Artykuł metodologiczny

Zogniskowane ultradźwięki indukowane otwieraniem bariery krew-mózg w celu celowania w struktury mózgu i oceny neuromodulacji chemogenetycznej

4.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61352

⸱

22 grudnia 2020

 , 
1Department of Bioengineering, Rice University

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół określa kroki niezbędne do dostarczenia genu poprzez skoncentrowanie ultradźwięków na otwarciu bariery krew-mózg (BBB), ocenę wynikowej ekspresji genu oraz pomiar aktywności neuromodulacyjnej receptorów chemogenetycznych za pomocą testów histologicznych.

Streszczenie

Akustycznie ukierunkowana chemogenetyka (ATAC) pozwala na nieinwazyjną kontrolę określonych obwodów neuronalnych. ATAC osiąga taką kontrolę poprzez połączenie zogniskowanego ultradźwięków (FUS) indukowanego otwierania bariery krew-mózg (FUS-BBBO), dostarczania genów za pomocą wektorów wirusowych związanych z adenowirusem (AAV) oraz aktywacji sygnalizacji komórkowej za pomocą zmodyfikowanych, chemochemicznych receptorów białkowych i ich pokrewnych ligandów. Dzięki ATAC możliwa jest transdukcja zarówno dużych, jak i małych obszarów mózgu z milimetrową precyzją za pomocą jednej nieinwazyjnej aplikacji ultradźwiękowej. Ta transdukcja może później pozwolić na długotrwałą, nieinwazyjną, bezustrojową neuromodulację u swobodnie poruszających się zwierząt przy użyciu leku. Ponieważ FUS-BBBO, AAV i chemogenetyka były stosowane u wielu zwierząt, ATAC powinien być również skalowalny do stosowania u innych gatunków zwierząt. Niniejszy artykuł rozszerza wcześniej opublikowany protokół i nakreśla, jak zoptymalizować dostarczanie genów za pomocą FUS-BBBO do małych obszarów mózgu pod kontrolą MRI, ale bez potrzeby stosowania skomplikowanego urządzenia FUS kompatybilnego z MRI. Protokół opisuje również projekt komponentów do celowania i ograniczania myszy, które mogą być drukowane w 3D przez dowolne laboratorium i mogą być łatwo modyfikowane dla różnych gatunków lub niestandardowego sprzętu. Aby zwiększyć odtwarzalność, protokół szczegółowo opisuje, w jaki sposób mikropęcherzyki, AAV i nakłucie żyły zostały wykorzystane w rozwoju ATAC. Na koniec przedstawiono przykładowe dane, które mają pomóc we wstępnych badaniach z wykorzystaniem ATAC.

Wprowadzenie

Wykorzystanie technologii neuromodulacji specyficznych dla obwodów, takich jak optogenetyka1,2 i chemogenetics3,4,5, poszerzyło nasze zrozumienie stanów psychicznych jako zaburzeń obwodów neuronalnych. Obwody neuronalne są trudne do zbadania, a jeszcze trudniejsze do kontrolowania w leczeniu zaburzeń mózgu, ponieważ są zwykle definiowane przez określone typy komórek, regiony mózgu, molekularne szlaki sygnałowe i czas aktywacji. Idealnie nadaje się zarówno do zastosowań badawczych, jak i klinicznych, taka kontrola byłaby sprawowana nieinwazyjnie, ale osiągnięcie zarówno precyzyjnej, jak i nieinwazyjnej neuromodulacji jest wyzwaniem. Na przykład, podczas gdy leki neuroaktywne mogą docierać do mózgu nieinwazyjnie, brakuje im swoistości przestrzennej, działając w całym mózgu. Z drugiej strony, elektryczna stymulacja głębokiego mózgu może kontrolować określone obszary mózgu, ale ma trudności z kontrolowaniem określonych typów komórek i wymaga operacji oraz umieszczenia urządzenia6.

Akustycznie ukierunkowana chemogenetyka7 (ATAC) zapewnia neuromodulację ze specyficznością przestrzenną, komórkową i czasową. Łączy w sobie trzy techniki: skoncentrowane otwieranie bariery krew-mózg indukowane ultradźwiękami (FUS-BBBO) do celowania przestrzennego, wykorzystanie wektorów wirusowych związanych z adenowirusami (AAV) do nieinwazyjnego dostarczania genów pod kontrolą promotorów specyficznych dla typu komórki oraz zmodyfikowane receptory chemogenetyczne do selektywnego modulowania transfekowanych obwodów nerwowych poprzez podawanie leków. FUS to technologia zatwierdzona przez FDA, która wykorzystuje zdolność ultradźwięków do skupiania się głęboko w tkankach, w tym w ludzkim mózgu, z milimetrową precyzją przestrzenną. Przy dużej mocy FUS jest stosowany do nieinwazyjnej ablacji celowanej, w tym zatwierdzonego przez FDA leczenia drżenia samoistnego8. FUS-BBBO łączy ultradźwięki o niskiej intensywności z ogólnoustrojowo podawanymi mikropęcherzykami, które oscylują w naczyniach krwionośnych w ognisku ultradźwięków, powodując miejscowe, tymczasowe (6-24 h) i odwracalne otwarcie BBB9. To otwarcie pozwala na dostarczanie białek9,10, małych cząsteczek11 i wektorów wirusowych7,12,13,14 do mózgu bez znaczącego uszkodzenia tkanek u gryzoni10 i naczelnych innych niż ludzie15. Trwają badania kliniczne nad FUS-BBBO16,17, wskazując na możliwe zastosowania terapeutyczne tej techniki.

Dostarczanie genów wirusowych za pomocą AAV również szybko rozwija się w klinicznym zastosowaniu w zaburzeniach OUN, z ostatnimi zatwierdzeniami FDA i UE jako głównymi kamieniami milowymi. Wreszcie, receptory chemogenetyczne18, takie jak Designer Receptors Activated Exclusive by Designer Drugs (DREADDs), są szeroko stosowane przez neurobiologów do zapewnienia farmakologicznej kontroli nad pobudzeniem neuronów u zwierząt transgenicznych lub transfekowanych19,20. DREADD to receptory sprzężone z białkiem G (GPCR), które zostały genetycznie zmodyfikowane tak, aby reagować na syntetyczne cząsteczki chemogenetyczne, a nie endogenne ligandy, tak że ogólnoustrojowe podawanie tych ligandów zwiększa lub zmniejsza pobudliwość neuronów wykazujących ekspresję DREADD. Po połączeniu tych trzech technologii w ATAC można je wykorzystać do nieinwazyjnej modulacji wybranych obwodów neuronowych z precyzją przestrzenną, komórkową i czasową.

