Artykuł metodologiczny

Rozwarstwienie i izolacja mysiego gleju z wielu regionów ośrodkowego układu nerwowego

DOI:

10.3791/61345

⸱

4 czerwca 2020

 , 
1Department of Neurosciences, Lerner Research Institute, Cleveland Clinic Foundation, 2Brain Health Research Institute, Kent State University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy protokół izolacji in vitro wielu populacji komórek glejowych z ośrodkowego układu nerwowego myszy. Metoda ta pozwala na segregację regionalnego mikrogleju, komórek prekursorowych oligodendrocytów i astrocytów w celu zbadania fenotypów każdego z nich w różnych systemach hodowli.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawione tutaj metody demonstrują procedury laboratoryjne do rozbioru czterech różnych regionów ośrodkowego układu nerwowego (OUN) od mysich noworodków w celu izolacji subpopulacji glejowych. Celem zabiegu jest dysocjacja mikrogleju, komórek progenitorowych oligodendrocytów (OPC) i astrocytów od tkanki korowej, móżdżku, pnia mózgu i rdzenia kręgowego w celu ułatwienia dalszej analizy in vitro. Procedury izolacji regionu OUN pozwalają na określenie regionalnej heterogeniczności między glejami w systemach hodowli wielokomórkowych. Przeprowadza się szybką izolację regionu OUN, a następnie mechaniczne usunięcie opon mózgowych, aby zapobiec zanieczyszczeniu komórek oponowych gleju. Protokół ten łączy delikatną dysocjację tkanek i powlekanie na określonej matrycy, zaprojektowaną w celu zachowania integralności i przylegania komórek. Izolowanie mieszanego gleju z wielu regionów OUN zapewnia kompleksową analizę potencjalnie heterogenicznego gleju przy jednoczesnej maksymalizacji wykorzystania poszczególnych zwierząt doświadczalnych. Dodatkowo, po dysocjacji tkanki regionalnej, mieszany glej jest dalej dzielony na wiele typów komórek, w tym mikroglej, OPC i astrocyty do stosowania w pojedynczym typie komórki, wstawkach do kultur komórkowych lub systemach kohodowli. Ogólnie rzecz biorąc, zademonstrowane techniki zapewniają kompleksowy protokół o szerokim zastosowaniu do starannej sekcji czterech indywidualnych regionów OUN od mysich noworodków i obejmują metody izolacji trzech indywidualnych typów komórek glejowych w celu zbadania regionalnej heterogeniczności w dowolnej liczbie systemów hodowli komórkowych in vitro lub testów.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gleju są niezbędne do prawidłowego funkcjonowania neuronów w OUN. Składają się one z trzech głównych subpopulacji, astrocytów, oligodendrocytów i mikrogleju, z których każda ma inną, ale niezbędną rolę1. Bez odpowiedniej różnorodności i aktywności komórek glejowych funkcja neuronów byłaby poważnie zaburzona, co prowadziłoby do upośledzenia OUN. Komórki glejowe są zdolne do wpływania na neuroprzekaźnictwo, a każdy typ komórek robi to w unikalny sposób. Komórki glejowe w mózgu mają zdolność komunikowania się między sobą, a także z komórkami neuronalnymi, w celu ułatwienia prawidłowego funkcjonowania OUN2. Oligodendrocyty zwiększają prędkość transmisji elektrycznej poprzez tworzenie osłonki mielinowej, która ułatwia grupowanie kanałów jonowych w węzłach Ranviera, miejscach generowania neuronalnego potencjału czynnościowego3. Mikroglej ma kluczowe znaczenie dla oczyszczania synaps poprzez monitorowanie transmisji synaptycznej i "przeprogramowanie" połączeń neuronalnych po urazie4. Ponadto mikroglej jest najliczniejszą rezydującą komórką odpornościową OUN, działającą jako podstawowa forma obrony gospodarza przed patogenami5. Astrocyty mogą regulować przekaźnictwo synaptyczne między neuronami poprzez modyfikację stężenia zewnątrzkomórkowego potasu6. Odgrywają również rolę w kontrolowaniu lokalnego przepływu krwi7, uwalniając i pobierając elementy neuromodulujące8, oraz odgrywają kluczową rolę w utrzymaniu bariery krew-mózg9. Tak więc każdy podtyp glejowy ma kluczowe znaczenie dla funkcji OUN, ponieważ defekty dowolnego typu od dawna są związane z szeroką gamą stanów patologicznych, w tym chorobami psychicznymi, padaczką i stanami neurodegeneracyjnymi10.

Największą przeszkodą w badaniu patobiologii OUN jest niemożność zbadania komórek ludzkich w kontekście ich niszy mikrośrodowiskowej. Tkanka z biopsji ludzkiej jest najczęściej pobierana po sekcji zwłok, a komórki mogą łatwo ulec uszkodzeniu lub utracie podczas ekstrakcji i przetwarzania. Co więcej, wyzwaniem jest utrzymanie ludzkich komórek przy życiu i żywotności in vitro przez dowolny okres czasu bez wyprowadzania unieśmiertelnionych linii komórkowych z guzów, w którym to momencie nie odzwierciedlają one już dokładnie ich normalnych właściwości fizjologicznych11,12. Ponadto istnieje znaczna różnorodność regionalna między poszczególnymi typami komórek glejowych13,14,15, a uzyskanie regionalnych próbek OUN od poszczególnych pacjentów jest prawie niemożliwe. W związku z tym konieczne jest opracowanie alternatywnych modeli w celu zbadania udziału regionalnego gleju w określonych zaburzeniach OUN.

