Method Article

Samoorganizacja peptydowych kwasów nukleinowych modyfikowanych promieniami gamma w złożone nanostruktury w mieszaninach rozpuszczalników organicznych

DOI:

10.3791/61351

⸱

June 26th, 2020

 ,  , 
1Department of Mechanical Engineering, Carnegie Mellon University, 2Department of Biomedical Engineering, Carnegie Mellon University, 3Department of Electrical and Computer Engineering, Carnegie Mellon University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten artykuł zawiera protokoły projektowania i samoorganizacji nanostruktur z oligomerów kwasu nukleinowego modyfikowanych gamma peptydów w mieszaninach rozpuszczalników organicznych.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obecne strategie w nanotechnologii DNA i RNA umożliwiają samoorganizację różnych nanostruktur kwasów nukleinowych w środowisku wodnym lub znacznie uwodnionym. W tym artykule opisujemy szczegółowe protokoły, które umożliwiają budowę architektur nanowłókien w mieszaninach rozpuszczalników organicznych poprzez samoorganizację jednowątkowych, jednoniciowych, modyfikowanych gamma płytek z peptydowym kwasem nukleinowym (γPNA). Każda płytka jednoniciowa (SST) jest 12-zasadowym oligomerem γPNA złożonym z dwóch połączonych domen modułowych po 6 zasad każda. Każda domena może wiązać się z wzajemnie uzupełniającą się domeną obecną na sąsiednich niciach przy użyciu zaprogramowanej komplementarności, tworząc nanowłókna, które mogą rosnąć do mikronów długości. Motyw SST składa się z 9 oligomerów ogółem, aby umożliwić tworzenie nanowłókien 3-helisowych. W przeciwieństwie do analogicznych nanostruktur DNA, które tworzą struktury monodyspersyjne o średnicy, te systemy γPNA tworzą nanowłókna, które zwijają się wzdłuż swojej szerokości podczas samoorganizacji w mieszaninach rozpuszczalników organicznych. Opisane tutaj protokoły samoorganizacji obejmują zatem również konwencjonalny środek powierzchniowo czynny, dodecylosiarczan sodu (SDS), w celu zmniejszenia efektu sprzedaży wiązanej.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Udana budowa wielu złożonych nanostruktur1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 w wodnym lub zasadniczo uwodnionym podłożu wykonanym przy użyciu naturalnie występujących kwasów nukleinowych, takich jak DNA1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 i RNA11,12 był wyświetlany w poprzednich pracach. Jednak naturalnie występujące kwasy nukleinowe ulegają dupleksowym spiralnym zmianom konformacyjnym lub mają obniżoną stabilność termiczną w mieszaninach rozpuszczalników organicznych13,14.

Poprzednio, nasze laboratorium opisało metodę budowy 3-helisowych nanowłókien przy użyciu zmodyfikowanych przez pozycję gamma syntetycznych naśladowców kwasów nukleinowych zwanych gamma-peptydowymi kwasami nukleinowymi (γPNA)15 (Rysunek 1A). Potrzeba takiego rozwoju i potencjalnych zastosowań syntetycznego kwasu nukleinowego naśladującego PNA została omówiona w ramach pola16,17. Wykazaliśmy, poprzez adaptację strategii jednoniciowych płytek (SST) przedstawionej dla nanostruktur DNA18,19,20, że 9 sekwencyjnie odrębnych oligomerów γPNA można zaprojektować do tworzenia nanowłókien 3-helisowych w wybranych polarnych mieszaninach rozpuszczalników organicznych aproton, takich jak DMSO i DMF. Oligomery γPNA zostały komercyjnie uporządkowane z modyfikacjami (R)-glikolu dietylenowego (mini-PEG) w trzech γ pozycjach (1, 4 i 8 pozycjach zasadowych) wzdłuż każdego 12-zasadowego oligomeru w oparciu o metody opublikowane przez Sahu i wsp. 21 Te modyfikacje gamma powodują spiralną preorganizację, która jest związana z wyższym powinowactwem wiązania i stabilnością termiczną γPNA w porównaniu z niezmodyfikowanym PNA.

