Artykuł metodologiczny

Spektrofotometryczne badania przesiewowe w kierunku potencjalnych inhibitorów cytozolowych S-transferaz glutationowych

14.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61347

⸱

10 października 2020

 ,  , 
1Research platform of Pediatric Onco-Hematology, Department of Paediatrics, Gynaecology and Obstetrics, Faculty of Medicine, University of Geneva, 2Section of Biology, Faculty of Science, University of Geneva, 3Onco-Hematology Unit, Department of Women, Children-Adolescents, University Hospitals of Geneva

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

S-transferazy glutationu (GST) są enzymami detoksykacyjnymi biorącymi udział w metabolizmie wielu leków chemioterapeutycznych. Nadekspresja GST jest skorelowana z opornością na chemioterapię raka. Jednym ze sposobów przeciwdziałania temu fenotypowi jest stosowanie inhibitorów. Protokół ten opisuje metodę wykorzystującą test spektrofotometryczny do badań przesiewowych pod kątem potencjalnych inhibitorów GST.

Streszczenie

S-transferazy glutationu (GST) to enzymy metaboliczne odpowiedzialne za eliminację endogennych lub egzogennych związków elektrofilowych przez koniugację glutationu (GSH). Ponadto GST są regulatorami kinaz białkowych aktywowanych mitogenem (MAPK) zaangażowanych w szlaki apoptozy. Nadekspresja GST jest skorelowana ze zmniejszoną skutecznością terapeutyczną wśród pacjentów poddawanych chemioterapii elektrofilowymi środkami alkilującymi. Stosowanie inhibitorów GST może być potencjalnym rozwiązaniem w celu odwrócenia tej tendencji i zwiększenia siły leczenia. Osiągnięcie tego celu wymaga odkrycia takich związków, z dokładnym, szybkim i łatwym testem enzymatycznym. Protokół spektrofotometryczny wykorzystujący 1-chloro-2,4-dinitrobenzen (CDNB) jako substrat jest najczęściej stosowaną metodą w literaturze. Jednak opisane już eksperymenty z hamowaniem GST nie zawierają protokołu szczegółowo opisującego każdy etap optymalnego testu hamowania, takiego jak pomiar stałej Michaelisa-Mentena (Km) dla CDNB lub wskazanie zastosowanego stężenia enzymu, parametrów kluczowych dla oceny siły hamowania badanego związku. W związku z tym w tym protokole opisujemy każdy etap zoptymalizowanego spektrofotometrycznego testu enzymatycznego GST, aby przebadać biblioteki potencjalnych inhibitorów. Wyjaśniamy obliczanie zarówno połowy maksymalnego stężenia hamującego (IC50), jak i stałej hamowania (Ki) - dwóch cech używanych do pomiaru siły działania inhibitora enzymu. Opisana metoda może być realizowana przy użyciu puli GST wyekstrahowanych z komórek lub czystych rekombinowanych ludzkich GST, a mianowicie GST alfa 1 (GSTA1), GST mu 1 (GSTM1) lub GST pi 1 (GSTP1). Protokół ten nie może być jednak stosowany do GST theta 1 (GSTT1), ponieważ CDNB nie jest substratem dla tej izoformy. Metodę tę zastosowano do zbadania siły hamowania kurkuminy przy użyciu GST z wątroby koni. Kurkumina jest cząsteczką wykazującą właściwości przeciwnowotworowe i wykazała powinowactwo do izoform GST po przewidywaniach dokowania in silico. Wykazaliśmy, że kurkumina jest silnym konkurencyjnym inhibitorem GST, z IC50 wynoszącym 31,6 ± 3,6 μM i Ki wynoszącym 23,2 ± 3,2 μM. Kurkumina może być łączona z elektrofilowymi lekami chemioterapeutycznymi w celu poprawy jej skuteczności.

Wprowadzenie

Cytozolowe enzymy S-transferazy glutationowej (GST, EC 2.5.1.18) katalizują koniugację glutationu (GSH) z różnymi związkami elektrofilowymi, takimi jak chemioterapeutyki, w celu ich detoksykacji i łatwego wyeliminowania z organizmu1. Siedem izoform cytozolowego GST zostało zidentyfikowanych jako alfa, mu, pi, sigma, omega, theta i zeta. GST są wyrażane głównie w wątrobie, jądrach, płucach i przewodzie pokarmowym2. Izoforma GST alfa 1 (GSTA1) ulega silnej ekspresji w hepatocytach. Ciało niejednorodnie wyraża inne podtypy, w tym GST pi 1 (GSTP1) głównie w mózgu, sercu i płucach oraz GST mu 1 (GSTM1) w wątrobie i jądrach3. Chociaż istnieje wysoka homologia sekwencji między izoformami GST, każda z nich wykazuje specyficzność substratową i jest zaangażowana w metabolizm leków i raka na różne sposoby, zgodnie z jego wyrażeniem różnicowym4,5.

Związki elektrofilowe albo dostają się do organizmu egzogennie, albo są wytwarzane endogennie. Pestycydy, prostaglandyny, czynniki rakotwórcze i chemioterapeutyki to tylko niektóre z potencjalnych substratów reakcji koniugacji glutationu6. Na przykład każdy związek reaktywny z niedoborem elektronów utworzony w komórce prawdopodobnie stanie się substratem elektrofilowym. Środki alkilujące, takie jak chlorambucyl lub melfalan, są eliminowane jako koniugaty GSH katalizowane przez GST, a zwiększone poziomy tych enzymów są skorelowane z opornością na te związki6,7.

Inną ważną rolą cytozolowych GST jest regulacja aktywności aktywowanych mitogenem kinaz białkowych (MAPK), takich jak MAPK8 (znana również jako kinaza N-końcowa c-Jun lub JNK1) i MAP3K5 (znana również jako kinaza regulująca sygnał apoptozy 1, lub ASK1)8. Niektóre izoformy w swojej konformacji monomerycznej wiążą się z tymi białkami i w ten sposób blokują kaskadę fosforylacji. W normalnych warunkach izoforma GSTP1 będzie sekwestrować MAPK8 (aktywator białka c-Jun). Połączenie c-Jun z białkiem c-Fos tworzy czynnik transkrypcyjny białka aktywatora 1 (AP-1), który jest odpowiedzialny za transkrypcję genów proapoptotycznych. W zestresowanych komórkach kompleks utworzony przez GSTP1 i MAPK8 dysocjuje, c-Jun jest aktywowany, a geny prowadzące do apoptozy zaczynają ulegać ekspresji9. Większa ekspresja tej izoformy GST może zatem blokować szlak, prowadząc do zwiększonej żywotności komórek, większej proliferacji komórek i niższej wrażliwości komórek na chemioterapię. Podobne scenariusze mogą wystąpić w przypadku paralogów GSTP1, na przykład GSTM1, który wchodzi w interakcję z MAP3K510.

Role odgrywane przez GST w metabolizmie leków i w sekwestracji MAPK doprowadziły do hipotezy, że większa ekspresja GST może być oznaką mechanizmu odporności nowotworu na leczenie chemioterapeutyczne6,11. Na przykład GSTP1 ulega nadekspresji w wielu nowotworach, a jego obecność jest skorelowana ze złym rokowaniem i zwiększoną częstością nawrotów8. Polimorfizm w tych genach wykazał również zróżnicowaną ekspozycję na leki i wskaźniki przeżycia u pacjentów z różnymi chorobami, wzmacniając ideę, że enzymy te mają kluczowe znaczenie dla mechanizmów oporności na leki. Na przykład osoby z genotypem zerowym GSTM1 są związane z niższym klirensem leku i lepszym przeżyciem12,13. Istnieje kilka potencjalnych sposobów przeciwdziałania tej nadekspresji, takich jak stosowanie analogów GSH, proleków, które są aktywowane przez koniugację z GST lub bezpośrednich inhibitorów GST14,15.