Tutaj opisujemy system in vitro wykorzystujący specyficzną dla regionu OUN izolację wielu subpopulacji gleju u myszy, co pozwala na manipulację i kwantyfikację mikrogleju, komórek prekursorowych oligodendrocytów (OPC), które dają początek dojrzałym oligodendrocytom i astrocytom. Każda populacja może być niezależnie izolowana i poddawana szerokiej gamie technik eksperymentalnych, w tym leczeniu lekami lub cząsteczkami, immunocytochemii, ekstrakcji i analizie białek/RNA oraz innych systemach kohodowli, w zależności od konieczności eksperymentalnej. Ponadto ta technika izolacji daje wysoką liczbę komórek, co pozwala na scharakteryzowanie i zbadanie każdej populacji glejowej w sposób wysokoprzepustowy. Umożliwia również badanie różnicowania, wzrostu i proliferacji komórek OUN w odpowiedzi na szeroką gamę bodźców mikrośrodowiskowych w kontrolowany sposób, aby uniknąć czynników zakłócających, które są zwykle obecne w warunkach in vivo. Wreszcie, ta technika izolacji komórek ułatwia manipulowanie populacjami komórek glejowych w różnych regionach OUN w celu zbadania, w jaki sposób regionalne komórki glejowe oddziałują ze sobą i reagują na różne bodźce, co pozwala na precyzję i odtwarzalność.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Wszystkie badania na zwierzętach zostały autoryzowane i zatwierdzone przez Cleveland Clinic Lerner Research Institute Institutional Animal Care and Use Committee.

1. Przygotuj pożywki i materiały do sekcji

UWAGA: Wszystkie receptury i nośników są podane w Tabeli 1. Procedura ta jest wykonywana w sterylnych warunkach w komorze bezpieczeństwa biologicznego przeznaczonej do hodowli tkankowej.

  1. Przygotować i sterylnie przefiltrować mieszane podłoża glejowe (MGM). Można to zrobić dzień wcześniej i przechowywać w temperaturze 4 °C.
  2. Rozcieńczyć fibronektynę w stężeniu 1:100 sterylnymH2O. Objętość rozcieńczonej fibronektyny będzie zależeć od liczby szczeniąt i regionu OUN użytego w eksperymencie. Użyj jednej kolby T25 na 1 korę, jednej kolby T25 na 2-4 móżdżce, jednej kolby T25 na 2-4 pnie mózgu i jednej kolby T25 na 2-4 rdzenie kręgowe.
    UWAGA: Połączenie tkanki z tego samego regionu przy użyciu kryteriów wymienionych powyżej pozwoli na odpowiednią dysocjację bez zmiany protokołu opisanego poniżej. Połączenie większej ilości tkanek niż opisano w kroku 1.2 będzie wymagało dalszej optymalizacji stężeń odczynników dysocjacyjnych.
  3. Pobrać pipetą 3 ml rozcieńczonej fibronektyny do kolb T25 w temperaturze pokojowej i odstawić na 2 minuty.
  4. Odessać fibronektynę i pozostawić kolby do wyschnięcia na noc z poluzowaną pokrywką kolby.

2. Rozwarstwienie kory mózgowej, móżdżku, pnia mózgu i rdzenia kręgowego

UWAGA: Ta procedura może być wykonana na stole i wymaga zakresu sekcji. Stosuj ścisłą technikę aseptyczną na wszystkich etapach zabiegu i zminimalizuj narażenie tkanek na powietrze w pomieszczeniu. Podczas sekcji wszystkie podłoża należy przechowywać w chłodzie na lodzie, aby zapewnić maksymalną ochronę tkanek. Alternatywnie, procedurę tę można wykonać w kapturze, który pozwala na użycie wewnętrznej lunety preparcyjnej.

  1. Przetrzyj wszystkie obszary 70% etanolem.
  2. Pobrać pipetą 10 ml PBS/roztworu antybiotyku (PAS) na 10-centymetrową szalkę Petriego. Przygotuj jedną szalkę Petriego dla każdego szczeniaka, który ma zostać poddany sekcji. Ustaw na lodzie, aby roztwór był schłodzony.
  3. W zdezynfekowanym kapturze do hodowli tkankowych odpipetować 9 ml DMEM (bez dodatków) do 4 oddzielnych stożkowych probówek o pojemności 15 ml, po jednej dla każdego regionu OUN, wymienić nakrętki probówek i umieścić na lodzie. Umieść wiadro na lód z rurkami w odległości sięgającej od lunety preparcyjnej.
  4. Umieścić 10-centymetrową szalkę Petriego przygotowaną w kroku 2.2 na zdezynfekowanym etapie sekcji.
  5. Znieczulić i poddać eutanazji szczenię myszy zgodnie z protokołem instytucjonalnym i usunąć głowę przez szybkie ścięcie głowy ostrymi nożyczkami.
    UWAGA: W dniu poporodowym (P) używa się 3-5 szczeniąt. Starsze szczenięta mają bardziej rozwinięty OUN i mogą nie być odpowiednim źródłem rozszerzających się komórek glejowych. Młodsze młode (P) 0-2 mogą dawać większą liczbę gleju i mogą być wykorzystywane; Jednak tkanka rdzenia kręgowego jest bardzo trudna do wypreparowania w tak młodym wieku ze względu na rozmiar.
  6. Oczyść skórę szczeniaka za pomocą 70% etanolu.
  7. Za pomocą cienkich nożyczek przetnij warstwę skórną wzdłuż linii środkowej głowy zwierzęcia, zaczynając doogonowo i poruszając się rostralnie, aż do osiągnięcia pyska. Unikaj głębokiego wcinania się w czaszkę, aby uniknąć uszkodzenia tkanki.
  8. Pochylając głowę w dół, pociągnij warstwę skóry z każdej strony czaszki i za pomocą nożyczek sprężynowych wykonaj nacięcie wzdłuż linii środkowej czaszki, zaczynając od otworu wielkiego, ponownie przecinając ogon do rostralu.
  9. Za pomocą kleszczy z cienką końcówką pociągnij połówki czaszki na prawą i lewą stronę, odsłaniając korę, móżdżek i pień mózgu.
  10. Po wystawieniu na działanie promieni słonecznych delikatnie wyjmij mózg z czaszki i ułóż go na 10-centymetrowej szalce Petriego przygotowanej w kroku 2.2. Upewnij się, że mózg pozostaje nieuszkodzony, aby zachować strukturę anatomiczną, z przyczepionym tyłomózgowiem.
  11. Używając cienkich, zakrzywionych kleszczyków z czubkiem kleszczy skierowanym do góry, uszczypnij móżdżek. Wyjmij opony mózgowe i umieść w przeznaczonej do tego stożkowej probówce o pojemności 15 ml w pojemniku na lód.
  12. Upewnij się, że pień mózgu jest bezpośrednio brzuszny w stosunku do móżdżku i jest widoczny po usunięciu móżdżku. Usuń go kleszczami z cienką końcówką, usuń opony mózgowe i umieść w przeznaczonej do tego stożkowej probówce o pojemności 15 ml w wiadrze z lodem.
  13. Oddziel śródmózgowie od kory, usuń opony korowe i umieść w przeznaczonej do tego stożkowej probówce o pojemności 15 ml w wiadrze z lodem.
  14. Aby usunąć rdzeń kręgowy, umieść pozbawione głowy szczenię myszy w pozycji leżącej na plecach (leżąc twarzą do góry) z odciętym kręgosłupem uniesionym w kierunku badacza.
  15. Spryskaj ponownie 70% etanolem.
  16. Przeciąć wzdłuż bocznych boków kręgosłupa, w kierunku rostralnym do ogonowego, przez klatkę piersiową, aż do dotarcia do kończyn tylnych. Podczas cięcia odepchnij narządy wewnętrzne, aż kręgosłup będzie widoczny.
  17. Przeciąć wzdłuż każdej bocznej strony kręgosłupa aż do jego odizolowania i umieścić na 10-centymetrowej szalce Petriego przygotowanej w kroku 2.2.
  18. Brzuszną stroną do góry, używając cienkich nożyczek sprężynowych, naprzemiennie przecinaj prawą i lewą stronę każdego kręgu, aż dotrze do odcinka lędźwiowego, aby odsłonić tkankę rdzenia kręgowego.
  19. Delikatnie usuń rdzeń kręgowy i opony mózgowe za pomocą kleszczy z cienką końcówką pod mikroskopem preparacyjnym. Umieść w wyznaczonej stożkowej probówce o pojemności 15 ml w wiaderku na lód.
  20. Powtórzyć kroki 2.5-2.19 dla każdego młodego, łącząc tkanki z tego samego regionu w celu dopasowania do kryteriów określonych w kroku 1.2 dla każdej przygotowanej kolby T25.
    UWAGA: Usuń opony mózgowe tak całkowicie, jak to możliwe. Jeśli pozostanie znaczna ilość opon mózgowych, podobny do fibroblastów fenotyp komórek opon mózgowych wyrośnie i przytłoczy hodowlę komórkową. Wiele rdzeni kręgowych o jednakowym fenotypie można łączyć w celu wytworzenia określonej hodowli komórkowej. Należy uważać, aby nie doszło do przeludnienia komórek, co może prowadzić do apoptozy glejowej i zróżnicowanych fenotypów.