Ten artykuł jest adaptacją naszej raportowanej pracy, w której badamy wpływ roztworu rozpuszczalnika i podstawiania go DNA na tworzenie nanostruktur opartych na γPNA15. Celem niniejszego artykułu jest przedstawienie szczegółowych opisów konstrukcji, a także szczegółowych protokołów dla metod dostosowanych do rozpuszczalników, które zostały opracowane dla samoorganizacji i charakterystyki nanowłókien γPNA. W związku z tym najpierw wprowadzamy modułową strategię SST, ogólną platformę do projektowania nanostruktur przy użyciu syntetycznego kwasu nukleinowego naśladującego PNA.

Skoczek spiralny dla dupleksów PNA wynosi 18 zasad na turę w porównaniu do dupleksów DNA, które przechodzą jeden obrót na 10,5 zasad (Rysunek 1B). W związku z tym długość domeny zademonstrowanych SST γPNA ustalono na 6 podstawach, aby pomieścić jedną trzecią pełnego obrotu lub 120° obrotu, aby umożliwić interakcję między trzema trójkątnie ustawionymi helisami. Ponadto, w przeciwieństwie do poprzednich motywów SST, każdy SST zawiera tylko 2 domeny, skutecznie tworząc jednowymiarową strukturę przypominającą wstęgę, która owija się, tworząc wiązkę trzech helis (Rysunek 1C). Każdy 12-zasadowy oligomer γPNA jest modyfikowany gamma w pozycjach 1, 4 i 8, aby zapewnić równomiernie rozmieszczony rozkład grup mini-PEG w całym motywie SST. Dodatkowo, w obrębie motywu, istnieją dwa rodzaje oligomerów: "ciągłe" nici, które istnieją na pojedynczej helisie i "skrzyżowane" nici obejmujące helisę (Rysunek 1D). Ponadto oligomery P8 i P6 są znakowane odpowiednio fluorescencyjnym Cy3 (zielona gwiazda) i biotyną (żółty owal) (Rysunek 1D), aby umożliwić wykrycie tworzenia się struktury za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. W sumie motyw SST składa się z 9 całkowitych oligomerów, aby umożliwić tworzenie nanowłókien 3-helisowych poprzez zaprogramowaną komplementarność każdej pojedynczej domeny do odpowiadającej jej domeny na sąsiednim oligomerze (Rysunek 1E).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Projektowanie sekwencji γPNA

  1. Pobierz zestaw narzędzi do projektowania DNA22 opracowany przez Winfree Lab w Caltech23 do folderu zawierającego skrypty programistyczne do projektowania sekwencji.
  2. W tym folderze projektowania sekwencji otwórz język programowania czwartej generacji zgodny z rozszerzeniem pliku ".m", a następnie dodaj wcześniej pobrany folder "DNAdesign" do ścieżki za pomocą następującego polecenia:
    >> addpath DNAdesign
  3. Następnie uruchom następujący skrypt o nazwie "PNA3nanofiber.m" (patrz rysunek uzupełniający 1) za pomocą następującego polecenia:
    >> Nanowłókno PNA3
  4. Uruchom ten skrypt, aby utworzyć zmienne o nazwach "thisSeqs" i "thisScore". Zmienna "thisSeqs" zawiera sekwencje zaprojektowanych oligomerów, a "thisScore" to wynik rzutu karnego.
  5. Uruchom skrypt wiele razy, aby uzyskać jak najniższy wynik. Próbkę 20 takich serii przedstawiono w tabeli 1.
  6. Ręcznie potwierdź pożądaną komplementarność Watsona-Cricka dla każdej dziedziny wygenerowanych sekwencji dla określonego motywu strukturalnego SST. Specyfikacje sekwencji dla struktury nanowłókien 3-helisowych przedstawiono w tabeli 2.
  7. Sprawdź następujące elementy dla wygenerowanych sekwencji.
    1. Unikaj używania czterech kolejnych zasad C i G.
    2. Ręcznie wybierz określone sekwencje do funkcjonalizacji N-końca za pomocą barwnika fluorescencyjnego i cząsteczek biotyny, aby umożliwić badania mikroskopii fluorescencyjnej.
    3. Uwzględnij co najmniej 3 modyfikacje gamma mini-PEG na szkielecie, aby umożliwić wstępnie zorganizowaną konformację spiralną w jednoniciowych oligomerach, jak opisano przez Sahu i wsp. 21