Tutaj rozszerzamy i aktualizujemy poprzednio opublikowany protokół dla FUS-BBBO11, włączając metodologię dokładnego celowania w regiony mózgu za pomocą FUS-BBBO u myszy przy użyciu prostego sprzętu do celowania wydrukowanego w 3D. Pokazujemy również zastosowanie FUS-BBBO do ATAC. Pokazujemy kroki niezbędne do dostarczenia AAV przenoszących receptory chemogenetyczne oraz ocenę ekspresji genów i neuromodulacji za pomocą histologii. Technika ta jest szczególnie przydatna do celowania w duże lub liczne regiony mózgu w celu ekspresji genów lub neuromodulacji. Na przykład duży obszar kory mózgowej może być łatwo transdukowany za pomocą FUS-BBBO i modulowany za pomocą chemogenetyki. Jednak dostarczenie genu za pomocą alternatywnej techniki, zastrzyków wewnątrzczaszkowych, wymagałoby dużej liczby inwazyjnych zastrzyków i kraniotomii. FUS-BBBO i jego zastosowanie, ATAC, mogą być skalowane do zwierząt o różnych rozmiarach, gdzie obszary mózgu są większe i trudniejsze do inwazyjnego celu.

Protokół

Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Kalifornijskiego Instytutu Technologii, gdzie dane zostały pierwotnie uzyskane przez J.O.S.

1. Projektowanie i druk 3D uprzęży dla zwierząt i sprzętu do prowadzenia obrazu

  1. Skorzystaj z plików ze strony Szablowski lab pod adresem: https://www.szablowskilab.org/downloads do druku 3D komponentów.
  2. Upewnij się, że materiał do drukowania ma niską podatność na rezonans magnetyczny, ale ma widoczne w rezonansie magnetycznym wsparcie. Szczegółowe informacje na temat użytych materiałów znajdują się w sekcji materiały i odczynniki.
  3. Weź pod uwagę degradację materiału przy wielu zastosowaniach, wielokrotnie testując materiał i obserwując miejsca zużycia, które powinny zostać wzmocnione. Upewnij się, że zadrukowane ścianki mają grubość co najmniej 2 mm.
  4. Używaj precyzyjnych drukarek 3D, aby poprawić precyzję celowania.
  5. Przeciwdziałaj grawitacji i innym siłom, aby uniknąć odchyleń plastikowych elementów drukowanych w 3D, podpierając komponenty wzdłuż ich długości i zwiększając grubość ścianek drukowanych w 3D, jeśli zaobserwuje się jakiekolwiek zginanie.
  6. Uwzględnij precyzję w wielu osiach, w tym przedniej/tylnej, przyśrodkowej/bocznej, grzbietowej/brzusznej, a także odchylenia, pochylenia i pochylenia.
  7. Przetestuj dokładność celowania, wykonując FUS-BBBO i rejestrując odchylenie od docelowej pozycji.
  8. Jeśli używasz zmotoryzowanych systemów stereotaktycznych, oceń wpływ dynamicznego ruchu na elastyczność materiału, nagrywając procedurę celowania FUS-BBBO na wideo i skoryguj wszelkie odchylenia, pogrubiając ścianki materiału wydrukowanego w 3D.

2. Opis systemu ultrasonograficznego

  1. Użyj systemu ultrasonograficznego z ośmioelementowym przetwornikiem pierścieniowym (średnica = 25 mm, naturalny punkt ogniskowy = 20 mm; apertura (F) = 0,8)) i połącz obudowę z głowicą za pomocą odgazowanego żelu ultradźwiękowego, nakładając żel na ogoloną głowę myszy.
    UWAGA: Częstotliwość środkowa przetwornika użytego w poprzednim badaniu7 wynosiła 1,5 MHz, czas trwania impulsu wynosił 10 ms, a częstotliwość powtarzania impulsów wynosiła 1 Hz przez 120 s. Ciśnienia były kalibrowane za pomocą hydrofonu światłowodowego i utrzymywane w zakresie 0,36-0,45 MPa. Załóżmy, że tłumienie akustyczne przez czaszkę wynosi 18%, klasa sup<="xref">21 dla częstotliwości 1,5 MHz i kości ciemieniowej. Zakres warunków odpowiednich dla bezpiecznego otwarcia BBB i dostawy AAV został szczegółowo opisany w innym miejscu7,14,22.

3. Przygotowanie zwierząt

  1. Znieczulić jedną mysz za pomocą inhalacji izofluranu w stężeniu 2% z powietrzem klasy medycznej. Sprawdź głębokość znieczulenia za pomocą szczypania dotykowego, aby potwierdzić brak odpowiedzi. Następnie nałóż maść okulistyczną, aby zapobiec wysuszeniu rogówki, używając jednorazowego sterylnego patyczka higienicznego, aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu tubki maści.
    UWAGA: Typowa procedura FUS-BBBO może trwać od 30 minut do 2 godzin, a znieczulenie musi być utrzymywane przez cały czas.
  2. Po znieczuleniu myszy umyj czysty cewnik heparynizowaną solą fizjologiczną (10 j./ml).
    UWAGA: Odpowiedni cewnik dla myszy o wadze 25-35 g posiada igłę 30 G i rurkę PE10.
  3. Następnie zdezynfekuj ogon myszy za pomocą podkładki z 70% etanolu. Umieść cewnik do żyły ogonowej w bocznej żyle ogonowej i zabezpiecz go klejem tkankowym. Obserwuj cofanie się krwi z żyły ogonowej do cewnika, aby potwierdzić jego umieszczenie.
  4. Ogol głowę myszy, a następnie użyj kremu do depilacji po wyschnięciu kleju tkankowego, aby zmniejszyć możliwość uwięzienia pęcherzyków powietrza pod żelem ultradźwiękowym podczas insonacji.
  5. Umieść mysz w wydrukowanym w 3D wózku MRI, montując przednie zęby na belce do gryzienia i głowę w stożku nosowym (Rysunek 1a).
  6. Wstrzyknąć podskórnie do 10 μl lidokainy w miejsce styku z nausznikami. Następnie przymocuj stępione pręty do czaszki i wywieraj bezpieczny nacisk, uważając, aby nie wywierać nacisku na tchawicę, ponieważ utrudnia to oddychanie. Obserwuj oddech przez 30 sekund, aby upewnić się, że zwierzę oddycha swobodnie z szybkością 1/s.
  7. Podłącz prowadnicę celowania do wkładek usznych, sprawdź oddech jak w kroku 3.6 (Rysunek 1b) i kontynuuj wizualne monitorowanie oddechu przez całą procedurę co minutę. Częstość oddechów podwyższona powyżej 1/s jest jedną ze oznak utraty znieczulenia. Kontynuuj monitorowanie reakcji na uszczypnięcie palca u nogi co 5 minut, gdy myszy nie znajdują się w skanerze MRI lub jeśli częstość oddechów jest podwyższona powyżej 1/s.
  8. Przenieś wózek MRI do uchwytu MRI, a następnie do wnętrza otworu magnesu.
    UWAGA: Konstrukcja sprzętu jest zoptymalizowana pod kątem cewki 72 mm wewnątrz 7T MRI.
  9. Uzyskaj sekwencję MRI, aby zlokalizować mysz w skanerze.
  10. Wybierz sekwencję szybkiego ujęcia 3D pod niskim kątem (FLASH), aby uzyskać cały mózg, korzystając z następujących parametrów, zgodnie ze szczegółowymi instrukcjami producenta urządzenia. Czas echa: 3,9 ms, Czas powtarzania: 15 ms, Kąt impulsu wzbudzenia: 15°, Rozmiar matrycy: 130 x 130 x 114, Rozdzielczość: 350 x 200 x 200 μm na woksel, Średnie: 1, Czas akwizycji: 3 min 42s
  11. Przesyłanie plików z systemu MRI do komputera sterującego systemem FUS.
  12. Otwórz sekwencję obrazowania w oprogramowaniu, aby wykonać celowanie pod kontrolą MRI, gdzie obraz powinien wyglądać tak, jak w Rysunek 1c.