Wszystkie te metody są obecnie badane, a kilka związków rozpoczęło badania kliniczne pod kątem ich potencjalnego zastosowania wśród pacjentów. Jednakże, zgodnie z naszą najlepszą wiedzą, nie ma żadnych związków stosowanych jako inhibitory GST w warunkach klinicznych15. Rzeczywiście, brak swoistości dla niektórych izoform lub wyczerpanie GSH w normalnych komórkach, co może prowadzić do toksyczności spowodowanej akumulacją reaktywnych form tlenu (ROS) w układach narządów, to tylko niektóre z wad, które zmniejszają potencjał inhibitorów GST14,15. Ryzyko, że związki te mogą wywierać inne efekty farmakodynamiczne na organizm, również ogranicza ich stosowanie. Na przykład kwas etakrynowy jest najczęściej badanym inhibitorem GST w środowisku laboratoryjnym, ale ponieważ jest stosowany głównie jako silny środek moczopędny, właściwość ta ogranicza jego stosowanie w połączeniu z innymi lekami w warunkach klinicznych. Kurkumina to kolejny naturalny związek, który z powodzeniem został przebadany jako inhibitor GST. Cząsteczka ta jest eterem polifenolowym ekstrahowanym z kurkumy z gatunku Curcuma longa. Wykazał obiecujące wyniki jako możliwa opcja leczenia raka poprzez indukowanie apoptozy różnego rodzaju linii komórek nowotworowych16,17. Związek ten może regulować różne szlaki komórkowe, takie jak kinaza tyrozynowa18 lub szlak GST. Badania z czystymi białkami wykazały jego siłę hamowania na GSTA1, GSTM1 i GSTP119,20. Jednak sprzeczne wyniki zaobserwowano w komórkach nowotworowych, gdzie mierzono większą wewnątrzkomórkową aktywność GST, gdy komórki były traktowane kurkuminą21. Dlatego ważne jest, aby przed planowaniem dalszych eksperymentów komórkowych zbadać połowiczne maksymalne stężenie hamujące (IC50) i stałą inhibicji (Ki) dowolnego domniemanego inhibitora GST przy użyciu jasno opisanego protokołu z odpowiednimi kontrolami.

Badanie przesiewowe i testowanie potencjalnych nowych inhibitorów GST ma zatem duże znaczenie kliniczne, a każdy nowy znaleziony związek musi być bezpieczny i skuteczny do stosowania w połączeniu z lekami elektrofilowymi. Skoncentrowanie badań na inhibitorach specyficznych dla izoform może umożliwić hamowanie GST w tkankach nowotworowych wykazujących specyficzne wzorce ekspresji GST, umożliwiając w ten sposób opracowanie skutecznej terapii skojarzonej. Interesujące może być również znalezienie inhibitorów z różnicowymi trybami hamowania. Na przykład inhibitor kompetycyjny, który wykorzystuje GSH jako substrat, może wywołać jego zubożenie. Wykazano, że to zmniejszenie stężenia GSH w komórkach indukuje stres oksydacyjny w neuronach, prowadząc do apoptozy. Inny powszechny sposób hamowania - hamowanie niekonkurencyjne - nie może być odwrócony, nawet jeśli substrat jest obecny w wysokich stężeniach.

Szybkość aktywności enzymatycznej jest reprezentowana przez stałą Michaelisa-Mentena (Km) i maksymalną prędkość (Vmax), które można określić poprzez wykreślenie wykresu Michaelisa-Mentena, z koncentracją substratu w stosunku do prędkości reakcji23. Km to stężenie substratu wymagane do zajęcia połowy enzymatycznych miejsc aktywnych, co oznacza, że wysokie Km oznacza mniejsze powinowactwo. Vmax oznacza maksymalną prędkość reakcji, osiąganą, gdy wszystkie miejsca aktywne są zajęte przez substrat. Km jest równe połowie Vmax. Istnieją trzy najczęstsze tryby hamowania: konkurencyjny, niekonkurencyjny i niekonkurencyjny. W przypadku inhibicji kompetycyjnej inhibitor wiąże się z miejscem aktywnym enzymu i konkuruje z substratem. W związku z tym Vmax nie zmienia się po dodaniu inhibitora, ale Km wzrasta, ponieważ potrzeba więcej substratu, aby przeciwdziałać hamowaniu. Hamowanie niekonkurencyjne występuje tylko wtedy, gdy substrat tworzy kompleks z enzymem. W tym przypadku, ponieważ poziom inhibicji zależy od stężenia substratu i enzymu, Vmax i Km zmniejszają się po dodaniu inhibitora do reakcji. Ostatni sposób hamowania jest niekonkurencyjny i jest mieszanką dwóch pozostałych wzorców hamowania. Inhibitor może wiązać się z miejscem aktywnym enzymu, niezależnie od tego, czy enzym jest związany ze swoim substratem, czy nie. Tutaj Vmax zmniejsza się po dodaniu inhibitora, ale Km nie zmienia się24.

Test spektrofotometryczny, który mierzył aktywność GST, został po raz pierwszy opracowany przez Habig et al. w 1974 roku przy użyciu 1-chloro-2,4-dinitrobenzenu (CDNB) jako substratu dla reakcji22. Koniugacja między GSH i CDNB tworzy GS-DNB, który wykazuje maksymalną absorbancję światła przy długości fali 340 nm, którą można zarejestrować za pomocą spektrofotometru. Większość technik opisanych poniżej pochodzi od Habig i wsp., w tym informacje o najlepszych ustawieniach i ważnych punktach optymalizacji testu hamującego. Technika ta może być stosowana do badań przesiewowych potencjalnych inhibitorów GST, niezależnie od tego, czy są wybierane na podstawie racjonalnego doboru leków przy użyciu przewidywań obliczeniowych, czy też na podstawie przeglądu literatury. Omówiono również, w jaki sposób dostosować protokół do nowo zsyntetyzowanych białek GST lub określonych izoform. Na przykład testowanie siły hamującej izoform GST wykazujących klinicznie istotny polimorfizm lub polimorfizmów pojedynczego nukleotydu (SNP) może być potencjalnym zastosowaniem tego protokołu, ukierunkowanym na GST specyficzne dla pacjenta.

Ten protokół zapewnia szybką, wykonalną i skuteczną metodę badania przesiewowego potencjalnych inhibitorów GST in vitro przed jakimikolwiek innymi badaniami funkcjonalnymi. Opisano etapy niezbędne do oceny najczęściej mierzonych cech inhibitora enzymatycznego: stężenie hamujące 50 (IC50), czyli stężenie inhibitora wymagane do zmniejszenia aktywności enzymatycznej o połowę; oraz stała inhibicji (Ki), która reprezentuje stałą równowagi dysocjacji między inhibitorem a enzymem, charakterystyczną dla powinowactwa między tymi dwiema cząsteczkami. Te dwie wartości są mierzone za pomocą regresji nieliniowej i równań specyficznych odpowiednio dla każdego trybu hamowania. Demonstrujemy również ocenę tego wzorca hamowania, używając wykresów Michaelisa-Mentena do określenia zmiany Vmax i Km po dodaniu inhibitora23,25,26.

Protokół

1. Przygotowanie roztworu enzymu GST

UWAGA: Procedura przygotowania roztworu enzymu zależy od tego, czy jednostki aktywności enzymatycznej są znane przed przeprowadzeniem analizy. Jedna jednostka enzymatyczna to ilość enzymu potrzebna do syntezy 1 µmol produktu na minutę. Aktywność enzymatyczna jest wyrażona w unit/mL lub µmol/min/mL i zależy od rozcieńczenia roztworu enzymatycznego. Specyficzna aktywność enzymatyczna jest wyrażona w unit/mg lub µmol/min/mg i zależy wyłącznie od czystości roztworu. Obie te charakterystyki są określane poniżej. Jeśli jednostka enzymatyczna wyizolowanej izoformy GST jest nieznana, należy ją oszacować, aby dostosować stężenia enzymu dla każdej reakcji i zapewnić powtarzalne wyniki.