3. Dysocjacja tkanek

UWAGA: Wszystkie poniższe procedury są przeprowadzane w sterylnym komorze bezpieczeństwa biologicznego z przeznaczeniem do hodowli tkanek przy użyciu techniki aseptycznej i sterylnych materiałów.

  1. Dodaj 1 ml 0,05% trypsyny zawierającej 0,53 mM EDTA do każdej stożkowej probówki o pojemności 15 ml z 9 ml DMEM i tkanki, aby rozpocząć lizę tkanki.
    UWAGA: DMEM zawiera dużą ilość chlorku wapnia, który może działać jako inhibitor trypsyny. Jeśli dysocjacja nie jest zakończona zgodnie z opisanymi krokami, można zastosować zrównoważony roztwór soli Hanksa bez wapnia i magnezu. Po trypsynizacji enzym można zneutralizować poprzez dodanie inhibitora trypsyny, chociaż wapń należy dodać z powrotem do roztworu, ponieważ jest on kofaktorem dla DNazy I, który jest stosowany w kolejnych etapach.
  2. Rozprowadzić pipetą o pojemności 10 ml około 20 razy.
  3. Przenieść zawiesiny komórek do pustych probówek stożkowych o pojemności 50 ml.
  4. Roztwór inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 15 minut, delikatnie mieszając lizaty po 8 minutach.
  5. Dodać 5 ml MGM i 200 μl (5 mg/mL) DNazy I do każdej probówki, aby uzyskać końcowe stężenie 50 μg/ml.
  6. Potaryzować każdy lizat pipetą o pojemności 10 ml 10 razy.
  7. Pozostaw zawiesiny komórek na 3 minuty w temperaturze pokojowej, aby umożliwić niezdysocjowaną tkankę osadzanie się na dnie probówek.
  8. Przenieś zawiesiny komórek do nowych stożkowych probówek o pojemności 50 ml, pozostawiając niezdysocjowaną tkankę.
    UWAGA: Opisane powyżej etapy lizy i rozcierania znacznie ograniczają ilość niezdysocjowanej tkanki.
  9. Odwirować probówki o sile 300 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C bez hamulca.
  10. Odessać supernatant i ponownie zawiesić pozostałe granulki komórek w 5 ml MGM.
  11. Rozetrzeć osad za pomocą pipety 5 ml 20x.
  12. Zawiesiny komórek o objętości 5 ml należy umieścić na powlekanych kolbach T25.
  13. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C, 5% CO2 i początkowo zmienić pożywkę po 24 godzinach, aby usunąć resztki komórek.
    UWAGA: Niektóre protokoły zalecają początkową wymianę nośnika po 72 godzinach. Może być wymagana optymalizacja tego kroku.
  14. Wykonuj 100% wymianę pożywki za pomocą MGM co 48-72 godziny, aż komórki będą zlewać się w 80% (około 5-7 dni).
    UWAGA: Wszystkie media muszą być podgrzane do 37 °C przed wymianą nośnika.