2. Przygotowanie pasm γPNA

  1. Otrzymać nici składowe γPNA o określonych sekwencjach w syntezie w skali 50 nmol z oczyszczaniem metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) od komercyjnego producenta.
  2. Zawiesić każdą nić w wodzie dejonizowanej do stężenia 300 μM. Zawieszone pasma należy przechowywać w zamrażarce w temperaturze -20 °C do kilku miesięcy, aż będą potrzebne do eksperymentów.

3. Badania krzywej topnienia podzbiorów oligomerów γPNA

  1. Uzyskaj zakresy temperatur topnienia dla różnych kombinacji komplementarnych podzbiorów 2-oligomerów i 3-oligomerów, przeprowadzając badanie krzywej topnienia w wodnych, takich jak 1x sól fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS) lub preferowany polarny rozpuszczalnik organiczny, taki jak dimetyloformamid (DMF) lub dimetylosulfotlenek (DMSO) (patrz Rysunek 2).
    UWAGA: Krzywe topnienia termicznego przy >50% DMF zaczynają tracić górną linię bazową i wykazują poważne zakłócenia, częściowo z powodu wysokiej absorbancji DMF na długości fali wymaganej w eksperymentach. Jest to zjawisko odnotowane w literaturze24. Możliwe jest jednak uzyskanie krzywych topnienia przy stężeniach 5 μM na pasmo w tych warunkach rozpuszczalnika.
    1. Podwielokrotność 16,7 μl z 300 μM zapasu każdego oligomeru i doprowadzić końcową objętość do 1000 μl w 1x PBS lub 100% (v/v) DMSO lub 100% (v/v) DMF, skutecznie uzyskując 5 μM stężenia końcowego na oligomer. Przenieś tę mieszaninę podzbiorów oligomerów do 1 cm ścieżki optycznej, kuwety kwarcowej.
    2. Eksperymenty UV-Vis o zmiennej temperaturze należy przeprowadzić w spektrofotometrze wyposażonym w programowalny blok temperatury.
    3. Zebrać punkty danych dla krzywych topnienia w zakresie temperatur 15–90 °C zarówno dla cykli chłodzenia (wyżarzania), jak i ogrzewania (topnienia) z szybkością 0,5–121 °C/min. Próbki należy przechowywać przez 10 minut w temperaturze 90 °C przed schłodzeniem i w temperaturze 15 °C przed ogrzewaniem. Wyznaczyć temperaturę topnienia (Tm) od piku pierwszej pochodnej krzywej grzewczej.
    4. Sprawdzić, czy zakresy temperatur topnienia dla podzbiorów 2-oligomerów są wyższe niż 35 °C we wszystkich przypadkach rozpuszczalników. Dodatkowo sprawdź, czy odpowiednie podzbiory 3-oligomerowe, które zawierają dodatkową nić do odpowiadającego im podzbioru 2-oligomerowego, wykazują znaczny wzrost Tm ze względu na zwiększoną kooperatywność.
      UWAGA: Pozwoliłoby to zweryfikować, czy pojedynczy garnek samoorganizujący się z wieloma oligomerami może wspólnie składać się w pożądaną nanostrukturę z rozsądną stabilnością termiczną.

4. Protokół samoorganizacji dla wielu różnych oligomerów γPNA

UWAGA: Aby opracować protokół samoorganizacji termicznej rampy dla nanostruktur γPNA, pożądane jest wyżarzanie metodą powolnej narastania.