  1. Jeśli jednostka enzymatyczna GST użytego w analizie jest znana:
    1. Przygotować świeży roztwór zapasowy enzymu GST o stężeniu 0,1 U/mL w wodzie, a następnie przejść do kroku 2.
      UWAGA: Roztwór ten można przechowywać w alikwotach w temperaturze -20 °C przez kilka miesięcy lub w -80 °C przez dłuższy czas, jednak należy unikać cykli zamrażania i rozmrażania.
  2. Jeśli jednostka enzymatyczna GST użytego w analizie jest nieznana:
    1. Oznaczyć stężenie białka w roztworze enzymu za pomocą testu białkowego kwasem bicinchoninowym (BCA) lub innego zestawu.
    2. Rozcieńczyć roztwór białka do końcowego stężenia białka 0,02 mg/mL.
    3. Do płytki 96-dołkowej dodać 20 µL roztworu enzymu, 20 µL GSH 25 mM (masa cząsteczkowa: 307,32 g/mol) oraz 150 µL soli fizjologicznej z buforem fosforanowym Dulbecco (DPBS). W przypadku próby ślepej dodać 20 µL wody zamiast roztworu enzymu.
    4. Do każdego dołka dodać 10 µL substratu CDNB 50 mM (masa cząsteczkowa: 202,55 g/mol).
    5. W spektrofotometrycznym czytniku mikropłytek ustawić parametry odczytu dołków przy 340 nm. Zaleca się pomiar absorbancji co minutę przez 10 minut.
    6. Włożyć płytkę do czytnika mikropłytek i rozpocząć odczyt zgodnie z ustawieniami z kroku 1.2.5.
    7. Obliczyć zmianę absorbancji na minutę dla próbek enzymatycznych i próby ślepej.
      UWAGA: Zweryfikować liniowość reakcji, wykreślając absorbancję na osi y i czas w minutach na osi x. Jeśli reakcja nie jest liniowa i osiąga plateau, oznacza to, że cały substrat został zużyty, a reakcja przebiega zbyt szybko. W takim przypadku należy zmniejszyć ilość enzymu dodawanego do dołka, rozcieńczając roztwór zapasowy dwukrotnie.
    8. Odjąć wartość absorbancji próby ślepej od odczytów absorbancji próbek testowych.
    9. Korzystając z równania 1, reprezentującego prawo Beera-Lamberta, obliczyć stężenie powstałego GS-DNB (w µM) w każdej minucie reakcji.
      Równanie 1:
      Wzór na stężenie: C=A340/minε*l, równanie spektroskopii absorpcyjnej.
      gdzie C to stężenie substratu w µM, A340/min to zmiana absorbancji na minutę, zmierzona w kroku 1.2.7, ε to molowy współczynnik ekstynkcji dla koniugatu CDNB przy 340 nm (0,0096 µM-1*cm-1), a l to długość drogi optycznej w dołku (w cm). Dla płytki 96-dołkowej wypełnionej 200 µL roztworu enzymatycznego droga optyczna wynosi około 0,55 cm. Wartość ta może się różnić w zależności od modelu płytki i powinna zostać zweryfikowana u producenta.
    10. Aby określić ilość produktu obecnego w jednym dołku w µmol/min, pomnożyć wyniki uzyskane za pomocą równania 1 przez objętość roztworu, 2 x 10-4 L.
    11. Znormalizować aktywność w stosunku do ilości użytego białka, dzieląc wyniki z kroku 1.2.9 przez 4 x 10-4 mg. Wynikiem jest specyficzna aktywność enzymatyczna w unit/mg lub µmol/min/mg.
      UWAGA: Jeśli w kroku 1.2.6 zmieniono rozcieńczenie z powodu nieliniowej reakcji, należy odpowiednio dostosować ilość białka.
    12. Aby wyznaczyć aktywność enzymatyczną, dostosować wyniki do stężenia białka w mg/mL, mnożąc specyficzną aktywność enzymatyczną wyznaczoną w kroku 1.2.10 przez 0,002 mg/mL. Pozwoli to uzyskać aktywność enzymatyczną w unit/mL lub µmol/min/mL.
      UWAGA: W przeciwieństwie do aktywności enzymatycznej, pomiar ten nie zmieni się w zależności od rozcieńczenia roztworu białka. Obowiązuje ta sama uwaga co w kroku 1.2.10, ale w odniesieniu do stężenia białka.
    13. Przygotować roztwór zapasowy enzymu GST o stężeniu 0,1 unit/mL w wodzie, a następnie przejść do kroku 2.
      UWAGA: Roztwór ten można przechowywać w alikwotach w temperaturze -20 °C przez kilka miesięcy lub w -80 °C przez dłuższy czas, jednak należy unikać cykli zamrażania i rozmrażania. Zaleca się kontrolę aktywności enzymatycznej, jeśli eksperymenty są prowadzone przez dłuższy okres czasu, ponieważ może dojść do degradacji roztworu białka.

2. Pomiar stałej Michaelisa–Menten izoformy GST dla CDNB

UWAGA: Procedura została wyjaśniona dla substratu CDNB, ale może być zastosowana do każdego innego substratu, np. GSH. Każde stężenie CDNB wymaga osobnej próby ślepej, ponieważ absorbancja przy 340 nm będzie wzrastać wraz ze stężeniem CDNB.

  1. Przygotować sześć różnych stężeń CDNB, w zakresie od 10 mM do 100 mM, w etanolu 95% (v/v).
  2. Przygotować roztwór do analizy, zawierający 10 µL CDNB, 20 µL enzymu GST, 20 µL GSH 25 mM oraz 150 µL DPBS. W przypadku próby ślepej, zamiast roztworu CDNB, dodać jedynie 10 µL etanolu 95%.
  3. Przygotować próbę ślepą dla każdego stężenia CDNB, zawierającą 10 µL CDNB, 20 µL wody, 20 µL GSH 25 mM oraz 150 µL DPBS.
  4. Rejestrować absorbancję przy 340 nm w każdej minucie przez 10 minut za pomocą czytnika mikropłytek.
  5. Korygować absorbancję poprzez odjęcie wyników z próby ślepej od wyników z odpowiednich pozostałych dołków testowych. Na podstawie zmierzonych wartości obliczyć prędkość reakcji, korzystając z Równania 2.
    Równanie 2:
    Schemat formuły kinetyki enzymatycznej: obliczanie prędkości przy użyciu absorbancji A340 do analizy szybkości reakcji.
    gdzie A340/min to eksperymentalnie wyznaczona zmiana absorbancji na minutę, Vtotal (objętość całkowita) wynosi 0,2 mL, Venzyme (objętość enzymu) wynosi 0,02 mL, a εGS-DNB to molowy współczynnik ekstynkcji koniugatu GS-DNB przy 340 nm (9,6 mM-1*cm-1). W dołku o pojemności 200 µL płytki 96-dołkowej droga optyczna wynosi 0,55 cm (zależnie od typu płytki), a współczynnik ekstynkcji wynosi 5,3 mM-1. Prędkość może być wyrażona w µmol/mL/min lub mM/min.
  6. Wykreślić wykres Michaelisa–Menten, nanosząc prędkość (na osi y) w funkcji stężenia substratu (na osi x).
  7. Wyznaczyć prędkość maksymalną (Vmax) reakcji oraz stałą Michaelisa–Mentena (Km) (tj. stężenie substratu przy połowie Vmax).
    UWAGA: Przy użyciu oprogramowania takiego jak GraphPad Prism, krzywą kinetyki enzymatycznej można dopasować za pomocą regresji nieliniowej w celu obliczenia parametrów kinetyki enzymatycznej Michaelisa–Mentena, takich jak Vmax i Km.
  8. Przygotować roztwór zapasu CDNB o stężeniu 20-krotnie wyższym niż obliczona wartość Km w etanolu 95% (v/v).