4. Celowanie za pomocą rezonansu magnetycznego

UWAGA: Korzystając z specjalnie zaprojektowanych prowadnic celowania, nie jest konieczne umieszczanie przetwornika ultradźwiękowego w MRI, ani nie jest konieczne nacinanie skóry w celu wykonania celowania poprzez zerowanie stereotaksu na liniach bregma i lambda. Wykonaj poniższe czynności, aby przeprowadzić proces kierowania.

  1. Umieść karetkę w instrumencie stereotaktycznym. Zabezpiecz go na miejscu za pomocą metalowego bloku z taśmą dwustronną i dociskając wózek do dwóch słupków wsporczych instrumentu stereotaktycznego.
  2. Prześlij obrazy MRI do komputera z uruchomionym oprogramowaniem naprowadzającym FUS, wybierając pliki w menedżerze danych, klikając prawym przyciskiem myszy, aby wyświetlić opcje menu, i wybierając opcję "Przenieś natychmiast".
  3. Otwórz oprogramowanie naprowadzające FUS i załaduj obraz, klikając "Otwórz sekwencję" i wczytując wszystkie pliki sekwencji obrazowania.
  4. Sformatuj obraz do trzech osi, naciskając prawy przycisk myszy i "Formatuj".
  5. Zlokalizuj przetwornik w kołowym przewodniku celowania (Rysunek 1c), klikając prawym przyciskiem myszy.
  6. W widoku strzałkowym dostosuj pozycję pionową wirtualnego przetwornika, aby uwzględnić grubość kąpieli wodnej i obudowę przetwornika (w tym przypadku – 8,2 mm w górę, Rysunek 1d).
  7. Wskaż obszar(y), na który chcesz być skierowany(e) w planerze trajektorii i zanotuj współrzędne w arkuszu kalkulacyjnym (w tym przypadku – śródmózgowie, jak w Rysunek 1d).
  8. Wybierz żądaną głębokość kierowania (wartość z na trajektorii elektronicznej (Rysunek 2) i zanotuj współrzędne w arkuszu kalkulacyjnym.
  9. Namierz każdy z punktów, naciskając "Wyślij trajektorię" i "Wykonaj" (Rysunek 2).
    UWAGA: Odbywa się to, gdy uchwyt myszy jest umieszczony wewnątrz silników. Jednak to samo celowanie można osiągnąć z dużą dokładnością na instrumencie stereotaktycznym.
  10. Aby skorelować współrzędne rezonansu magnetycznego z ramką stereotaktyczną, umieść specjalnie zamontowany przetwornik na prowadnicy celowniczej i przesuwaj, aż każda z trzech celowniczych (Rysunek 3, element A) może przejść zarówno przez uchwyt przetwornika (Rysunek 3, element B), jak i prowadnicę celowania ( Rysunek 3, element C). Upewnij się, że nie są naprężone ani przechylone.
  11. Przesuń przetwornik o 10.56 mm do przodu w kierunku przednim/tylnym, aż znajdzie się w tym samym miejscu, w którym pojawia się środek prowadnicy celowniczej na rezonansie magnetycznym.
  12. Określ odległość od środka wirtualnego przetwornika (Rysunek 3a, element A) do docelowego obszaru (Rysunek 3a, element B) i przesuń przetwornik do tych współrzędnych za pomocą ramki stereotaktycznej.
  13. Przystąp do przygotowania roztworu do wstrzykiwań.

5. Przygotowanie roztworu do wstrzykiwań

UWAGA: Roztwory mikropęcherzyków są bardzo wrażliwe na ciśnienie. W związku z tym energiczne mieszanie lub szybkie wstrzykiwanie przez cienkie igły może spowodować zapadnięcie się mikropęcherzyków i zmniejszyć skuteczność otwierania BBB. Ponadto mikropęcherzyki są lżejsze od wody i mogą unosić się na górze rurki, cewnika lub strzykawki ( Rysunek 4), np. w automatycznym wstrzykiwaczu. Zdecydowanie zaleca się ponowne wymieszanie roztworu mikropęcherzyków bezpośrednio przed każdym wstrzyknięciem.

  1. Pobrać 0,8 ml soli fizjologicznej za pomocą strzykawki do probówki o pojemności 1,5 ml.
  2. Za pomocą strzykawki dodaj 0,1 ml środka kontrastowego MRI do tej samej probówki o pojemności 1,5 ml i wymieszaj.
  3. Przynieś nieaktywowany roztwór mikropęcherzyków23,24 do temperatury pokojowej.
  4. Tuż przed insonacją aktywuj mikropęcherzyki przez 45 s w urządzeniu do aktywacji mikropęcherzyków.
  5. Powoli (ponad ~3 s) pobrać 0,1 ml mikropęcherzyków za pomocą strzykawki tuberkulinowej o pojemności 1 ml i igły 21 G ze środkowej głębokości płynu.
  6. Dodać 0,08 ml mikropęcherzyków do roztworu środka kontrastowego i soli fizjologicznej przygotowanego w kroku 5.3. Mieszaj, stukając ręką przez 15 sekund.
  7. Przy końcowym stężeniu AAV wynoszącym 0,5-2 x10 10 cząstek wirusa na gram masy ciała (VP/g), należy wstrzyknąć ładunek do dostarczenia (w tym przypadku AAV9) przez igłę 30 G do cewnika do żyły ogonowej, w przypadku ATAC – AAV przenoszące receptory chemogenetyczne lub kontrolę negatywną, taką jak AAV przenoszące GFP pod tym samym promotorem.
  8. Ponownie mieszaj mikropęcherzyki ręcznie przez 15 sekund, aby uniknąć unoszenia się na wodzie (Rysunek 4).
  9. Bezpośrednio po tym należy odessać 200 μl roztworu mikropęcherzyków przez strzykawkę bez dołączonej igły. Brak igły zmniejszy siły ścinające działające na mikropęcherzyki.
  10. Odwrócić strzykawkę i wymieszać, naciskając tłok w górę i w dół.
  11. Przymocuj igłę 30 G i, nadal odwróconą, powoli wypchnij mikropęcherzyki, aż na końcu igły pojawią się kropelki.

6. Procedura insonacji

  1. Ustaw parametry insonacji: czas trwania impulsu 10 ms, 120 powtórzeń co s i nacisk 0,30-0,45 MPa na czaszkę.
  2. Wyjmij prowadnicę celowniczą i nałóż odgazowany żel ultradźwiękowy na głowę myszy, upewniając się, że nie tworzą się pęcherzyki.
  3. Opuść przetwornik i umieść go bezpośrednio na płasko na uchwycie paska dousznego i wybierz współrzędne do instrumentów stereotaktycznych (Rysunek 5).
  4. Wstrzyknąć roztwór AAV (0,5-2 x10 10 VP/g).
  5. Mieszaj mikropęcherzyki i roztwór środka kontrastowego MRI przez 15 s i wstrzyknij 80 μl na 30 g myszy.
  6. Natychmiast zastosuj ultradźwięki przez 120 sekund, naciskając "Wyślij" i "Wykonaj".
  7. Jeśli celem jest więcej niż jedna witryna, przesuń przetwornik do tej witryny i dostosuj kierowanie na głębokość zgodnie z poniższymi liczbami w arkuszu kalkulacyjnym z kroków 4.7–4.9. Następnie powtórz kroki 6,5-6,6 dla każdego miejsca insonowanego.

