Ten artykuł zawiera protokoły projektowania i samoorganizacji nanostruktur z oligomerów kwasu nukleinowego modyfikowanych gamma peptydów w mieszaninach rozpuszczalników organicznych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Samoorganizacja peptydowych kwasów nukleinowych modyfikowanych promieniami gamma w złożone nanostruktury w mieszaninach rozpuszczalników organicznych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Obecne strategie w nanotechnologii DNA i RNA umożliwiają samoorganizację różnych nanostruktur kwasów nukleinowych w środowisku wodnym lub znacznie uwodnionym. W tym artykule opisujemy szczegółowe protokoły, które umożliwiają budowę architektur nanowłókien w mieszaninach rozpuszczalników organicznych poprzez samoorganizację jednowątkowych, jednoniciowych, modyfikowanych gamma płytek z peptydowym kwasem nukleinowym (γPNA). Każda płytka jednoniciowa (SST) jest 12-zasadowym oligomerem γPNA złożonym z dwóch połączonych domen modułowych po 6 zasad każda. Każda domena może wiązać się z wzajemnie uzupełniającą się domeną obecną na sąsiednich niciach przy użyciu zaprogramowanej komplementarności, tworząc nanowłókna, które mogą rosnąć do mikronów długości. Motyw SST składa się z 9 oligomerów ogółem, aby umożliwić tworzenie nanowłókien 3-helisowych. W przeciwieństwie do analogicznych nanostruktur DNA, które tworzą struktury monodyspersyjne o średnicy, te systemy γPNA tworzą nanowłókna, które zwijają się wzdłuż swojej szerokości podczas samoorganizacji w mieszaninach rozpuszczalników organicznych. Opisane tutaj protokoły samoorganizacji obejmują zatem również konwencjonalny środek powierzchniowo czynny, dodecylosiarczan sodu (SDS), w celu zmniejszenia efektu sprzedaży wiązanej.
Wprowadzenie
Udana budowa wielu złożonych nanostruktur1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 w wodnym lub zasadniczo uwodnionym podłożu wykonanym przy użyciu naturalnie występujących kwasów nukleinowych, takich jak DNA1,2,....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Projektowanie sekwencji γPNA
- Pobierz zestaw narzędzi do projektowania DNA22 opracowany przez Winfree Lab w Caltech23 do folderu zawierającego skrypty programistyczne do projektowania sekwencji.
- W tym folderze projektowania sekwencji otwórz język programowania czwartej generacji zgodny z rozszerzeniem pliku ".m", a następnie dodaj wcześniej pobrany folder "DNAdesign" do ścieżki za pomocą następującego polecenia:
>> addpath DNAdesign - Następnie uruchom następujący skrypt o nazwie "PNA3nanofiber.m" (patrz rysunek uzupełniający 1) za pomocą następującego polecenia: <....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Protokoły omówione w powyższych sekcjach opisują projekt zaadaptowanego motywu SST z nanowłókien DNA do solidnego generowania samoorganizujących się struktur nanowłókien przy użyciu wielu, odrębnych oligomerów γPNA. W tej sekcji opisano interpretację danych uzyskanych w wyniku pomyślnego odtworzenia opisanych protokołów.
Zgodnie z protokołem opisanym w sekcji 5 dla obrazowania TIRF próbek oligomerów γPNA wyżarzonych w 75% DMSO: H2O (v/v) najłatwiej dostarcza dowodów na dobrze zorgan.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Niniejszy artykuł koncentruje się na adaptacji i ulepszaniu istniejących protokołów nanotechnologii kwasów nukleinowych w kierunku mieszanin rozpuszczalników organicznych. Opisane tutaj metody koncentrują się na modyfikacjach i rozwiązywaniu problemów w określonej przestrzeni eksperymentalnej wybranych polarnych aprotonowych rozpuszczalników organicznych. Istnieje jeszcze niezbadany potencjał dla innych uznanych protokołów nanotechnologii kwasów nukleinowych, które można zaadaptować w tej przestrzeni. Może to poprawić po.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.