3. Absorbancja potencjalnego inhibitora GST

UWAGA: Krok ten wykonuje się w celu zbadania, czy potencjalny inhibitor GST użyty w reakcji wytwarza metabolit, który zwiększa absorbancję przy mierzonej długości fali. Jeśli tak, ilość użytego inhibitora wpłynie na wyniki i dla każdego stężenia należy przygotować odpowiednią próbę ślepą.

  1. Rozcieńczyć inhibitor do wymaganych stężeń.
    UWAGA: Przygotować trzy różne rozcieńczenia, najlepiej najniższe, średnie i najwyższe stężenia testowane podczas badania inhibicji. Maksymalne stężenie DMSO w dołku powinno być równe lub mniejsze niż 1% (v/v). W naszym laboratorium przetestowaliśmy wpływ stężenia DMSO na badanie i 1% nie zmieniło znacząco aktywności GST.
  2. Do płytki 96-dołkowej dodać 2 µL potencjalnego inhibitora GST, 20 µL GSH 25 mM oraz 168 µL DPBS. Jako odpowiednią kontrolę bez inhibitora zastosować dodanie równych objętości rozpuszczalnika użytego do próbek inhibitora.
  3. Inkubować reakcję przez 10 minut, aby rozpocząć reakcję enzymatyczną.
    UWAGA: Ten krok można zoptymalizować, testując różne czasy inkubacji, w celu rozpoczęcia reakcji przy jednoczesnym uniknięciu całkowitego wyczerpania substratu.
  4. Do każdego dołka dodać 10 µL CDNB, aby uzyskać stężenie końcowe równe Km wyznaczonemu w kroku 2.
  5. Wstrząsnąć płytką przez kilka sekund.
  6. Rejestrować absorbancję przy 340 nm w każdej minucie przez 10 minut za pomocą czytnika mikropłytek.
  7. Obliczyć zmianę absorbancji na minutę.
  8. Zweryfikować zmianę absorbancji w porównaniu z reakcją ślepą oraz reakcją kontrolną ujemną bez inhibitora.
    1. W przypadku wystąpienia znaczącej zmiany, dla każdego stężenia inhibitora zastosować próbę ślepą w celu skorygowania wyników.
      UWAGA: Wynik ten wskazuje, że składniki reakcji, w obecności enzymu GST, reagują spontanicznie i tworzą metabolit, który zwiększa absorbancję przy 340 nm. Aby skorygować tę dodatkową absorbancję, dla każdego stężenia należy zmierzyć odpowiednią próbę ślepą.
    2. Jeśli nie występuje znacząca zmiana absorbancji, dla wszystkich stężeń zastosować ogólną próbę ślepą zawierającą jedynie rozpuszczalnik użyty do rozcieńczenia inhibitora GST.

4. Test inhibicji GST i wyznaczenie wartości IC50

  1. Przygotować dziewięć stężeń potencjalnego inhibitora GST.
    UWAGA: Stężenia można dostosować w zależności od wyników. Celem jest zdefiniowanie dolnego i górnego plateau krzywej regresji nieliniowej. Więcej szczegółów na temat tego kroku znajduje się w sekcji dyskusji.
  2. Przygotować roztwór pomiarowy poprzez rozcieńczenie 20 µL roztworu GSH o stężeniu 25 mM w 148 µL DPBS. Dostosować objętość do liczby studzienek wykorzystanych w badaniu.
  3. W przezroczystej płytce 96-dołkowej przygotować reakcję enzymatyczną w końcowej objętości 190 µL. Na tych etapach zaleca się stosowanie pipety wielokanałowej.
    1. Do studzienek badawczych dodać 20 µL roztworu enzymu, 2 µL roztworu potencjalnego inhibitora GST oraz 168 µL roztworu pomiarowego.
    2. Do kontroli dodać 20 µL roztworu enzymu, 2 µL rozcieńczalnika użytego do inhibitora GST oraz 168 µL roztworu pomiarowego.
    3. Do studzienek ślepych dodać 20 µL wody, 2 µL potencjalnego inhibitora GST oraz 168 µL roztworu pomiarowego.
      UWAGA: Jeśli inhibitor GST absorbuje promieniowanie o długości fali 340 nm, dla każdego testowanego stężenia należy przygotować osobną próbę ślepą.
  4. Do każdej studzienki, w tym do ślepej próby, dodać 10 µL roztworu CDNB w stężeniu 20x Km. Na tym etapie zaleca się stosowanie pipety wielokanałowej.
  5. Wstrząsnąć płytką przez kilka sekund.
  6. Mierzyć absorbancję przy 340 nm co minutę przez 10 minut przy użyciu czytnika mikropłytek.
  7. Skorygować absorbancję o wartość tła, odejmując wyniki uzyskane dla ślepych prób studzienek badawczych.
  8. Znormalizować wyniki, dzieląc wartości uzyskane przy zastosowaniu roztworu inhibitora GST przez absorbancję na minutę w kontroli bez inhibitora.
  9. Wykreślić wykresy regresji nieliniowej zależności logarytmu stężenia inhibitora (oś x) od aktywności GST (oś y), a następnie wyznaczyć IC50.
    UWAGA: Program GraphPad Prism oblicza IC50 z wykresów regresji nieliniowej, przewidując stężenie, które wykaże 50% aktywności enzymatycznej w porównaniu do kontroli. Przewidywanie to opiera się na dolnym i górnym plateau, a także na nachyleniu krzywej tworzącej wykres sigmoidalny.

5. Ocena wartości Ki oraz rodzaju inhibicji

  1. Przygotować cztery różne stężenia CDNB: trzy wyższe oraz jedno równe wcześniej wyznaczonej wartości Km.
  2. Przygotować trzy różne stężenia inhibitora GST, równe lub niższe od wcześniej wyznaczonej wartości IC50.
  3. Przeprowadzić test inhibicji zgodnie z opisem w krokach od 4.2 do 4.7.
  4. Obliczyć prędkość reakcji korzystając z Równania 2.
  5. Wykreślić wykresy Michaelisa-Menten dla każdego stężenia inhibitora i obliczyć Vmax oraz Km dla każdej reakcji.
  6. Na podstawie zmian Vmax i Km przy zastosowaniu różnych stężeń określić mechanizm inhibicji inhibitora GST.
    UWAGA: Krok ten jest szczegółowo omówiony w sekcjach wyników i dyskusji.
  7. Na podstawie mechanizmu inhibicji obliczyć Ki.
    UWAGA: W programie GraphPad Prism do obliczenia Ki zostaną użyte różne równania, w zależności od charakteru inhibicji. Stosowane równania opierają się na zaobserwowanych wartościach Km i Vmax po dodaniu inhibitora w porównaniu do wartości Km i Vmax w próbie kontrolnej.