7. Ocena MRI otwarcia BBB

UWAGA: Ocena MRI otwarcia BBB została szczegółowo opisana w innym miejscu11. Lokalizacja otwarcia BBB może być wizualizowana jako jaśniejsze obszary u myszy, które otrzymały wstrzyknięcie środka kontrastowego Gd zależnego od T1.

  1. Po zastosowaniu ultrasonografu zapisz sekwencję MRI, jak w kroku 3.10.
  2. Wyjmij mysz ze skanera MRI i umieść ją w klatce rekonwalescencji, aby umożliwić powrót do zdrowia po znieczuleniu. Codziennie monitoruj myszy pod kątem oznak niepokoju, utraty wagi lub innych humanitarnych punktów końcowych. Skonsultuj się z personelem weterynaryjnym i wytycznymi IACUC w celu podjęcia jakiegokolwiek leczenia w przypadku wystąpienia nieoczekiwanych zdarzeń niepożądanych.

8. Stymulacja DREADD za pomocą ligandu chemogenetycznego

  1. Wybierz receptor chemogenetyczny. W przypadku DREADD wybierz receptor hM3Dq do aktywacji neuronów za pośrednictwem szlaków sprzężonych z Gq19, receptor hM4Di do hamowania aktywności neuronalnej poprzez szlaki sprzężone z Gi/o20, lub receptor KORD do aktywacji neuronów za pośrednictwem szlaków sprzężonych z Gs za pomocą ligandu Salvinorin-B25.
  2. Rozpuścić n-tlenek klozapiny (CNO) w sterylnym roztworze soli fizjologicznej o stężeniu 1 mg/ml. Przechowywać podany CNO w temperaturze -20 °C.
  3. Podawać CNO19, lub inny ligand chemogenetyczny26,27,28, drogą dootrzewnową w stężeniu między 0,3 – 10 mg/kg.
  4. Jeśli ma być rejestrowany wpływ CNO na zachowanie, rozpocznij rejestrowanie aktywności behawioralnej w ciągu 15-45 minut po podaniu leku, aby osiągnąć maksymalną aktywację DREADDs19.
  5. Jeśli pożądana jest analiza aktywacji neuronów, należy użyć myszy do oceny histologicznej po 60-120 minutach od wstrzyknięcia.
  6. Przystąpić do eutanazji przez perfuzję serca (patrz punkt 9).

9. Ocena histologiczna ekspresji genów i aktywacji chemogenetycznej

UWAGA: Po osiągnięciu eksperymentalnego punktu końcowego (np. koniec badania behawioralnego, czas potrzebny do ekspresji genu) kluczowe jest potwierdzenie lokalizacji i obecności ekspresji genu.

  1. Po aktywacji ligandem chemogenetycznym wykonaj perfuzję serca w celu zachowania tkanek.
    1. Znieczulić mysz mieszaniną ketaminy (100 mg/kg) / ksylazyny (10 mg / kg) w sterylnym roztworze soli fizjologicznej przez wstrzyknięcie IP. Potwierdź znieczulenie szczyptą palca u nogi i upewnij się, że częstość oddechów została obniżona do około 1/s. Zapewnij wsparcie termiczne przez poduszkę grzewczą do momentu potwierdzenia eutanazji.
    2. Przygotować 10% neutralną buforowaną formalinę (NBF) i PBS z 10 jednostkami heparyny na ml.
      UWAGA: Roztwory powinny mieć temperaturę 4 °C.
    3. Wlać każdy bufor do oddzielnych probówek o pojemności 50 ml i podłączyć, a następnie zalać pompę perystaltyczną podłączoną do cewnika motylkowego 25 G roztworem PBS/heparyny.
    4. Przymocuj kończyny do chłonnej niebieskiej podkładki z taśmą i upewnij się, że zwierzę jest ułożone w pozycji leżącej na podkładce. Zdezynfekuj futro, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego narządów obwodowych w przypadku konieczności ich pobrania.
    5. Otwórz jamę otrzewnej przez poprzeczne nacięcie, odsłaniając przeponę.
    6. Otwórz klatkę piersiową przez dwa nacięcia nożyczek chirurgicznych wzdłuż osi przedniej / tylnej.
    7. Odsłonić serce i umieścić igłę w lewej komorze (prawa strona serca, patrząc na wznak) i umieścić w cewniku motylkowym w kroku 9.1.3.
    8. Wykonaj małe nacięcie w prawej komorze, aby umożliwić odpływ krwi.
    9. Włącz pompę perystaltyczną, aby rozpocząć wypłukiwanie krwi za pomocą PBS/heparyny.
      UWAGA: Jeśli ten krok nie zostanie wykonany odpowiednio, krew będzie krzepnąć podczas utrwalania formaliną i uniemożliwi odpowiednią perfuzję.
    10. Po wypłukaniu całej krwi i rozpoczęciu wypływania czystego PBS z prawej komory, przełącz wlot pompy perystaltycznej na roztwór NBF i rozpocznij perfuzję przez 25 ml na mysz.
    11. Pobrać mózg, umieścić w co najmniej 4 ml NBF i post-fix na 24 godziny.
  2. Podziel mózg za pomocą skrawków koronalnych na wibratomie o grubości 50 μm.
  3. Umieść każdą sekcję w studzience na 24-dołkowej płytce, w której przechowuje się sekcje w całym mózgu.
  4. Oceń ekspresję receptorów chemogenetycznych połączonych z białkami fluorescencyjnymi (np. mCherry lub mCitrine) pod mikroskopem fluorescencyjnym, aby zidentyfikować odcinki wykazujące ekspresję w celu potwierdzenia lokalizacji. Wyraz twarzy prawdopodobnie będzie przyćmiony.
  5. Przeprowadzić barwienie immunologiczne przeciwko fluoroforowi, stosując następujący protokół:
    1. Umieścić 3 skrawki w 0,5 ml roztworu zawierającego 10% surowicy gospodarza przeciwciała drugorzędowego i inkubować przez 30 minut.
    2. Przenieść skrawki do roztworu przeciwciała pierwszorzędowego w rozcieńczeniu 1:250 – 1:1,000, przyjmując jako punkt wyjścia 1:500.
    3. Skrawki inkubować z przeciwciałem pierwszorzędowym przez noc w temperaturze 4 °C na mikropłytce uszczelnionej folią parafinową.
    4. Umyj sekcje PBS, 3x przez 5 minut na raz.
    5. Dodać 0,5 ml na studzienkę roztworu przeciwciał drugorzędowych w 10% surowicy.
    6. Inkubować przez 4 godziny w temperaturze pokojowej.
    7. Umyj sekcje PBS, 3x przez 5 minut na raz.
    8. Zamontować na szkiełkach z wodnym medium montażowym zawierającym plamę jądrową (np. DAPI).
  6. Oceń lokalizację i rozprzestrzenianie się za pomocą mikroskopu konfokalnego, wykonując skan kafelkowy całego przekroju.
  7. Oceń intensywność ekspresji, mierząc intensywność pikseli fluorescencyjnych w docelowych obszarach mózgu i porównaj z kontrolą wstrzykniętą doczaszkowo.
  8. Alternatywnie, oceń procent dodatnich neuronów, licząc komórki barwione przez receptory chemogenetyczne, w porównaniu z komórkami DAPI-dodatnimi lub markerami specyficznymi dla komórki.
  9. Oceń uszkodzenie tkanki, wykonując barwienie hematoksyliną na odcinku 50 μm i obrazując pod kątem utraty komórek, nagromadzenia resztek komórek i innych oznak poważnych uszkodzeń.
  10. Aby ocenić swoistość celowania w komórkę, należy wykonać podwójne barwienie immunologiczne, jak opisano poniżej dla receptora chemogenetycznego i markera specyficznego dla komórki. Następnie wykonaj liczenie komórek dodatnich, jak w kroku 9.8.
    1. Umieścić 3 skrawki w 0,5 ml roztworu zawierającego 10% surowicy gospodarza przeciwciała drugorzędowego i inkubować przez 30 minut.
    2. Przenieść skrawki do roztworu pierwszorzędowego przeciwciała przeciwko markerowi fluorescencyjnemu receptorów chemogenetycznych w rozcieńczeniu 1:250 – 1:1,000, przyjmując 1:500 jako punkt wyjścia. Dodaj drugie przeciwciało pierwszorzędowe z innego gatunku gospodarza, które jest ukierunkowane na marker specyficzny dla komórki (np. CamkIIa).
    3. Skrawki inkubować z przeciwciałem pierwszorzędowym przez noc w temperaturze 4 °C w mikropłytce uszczelnionej folią parafinową.
    4. Umyj sekcje PBS, 3x przez 5 minut na raz.
    5. Dodać 0,5 ml na studzienkę roztworu przeciwciał drugorzędowych w 10% surowicy gatunków gospodarzy obu przeciwciał drugorzędowych.
      UWAGA: Każde przeciwciało powinno mieć odrębny fluorofor i powinno być reaktywne przeciwko przeciwciałom pierwszorzędowym w kroku 9.10.2.
    6. Inkubować przez 4 godziny w temperaturze pokojowej.
    7. Umyj sekcje PBS, 3x przez 5 minut na raz.
    8. Zamontuj na szkiełkach i przymocuj wodnym medium montażowym zawierającym plamę jądrową.