4. Izolacja mikrogleju

  1. Gdy mieszane kultury gleju osiągną 80% zbieżności, przygotuj kolby do wstrząsania, dokręcając pokrywki i uszczelniając folią parafinową.
  2. W celu usunięcia mikrogleju z mieszanych kultur glejowych, należy zabezpieczyć kolby poziomo na wytrząsarce orbitalnej wewnątrz inkubatora o temperaturze 37 °C. Wstrząsać kolbami o masie 15 x g przez 1 godzinę.
  3. Wyjąć pożywkę i pipetę do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Przepłukać kolby dwukrotnie ciepłym MGM o pojemności 3 ml, dodając płyn do stożkowych probówek o pojemności 15 ml. To jest mikroglej.
  4. Dodać 5 ml ciepłego, świeżego MGM do kolb hodowlanych.
  5. Ponownie zamknąć kolby folią parafinową, zabezpieczyć kolby poziomo na wytrząsarce i wstrząsać w temperaturze 15 x g w temperaturze 37 °C przez 15 godzin w celu oddzielenia OPC od astrocytów.
    UWAGA: Ten krok można wykonać w nocy, ale 15-godzinny czas wstrząsania ma kluczowe znaczenie, ponieważ nadmiar czasu może spowodować śmierć komórki.
  6. Odwirować supernatant z kroku 4.3. przy 300 x g przez 3 minuty i wyhodować mikroglej zgodnie ze standardowymi protokołami16 lub użyć do testu biologicznego.

5. Izolacja komórek prekursorowych oligodendrocytów

UWAGA: Podczas powlekania OPC po wstępnej izolacji, muszą one być powlekane na powierzchni pokrytej poli-D-lizyną (sterylna płytka lub szkiełko nakrywkowe). Przygotuj te materiały przed ukończeniem tej sekcji.

  1. Po 15 godzinach wstrząsania usunąć supernatant z kolb i ułożyć płytkę na sterylnej szalce Petriego o średnicy 100 mm.
  2. Inkubować supernatant w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 30 minut, mieszając po 15 minutach w celu usunięcia resztek mikrogleju, ponieważ te bardzo szybko przylegają do naczynia. Na tym etapie można użyć szalek Petriego niepoddanych hodowli tkankowej.
  3. Usunąć nieprzylegający supernatant komórek, policzyć i płytkę na powierzchni pokrytej poli-D-lizyną. Zazwyczaj platerowanych jest 7 500-10 000 OPC/cm2.
  4. Inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez co najmniej 1 godzinę (do 6 godzin), następnie delikatnie zassać 95% pożywki i powoli dodawać ciepłe pożywki OPC, pipetując pożywkę do ścianki studzienki, aby zminimalizować zakłócenia OPC. Zmieniaj pożywkę co 48 godzin, aż ogniwa będą gotowe do użycia.
    UWAGA: Bardzo ważne jest, aby wymieniać tylko jedną studzienkę na raz. OPC są wrażliwe i szczególnie nietolerancyjne na suche warunki. Dodanie PDGF-AA do pożywki OPC ma na celu opóźnienie dojrzewania OPC do oligodendrocytów. Czynnik ten można wykluczyć z pożywek hodowlanych, jeżeli celem doświadczenia są dojrzałe oligodendrocyty.

6. Izolacja astrocytów

  1. Po 15 godzinach wstrząsania usunąć supernatant i przepłukać kolby 2x ciepłym 1x PBS.
  2. Dodać 4 ml 0,05% trypsyny zawierającej 0,53 mM EDTA i inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 5 minut lub do momentu, gdy komórki się podniosą. Aby upewnić się, że astrocyty się podniosły, wizualizuj je za pomocą standardowego mikroskopu szerokokątnego. Astrocyty będą wyglądać na kuliste po trypsynizacji.
  3. Po odłączeniu astrocytów należy ustawić kolbę pionowo i dodać 4 ml MGM. Zmiksować do wymieszania.
  4. Pipetować astrocyty do stożkowej probówki o pojemności 15 ml, wirować przy 300 x g przez 5 minut.
  5. Ponownie zawiesić astrocyty w pożywce astrocytowej i płytce na powierzchni pokrytej fibronektyną, jak opisano w kroku 1.2. lub użyć do testu biologicznego.
    UWAGA: Podczas pierwszej zmiany pożywki można dodać mysi czynnik wzrostu fibroblastów o sile 20 ng / ml, aby pomóc w ustaleniu kultury astrocytów. Dodatkowo standardowa powłoka żelatynowa może być tanią alternatywą dla fibronektyny.

