotech | P04-36300 | |
| Absolutny etanol | VWR chemikalia | 20821.310 | |
| Przeciwciało fibronektyny | Abcam | ab23750 | Zalecane rozcieńczenie 1:1000 |
| Filtr 0,22um | Sartorius | 16532 | |
| Cienkie nożyczki | FST | 14094-11 | |
| Kleszcze Dumont | F.S.T. | 11295-10 | |
| Maszynki do strzyżenia włosów | AESCULAP | B00VAQ4KUY (ISIS) | |
| Poduszka grzewcza | Petelevage | 120070 | |
| Izofluoran | Piramal healthcare | FR/V/03248850/2011 | |
| Ketamina | Imalgene | FR/V/0167433 4/1992 | znieczulenie chirurgiczne, podawane dootrzewnowo w dawce 100mg/kg |
| mleczanowy roztwór Ringera | Flee-Flex | 1506443 | |
| Lamina Multilabel | Perkin Elmer | ||
| LAS | Leica | wersja 2.7.3 | |
| Leica Bond III | Leica Biosystem | 1757 | |
| Leukosilk | dressing BSN medical | 72669-01 | |
| Lidocaine | Aguettant | N01BB02 | miejscowy lek przeciwbólowy, podawany podskórnie w dawce 0,05 &m; g / g |
| Manometr | Kern | HDB-5K5 | |
| Masson Trichrome Zestaw do barwienia | Sigma-Aldrich | HT15-1KT | |
| Kasety do biopsji Micromesh | Simport | M507 | |
| Wielofotonowy odwrócony stojak Mikroskop Leica SP5 | Leica microsystems | DM500 | Skaner 8000Hz NDD PMT |
| Nieprzywierający opatrunek Adaptic | Systagenix | A6222 | 12,7 cm X 22,9 cm |
| Ocrygel | Tvm Francja | ### | |
| Paracetamol 300mg | Dolliprane | Liquiz | |
| Paraformaldheyde 4% | VWR chemikalia | 1169945 | |
| Powidon-jod | MEDA pharma | D08AG02 | rozcieńczony do 1:2 |
| SKH1-Hrhr mysz | Charles river | 686SKH1-HR | 6-tygodniowy |
| Szkiełka | Thermoscientific | AGAA000080 | |
| Klej chirurgiczny | BSN medical | 9927 | |
| Sterylna gaza | Hartmann | 418545/9 | 10 X 10 cm |
| Sterylna woda | Versylene Fresenius | B230521 | |
| Serweta chirurgiczna | Hartmann | 2775161 | |
| Ti:Szafir kameleonUltra | Coherent | DS 16-02-16 F | 690-1040 nm |
| Testo | Testo 868 | ||
| Ksylazyna (Rompum 2%) | Bayer | FR/V/ 8146715 2/1980 | znieczulenie chirurgiczne, podawane dootrzewnowo w dawce 10 mg/kg |
Bibliografia
- Shakir, S., et al. Indications and Limitations of Bilayer Wound Matrix-Based Lower Extremity Reconstruction: A Multidisciplinary Case-Control Study of 191 Wounds. Plastic and Reconstructive Surgery. , (2019).
- Greenhalgh, D. G. Management of Burns. New England Journal of Medicine. 380 (24), 2349-2359 (2019).
- Bosse, M. J., et al. An analysis of outcomes of reconstruction or amputation after leg-threatening injuries. New England Journal of Medicine. 347 (24), 1924-1931 (2002).
- Braza, M. E., Fahrenkopf, M. P. StatPearls. , (2019).
- Duchesne, C., Banzet, S., Lataillade, J. J., Rousseau, A., Frescaline, N. Cold atmospheric plasma modulates endothelial nitric oxide synthase signalling and enhances burn wound neovascularisation. Journal of Pathology. 249 (3), 368-380 (2019).