10. Oceń aktywację neuronów za pomocą barwienia immunologicznego dla c-Fos

  1. Przeprowadzić barwienie c-Fos zgodnie z ppkt 9.5 niniejszego protokołu, używając przeciwciała pierwszorzędowego c-Fos i przeciwciała drugorzędowego ze znacznikiem fluorescencyjnym innym niż barwienie jądrowe.
  2. Policz procent komórek, które są dodatnie zarówno dla c-Fos, jak i barwienia jądrowego w obszarze docelowym dla receptora chemogenetycznego.
  3. Przeanalizuj procent jąder c-Fos dodatnich w grupie myszy wykazujących ekspresję receptorów chemogenetycznych i traktowanych ligandem chemogenetycznym lub kontrolą nośnika oraz w grupie myszy typu dzikiego, które są traktowane ligandem chemogenetycznym lub kontrolą nośnika.

Wyniki

Pierwszym krokiem wykonywania protokołu ATAC jest skierowanie FUS-BBBO do pożądanych obszarów mózgu. Na przykład, zgodnie z opisanym protokołem, hipokamp został poddany działaniu FUS-BBBO, a następnie do myszy wstrzyknięto środek kontrastowy oraz AAV9 niosący DREADDs, po czym wykonano sekwencję szybkiej trójwymiarowej MRI (FLASH), uzyskując obrazy mózgu myszy. W obszarze hipokampu (Rycina 6) oraz w innych częściach mózgu (Rycina 7) zaobserwowano wzmocnienie sygnału T1. Po kilku tygodniach DREADDs były wyrażane w docelowym obszarze mózgu. Choć wiele DREADDs jest połączonych z fluorescencyjnym raporterem (np. mCherry), stwierdzono, że proces perfuzji i utrwalania za pomocą formaldehydu drastycznie zmniejsza fluorescencję tych białek. Immunohistochemiczne barwienie przeciwko mCherry lub DREADD umożliwiło bardziej wiarygodne wykrycie ekspresji (Rycina 8), co oparto na wcześniejszych doświadczeniach. W poprzednich eksperymentach u około 85% myszy zaobserwowano ekspresję po zastosowaniu FUS-BBBO7. Prostym testem wystarczającego poziomu ekspresji DREADDs jest sprawdzenie ich funkcjonalności na poziomie komórkowym. Można to zrobić, na przykład, poprzez podanie liganda chemicznego lub kontrolnego roztworu soli fizjologicznej, takiego jak CNO19, deschloroclozapina28 lub innych29, a następnie odczekanie 2 godziny przed perfuzją serca i utrwaleniem. Przekroje mózgu poddano następnie współimmunobarwieniu na białko c-Fos30, wskazujące na zwiększoną aktywność neuronów, oraz na DREADD. Eksperyment uznawano za udany, jeśli w miejscu mózgu, w którym wprowadzono DREADDs, stwierdzono istotnie większą liczbę jąder neuronowych dodatnich dla c-Fos w grupie, która otrzymała ligand chemiczny, w porównaniu z grupą, która otrzymała roztwór soli fizjologicznej7, lub w porównaniu z miejscem kontralateralnym, które nie było poddane działaniu FUS-BBBO. Warto zaznaczyć, że niektóre z tych ligandów mogą aktywować neurony nieswoiście, bez ekspresji DREADDs. Na przykład wykazano, że CNO ulega metabolizacji do niskich stężeń klozapiny u myszy, która przenika przez BBB i aktywuje DREADDs z dużą skutecznością27. Jednakże stwierdzono również, że może on wiązać się z nieswoimi miejscami. Jak w każdym eksperymencie, kluczowe jest uwzględnienie wszystkich odpowiednich kontroli w badaniach chemicznych31. Jedną z możliwych kontroli jest podanie liganda chemicznego myszom typu dzikiego, bez dodatkowych zabiegów, w celu wykluczenia efektów samego leku na pożądany test behawioralny lub histologiczny. Inną kontrolą może być uwzględnienie czterech grup: DREADD + ligand, DREADD + nośnik, EGFP + ligand, EGFP + nośnik, co pozwoli uwzględnić wszelkie potencjalne efekty zarówno dostarczenia genu za pomocą FUS-BBBO, jak i liganda chemicznego.