Wyniki

Stała Michaelisa-Menten (Km) CDNB dla GST z wątroby konia
Kurkumina jest bezpiecznym związkiem naturalnym, nawet po spożyciu w wyższych dawkach27, który wykazał właściwości przeciwnowotworowe16. Potencjał inhibicyjny tej cząsteczki został wykazany w odniesieniu do ludzkich rekombinowanych GST19,20. Wykorzystując opisany protokół, oceniliśmy wpływ kurkuminy na aktywność GST, używając puli izoform GST z wątroby konia. Według dostawcy aktywność właściwa tej mieszaniny białek wynosi 25 U/mg. Roztwór zapasowy o stężeniu 0,1 U/mL przygotowano poprzez rozpuszczenie liofilizowanego proszku w odpowiedniej ilości wody. Równolegle zastosowano kwas etakrynowy jako kontrolę pozytywną, ponieważ związek ten jest najszerzej stosowanym inhibitorem GST w badaniach. Kroki konfiguracji testu aktywności GST oraz badania inhibitorów przedstawiono na Rysunku 1.

Wartość Km musi zostać określona dla każdej reakcji enzym-substrat, ponieważ zastosowanie stężenia substratu równego Km zapobiega błędom w określaniu rodzaju inhibicji28. W celu zmierzenia tego parametru przetestowano sześć różnych stężeń CDNB, w zakresie od 0.5 mM do 5 mM, przy stałym stężeniu GSH wynoszącym 2.5 mM.

Końcowa objętość reakcji wynosiła 200 µL w płytce 96-dołkowej. Dla każdego eksperymentu zastosowano odpowiednią próbę ślepą, używając takiego samego stężenia CDNB jak w dołku testowym, ponieważ mogło dojść do spontanicznego sprzęgania CDNB i GSH, co mogłoby zwiększyć absorbancję. Dla wszystkich reakcji zastosowano końcowe stężenie enzymu wynoszące 0,01 jednostki/mL, dodając 20 µL roztworu zapasowego do mieszaniny assay. Absorbancję przy 340 nm rejestrowano co minutę przez 10 minut. Prędkość reakcji (w mM/min) obliczono zgodnie z równaniem 2. Wykreślono wykres Michaelisa–Menten zależności stężenia substratu (mM) od prędkości (µM/min) (rycina 2) i obliczono Km reakcji. Eksperyment powtarzano do momentu, aż co najmniej trzy zestawy danych wykazały podobne wyniki. Km CDNB dla GST z wątroby konia wyniosło 0,26 ± 0,08 mM. Dla każdego testu inhibicyjnego z użyciem tej partii GST zastosowano stężenie CDNB wynoszące 0,2 mM.

Podczas eksperymentów z wykorzystaniem kurkuminy inkubowanej samodzielnie z GSH i CDNB nie odnotowano spontanicznego tworzenia się metabolitu absorbującego przy 340 nm. W każdym eksperymencie dla każdego stężenia inhibitora stosowano tę samą próbę ślepą.

Potencjał hamujący kurkuminy wobec GST
Potencjał hamujący kurkuminy przewidziano za pomocą symulacji dokowania in silico z wykorzystaniem oprogramowania (np. AutoDock Vina wersja 1.1.2).29 Przewidziano swobodną energię wiązania między różnymi izoformami GST (mianowicie GSTA1, GSTM1 i GSTP1) a kurkuminą (dane nie przedstawiono). Następnie stałą inhibicji Ki obliczono zgodnie z Równaniem 3.

Równanie 3:
Równanie stałej inhibicji Ki(uM)=exp(ΔG/RT) do analizy kinetyki enzymatycznej.
gdzie ∆G to wolna energia wiązania wyznaczona za pomocą analizy in silico, R to stała gazowa wynosząca 1.987 cal*K-1*mol-1, a T to temperatura podczas eksperymentu, w tym przypadku w kelwinach (298 K).

Na podstawie wyników wolnej energii wiązania uzyskanych za pomocą programu AutoDock Vina, kurkumina jest silnym inhibitorem GST dla ludzkich izoform GSTA1, GSTM1 i GSTP1, z Ki wartości 78.1 µM, 78.1 µM i 27.4 µM odpowiednio. Pierwsze testy inhibicyjne przeprowadzono z wykorzystaniem tych obliczeniowych Ki szacunki, a stężenia zostały skorygowane zgodnie z wynikami, jeśli było to konieczne.

W pierwszej kolejności oszacowano wartość IC50. Parametr ten oznacza stężenie inhibitora, które redukuje szybkość reakcji enzymatycznej o 50%. Jest on zatem zależny od stężenia enzymu30. Przygotowano dziewięć końcowych stężeń inhibitora, w zakresie od 0,39 µM do 100 µM, przy czym każde kolejne stężenie było dwukrotnie większe od poprzedniego. Roztwór testowy składał się z 20 µL GSH 2,5 mM, 20 µL GST z wątroby konia w końcowym stężeniu 0,01 U/mL, 2 µL roztworu kurkumy oraz 148 µL PBS. Kontrolę stanowił ten sam roztwór z zastosowaniem rozcieńczalnika użytego do kurkumy. Mieszaninę inkubowano przez 15 minut, aby rozpocząć test enzymatyczny i zapobiec degradacji kurkumy w roztworze testowym, ponieważ związek ten jest niestabilny w roztworach buforowych31. Następnie do każdej dołki dodano 10 µL roztworu CDNB o stężeniu 4 mM, aby uzyskać końcowe stężenie CDNB wynoszące 0,2 mM. Absorbancję przy 340 nm rejestrowano co minutę przez 10 minut w celu obliczenia zmian absorbancji na minutę. Aby obliczyć IC50, każdą próbkę inkubowaną z kurkumą znormalizowano względem kontroli, co pozwoliło wyznaczyć procent aktywności. Wyniki te przeanalizowano za pomocą oprogramowania do wykresów, obliczając regresję nieliniową logarytmicznego stężenia inhibitora względem inhibicji. Wartość IC50 wyznaczona dla kurkumy w odniesieniu do GST z wątroby konia wyniosła 31,6 ± 3,6 µM (Rysunek 3A).

Ten sam eksperyment przeprowadzono równolegle, stosując kwas etakrynowy jako kontrolę pozytywną, w stężeniach od 0,39 do 100 µM, analogicznie jak w przypadku kurkuminy. Wartość IC50 wyniosła 6,6 ± 1,1 µM (Rysunek 3B).

Kolejnym krokiem była ocena mechanizmu hamowania tych transferaz przez kurkuminę. Przetestowano cztery różne stężenia kurkuminy: 0, 7,5, 15 i 30 µM, a także cztery różne stężenia CDNB: 0,2, 0,4, 1 i 1,5 mM. Protokół był taki sam jak w poprzednim eksperymencie. Prędkość dla każdego warunku obliczono przy użyciu Równania 2. Dla każdego stężenia inhibitora wykreślono krzywą zależności prędkości (w µM/min) od stężenia substratu (mM) (Rycina 3C). Wartości Vmax i Km określono na podstawie każdego wykresu za pomocą oprogramowania GraphPad Prism. Mechanizm hamowania potencjalnego inhibitora oceniono na podstawie zmian tych dwóch parametrów oraz różnych warunków testów.24 Ponieważ Vmax nie zmieniła się znacząco między warunkami, natomiast Km wzrastała wraz z różnymi stężeniami inhibitora, hamowanie GST przez kurkuminę jest konkurencyjne. Taki wzorzec hamowania występuje, gdy inhibitor konkuruje z substratem o miejsce aktywne enzymu. Aby zmierzyć Ki inhibitora konkurencyjnego, program GraphPad wykorzystuje Równanie 4 i Równanie 5 zgodnie z opisem Copelanda i wsp.32.
Równanie 4:
Równanie Michaelisa-Mentena z czynnikiem inhibitora; kinetyka enzymatyczna; analiza formuły matematycznej.
Równanie 5:
Równanie Michaelisa-Mentena, formuła kinetyki enzymatycznej, reprezentacja matematyczna.
gdzie Km obs to obserwowana stała Michaelisa-Mentena, Km to stała Michaelisa-Mentena dla kontroli, [I] to stężenie inhibitora, Ki to stała hamowania, Y to prędkość, a X to stężenie substratu.