7. Identyfikacja i izolacja mikrogleju, OPC, astrocytów i dojrzałych oligodendrocytów za pomocą immunocytochemii

  1. Gdy posiane komórki osiągną odpowiednią konfluencję, delikatnie usuń pożywkę i utrwal przylegające komórki za pomocą 4% paraformaldehydu (PFA) przez 10 minut. Wykonaj ten krok w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
    UWAGA: Podczas zasysania lub dodawania roztworów delikatnie docisknij, aby zapobiec oderwaniu się komórek.
  2. Powoli odessać PFA, a następnie przemyć komórki 3x 1x PBS przez 5 min.
  3. Przygotuj odpowiedni roztwór blokujący, używając 10% serum i 0,1% Triton X-100 w 1x PBS.
    UWAGA: Źródło surowicy odzwierciedla zwierzę gospodarza, u którego wyhodowano przeciwciało drugorzędowe. Na przykład, jeśli przeciwciałem drugorzędowym jest koza anty-królicza, odpowiednią surowicą blokującą jest normalna surowica kozia. Podobnie, jeśli przeciwciałem drugorzędowym jest przeciwciało anty-królicze osła, surowica blokująca powinna być normalną surowicą osła.
  4. Dodaj roztwór blokujący, aż komórki zostaną całkowicie pokryte. Blokuj przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  5. Przygotować roztwór rozcieńczalnika przeciwciał (9 ml 1x PBS, 0,01 g albuminy surowicy bydlęcej, 30 μl Triton X-100). Alternatywnie, przeciwciała można rozcieńczyć w roztworze blokującym opisanym w kroku 6.3.
  6. Rozcieńczyć przeciwciała pierwszorzędowe specyficzne dla następujących przeciwciał w rozcieńczalniku przeciwciał lub roztworze blokującym:
    1. Mikroglej: zjonizowana cząsteczka adaptora wiążącego wapń 1 (Iba1) w rozcieńczeniu 1:250 (2,4 μg/ml).
    2. OPC: antygen nerwowy/glejowy 2 (NG2) w rozcieńczeniu 1:200 (5 μg/ml).
    3. Dojrzałe oligodendrocyty: zasadowe białko mielinowe (MBP) w rozcieńczeniu 1:400 (stężenie zależy od partii i może być konieczna optymalizacja).
    4. Astrocyty: kwaśne białko fibrylarne glejowe (GFAP) w rozcieńczeniu 1:400 (0,25 μg / ml) < klasa sup = "xref">17,
      UWAGA: Nie mieszaj przeciwciał pierwszorzędowych wytworzonych u tego samego gatunku.
      UWAGA: GFAP niezawodnie oznaczy astrocyty istoty białej. W przypadku astrocytów istoty szarej może być konieczne zastosowanie alternatywnego markera.
  7. Przeciwciało pierwszorzędowe inkubować przez noc w temperaturze 4 °C (preferowane jest delikatne mieszanie).
  8. Przemyj 3x 1x PBS przez 5 minut, aby usunąć przeciwciało pierwotne.
  9. Inkubować komórki z odpowiednimi przeciwciałami drugorzędowymi w rozcieńczalniku 1:400 w rozcieńczalniku przeciwciał lub roztworze blokującym chronionym przed światłem.
    UWAGA: Przeciwciała drugorzędowe są sprzężone z fluoroforem, który może być wymieniany w zależności od dostępnych parametrów mikroskopu. Po zastosowaniu fluorescencyjnych przeciwciał drugorzędowych należy w miarę możliwości chronić przed światłem.
  10. Inkubować przeciwciała drugorzędowe przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, ograniczając ekspozycję na światło.
  11. Przemyć 3 razy 1x PBS przez 5 minut, aby usunąć nadmiar przeciwciał drugorzędowych.
  12. Do znakowania jąder należy użyć roztworu DAPI/PBS w proporcji 1:1 000 i inkubować komórki przez 5 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
  13. Umyj 3x z 1x PBS przez 5 min w ciemności.
  14. Aby zamontować, nałóż nośnik montażowy i pozostaw do wyschnięcia w ciemności przed obrazowaniem.
    UWAGA: Zamontowane szkiełka można przechowywać w temperaturze pokojowej przez 2-3 dni. W przypadku długotrwałego przechowywania należy przesunąć szkiełka do temperatury 4 °C. Obraz w ciągu jednego tygodnia, aby uzyskać maksymalny sygnał. Wszystkie reprezentatywne obrazy zostały zobrazowane pod mikroskopem konfokalnym; Zalecane są jednak również odwrócone mikroskopy fluorescencyjne.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Reprezentatywne dane pokazane poniżej ilustrują, że sygnalizacja IFNγ wpływa na różnicowanie i dojrzewanie OPC. Bez obecności receptora IFNγ (IFNγR), korowe OPC nie różnicują się tak łatwo w dojrzałe oligodendrocyty mielinizujące, o czym świadczy brak barwienia MBP (Rysunek 1). Ponieważ oligodendrocyty i astrocyty pochodzą od wspólnego przodka, przeanalizowaliśmy ekspresję GFAP, która oznacza astrocyty. Odkryliśmy, że komórki z niedoborem IFNγR silnie wyrażają GFAP, co sugeruje, że mogą przyjmować fenotyp astrocytów, potwierdzając wcześniejsze doniesienia19.

Dodatkowym dowodem na regionalną heterogeniczność komórek OUN jest różnica w morfologii astrocytów, obserwowana w astrocytach z kory, móżdżku, pnia mózgu i rdzenia kręgowego (Rysunek 2). Warto zauważyć, że astrocyty z tego samego regionu mogą również wykazywać heterogeniczność morfologiczną, co potwierdza pogląd, że ten podtyp glejowy jest wysoce dynamiczny. Różnice w architekturze komórkowej sugerują różnorodność funkcjonalną, a zatem zdolność do izolowania populacji glejowych jest niezbędna do badania odpowiedzi fenotypowych przy braku i obecności bodźców mikrośrodowiskowych.

Oligodendrocyty są niezbędne do mielinizacji aksonów neuronalnych i są niezbędne do prawidłowej naprawy i funkcjonowania OUN. OPC dają początek swoim dojrzałym odpowiednikom, co sprawia, że kluczowe znaczenie ma zrozumienie biologii stojącej za ich zdolnością do różnicowania. Sygnalizacja cytokin znacząco wpływa na zachowanie komórek macierzystych i odpornościowych. Dlatego ważne jest, aby zrozumieć, w jaki sposób regionalne odpowiedzi OPC mogą różnić się na różnicową stymulację cytokinami (Ryc. 3), co może wpływać na ich zdolność do różnicowania się w dojrzałe oligodendrocyty mielinizujące.

figure-results-1
Rysunek 1: Reprezentatywne dane pokazujące różnicowanie OPC u myszy WT i IFNγR-/- w obecności egzogennego IFNγ. Korowe OPC wyizolowano z (A) WT i (B) IFNγR-/- P4 mysich pupów zgodnie z procedurą opisaną powyżej. Komórki traktowano 1 ng/ml IFNγ przez 48 godzin, a następnie utrwalano i barwiono w celu nakreślenia różnicowania komórek. OPC zostały oznaczone dla NG2 i GFAP w celu zidentyfikowania tych, które przyjmowały fenotyp astrocytarny. Podobnie, OPC zostały również oznaczone dla NG2 i MBP, aby zidentyfikować te, które różnicowały się w dojrzałe oligodendrocyty. Podziałka = 20 μM. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rycina 2: Reprezentatywne dane wykazujące regionalną heterogeniczność morfologii astrocytów. Astrocyty z kory mózgowej, móżdżku, pnia mózgu i rdzenia kręgowego wyizolowano od młodych myszy P4 przy użyciu protokołu opisanego powyżej i oznaczono jako GFAP (zielony) za pomocą immunocytochemii po 48 godzinach w hodowli. Podziałka = 20 μM. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Reprezentatywne dane pokazujące zróżnicowane odpowiedzi regionalnych OPC na cytokiny. OPC wyizolowano z pnia mózgu i rdzenia kręgowego szczeniąt myszy P4 przy użyciu protokołu opisanego powyżej. Komórki potraktowano rosnącymi stężeniami (1-10 ng/ml) (A) IFNγ lub (B) interleukiny (IL)-17 w celu zbadania zróżnicowanego wpływu cytokin na zdolność regionalnych OPC do różnicowania się w mielinizujące oligodendrocyty. Po 48-godzinnej inkubacji z określonymi cytokinami, OPC utrwalono i znakowano dla NG2 (zielony) i MBP (czerwony). Podziałka liniowa = 20 μM. Dane reprezentują średnie ± SEM. **, p < 0,01; , p < 0,001; , p < 0,0001 przez 2-kierunkową ANOVA. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