Układ do obrazowania ultradźwiękowego i analiza; diagram przedstawia geometrię skanowania oraz wyniki danych dla badania tkanki.
Rysunek 1: Proces celowania w skupieniu FUS pod kontrolą MRI w modelu ATAC. (a) Umieszczenie myszy z użyciem uchwytów do uszu, maski nosowej i platformy, którą można umieścić wewnątrz skanera MRI. (b) Drukowany w 3D prowadnik (niebieski), widoczny w obrazowaniu MRI, przymocowany do końców ramy uchwytów do uszu, a następnie ustalony w pozycji za pomocą uchwytu powierzchniowej cewki MRI zawierającej cztery śruby zatrzaskowe (półprzezroczysty niebieski). (c) Wygląd drukowanego w 3D prowadnika na obrazie strzałkowym MRI (lewy panel), przy czym dolna krawędź wirtualnej reprezentacji przetwornika (żółty półokrąg) jest wyrównana z dolną krawędzią prowadnika. Prawy panel pokazuje wygląd drukowanego w 3D prowadnika na obrazie czołowym MRI. Jasny okrąg wykonany jest z materiału podporowego PolyJet, który wykazuje silny kontrast w MRI. Krzyż został wykonany z plastiku. Żółty okrąg oznacza położenie przetwornika, które zostało ustawione współśrodkowo z prowadnikiem wewnątrz ramy stereotaksyjnej. (d) Aby celować w struktury mózgu, wirtualny przetwornik przesuwano w kierunku z nad myszą, by dostosować go do grubości stożka / obudowy ultradźwięków. W tym przypadku, ze względu na grubość łaźni wodnej, przetwornik przesunięto o 8,2 mm powyżej prowadnika w celu dokładnego celowania. Struktury mózgu wybrano na podstawie danych obrazowania MRI, a następnie zapisano ich współrzędne MRI i wprowadzono do urządzenia stereotaksyjnego. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Diagram ustawienia celowania stereotaksycznego; trajektoria mechaniczno-elektroniczna; analiza współrzędnych.
Rysunek 2: Interfejs używanego oprogramowania. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Schemat systemu z transducerem prowadzonym przez MRI z ustawieniem śrub celujących do precyzyjnej nawigacji i wyrównania.
Rycina 3: Proces dopasowania przestrzeni współrzędnych MRI do urządzenia stereotaksyjnego. (a) Trzy otwory w uchwycie transduceru zostały wyrównane z trzema otworami w prowadnicy MRI, a następnie włożono trzy stożkowe śruby celujące, nie powodując przy tym wygięcia całego zestawu. (b) W idealnym przypadku wszystkie trzy śruby powinny znajdować się dokładnie w środku otworów. (c) Jeśli występuje jakakolwiek niedokładność w wyrównaniu, nie wszystkie trzy śruby będą pasować — na przykład przy niewielkim, najprawdopodobniej niezauważalnym odchyleniu (yaw) o 1°, tylko jedna śruba wejdzie, podczas gdy przeciwległe śruby utkną w prowadnicy MRI. Alternatywnie, może być widoczne wygięcie całego zestawu, gdy śruby są wciskane siłą. (d) Powiększony widok dopasowania śruby. Śruby powinny być umieszczone koncentrycznie, aby osiągnąć największą dokładność. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Diagrama końcówki strzykawki, obserwacja dynamiki płynów, prezentująca obecność pęcherzyków i analizę wzorców przepływu.
Rysunek 4: Szybka relokacja mikropęcherzyków wewnątrz strzykawki. (a) Zdjęcie strzykawki wykonano 5 s po zmieszaniu. (b) Po upływie minuty widoczna była wyraźna warstwa, w której część pęcherzyków skupiła się w pobliżu górnej części strzykawki tuberkulinowej o pojemności 1 mL. W szczególności w tym przykładzie zastosowano roztwór mikropęcherzyków. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

diagram ustawienia pomiarowego optycznego do badań spektroskopii absorpcji przejściowej z zastosowaniem niestandardowych uchwytów.
Rycina 5: Proces umieszczania środka przetwornika nad środkiem nakładki MRI. (a) W modelach pokazanych w niniejszym artykule, czerwony nośnik został zaprojektowany tak, aby przesunąć się o 10,56 mm do przodu z pozycji pokazanej na Rycinie 3b do pozycji pokazanej tutaj. (b) Nakładkę MRI (niebieską) usunięto przed sonikacją, a żel ultradźwiękowy nałożono pomiędzy myszą a przetwornik (pomarańczowy), aby zapewnić przejście fal ultradźwiękowych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Seria obrazów rezonansu magnetycznego mózgu ilustrujących wykrywanie zmian; widok czołowy; analiza obrazowania diagnostycznego.
Rysunek 6: Wizualizacja otwarcia BHE metodą MRI. (a) Widok przekroju poprzecznego otwarcia BHE. Jasniejszy obszar oznaczony grotem strzałki pokazuje wyciek środka kontrastującego T1 w MRI. (b) Widok czołowy grzbietowego hipokampa i kory nad hipokampem, które zostały poddane FUS-BHE (groty strzałek). (c) Widok czołowy środkowego hipokampa poddanego FUS-BHE (groty strzałek). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Badanie mózgu metodą MRI; obraz anatomii osiowej mózgu; w odcieniach szarości; badania z zakresu neurobiologii.
Rycina 7: Przykład celowania w cztery obszary mózgu przy użyciu systemu celowania z trzema śrubami opisanego w niniejszym artykule. Obszary oznaczone grotami strzałek wykazały miejsca otwarcia bariery krew–mózg towarzyszone dyfuzją środka kontrastowego stosowanego w MRI. Cztery miejsca zostały celowane kolejno, z odstępem około 150 s między kolejnymi otwarciemi bariery krew–mózg, od dołu do góry. Obraz został wykonany w ciągu 2 minut po ostatnim otwarciu bariery krew–mózg. Skala odpowiada 2 mm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Analiza przekrojów mózgu, immunodetekcja mCherry i fluorescencja, obraz mikroskopowy, wyniki porównawcze.
Rycina 8: Wykrywanie ekspresji DREADD.  (a) Immunodetekcja fluoroforu przyłączonego do DREADD, w tym przypadku mCherry, była wiarygodną metodą wykrywania w niektórych badaniach. (b) W innym reprezentatywnym przekroju, w którym DREADD zostały skierowane do hipokampa w tych samych warunkach co w (a), fluorescencja samego mCherry wywołała silne tło i stosunkowo słaby sygnał. (c) Jako kontrolę ujemną użyto myszy, której podano iniekcję ogólnoustrojową AAV, ale nie przeprowadzono FUS-BBBO. Nie stwierdzono istotnej ekspresji metodą immunodetekcji mCherry. Sztaby skali mają długość 500 mm. (Dane w a, c zmodyfikowane na podstawie7 z pozwoleniem, Copyright 2020 Nature-Springer). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

ATAC wymaga pomyślnego wdrożenia kilku technik skutecznej neuromodulacji określonych obwodów neuronalnych, w tym dokładnego celowania pod kontrolą MRI, FUS-BBBO i histologicznej oceny ekspresji genów. Komponenty do druku 3D zostały opracowane, aby uprościć celowanie w małe struktury mózgu za pomocą FUS-BBBO sterowanego obrazowaniem.