Obliczenia oparto na tych samych eksperymentach, co ocenę mechanizmu inhibicji. Wartość Ki oszacowana dla inhibicji GST z wątroby konia przez kurkuminę wyniosła 23.2 ± 3.2 µM.

Schemat blokowy procesu analizy GST; przygotowanie enzymu, wyznaczenie Km, absorbancji, IC50 oraz Ki.
Rycina 1: Schemat blokowy opisujący etapy enzymatycznych testów GST oraz testów inhibicji. Szczegółowe informacje na temat procedury przedstawiono w sekcji protokołu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić tę rycinę w większym rozmiarze.

Wykres kinetyki Michaelisa-Menten, prędkość enzymatyczna w funkcji stężenia CDNB, wykres analizy danych.
Rycina 2: Wykres Michaelisa-Menten aktywności enzymatycznej GST.W celu oznaczenia aktywności GST w puli enzymów GST z wątroby konia zastosowano zwiększające się stężenia substratu CDNB przy stałym stężeniu GSH (2.5 mM). Wartość Km dla CDNB wyznaczona na podstawie krzywej na wykresie wyniosła 0,26 ± 0,08 mM. Każdy punkt na wykresie reprezentuje średnią z czterech niezależnych serii pomiarowych wraz z SD. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Inhibicja aktywności GST przez kurkumę i kwas etakrynowy; wykres zależności prędkości od stężenia CDNB.
Rysunek 3: Wpływ kurkumy i kwasu etakrynowego na aktywność enzymatyczną GST.(A-B) Dodanie zwiększających się stężeń kurkumy (A) lub dodatniej kontroli w postaci kwasu etakrynowego (B), przy zachowaniu tych samych stężeń końcowych GST (0.01 U/mL), GSH (2.5 mM) i CDNB (0.2 mM), posłużyło do obliczenia IC50 obu związków dla GST z wątroby konia za pomocą regresji nieliniowej. Wartość IC50 określono na 31.6 ± 3.6 µM dla kurkumy i 6.6 ± 1.1 µM dla kwasu etakrynowego. (C) Wykres Michaelisa-Menten dla różnych stężeń kurkumy, badanych przy zmiennych stężeniach substratu CDNB, wskazujący na konkurencyjny mechanizm inhibicji. Wobec braku inhibitora Vmax i Km wyniosły odpowiednio 132.7 ± 4.6 µM oraz 0.5 ± 0.08 µM. Przy stężeniu kurkumy 30 µM wartości Vmax i Km wynosiły 130.4 ± 13.1 µM oraz 1.08 ± 0.39 µM. Punkty danych na wszystkich wykresach (A-C) reprezentują średnie z trzech różnych serii eksperymentalnych wraz z SD. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

Udostępniamy protokół opisujący każdy etap spektrofotometrycznego testu enzymatycznego GST, aby przebadać domniemane inhibitory (Rysunek 1, Tabela 1) i określić ilościowo ich siłę hamującą. Podkreśliliśmy również najważniejsze kryteria, które należy wziąć pod uwagę, aby uzyskać dokładne testy enzymatyczne zapewniające powtarzalne wyniki. Główną zaletą opisanego protokołu w porównaniu z innymi metodami kolorymetrycznymi lub spektrometrią mas jest to, że protokół ten jest szybki i łatwy do wykonania oraz zapewnia ilościowe pomiary aktywności GST, a także siły hamowania przesiewanych cząsteczek.

Przedstawiono sposób obliczania dwóch najważniejszych parametrów Michaelisa-Mentena inhibitora enzymu: IC50 i Ki. Silny inhibitor będzie wywierał najniższy możliwy poziom Ki IC50, co wskazuje, że powinowactwo między inhibitorem a enzymem jest wysokie30. Ponieważ IC50 zależy od stężenia enzymu i warunków oznaczania33, wykorzystanie tej wartości do porównania inhibitorów z różnych eksperymentów lub uzyskanych przy użyciu innych warunków testowych może być trudne34. Zastosowanie stałej inhibicji Ki jest lepszym wskaźnikiem siły hamującej potencjalnych związków. Ki może być używany do porównywania dwóch inhibitorów o różnych sposobach hamowania, ponieważ opiera się wyłącznie na powinowactwie między inhibitorem a enzymem. Jednak, aby mieć jasne wyobrażenie o naturze hamowania, należy określić oba parametry inhibitora30. Zmierzyliśmy IC50 i Ki K i kurkuminy odpowiednio 31,6 ± 3,6 μM i 23,2 ± 3,2 μM, co wskazuje, że związek ten jest silnym inhibitorem GST. Wyniki te potwierdziły przewidywania in silico , w których oszacowano wartości Ki w zakresie od 27,4 do 78,1 μM dla różnych ludzkich izoform GST i kurkuminy.

Aktywność enzymatyczna lub szybkość reakcji i ilość enzymu
Jak wspomniano powyżej, IC50 jest zależny od stężenia enzymu, a przeprowadzenie eksperymentu z nieznanym poziomem aktywności enzymatycznej może prowadzić do fałszywych wniosków33. Aby kontrolować inne czynniki, które mogą zmniejszać aktywność hamującą, należy rozważyć i zmierzyć aktywność enzymatyczną dla każdej nowej partii GST. Na przykład degradacja partii enzymatycznej, spowodowana zbyt wieloma cyklami zamrażania/rozmrażania, może zmniejszyć aktywność, a tym samym prowadzić do niższego IC50, nawet jeśli eksperyment został przeprowadzony w tych samych warunkach. Innymi słowy, użycie 0,01 jednostki enzymu nie da takich samych wyników, jak użycie 1 jednostki. Użycie zbyt dużej ilości enzymów może doprowadzić do szybkiego zubożenia substratu, a reakcja nie będzie miała liniowego kształtu. Ten parametr może zatem prowadzić do niedokładnego wyniku, ponieważ po długim czasie inkubacji nie będzie widoczna żadna zmiana absorbancji.

Km Wartość
Aby zapewnić najlepsze warunki do oceny rodzaju inhibicji wykazywanej przez inhibitor, stężenie substratu musi być równe lub niższe od stałej Michaelisa-Mentena (Km). Km jest reprezentowany przez stężenie substratu wymagane do zajęcia połowy miejsc aktywnych na enzymie28. Na przykład wyższe stężenie substratu może przeciwdziałać inhibitorowi kompetycyjnemu, a ocena tego typu inhibicji będzie trudna w takich warunkach. Dlatego jednym z kluczowych kroków w tej metodologii jest określenie Km enzymu dla wybranego substratu (tutaj CDNB). W niektórych badaniach wartość ta nie została określona, co może prowadzić do fałszywych wniosków na temat wzorca hamowania spowodowanego przez inhibitor, a jeśli tryb hamowania jest nieprawidłowy, Ki zostanie obliczony nieprawidłowo, ponieważ równanie opiera się na wzorcu hamowania26,28. Jeżeli badana jest inna izoforma GST, obowiązkowa jest nowa ocena wartości Km, ponieważ wartość ta jest unikalna dla pary enzymu i liganda. Ponieważ zastosowaliśmy stężenie CDNB nieco niższe niż Km (0,2 mM), które zdefiniowaliśmy jako 0,26 ± 0,08 mM, przewidywany konkurencyjny tryb hamowania kurkuminy na GST został dokładnie określony.