  1. W przypadku wygenerowanych sekwencji oligomerowych próbki należy wyżarzać przez 22,5 godziny w termocyklerze chłodzącym od 90 do 20 °C. Zazwyczaj temperatura topnienia uzyskana dla podzbiorów γPNA 2-oligomerów i 3-oligomerów mieści się w zakresach 40\u201270 °C dla różnych warunków rozpuszczalnika.
  2. Zaprogramować termocykler w następujący sposób: utrzymać temperaturę 90 °C przez 5 minut, zmniejszyć temperaturę od 90 do 70 °C ze stałą prędkością 0,1 °C/min, zmniejszyć temperaturę z 70 do 40 °C z szybkością 0,1 °C/3 min, zmniejszyć temperaturę z 40 do 20 °C z prędkością 0,1 °C/min i utrzymać temperaturę 4 °C (patrz tabela 3). Próbki można przechowywać w temperaturze 4 °C przez 12\u201224 h przed charakterystyką.
    UWAGA: Podczas gdy 2- i 3-oligomerowe podzbiory naszego systemu nanowłókien mogą tworzyć się w 1x PBS, pełne nanowłókna w skali mikronowej agregują się w 1x PBS. Dlatego warunki rozpuszczalnika powinny być zoptymalizowane w oparciu o skalę i rozmiar formowanej struktury, a także rodzaj i gęstość modyfikacji gamma.
  3. W przypadku długich nanowłókien 3-helisowych w skali mikronowej należy przygotować próbki wsadowe do wyżarzania w 75% DMSO: H2O (v/v), 75% DMF: H2O (v/v), 40% 1,4-dioksanu: H2O (v/v) w oparciu o badania optymalizacji rozpuszczalników15.
  4. Przygotować partie wyżarzania w następujący sposób (patrz tabela 4). Najpierw przygotuj 10 μl podproduktów o stężeniach 20 μM z głównych zapasów 300 μM dla każdego oligomeru, dzieląc 0,67 μl z głównego zasobu i zwiększając objętość do 10 μl za pomocą wody dejonizowanej.
  5. Podwielokrotność 1 μl z 20 μM subzasobów dla każdego oligomeru i dodać do probówki PCR o pojemności 200 μl. Odpowiada to całkowitej objętości 9 μl dla 9 oligomerów.
  6. Dodać 30 μl bezwodnego DMSO/DMF dla 75% DMSO i 75% DMF z dodatkowym 1 μl wody dejonizowanej, aby uzyskać końcową objętość 40 μl z każdym oligomerem przy końcowych stężeniach 500 nM. Dodać 16 μl 1,4-dioksanu i zwiększyć objętość wodą dejonizowaną do 40 μl dla stanu 40% rozpuszczalnika dioksanu.
  7. Załaduj partie wyżarzania do termocyklera i wyżarzania, korzystając z protokołu wymienionego w kroku 4.2.