Wykonywanie zogniskowanych ultradźwięków pod kontrolą rezonansu magnetycznego (MRIgFUS) wiąże się z szeregiem wyzwań. Po pierwsze, typowa cewka MRI ma ograniczoną przestrzeń, która jest zaprojektowana tak, aby pomieścić tylko próbkę, a nie sprzęt ultrasonograficzny. Większe otwory rezonansu magnetycznego zwiększają koszt sprzętu i obniżają jakość obrazu, ponieważ sygnał jest powiązany ze współczynnikiem wypełnienia cewki32. W związku z tym każdy sprzęt FUS umieszczony na obrazie zwierzęcia w rezonansie magnetycznym pogorszy jakość obrazowania. Po drugie, projektowanie urządzeń kompatybilnych z rezonansem magnetycznym jest trudne i kosztowne. Materiały kompatybilne z MRI muszą być diamagnetyczne, mieć niską skłonność do tworzenia prądów wirowych podczas napromieniowania o częstotliwości radiowej i mieć niską podatność magnetyczną w silnych polach magnetycznych. W każdym materiale przewodzącym powstawanie prądów wirowych lub jego podatność magnetyczna również negatywnie wpłynie na jakość obrazowania. Wreszcie, dostępne materiały kompatybilne z MRI mają niższe moduły Younga i trwałość niż metale zwykle używane do produkcji precyzyjnych maszyn celowniczych, np. ramek stereotaktycznych. Silniki używane do regulacji położenia muszą być kompatybilne z rezonansem magnetycznym i umieszczone poza otworem rezonansu magnetycznego ze względu na ich rozmiar. Silniki te muszą być podłączone w pewnej odległości od przetwornika wewnątrz otworu MRI przy użyciu materiałów kompatybilnych z MRI. Problemy z wypaczaniem się tworzywa sztucznego, brak wystarczającej ilości miejsca w otworze, aby zaimplementować elementy o solidnych rozmiarach oraz niewystarczająca ilość miejsca na zmianę pozycji celowania w całym mózgu, wpłynęły na dokładność celowania w poprzednich pracach.

Aby rozwiązać te problemy, podjęto decyzję o wykonaniu obrazowania w rezonansie magnetycznym i podawaniu FUS-BBBO poza skanerem. Aby umożliwić prowadzenie MRI, myszy umieszczono w wydrukowanym w 3D ograniczniku, który miał widoczny dla MRI przewodnik celowania, który można było wykorzystać do zlokalizowania struktur mózgu myszy zarówno w MRI, jak iw przestrzeni współrzędnych stereopodatkowych. Ponieważ zarówno czaszka myszy, jak i prowadnica celownicza są mocno przymocowane do uchwytów paska na uszy (rysunek 1a,b), prowadnica celowania może być użyta do skorelowania współrzędnych przestrzennych w obrazie MRI i wyzerowania instrumentów stereotaktycznych. Ogranicznik nie ma ruchomych części i nie zawiera przetwornika, co pozwoliło nam uczynić go zarówno wytrzymałym, jak i wystarczająco małym, aby zmieścić się w rezonansie magnetycznym i usunąć zakłócenia sygnału z elektroniki przetwornika. Przestrzeń wewnątrz prowadnicy celowania została wydrążona, ponieważ wydrukowane w 3D wsparcie dla niektórych materiałów jest widoczne w rezonansie magnetycznym (rysunek 1c). Otwory w zespole zostały wprowadzone, aby umożliwić kalibrację stereotax (rysunek 3). Przetwornik ultradźwiękowy podłączono do uchwytu elektrody stereotax, a celowanie przeprowadzono zgodnie z opisem w sekcji 4 (ryc. 1d). Przetwornik powinien być podparty na całej swojej długości przez obudowę listew usznych, zapobiegając wszelkim odchyleniom od płaszczyzny poziomu. Celowanie w kierunku grzbietowo-brzusznym można osiągnąć za pomocą przesunięć fazowych w układzie pierścieniowym.

Praktyczna precyzja celowania zależy od ogniskowania ultradźwiękowego i tłumienia czaszki. Procedura FUS-BBBO została szczegółowo opisana dla szczurów11 i została wdrożona w szeregu innych organizmów modelowych 23,33,34 oraz u ludzi16,17. Zależność między wielkością ogniska ultradźwięków jest odwrotnie proporcjonalna do częstotliwości, gdzie wyższe częstotliwości mogą skutkować bardziej precyzyjnym dostarczaniem. Jednak tłumienie czaszki wzrasta wraz z częstotliwościami35, co może prowadzić do rozgrzania czaszki i uszkodzenia obszarów korowych. Dokładna strategia kierowania będzie zależeć od miejsca w mózgu. Miejsca, w których w tkance mózgowej mieści się połowa maksymalnego ciśnienia o pełnej szerokości, pozwalają na przewidywalne i bezpieczne otwarcie BBB w wielu strukturach mózgu, takich jak prążkowie, śródmózgowie i hipokamp. Regiony w pobliżu podstawy mózgu stanowią szczególne wyzwanie u myszy. Mózg myszy mierzy około 8-10 mm w kierunku grzbietowo-brzusznym, co jest porównywalne z połową maksymalnego rozmiaru na całej szerokości wielu dostępnych na rynku przetworników. W związku z tym celowanie w dno czaszki może prowadzić do odbicia ultradźwięków od kości i powietrza obecnego w kanałach słuchowych, jamie ustnej lub tchawicy, co może prowadzić do nieprzewidywalnych wzorców wysokiego i niskiego ciśnienia36. Niektóre z tych ciśnień mogą przekroczyć próg kawitacji bezwładnościowej, który, jak wykazano, powoduje krwawienie i uszkodzenie tkanek37. Aby celować w regiony, które znajdują się w pobliżu podstawy czaszki, może być lepsze użycie intersekcjonalnego ATAC7, gdzie genetyka intersekcjonalna38 jest stosowana w celu ograniczenia ekspresji genów do mniejszego obszaru niż ten, na który celuje się wiązką FUS. W opublikowanym przykładzie intersekcjonalnego ATAC, transgeniczne zwierzę wyrażające enzym edytujący geny (Cre38) w komórkach dopaminergicznych zostało poddane ultradźwiękom w podsekcji regionu zawierającego komórki dopaminergiczne. Wreszcie, obszary korowe mogą być celowane za pomocą FUS, ale może wystąpić dyfrakcja i odbicie ultradźwięków, co prowadzi do nierównych profili ciśnienia. Protokół ten nie obejmuje celowania w regiony kory mózgowej, ponieważ będzie to w dużym stopniu zależało od użytych gatunków; jednak zaobserwowano pewne celowanie w korę powyżej hipokampa7 (np. Ryc. 7), co wskazuje, że przynajmniej u myszy jest to możliwe.

Wybór aktywatora chemogenetycznego i dawkowanie będzie zależało od konkretnych potrzeb eksperymentalnych. W wielu badaniach, w tym w jednym z badań autorów7, nie wykazano istotnej odpowiedzi nieswoistej39,40, podczas gdy wyższe dawki (np. 10 mg/kg) mogą powodować działania niepożądane, przynajmniej w niektórych przypadkach41. Jednak, podobnie jak w przypadku wszystkich eksperymentów behawioralnych, odpowiednie kontrole31 są niezbędne ze względu na potencjalną nieukierunkowaną aktywność CNO i jego metabolitów42. Takie kontrole mogą obejmować podawanie CNO i kontroli soli fizjologicznej zwierzętom wykazującym ekspresję DREADD oraz podawanie CNO zwierzętom typu dzikiego lub, w niektórych szczególnych przypadkach, porównanie ipsi- i przeciwległych miejsc w mózgu, które odpowiednio wykazują i nie wykazują ekspresji receptorów chemogenetycznych. Dodatkowo, ostatnie badania ujawniły szereg nowych agonistów DREADD o ulepszonej swoistości 28,29,43. Inne receptory chemogenetyczne 5,25,44 mogą być również stosowane w połączeniu z procedurą ATAC.