Silnik IC50
Uzyskanie dobrej krzywej sigmoidalnej, za pomocą której można oszacować IC50, wymaga znalezienia zarówno dolnego, jak i górnego płaskowyżu. Dolny plateau reprezentuje stężenia inhibitora, które zapewniają maksymalną aktywność hamującą. W niektórych przypadkach związek może nie hamować enzymu w pełni, nawet w wysokich stężeniach, z powodu takich problemów technicznych, jak rozpuszczalność. Jednak narzędzia takie jak GraphPad Prism mogą dość dokładnie dopasować się do dolnego płaskowyżu. Górny plateau składa się ze stężeń inhibitora, które są niewystarczające do zahamowania enzymu, a zatem aktywność jest maksymalna. Oba te płaskowyże mają kluczowe znaczenie dla wyznaczenia IC50, a także stężeń pomiędzy, w celu znalezienia nachylenia krzywej - wtedy IC50 można wyprowadzić z kształtu krzywej esicy35. Kurkumina jest słabo rozpuszczalna w wodzie, dlatego maksymalne stężenie stosowane w tym teście jest ograniczone, aby uniknąć wytrącania się w roztworze testowym. Zastosowano więc roztwory o mniejszym stężeniu, które nie hamują w pełni aktywności GST. Spowodowało to problemy z określeniem dolnego płaskowyżu. Aby przeciwdziałać temu problemowi, przewidzieliśmy dolne wartości na podstawie wykresu regresji nieliniowej, który zapewnił IC50 na poziomie 31,6 ± 3,6 μM dla kurkuminy (rysunek 3A). W przypadku kwasu etakrynowego nie było potrzeby przewidywania wartości dla dolnego plateau, ponieważ związek ten jest rozpuszczalny w roztworze testowym, a IC50 mierzono przy 6,6 ± 1,1 μM.

Metodę tę można zastosować do najbardziej eksprymowanych izoform GST u ludzi, a mianowicie GSTA1, GSTM1 lub GSTP1. Jednak protokół ten nie jest odpowiedni do ilościowego określenia aktywności izoformy GSTT1, ponieważ CDNB nie jest substratem dla tego podtypu. 36, 37 Tymczasem protokół można nieznacznie zmodyfikować, aby przeciwdziałać temu problemowi. Na przykład używając 1,2-epoksydo-3-(4'-nitrofenoksy)propanu (ENPP) jako substratu dla GSTT1 i mierząc ilość koniugatu przy 360 nm zamiast 340 nm. 37

Etapy protokołu mogą być dostosowane i zastosowane do badania aktywności GST i testowania inhibitorów w eksperymentach z hodowlami komórkowymi. Pomiar aktywności GST na komórkach poddanych działaniu inhibitora GST i bez niego wskaże, czy związek ten może być stosowany w takich warunkach eksperymentalnych. Jest to szczególnie interesujące, gdy inhibitor jest lipofilowy. Na przykład przedstawiliśmy, że kurkumina jest silnym inhibitorem GST przy użyciu tego protokołu. Niemniej jednak jego zastosowanie w badaniach komórkowych może być ograniczone, ponieważ cząsteczka jest słabo rozpuszczalna w wodzie i szybko ulega degradacji w pożywce. 31 Możliwe jest również ulepszenie tego protokołu w odniesieniu do nieizoformalnej specyficzności substratu CDNB. Zastosowanie tego protokołu w badaniach komórkowych dostarczy jedynie informacji o ogólnej aktywności GST, ale nie o aktywności konkretnego podtypu GST. Dodanie substratu specyficznego dla izoformy i/lub użycie specyficznej rekombinowanej izoformy GST pozwoli na przetestowanie inhibitorów GST specyficznych dla danej izoformy.

Podsumowując, opisujemy kompletną procedurę testowania inhibitorów GST, które mogą być stosowane w połączeniu z chemioterapią elektrofilową. Położyliśmy nacisk na kluczowe etapy testu enzymatycznego i inhibicji GST, aby przetestować potencjalnie interesującą cząsteczkę i określić jej skuteczność jako inhibitora z wartościami ilościowymi, IC50 i Ki. Metoda ta może być zastosowana do dowolnego przypuszczalnego związku i przeprowadzona na najbardziej eksprymowanych ludzkich izoformach GST (GSTA1, GSTM1 i GSTP1) lub nieznacznie dostosowana do przeprowadzenia badań hodowli komórkowych z inhibitorami GST lub zmierzenia aktywności innej interesującej izoformy GST z wyboru.

OdczynnikiNazwaStężenie w roztworze do oznaczaniaInny
SubstratSieć CDNBZmierzone Km (mM)Rozcieńczony w 95% etanolu. Końcowe stężenie etanolu powinno wynosić ≤ 5% (v/v)
Substrat sprzężonyGSH (Urząd Transportu T2,5 mMRozcieńczony w wodzie.
Stężenie musi nasycić roztwór.
BuforPBS-pH = 7,1
EnzymPula izoform GST lub czystej izoformy0,01 jednostki/ml, oznaczone doświadczalnie.Rozcieńczony w wodzie.
Inhibitor GSTPotencjalny związek z wyboruIC50: 3 stężenia, które maksymalnie hamują, 3, które minimalnie hamują i 3 pomiędzy.Rozcieńczony w DMSO, a następnie w wodzie, aby uzyskać końcowe stężenie DMSO ≤ 1% (v/v)
Ki: 3 stężenia wokół IC50.
Parametry
Temperatura pokojowa (25°C)
pH = 7,1
DMSO ≤ 1% (v/v)
Etanol ≤ 5% (v/v)

Tabela 1: Podsumowanie odczynników i parametrów, które należy wziąć pod uwagę podczas testu inhibicji GST.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca badawcza była wspierana przez Fundację CANSEARCH. Autorzy pragną podziękować Pani Laurence Lesne i Panu Yoannowi Sarmiento za pomoc techniczną, szczególnie w przeprowadzaniu eksperymentów replikacyjnych przy jednoczesnej standaryzacji testów z inhibitorami. Z dużym uznaniem doceniamy owocne dyskusje i wkład pana Denisa Marino, dr Simony Mlakar i dr Vida Mlakara. Dziękujemy dr Patricii Huezo-Diaz Curtis za pomoc w narracji filmu. Dziękujemy dr Muthukumarowi za jego wkład w prognozy in silico. Dziękujemy również Panu Darrenowi Hartowi za pomoc w korekcie tego manuskryptu w języku angielskim.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1-Chloro-2,4-dinitrobenzen (CDNB)Sigma-Aldrich237329Substrate używany do testu enzymatycznego GST
Corning UV-Transparent MicroplatesSigma-AldrichCLS3635Przezroczysta płytka do przeprowadzenia testu enzymatycznego.
W przypadku stosowania 200 ul długość ścieżki wynosi 0,552 cm dla tej płytki.
KurkuminaSigma-Aldrich8511Używana w sekcji wyników, do testowania siły hamowania kurkuminy
Dimetylosulfotlenek (DMSO)Sigma-AldrichD2650Aby przygotować zapas domniemanego
inhibitora DPBSSigma-AldrichD8537Bufor do reakcji enzymatycznej
Etanol 95%Fisher 10542382 naukowyAby rozcieńczyć CDNB
S-transferaza glutationowa z wątroby koniSigma-AldrichG6511Używana w sekcji wyników, do testowania siły hamowania kurkuminy
L-glutationu zredukowanego (GSH)Sigma-AldrichG4251Kosubstrat do testu enzymatycznego GST
Zestaw do oznaczania białek Pierce BCAThermoFisher23225Do ilościowego określenia ilości białka obecnego w roztworze enzymatycznym
Spectramax iD3Urządzenia molekularneDo wykonywania pomiarów spektrofotometrycznych