5. Obrazowanie mikroskopowe z pełnym wewnętrznym odbiciem fluorescencyjnym (TIRF)

  1. Przygotuj komorę wilgotnościową z pustego pudełka po końcówkach do pipet. Napełnij pudełko około 5 ml wody, aby zapobiec wysuszeniu kanałów przepływu próbki opisanych w następujący sposób (patrz Rysunek 3).
  2. Przygotować komorę przepływową ze szkiełkiem mikroskopowym, 2 dwustronnymi paskami taśmy i szkiełkiem nakrywkowym pokrytym nitrocelulozą. Aby pokryć szkiełko nakrywkowe nitrocelulozą, zanurz je w zlewce zawierającej 0,1% kolodionu w octanie amylu i wysusz na powietrzu.
    1. Przygotować roztwór nitrocelulozy, sporządzając 20-krotne rozcieńczenie z dostępnego w handlu 2% kolodionu w octanie amylu rozpuszczalnikiem octanu izoamylu.
  3. Przygotować biotynylowany roztwór albuminy surowicy bydlęcej (Biotin-BSA), ważąc 1 mg Biotin-BSA i rozpuszczając go w 1 ml 1x PBS. Przepłynąć 15 μL 1 mg/ml Biotyny-BSA w buforze 1x PBS, umieszczając kanał przepływowy pod kątem. Inkubować kanał przepływowy przez 2–4 minuty w temperaturze pokojowej w wilgotnej komorze.
  4. Przygotować bufor do przemywania przez rozpuszczenie 1 mg BSA w 1 ml 1x PBS. Nadmiar Biotyny-BSA przepłukać przepływem 15 μl buforu do płukania. Aby pasywować powierzchnię, inkubuj kanał przepływowy przez 2–4 minuty w temperaturze pokojowej w wilgotnej komorze.
  5. Przygotować roztwór streptawidyny, odmierzając 0,5 mg streptawidyny i 1 mg BSA, a następnie rozpuszczając przy użyciu 1 ml 1x PBS. Przepływ 15 μL 0,5 mg/ml streptawidyny w 1x PBS zawierającym 1 mg/ml BSA. Inkubować kanał przepływowy przez 2–4 minuty w temperaturze pokojowej w wilgotnej komorze. Przelać 15 μl buforu do przemywania w celu wypłukania niezwiązanej streptawidyny.
  6. Przepłynąć 15 μl uprzednio wyżarzonej partii oligomerów γPNA o stężeniu 500 nM na nić w stanie 75% DMSO, 75% DMF lub 40% 1,4-dioksanu. Inkubuj kanał przepływowy przez 2–4 minuty w temperaturze pokojowej w wilgotnej komorze.
  7. Przygotować 1 mM Trolox w preferowanych warunkach rozpuszczalnika, rozcieńczając 10-krotnie z 10 mM zapasu Trolox w DMSO (odmierzyć 2,5 mg Trolox i rozpuścić w 1 ml DMSO). Przemyć niezwiązane nanostruktury w kanale przepływowym 15 μl 1 mM Trolox o takim samym składzie rozpuszczalnika jak nanostruktury.
    UWAGA: Zawartość >50% DMSO w kanale przepływowym powodowałaby niewielkie zakłócenia sygnału ze względu na różny współczynnik załamania stanu rozpuszczalnika podczas TIRF, który jest zwykle kalibrowany dla kątów TIRF dla wody nakrywkowej. Można to naprawić przez przemycie 1 mM Trolox wykonanym przez 10-krotne rozcieńczenie 10 mM Trolox przy użyciu wody dejonizowanej. Technika ta zapewnia wyraźniejsze obrazy, ale jest przydatna tylko do oceny, czy doszło do powstania, ponieważ wytwarza dwufazowe mikropęcherzyki w kanale przepływowym. W rezultacie, nanostruktury mogą być widoczne na styku dwóch faz, jak pokazano na Rysunek 4D.
  8. Przenieś kanał przepływu na uchwyt szkiełka i obraz za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w obrazowanie TIRF przy użyciu 60-krotnego obiektywu olejowego i 1,5-krotnej powiększy. Skanuj kanał przepływu przy powiększeniu 60x lub 90x, monitorując kanał Cy3 (patrz Rysunek 4).

6. Obrazowanie w transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM)

  1. Odważyć 0,5 g octanu uranylu w 50 ml wody destylowanej, aby przygotować 1% wodny roztwór barwienia octanu uranylu. Przefiltrować 1% wodny roztwór barwienia octanu uranylu za pomocą filtra 0,2 μm dołączonego do strzykawki.
    UWAGA: Alternatywnie, 2% wodny octan uranylu można kupić od komercyjnego producenta.
  2. Kup dostępne na rynku siatki miedziane powlekane warstwą nośną formvar o rozmiarze oczek 300.
    UWAGA: Ważne jest, aby pamiętać, że warstwa nośna formvar może zostać rozpuszczona przez rozpuszczalniki, takie jak DMSO, dłużej niż 2 minuty. W przypadku dłuższej inkubacji próbki dostępne są dostępne na rynku formwary stabilizowane tlenkiem krzemu na siatkach miedzianych, które pozwalają siatce być bardziej hydrofilową niż siatki powlekane węglem i mogą wytrzymać energiczne warunki próbki i wiązkę elektronów, jak pokazano na Rysunek 5C.
  3. Pipetować 4 μl próbki na siatkę przez 15 s. Użyj kawałka bibuły filtracyjnej, aby odsączyć próbkę, doprowadzając bibułę filtracyjną do kratki z boku.
  4. Natychmiast dodaj 4 μl roztworu plamy na siatkę na 5 s.
  5. Odsiąć plamę jak poprzednio i przytrzymać bibułę filtracyjną przy siatce przez 1–2 min, aby upewnić się, że siatka jest sucha. Próbki należy zazwyczaj obrazować w ciągu 1–2 godziny po barwieniu. Alternatywnie, jeśli kratka jest całkowicie sucha, kratki można przechowywać w skrzynce magazynowej siatki TEM do 3 dni przed obrazowaniem.
  6. Przenieś siatkę do uchwytu na próbki TEM i obraz za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego działającego pod napięciem 80 kV o powiększeniu w zakresie od 10 K do 150 K (patrz Rysunek 5).