Podziękowania
Ta praca była częściowo wspierana przez 1739308 grantów National Science Foundation, 1944130 grantów NSF CAREER oraz przez grant Biura Badań Naukowych Sił Powietrznych FA9550-18-1-0199. Sekwencje γPNA były hojnym darem od dr Tumula Srivastavy z Trucode Gene Repair, Inc. Chcielibyśmy podziękować dr Erikowi Winfree'owi i dr Rizalowi Hariadiemu za ich pomocne rozmowy na temat kodu DNA Design Toolbox MATLAB. Chcielibyśmy również podziękować Josephowi Suhanowi, Marze Sullivan i Center for Biological Imaging za ich pomoc w zbieraniu danych TEM.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| γ Nici/oligomery PNA | Trucode Gene Repair Inc. | Sekcja 2.1 | |
| Spektrofotometr UV-Vis | Agilent | Varian Cary 300 | Sekcja 3.1.2 |
| Kuwety kwarcowe | Starna | 29-Q-10 | Sekcja 3.1.1 |
| Termocykler | Bio Rad | C1000 touch | Sekcja 4.1 |
| Probówki PCR 0,2 ml | VWR | 53509-304 | Sekcja 4.5 |
| Bezwodne DMF | VWR | EM-DX1727-6 | Sekcja 4.6 |
| Bezwodny DMSO | VWR | EM-MX1457-6 | Sekcja 4.6 |
| Bezwodny 1,4-dioksan | Fisher Scientific | AC615121000 | Sekcja 4.6 |
| 10X sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) | VWR | 75800-994 | Sekcja 3.1.1 |
| Szkiełka mikroskopowe | VWR | 89085-399 | Sekcja 5.2 |
| Szkiełka nakrywkowe szklane | VWR | 48382-126 | Sekcja 5.2 |
| 2% kolodion w octanie amylu | Sigma-Aldrich | 9817 | sekcja 5.2 |
| Octan izoamylu | VWR | 200001-180 | sekcja 5.2 |
| Biotynylowana albumina surowicy bydlęcej (Biotin-BSA) | Sigma-Aldrich | A8549 | sekcja 5.3 |
| Albumina surowicy bydlęcej (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | sekcja 5.4 |
| Streptawidyna | Sigma-Aldrich | 189730 | Sekcja 5.5 |
| Trolox | Sigma-Aldrich | 238813 | Sekcja 5.7 |
| Mikroskop fluorescencyjny z całkowitym wewnętrznym odbiciem | Nikon | Nikon Ti2-E | Sekcja 5.8 |
| Transmisyjny mikroskop elektronowy | Joel | JEM 1011 | Sekcja 6.6 |
| Pęseta | Dumont | 0203-N5AC-PO | Sekcja 6.3 |
| Octan uranylu | Elektron Nauki mikroskopowe | 22400 | Sekcja 6.1 |
| Formvar, siatka 300, siatki miedziane | Ted Pella Inc. | 1701-F | Sekcja 6.2 |
| Tlenek krzemu formvar typu A, siatka 300, siatki miedziane | Ted Pella Inc. | 1829 | Sekcja 6.2 |
| Oligomery/nici DNA | IDT | Sekcja 7.1 | |
| Dodecylosiarczan sodu (SDS) | VWR | 97064-860 | Sekcja 8.1 |
Bibliografia
- Fu, T. J., Seeman, N. C. DNA double-crossover molecules. Biochemistry. 32 (13), 3211-3220 (1993).
- Winfree, E., Liu, F., Wenzler, L. A., Seeman, N. C. Design and self-assembly of two-dimensional DNA crystals. Nature. 394 (6693), 539-544 (1998).
- Shih, W., Quispe, J., Joyce, G.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