PBS/Roztwór antybiotykowy (PAS):
1,0 ml100X Antybiotyk/Antybiotyk zawierający 10 000 jednostek/ml penicyliny i 10 000 mg/ml streptomycyny
25 mg/mlAmfoterycyna B
99 ml1X PBS
Mieszane podłoża glejowe (MGM)
88 ml1X DMEM (wysoki poziom glukozy, z L-glutaminą, z pirogronianem Na)
10 mlAktywowany termicznie FBS
1,0 mlL-Glutamina (100X)
1,0 mlAntybiotyk/Antybiotyk
nośniki OPC (50mL)
49 mlPodłoże nerwowo-podstawne
1,0 mlsuplement B27 (50X)
10 ng/mlPDGF-AA
UWAGA: PDGF-AA jest dodawany na nowo przed każdą zmianą nośnika.
Pożywka astrocytowa (1 L)
764 mlMEM z solami Earle'a zawierającymi glutaminę
36 mlGlukoza (użyj 100 mg/ml bulionu do końcowego zagęszczenia 20 mM)
100 mlAktywowany termicznie FBS
100 mlInaktywowana termicznie surowica konia
10 mlGlutamina (użyj 200 mM zapasu, jeśli nie jest zawarta w podłożu podstawowym)
OPCJONALNIE: 10 ng/ml rekombinowany naskórkowy czynnik wzrostu myszy
UWAGA: Sterylnie przefiltruj wszystkie media i przechowuj w temperaturze 4°C do momentu użycia.

Tabela 1: Receptury i mediów.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym protokole opisujemy izolację trzech głównych subpopulacji komórek glejowych z OUN myszy: mikrogleju, OPC i astrocytów. Główną przeszkodą w badaniach nad chorobami neurodegeneracyjnymi i neurozapalnymi OUN jest brak pierwotnych komórek i tkanek ludzkich, szczególnie tych, które są regionalne i pochodzą od tego samego pacjenta. W większości przypadków ludzkie linie komórkowe OUN pochodzą z przekształconych, unieśmiertelnionych komórek rakowych, które mogą nie być dokładnymi reprezentacjami ich normalnego zachowania fizjologicznego 20,21,22. W związku z tym konieczne są alternatywne metody badania fenotypów komórek OUN w kontrolowany sposób. Co więcej, różnorodność neurologicznych populacji komórek glejowych sprawia, że konieczne jest zbadanie każdego podtypu zarówno niezależnie od siebie, jak i w warunkach wspólnej hodowli, aby podsumować zarówno ich autonomiczne, jak i nieautonomiczne funkcje komórkowe. Komórki glejowe pełnią wiele różnych krytycznych funkcji w OUN, począwszy od wsparcia neuronalnego23, uczenia się/poznania24,25 i odpowiedzi immunologicznych OUN26. W związku z tym konieczne jest zrozumienie funkcji molekularnych i komórkowych każdej subpopulacji glejowej w kontekście fizjologicznym i patologicznym. W tym celu przedstawiamy tutaj niezawodną metodę ekstrakcji i izolacji żywotnych podtypów gleju. Ze względu na praktyczne i etyczne ograniczenia w badaniach na ludziach, modele zwierzęce są obecnie najważniejszymi substytutami biologii ludzkich komórek glejowych. W szczególności myszy są idealnymi zwierzętami modelowymi, ponieważ ich genom może być manipulowany i analizowany w celu dalszej analizy określonych mechanizmów molekularnych leżących u podstaw zdrowia i choroby. Dlatego skuteczne usunięcie i oddzielenie mysiego mikrogleju, OPC i astrocytów jest kluczowym narzędziem do badania funkcji gleju w stanach fizjologicznych, neurodegeneracyjnych lub neurozapalnych.

Protokół ten można zoptymalizować w celu zbadania regionalnej heterogeniczności komórek OUN. Staje się coraz bardziej oczywiste, że glej wykazuje regionalną niejednorodność pod względem formy i funkcji. Astrocyty są zróżnicowane regionalnie i wykazują odrębną morfologię w zależności od ich lokalizacji w OUN27. Co więcej, gęstość astrocytów i ich indeks mitotyczny mogą definiować regiony anatomiczne, wspierając hipotezę, że regionalna heterogeniczność astrocytów może odzwierciedlać różnice molekularne i funkcjonalne w oparciu o ich lokalizację w OUN28. Regionalna heterogeniczność mikrogleju jest również aktywnie badana, chociaż mechanizmy leżące u podstaw i funkcjonalne konsekwencje różnorodności mikrogleju w rozwoju lub zachowaniu OUN są obecnie niejasne. Wiadomo jednak, że dorosłe mikroglej wykazują różnorodność pod względem liczby komórek, struktur komórkowych i subkomórkowych oraz sygnatur molekularnych29. Co więcej, ostatnie postępy w multipleksowanej cytometrii masowej dodatkowo zdefiniowały regionalną heterogeniczność mikrogleju, analizując fenotyp komórkowy z pięciu różnych regionów OUN dziewięciu ludzkich dawców, co pozwoliło na immunofenotypowanie ludzkiego mikrogleju na dużą skalę30. Obecnie takie podejścia są w początkowej fazie, co sprawia, że badania na zwierzętach są realnym rozwiązaniem w badaniu regionalnego gleju w rozwoju choroby OUN. Wreszcie, niejednorodność regionalna została niedawno opisana również w oligodendrocytach. Sekwencjonowanie jednokomórkowego RNA na 5072 pojedynczych komórkach z 10 regionów ośrodkowego układu nerwowego u młodych i dorosłych zidentyfikowało 13 odrębnych subpopulacji na różnych etapach różnicowania31. Co ważne, stwierdzono również, że w miarę dojrzewania oligodendrocytów z OPC ich profile transkrypcyjne rozchodziły się, a fenotypy funkcjonalne zmieniały się, co podkreślało heterogeniczność oligodendrocytów w obrębie OUN31.