7. Różne morfologie hybryd γPNA-DNA oparte na selektywnej wymianie na DNA

  1. Uzyskać oligomery DNA o określonych sekwencjach (patrz tabela 5) od komercyjnych producentów oligonukleotydów zsyntetyzowanych w skali 25 nmol przy użyciu standardowego odsalania. Ponownie zawiesić te sekwencje DNA za pomocą wody dejonizowanej wolnej od RNaz o stężeniach podstawowych 20 μM.
  2. W przypadku ciągłych zamienników nici γPNA z DNA, sekwencje D3, D5 i D9 mogą zastąpić nici p3, p5 i p9. Podobnie, w przypadku krzyżowych zamienników nici γPNA z DNA, sekwencje D1, D4 i D7 mogą zastąpić nici p1, p4 i p7.
  3. Podwielokrotność 1 μL z podzapasów 20 μM dla każdego oligomeru γPNA lub DNA i dodać do probówki PCR o pojemności 200 μl, jak w kroku 2.7. Dodać 30 μl bezwodnego DMSO i 1 μl wody dejonizowanej bez RNaz, aby uzyskać ostateczną objętość do 40 μl (patrz Tabela 6).
  4. Załaduj partie wyżarzania do termocyklera i wyżarzania, korzystając z protokołu wymienionego w kroku 4.2.
  5. Scharakteryzować hybrydowe nanostruktury γPNA-DNA za pomocą protokołu TIRF, wykonując kroki opisane w sekcji 5 lub korzystając z protokołu obrazowania TEM wymienionego w sekcji 6 (patrz Rysunek 6).

8. Różne morfologie nanowłókien γPNA w różnych stężeniach SDS

  1. Przygotuj główny zapas SDS 20% (wag./v), odmierzając 20 mg SDS i rozpuszczając go w 100 μl wody dejonizowanej.
  2. Przygotować subzapas SDS 6% (wt/v), podając 3 μl z 20% zapasu SDS i zwiększając objętość do 10 μl przy użyciu wody dejonizowanej.
  3. Wyżarzać oligomery γPNA w końcowych stężeniach 5,25 mM i 17,5 mM SDS w następujący sposób. Podwielokrotność 1 μL z zapasów 20 μM dla każdego oligomeru γPNA i dodanie go do probówki PCR o pojemności 200 μl, jak w kroku 2.7. Dodać 30 μl bezwodnego DMSO i 1 μl 6% i 20% SDS, aby uzyskać końcową objętość do 40 μl, aby osiągnąć końcowe stężenia SDS odpowiednio 5,25 mM i 17,5 mM (patrz tabela 7).
  4. Załadować partie wyżarzania o różnych stężeniach SDS do termocyklera i wyżarzania, korzystając z protokołu wymienionego w kroku 4.2.
  5. Scharakteryzować nanostruktury γPNA w obecności SDS za pomocą protokołu TIRF, wykonując czynności opisane w sekcji 5 lub korzystając z protokołu obrazowania TEM opisanego w sekcji 6 (patrz Rysunek 7).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokoły omówione w powyższych sekcjach opisują projekt zaadaptowanego motywu SST z nanowłókien DNA do solidnego generowania samoorganizujących się struktur nanowłókien przy użyciu wielu, odrębnych oligomerów γPNA. W tej sekcji opisano interpretację danych uzyskanych w wyniku pomyślnego odtworzenia opisanych protokołów.