- Eming, S. A., Martin, P., Tomic-Canic, M. Wound repair and regeneration: mechanisms, signaling, and translation. Science Translational Medicine. 6 (265), 266(2014).
- Pakyari, M., et al. Local Expression of Indoleamine 2,3, Dioxygenase Prolongs Allogenic Skin Graft Take in a Mouse Model. Advances in Wound Care. 8 (2), New Rochelle. 58-70 (2019).
- Pakyari, M., et al. A new method for skin grafting in murine model. Wound Repair and Regeneration. 24 (4), 695-704 (2016).
- McFarland, H. I., Rosenberg, A. S. Skin allograft rejection. Current Protocols in Immunology. , Chapter 4, Unit 4 4 (2009).
- Cristobal, L., et al. Local Growth Hormone Therapy for Pressure Ulcer Healing on a Human Skin Mouse Model. International Journal of Molecular Sciences. 20 (17), (2019).
- Melican, K., Aubey, F., Dumenil, G. Humanized mouse model to study bacterial infections targeting the microvasculature. Journal of Visualized Experiments. (86), (2014).
- Racki, W. J., et al. NOD-scid IL2rgamma(null) mouse model of human skin transplantation and allograft rejection. Transplantation. 89 (5), 527-536 (2010).
- Larsen, C. P., et al. Migration and maturation of Langerhans cells in skin transplants and explants. Journal of Experimental Medicine. 172 (5), 1483-1493 (1990).
- Leonard, D. A., Kurtz, J. M., Cetrulo, C. L. Vascularized composite allotransplantation: towards tolerance and the importance of skin-specific immunobiology. Current Opinion in Organ Transplantationt. 18 (6), 645-651 (2013).
- Stoikes, N., et al. Biomechanical evaluation of fixation properties of fibrin glue for ventral incisional hernia repair. Hernia: The Journal of Hernias and Abdominal Wall Surgery. 19 (1), 161-166 (2015).
- Foster, K., et al. Efficacy and safety of a fibrin sealant for adherence of autologous skin grafts to burn wounds: results of a phase 3 clinical study. Journal of Burn Care & Research. 29 (2), 293-303 (2008).
- Caro, A. C., Hankenson, F. C., Marx, J. O. Comparison of thermoregulatory devices used during anesthesia of C57BL/6 mice and correlations between body temperature and physiologic parameters. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 52 (5), 577-583 (2013).
- Grada, A., Mervis, J., Falanga, V. Research Techniques Made Simple: Animal Models of Wound Healing. Journal of Investigative Dermatology. 138 (10), 2095-2105 (2018).
- Wang, X., Ge, J., Tredget, E. E., Wu, Y. The mouse excisional wound splinting model, including applications for stem cell transplantation. Nature Protocols. 8 (2), 302-309 (2013).
- Ruzehaji, N., et al. Pan PPAR agonist IVA337 is effective in prevention and treatment of experimental skin fibrosis. Annals of the Rheumatic Diseases. 75 (12), 2175-2183 (2016).
- Ruzehaji, N., et al. Combined effect of genetic background and gender in a mouse model of bleomycin-induced skin fibrosis. Arthritis Research & Therapy. 17, 145(2015).
- Singer, A. J., Burn Boyce, S. T. Wound Healing and Tissue Engineering. Journal of Burn Care & Research. 38 (3), 605-613 (2017).
- Shakespeare, P. Burn wound healing and skin substitutes. Burns. 27 (5), 517-522 (2001).
- Sun, B. K., Siprashvili, Z., Khavari, P. A. Advances in skin grafting and treatment of cutaneous wounds. Science. 346 (6212), 941-945 (2014).
- Miller, R. J., et al. Development of a Staphylococcus aureus reporter strain with click beetle red luciferase for enhanced in vivo imaging of experimental bacteremia and mixed infections. Scientific Reports. 9 (1), 16663(2019).
Przedruki i uprawnienia