W związku z tym zrozumienie regionalnej heterogeniczności różnych rezydentnych komórek OUN w kontekście ich różnorodnych sąsiednich neuronów i innych komórek glejowych może dostarczyć ważnych przesłanek dla przyszłego rozwoju nowych terapii w leczeniu zaburzeń neurozapalnych i neurodegeneracyjnych. Chociaż protokół ten koncentruje się na ekstrakcji, izolacji i identyfikacji subpopulacji glejowych, stanowi wygodny punkt wyjścia do zbadania ich funkcji. Co więcej, można go zaadaptować i połączyć z transgenicznymi modelami myszy w celu zbadania mechanizmów genetycznych związanych z biologią komórek glejowych. Może być również stosowany do badania wzajemnych odpowiedzi komórek glejowych w testach kohodowlanych. Przedstawione kroki stanowią opłacalną i wysokoprzepustową metodę ekstrakcji i izolowania różnych populacji glejowych OUN, którą można następnie dostosować do szerokiej gamy parametrów eksperymentalnych. Należy zauważyć; Jednakże, opisana tutaj metoda wykorzystuje noworodki ze względu na niższy poziom mielinizacji i wysoką gęstość proliferującego gleju. Z tych powodów technicznie bardziej wykonalne jest wyizolowanie żywotnych komórek glejowych od noworodków w porównaniu z dorosłymi zwierzętami. Różnice fenotypowe w gleju noworodkowym w porównaniu z glejem u dorosłych powinny być zatem brane pod uwagę podczas projektowania doświadczenia i interpretacji danych.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy muszą ujawnić konflikt interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Morganowi Psenicece za redakcję i dyskusję manuskryptu oraz dr Grahame Kiddowi za pomoc w formatowaniu rycin. Prace te były wspierane przez NIAID K22 AI125466 (JLW).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,05% trypsyna i 0,53 mM EDTAGibco25300054Dysocjacja tkanek
Płytki 12-dołkoweGreiner Bio-One665 180Płytka do hodowli komórkowych
1X PBS pH 7,4Gibco10010031Standardowy odczynnik
32% paraformaldehydMikroskopia elektronowa Sciences15714-SUtrwalacz
50 ml, 25 cm2 hodowla komórkowa kolbaGreiner Bio-One690 175Kolba do hodowli komórkowych (T25)
Antybiotykowo-Przeciwgrzybicza 100XGibco15240-096Składnik podłoża
B-27 Suplement 50XGibco17504-044Składnik podłoża
Albumina surowicy bydlęcejSigmaA9647-50GRozcieńczalnik przeciwciał
Mikroskop konfokalnyZeissLSM 800Konfokalny do obrazowania
DAPIThermoFisherD1306Barwnik jądrowy
DMEM (1X), wysoki poziom glukozy z pirogronianem NaGibco11995040Składnik medialny
Dnaza ISigma10104159001Dysocjacja tkanek
Płodowa surowica bydlęca inaktywowana termicznieGibcoA3840001Składnik medialny
Fibronektyna z osocza bydlęcegoSigmaF1141-1MGPrzylegające do komórek
Nożyczki do cienkiego ścieguSklar64-3260Narzędzia do preparowania
Koza anty-królicza IgG Alexa Fluor 488InvitrogenA11008Wtórne przeciwciało barwiące
Koza anty-szczura IgG Alexa Fluor 555InvitrogenA21434Wtórne przeciwciało barwiące
Zbilansowany roztwór soli Hanksa (bez Ca lub Mg)ThermoFisher14170120Dysocjacja tkanek
L-glutamina, 200mMGibco20530081Składnik pożywki
Mysi naskórkowy czynnik wzrostuThermoFisherPMG8044Składnik podłoża
Mysz IFN-γPeprotech315-05-20UGSkładnik medialny
Mysz PDGF-AAPeprotech315-17Składnik medialny
NeurobasealGibco21103-049Składnik podłoża
Normalna surowica koziaSigmaG9023Składnik roztworu
blokującego Nożyczki operacyjneSurgi-OR95-272Narzędzia do preparacji
Poli-D-Lizyna 12 mm #1 Niemieckie szkło nakrywkoweCorning Biocoatt354086Przylegający do komórek
Prolong Gold Odczynnik zapobiegający blaknięciuTechnologia sygnalizacji komórkowej9071SMedia montażowe
Królik anty-Iba1Wako019-19741Przeciwciało pierwszorzędowe
Królik anty-NG2 Chondroityna ProteoglycanMilliporeab5320Pierwszorzędowe przeciwciało
anty-GFAPSzczur ThermoFisher13-0300Przeciwciało pierwszorzędowe
Szczurze przeciwciało przeciw mielinie białko podstawoweAbcamab7349Przeciwciało pierwotne
Nożyczki z ostrą końcówkąSurgi-OR95-104Narzędzia do preparacji
Mikroskop stereoskopowyLeicaS4 E Mikroskop stereo z zoomemMikroskop do preparacji
Kleszcze do tkanekSklar66-7644Narzędzia do preparowania
Triton X-100Fisher BioreagentsBP151-100Permabilizacja komórek
Inhibitor trypsyny (z białka jaja kurzego)Sigma10109878001Dysocjacja tkanek