Zgodnie z protokołem opisanym w sekcji 5 dla obrazowania TIRF próbek oligomerów γPNA wyżarzonych w 75% DMSO: H2O (v/v) najłatwiej dostarcza dowodów na dobrze zorgan...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niniejszy artykuł koncentruje się na adaptacji i ulepszaniu istniejących protokołów nanotechnologii kwasów nukleinowych w kierunku mieszanin rozpuszczalników organicznych. Opisane tutaj metody koncentrują się na modyfikacjach i rozwiązywaniu problemów w określonej przestrzeni eksperymentalnej wybranych polarnych aprotonowych rozpuszczalników organicznych. Istnieje jeszcze niezbadany potencjał dla innych uznanych protokołów nanotechnologii kwasów nukleinowych, które można zaadaptować w tej przestrzeni. Może to poprawić po...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była częściowo wspierana przez 1739308 grantów National Science Foundation, 1944130 grantów NSF CAREER oraz przez grant Biura Badań Naukowych Sił Powietrznych FA9550-18-1-0199. Sekwencje γPNA były hojnym darem od dr Tumula Srivastavy z Trucode Gene Repair, Inc. Chcielibyśmy podziękować dr Erikowi Winfree'owi i dr Rizalowi Hariadiemu za ich pomocne rozmowy na temat kodu DNA Design Toolbox MATLAB. Chcielibyśmy również podziękować Josephowi Suhanowi, Marze Sullivan i Center for Biological Imaging za ich pomoc w zbieraniu danych TEM.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
γ Nici/oligomery PNATrucode Gene Repair Inc.Sekcja 2.1
Spektrofotometr UV-VisAgilentVarian Cary 300Sekcja 3.1.2
Kuwety kwarcoweStarna29-Q-10Sekcja 3.1.1
TermocyklerBio RadC1000 touchSekcja 4.1
Probówki PCR 0,2 mlVWR53509-304Sekcja 4.5
Bezwodne DMFVWREM-DX1727-6Sekcja 4.6
Bezwodny DMSOVWREM-MX1457-6Sekcja 4.6
Bezwodny 1,4-dioksanFisher ScientificAC615121000Sekcja 4.6
10X sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)VWR75800-994Sekcja 3.1.1
Szkiełka mikroskopoweVWR89085-399Sekcja 5.2
Szkiełka nakrywkowe szklaneVWR48382-126Sekcja 5.2
2% kolodion w octanie amyluSigma-Aldrich9817sekcja 5.2
Octan izoamyluVWR200001-180sekcja 5.2
Biotynylowana albumina surowicy bydlęcej (Biotin-BSA)Sigma-AldrichA8549sekcja 5.3
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)Sigma-AldrichA2153sekcja 5.4
StreptawidynaSigma-Aldrich189730Sekcja 5.5
TroloxSigma-Aldrich238813Sekcja 5.7
Mikroskop fluorescencyjny z całkowitym wewnętrznym odbiciemNikonNikon Ti2-ESekcja 5.8
Transmisyjny mikroskop elektronowyJoelJEM 1011Sekcja 6.6
PęsetaDumont0203-N5AC-POSekcja 6.3
Octan uranyluElektron Nauki mikroskopowe22400Sekcja 6.1
Formvar, siatka 300, siatki miedzianeTed Pella Inc.1701-FSekcja 6.2
Tlenek krzemu formvar typu A, siatka 300, siatki miedzianeTed Pella Inc.1829Sekcja 6.2
Oligomery/nici DNAIDTSekcja 7.1
Dodecylosiarczan sodu (SDS)VWR97064-860Sekcja 8.1