Bibliografia

  1. Mannervik, B., Danielson, U. H. Glutathione transferases--structure and catalytic activity. CRC Critical Reviews in Biochemistry. 23 (3), 283-337 (1988).
  2. Awasthi, Y. C., Sharma, R., Singhal, S. S. Human glutathione S-transferases. The International Journal of Biochemistry. 26 (3), 295-308 (1994).
  3. Rowe, J. D., Nieves, E., Listowsky, I. Subunit diversity and tissue distribution of human glutathione S-transferases: interpretations based on electrospray ionization-MS and peptide sequence-specific antisera. Biochemical Journal. 325, Pt 2 481-486 (1997).
  4. Beckett, G. J., Hayes, J. D. Glutathione S-transferases: biomedical applications. Advances in Clinical Chemistry. 30, 281-380 (1993).
  5. Oakley, A. Glutathione transferases: a structural perspective. Drug Metabolism Reviews. 43 (2), 138-151 (2011).
  6. Townsend, D. M., Tew, K. D. The role of glutathione-S-transferase in anti-cancer drug resistance. Oncogene. 22 (47), 7369-7375 (2003).
  7. Tew, K. D. Glutathione-associated Enzymes in Anticancer Drug Resistance. Cancer Research. 54 (16), 4313-4320 (1994).
  8. Laborde, E. Glutathione transferases as mediators of signaling pathways involved in cell proliferation and cell death. Cell Death and Differentiation. 17 (9), 1373-1380 (2010).
  9. Adler, V., et al. Regulation of JNK signaling by GSTp. The EMBO Journal. 18 (5), 1321-1334 (1999).
  10. Cho, S. G., et al. Glutathione S-Transferase Mu Modulates the Stress-activated Signals by Suppressing Apoptosis Signal-regulating Kinase 1. Journal of Biological Chemistry. 276 (16), 12749-12755 (2001).
  11. Hayes, J. D., Flanagan, J. U., Jowsey, I. R. Glutathione Transferases. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 45 (1), 51-88 (2005).
  12. Lo, H. W., Ali-Osman, F. Genetic polymorphism and function of glutathione S-transferases in tumor drug resistance. Current Opinion in Pharmacology. 7 (4), 367-374 (2007).
  13. Ansari, M., et al. Glutathione S-transferase gene variations influence BU pharmacokinetics and outcome of hematopoietic SCT in pediatric patients. Bone Marrow Transplantation. 48 (7), 939-946 (2013).
  14. Mahajan, S., Atkins, W. M. The chemistry and biology of inhibitors and pro-drugs targeted to glutathione S-transferases. Cellular and molecular life sciences: CMLS. 62 (11), 1221-1233 (2005).
  15. Allocati, N., Masulli, M., Ilio, C. D., Federici, L. Glutathione transferases: substrates, inihibitors and pro-drugs in cancer and neurodegenerative diseases. Oncogenesis. 7 (1), 8(2018).
  16. Aggarwal, B. B., Kumar, A., Bharti, A. C. Anticancer potential of curcumin: preclinical and clinical studies. Anticancer Research. 23 (1), 363-398 (2003).
  17. Han, S. S., Chung, S. T., Robertson, D. A., Ranjan, D., Bondada, S. Curcumin causes the growth arrest and apoptosis of B cell lymphoma by downregulation of egr-1, c-myc, bcl-XL, NF-kappa B, and p53. Clinical Immunology. 93 (2), Orlando, Fla. 152-161 (1999).
  18. Golonko, A., Lewandowska, H., Świsłocka, R., Jasińska, U. T., Priebe, W., Lewandowski, W. Curcumin as tyrosine kinase inhibitor in cancer treatment. European Journal of Medicinal Chemistry. 181, 111512(2019).
  19. Awasthi, S., et al. Curcumin-glutathione interactions and the role of human glutathione S-transferase P1-1. Chemico-Biological Interactions. 128 (1), 19-38 (2000).
  20. Appiah-Opong, R., Commandeur, J. N. M., Istyastono, E., Bogaards, J. J., Vermeulen, N. P. E. Inhibition of human glutathione S-transferases by curcumin and analogues. Xenobiotica; the Fate of Foreign Compounds in Biological Systems. 39 (4), 302-311 (2009).
  21. Dubey, V., Owusu-Apenten, R. Curcumin Restores Glutathione-S-Transferase Activity for LNCaP Prostate Cancer Cells. Pure and Applied Chemistry. 2, 61-72 (2014).
  22. Habig, W. H., Pabst, M. J., Jakoby, W. B. Glutathione S-transferases. The first enzymatic step in mercapturic acid formation. The Journal of Biological Chemistry. 249 (22), 7130-7139 (1974).
  23. Johnson, K. A., Goody, R. S. The Original Michaelis Constant: Translation of the 1913 Michaelis-Menten Paper. Biochemistry. 50 (39), 8264-8269 (2011).
  24. Ochs, R. S. Understanding Enzyme Inhibition. Journal of Chemical Education. 77 (11), 1453(2000).
  25. Bisswanger, H. Enzyme assays. Perspectives in Science. 1 (1), 41-55 (2014).
  26. Acker, M. G., Auld, D. S. Considerations for the design and reporting of enzyme assays in high-throughput screening applications. Perspectives in Science. 1 (1), 56-73 (2014).
  27. Cheng, A. L., et al. Anticancer Research. 21, 2895-2900 (2001).
  28. Yang, J., Copeland, R. A., Lai, Z. Defining Balanced Conditions for Inhibitor Screening Assays That Target Bisubstrate Enzymes. Journal of Biomolecular Screening. 14 (2), 111-120 (2009).
  29. Uppugunduri, C. R. S., Muthukumaran, J., Santos-Silva, T., Ansari, M. Identification of putative substrates and inhibitors for Glutathione S-transferases using computational methods. Zenodo. , (2017).
  30. Burlingham, B. T., Widlanski, T. S. An Intuitive Look at the Relationship of Ki and IC50: A More General Use for the Dixon Plot. Journal of Chemical Education. 80 (2), 214(2003).
  31. Wang, Y. J., et al. Stability of curcumin in buffer solutions and characterization of its degradation products. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 15 (12), 1867-1876 (1997).
  32. Copeland, R. A. Evaluation of enzyme inhibitors in drug discovery. A guide for medicinal chemists and pharmacologists. Methods of Biochemical Analysis. 46, 1(2005).
  33. Kalliokoski, T., Kramer, C., Vulpetti, A., Gedeck, P. Comparability of Mixed IC50 Data - A Statistical Analysis. PLoS ONE. 8 (4), (2013).
  34. Brandt, R. B., Laux, J. E., Yates, S. W. Calculation of inhibitor Ki and inhibitor type from the concentration of inhibitor for 50% inhibition for Michaelis-Menten enzymes. Biochemical Medicine and Metabolic Biology. 37 (3), 344-349 (1987).
  35. Brooks, H. B., et al. Basics of Enzymatic Assays for HTS. Eli Lilly & Company and the National Center for Advancing Translational Sciences. , (2012).
  36. Arakawa, S., et al. Evaluation of hepatic glutathione transferase Mu 1 and Theta 1 activities in humans and mice using genotype information. Drug Metabolism and Disposition: The Biological Fate of Chemicals. 40 (3), 497-503 (2012).
  37. Sherratt, P. J., Pulford, D. J., Harrison, D. J., Green, T., Hayes, J. D. Evidence that human class Theta glutathione S-transferase T1-1 can catalyse the activation of dichloromethane, a liver and lung carcinogen in the mouse. Comparison of the tissue distribution of GST T1-1 with that of classes Alpha, Mu and Pi GST in human. The Biochemical Journal. 326 (3), 837-846 (1997).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Analiza inhibicji GSTsta a Michaelisa Mentenwyznaczanie IC50obliczanie Kiinhibicja konkurencyjnainhibicja kurkuminkinetyka enzymatycznasubstrat CDNB
Spektrofotometryczne badania przesiewowe w kierunku potencjalnych inhibitorów cytozolowych S-transferaz glutationowych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.