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fields, R. D., et al. Glial Biology in Learning and Cognition. The Neuroscientist. 20 (5), 426-431 (2014).
  2. Nuriya, M., Hirase, H. Involvement of astrocytes in neurovascular communication. Progress in Brain Research. 225, 41-62 (2016).
  3. Nave, K. A. Myelination and support of axonal integrity by glia. Nature. 468 (7321), 244-252 (2010).
  4. Wake, H., Moorhouse, A. J., Miyamoto, A., Nabekura, J. Microglia: actively surveying and shaping neuronal circuit structure and function. Trends in Neurosciences. 36 (4), 209-217 (2013).
  5. Kierdorf, K., Prinz, M. Microglia in steady state. The Journal of Clinical Investigation. 127 (9), 3201-3209 (2017).
  6. Hertz, L., Chen, Y. Importance of astrocytes for potassium ion (K(+)) homeostasis in brain and glial effects of K(+) and its transporters on learning. Neurosciences and Biobehavior Reviews. 71, 484-505 (2016).
  7. Gordon, G. R., Howarth, C., MacVicar, B. A. Bidirectional Control of Blood Flow by Astrocytes: A Role for Tissue Oxygen and Other Metabolic Factors. Advances in Experimental Medicine and Biology. 903, 209-219 (2016).
  8. Schneider, J., Karpf, J., Beckervordersandforth, R. Role of Astrocytes in the Neurogenic Niches. Methods Mol Biol. 1938, 19-33 (2019).
  9. Sharif, Y., et al. Blood brain barrier: A review of its anatomy and physiology in health and disease. Clinical Anatomy. 31 (6), 812-823 (2018).
  10. von Bernhardi, R., Eugenin-von Bernhardi, J., Flores, B., Eugenin Leon, J. Glial Cells and Integrity of the Nervous System. Advances in Experimental Medicine and Biology. 949, 1-24 (2016).
  11. Gordon, J., Amini, S., White, M. K. General overview of neuronal cell culture. Methods in Molecular Biology. 1078, Clifton, N.J. 1-8 (2013).
  12. Spaethling, J. M., et al. Primary Cell Culture of Live Neurosurgically Resected Aged Adult Human Brain Cells and Single Cell Transcriptomics. Cell reports. 18 (3), 791-803 (2017).
  13. Bayraktar, O. A., Fuentealba, L. C., Alvarez-Buylla, A., Rowitch, D. H. Astrocyte development and heterogeneity. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (1), 020362(2015).
  14. Liu, R., et al. Region-specific and stage-dependent regulation of Olig gene expression and oligodendrogenesis by Nkx6.1 homeodomain transcription factor. Development. 130 (25), 6221-6231 (2003).
  15. Tan, Y. L., Yuan, Y., Tian, L. Microglial regional heterogeneity and its role in the brain. Molecular Psychiatry. 25 (2), 351-367 (2020).
  16. Witting, A., Moller, T. Microglia cell culture: a primer for the novice. Methods in Molecular Biology. 758, 49-66 (2011).
  17. Williams, J. L., Patel, J. R., Daniels, B. P., Klein, R. S. Targeting CXCR7/ACKR3 as a therapeutic strategy to promote remyelination in the adult central nervous system. Journal of Experimental Medicine. 211 (5), 791-799 (2014).
  18. Domingues, H. S., Portugal, C. C., Socodato, R., Relvas, J. B. Oligodendrocyte, Astrocyte, and Microglia Crosstalk in Myelin Development, Damage, and Repair. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 71(2016).
  19. Tanner, D. C., Cherry, J. D., Mayer-Proschel, M. Oligodendrocyte progenitors reversibly exit the cell cycle and give rise to astrocytes in response to interferon-gamma. Journal of Neuroscience. 31 (16), 6235-6246 (2011).
  20. Stansley, B., Post, J., Hensley, K. A comparative review of cell culture systems for the study of microglial biology in Alzheimer's disease. Journal of Neuroinflammation. 9 (1), 115(2012).
  21. Spaethling, J. M., et al. Primary Cell Culture of Live Neurosurgically Resected Aged Adult Human Brain Cells and Single Cell Transcriptomics. Cell Reports. 18 (3), 791-803 (2017).
  22. Timmerman, R., Burm, S. M., Bajramovic, J. J. An Overview of in vitro Methods to Study Microglia. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12 (242), (2018).
  23. Stevens, B. Glia: much more than the neuron's side-kick. Current Biology. 13 (12), 469-472 (2003).
  24. Fields, R. D., et al. Glial biology in learning and cognition. Neuroscientist. 20 (5), 426-431 (2014).
  25. Yamamuro, K., Kimoto, S., Rosen, K. M., Kishimoto, T., Makinodan, M. Potential primary roles of glial cells in the mechanisms of psychiatric disorders. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9 (154), (2015).
  26. Hartenstein, V., Giangrande, A. Connecting the nervous and the immune systems in evolution. Communications Biology. 1 (1), 64(2018).
  27. Emsley, J. G., Macklis, J. D. Astroglial heterogeneity closely reflects the neuronal-defined anatomy of the adult murine CNS. Neuron Glia Biology. 2 (3), 175-186 (2006).
  28. Chaboub, L. S., Deneen, B. Developmental Origins of Astrocyte Heterogeneity: The Final Frontier of CNS Development. Developmental Neuroscience. 34 (5), 379-388 (2012).
  29. Tan, Y. L., Yuan, Y., Tian, L. Microglial regional heterogeneity and its role in the brain. Molecular Psychiatry. 25 (2), 351-367 (2020).
  30. Bottcher, C., et al. Human microglia regional heterogeneity and phenotypes determined by multiplexed single-cell mass cytometry. Nature Neurosciences. 22 (1), 78-90 (2019).
  31. Marques, S., et al. Oligodendrocyte heterogeneity in the mouse juvenile and adult central nervous system. Science. 352 (6291), 1326-1329 (2016).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Izolacja gleju mysiegosekcja obszar w OUNizolacja subpopulacji glejowychmikroglej oligodendrocyty astrocytyprotok dysocjacji tkankitechnika usuwania opon m zgowychtraktowanie trypsyn i EDTAwysiew kultur kom rkowychizolacja prekursor w oligodendrocyt wimmunohistochemia Western blot

Powiązane artykuły