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fu, T. J., Seeman, N. C. DNA double-crossover molecules. Biochemistry. 32 (13), 3211-3220 (1993).
  2. Winfree, E., Liu, F., Wenzler, L. A., Seeman, N. C. Design and self-assembly of two-dimensional DNA crystals. Nature. 394 (6693), 539-544 (1998).
  3. Shih, W., Quispe, J., Joyce, G. A 1.7-kilobase single-stranded DNA that folds into a nanoscale octahedron. Nature. 427 (6975), 618-621 (2004).
  4. Rothemund, P. W. K. Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns. Nature. 440 (7082), 297-302 (2006).
  5. He, Y., et al. Hierarchical self-assembly of DNA into symmetric supramolecular polyhedra. Nature. 452 (7184), 198-201 (2008).
  6. Douglas, S. M., Dietz, H., Liedl, T., Högberg, B., Graf, F., Shih, W. M. Self-assembly of DNA into nanoscale three-dimensional shapes. Nature. 459 (7245), 414-418 (2009).
  7. Andersen, E. S., et al. Self-assembly of a nanoscale DNA box with a controllable lid. Nature. 459 (7243), 73-76 (2009).
  8. Dietz, H., Douglas, S. M., Shih, W. M. Folding DNA into twisted and curved nanoscale shapes. Science. 325 (5941), 725-730 (2009).
  9. Han, D., et al. DNA origami with complex curvatures in three-dimensional space. Science. 332 (6024), 342-346 (2011).
  10. Liu, Y., Kumar, S., Taylor, R. E. Mix-and-match nanobiosensor design: Logical and spa421 tial programming of biosensors using self-assembled DNA nanostructures. WIREs Nanomedicne Nanobiotechnology. 10, 1518(2018).
  11. Chworos, A., et al. Building programmable jigsaw puzzles with RNA. Science. 306 (5704), 2068-2072 (2004).
  12. Delebecque, C. J., Lindner, A. B., Silver, P. A., Aldaye, F. A. Organization of intracellular reactions with rationally designed RNA assemblies. Science. 333 (6041), 470-474 (2011).
  13. Wang, X., Lim, H. J., Son, A. Characterization of denaturation and renaturation of DNA for DNA hybridization. Environmental health and toxicology. 29, 2014007(2014).
  14. Bonner, G., Klibanov, A. M. Structural stability of DNA in nonaqueous solvents. Biotechnology and Bioengineering. 68, 339(2000).
  15. Kumar, S., Pearse, A., Liu, Y., Taylor, R. E. Modular self-assembly of gamma-modified peptide nucleic acids in organic solvent mixtures. Nature Communications. 11 (1), 1-10 (2020).
  16. Barluenga, S., Winssinger, N. PNA as a biosupramolecular tag for programmable assemblies and reactions. Accounts of chemical research. 48, 1319-1331 (2015).
  17. Berger, O., Gazit, E. Molecular self-assembly using peptide nucleic acids. Peptide Science. 108, 22930(2017).
  18. Rothemund, P. W., et al. Design and characterization of programmable DNA nanotubes. Journal of American Chemical Society. 126, 16344-16352 (2004).
  19. Yin, P., et al. Programming DNA tube circumferences. Science. 321, 824-826 (2008).
  20. Yang, Y., et al. Self-assembly of DNA rings from scaffold-free DNA tiles. Nano Letters. 13, 1862-1866 (2013).
  21. Sahu, B., et al. Synthesis and characterization of conformationally preorganized, (R)-diethylene glycol-containing -peptide nucleic acids with superior hybridization properties and water solubility. Journal of Organic Chemisty. 76, 5614-5627 (2011).
  22. DNA Sequence Design Tools. , Available from: http://www.dna.caltech.edu/DNA_Sequence_Design_Tools/ (2020).
  23. Dirks, R. M., Lin, M., Winfree, E., Pierce, N. A. Paradigms for computational nucleic acid design. Nucleic Acids Research. 32 (4), 1392-1403 (2004).
  24. Sen, A., Nielsen, P. E. On the stability of peptide nucleic acid duplexes in the presence of organic solvents. Nucleic Acids Research. 35, 3367-3374 (2007).
  25. Yang, Z., Williams, D., Russell, A. J. Synthesis of protein-containing polymers in organic solvents. Biotechnology and Bioengineering. 45, 10-17 (1995).
  26. Coin, I., Beyermann, M., Bienert, M. Solid-phase peptide synthesis: from standard procedures to the synthesis of difficult sequences. Nature Protocols. 2, 3247(2007).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Gamma PNASelf AssemblyOrganic Solvent MixturesNanofiber ArchitecturesSingle Stranded TilesSodium Dodecyl SulfateTIRF ImagingTEM CharacterizationSolvent CompositionNanostructure Bundling

Related Articles