Ocena histologiczna ekspresji genów jest konieczna post mortem dla każdego zwierzęcia. Niewielka część zwierząt wykazuje słabą ekspresję genów po FUS-BBBO7. Dodatkowo konieczne jest wykazanie dokładności przestrzennej i swoistości ekspresji genów, ponieważ możliwe jest błędne ukierunkowanie. Warto zauważyć, że niektóre AAV mogą wykazywać zdolność śledzenia wstecznego lub następczego45 i mogą powodować transfekcję daleko od miejsca, w którym znajdują się dane ultrasonograficzne, pomimo dokładnego celowania ultrasonograficznego. Jeśli wyrażony receptor chemogenetyczny jest połączony z fluoroforem lub ulega jego współekspresji, obrazowanie fluoroforu w skrawkach tkanki może być wystarczające do oceny lokalizacji i intensywności ekspresji. Jednak wiele białek fluorescencyjnych ulega uszkodzeniu w procesie utrwalania tkanek, a barwienie immunologiczne białka mCherry, które jest często stosowane z DREADDs, dało lepszy sygnał w poprzednich badaniach7. Wreszcie, ze względu na gęstość neuronów w niektórych częściach mózgu (np. ziarnista warstwa komórkowa w hipokampie), użycie fluoroforów zlokalizowanych jądrowo wyrażanych w IRES, w przeciwieństwie do fuzji, do przeprowadzenia liczenia komórek może być korzystne, ponieważ jądra można łatwo segmentować i przeciwbarwić za pomocą barwników jądrowych, takich jak DAPI lub TO-PRO-3. Aby ocenić neuromodulację przez barwienie c-Fos, konieczne jest wykonanie barwienia przeciwjądrowego i zliczenie jąder c-Fos dodatnich, a nie jakiegokolwiek sygnału fluorescencyjnego. W niektórych przypadkach szczątki komórkowe mogą wykazywać fluorescencję i zakłócać pomiary komórek dodatnich.

Ograniczenia w dostarczaniu leku i genów za pomocą FUS-BBBO obejmują niższą rozdzielczość niż w przypadku dostarczania za pomocą inwazyjnych wstrzyknięć wewnątrzczaszkowych oraz potrzebę większych ilości wstrzykiwanych leków lub wektorów wirusowych. Dodatkowo, podczas gdy bezpośrednie wstrzyknięcie do mózgu powoduje wyłączne dostarczenie do miejsca wstrzyknięcia, FUS-BBBO wykorzystuje drogę dożylną, co umożliwia dostarczenie do tkanek obwodowych. Ograniczenia stosowania chemogenetyki do neuromodulacji obejmują powolną skalę czasową, która może być nieadekwatna do niektórych protokołów behawioralnych, które wymagają szybkich zmian intensywności neuromodulacji.

Oświadczenia

Brak konfliktu interesów.

Podziękowania

To badanie było wspierane przez Brain and Behavior Foundation, NARSAD Young Investigator Award. Kilka elementów drukowanych w 3D zostało pierwotnie zaprojektowanych przez Fabiena Rabusseau (Image Guided Therapy, Francja). Autor dziękuje Johnowi Heathowi (Caltech) i Margaret Swift (Caltech) za pomoc techniczną w przygotowaniu manuskryptu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Igły o rozmiarze 21 (BD)Fisher Scientific14826C
rozmiarze 25 Igły30 mm Harvard Bioscience725966
BD)Fisher Scientific14826F
Chłonna niebieska podkładkaOffice Depot902406
Przeciwciało anty-c-FosSanta Cruz BiotechnologySC-253-G
Przeciwciało anty-mCherryThermofisherPA534974
Bruker Biospec 70/30Brukerniestandardowyzawiera cewki RF
Tlenek klozapinyTocris4936
Specjalnie zaprojektowane uprzęże myszy drukowane w 3D i komponenty celujące w MRIgFUSImageGuidedTherapy, laboratorium Szablowskidopobrania na zamówienie z szablowskilab.org/downloads
Niestandardowy aparat do rezonansu magnetycznegoImageGuidedTherapyN/A
Definity mikropęcherzykiLantheusDE4
Odgazowany żel akwasoniczny/ultradźwiękowyFisher Scientific5067714
Depilacja crè meNairn/a
Ośmioelementowy przetwornik pierścieniowyImasonic Inc.niestandardowe
podkładki etanolowe/waciki nasączone alkoholem (70%) (BD)Office Depot599893
HeparynaSigma-AldrichH3149-25KU
IsofluranePatterson Veterinary07-893-1389
KetaminaPatterson Veterinary07-890-8598
Neutralna buforowana formalina (10%)Sigma-AldrichHT501128-4L
Hydrofon światłowodowyPrecision Acoustics Rurki
PE10Fisher ScientificNC1513314
Pompa
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Sigma-Aldrich524650-1EA
Środek kontrastowy ProhanceBracco0270-1111-04
SalineFisher NaukoweNC9054335
Przeciwciało wtórne, Osioł-anty kozaThermoFisherA-11055
Przeciwciało drugorzędowe, Osioł-anty królikThermoFisher84546
Nożyczki chirurgiczne (proste)Fisher Scientific17467480
ThermoGuide OprogramowanieImageGuidedTherapy
Klej do tkanek (Gluture)Fisher ScientificNC9855218
Strzykawka tuberkulinowa (1 ml) (BD)Fisher Scientific14823434
VeroClear materiał do druku 3DStratasysRGD810
Vialmix Urządzenie do aktywacji mikropęcherzykówLantheusVMIX
Wibracyjny mikrotomKompresja VF-300
KsylazynaSigma-AldrichZobacz materiał X1251-1G
Cewnik motylkowy o o rozmiarze (perystaltyczna

Bibliografia

  1. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8, 1263-1268 (2005).
  2. Zhang, F., Wang, L. -P., Boyden, E. S., Deisseroth, K. Channelrhodopsin-2 and optical control of excitable cells. Nature Methods. 3, 785-792 (2006).
  3. Armbruster, B. N., Li, X., Pausch, M. H., Herlitze, S., Roth, B. L. Evolving the lock to fit the key to create a family of G protein-coupled receptors potently activated by an inert ligand. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104, 5163-5168 (2007).
  4. Lerchner, W., et al. Reversible silencing of neuronal excitability in behaving mice by a genetically targeted, ivermectin-gated Cl- channel. Neuron. 54, 35-49 (2007).
  5. Magnus, C. J., et al. Chemical and genetic engineering of selective ion channel-ligand interactions. Science. 333, 1292-1296 (2011).
  6. Deeb, W., et al. Proceedings of the fourth annual deep brain stimulation think tank: a review of emerging issues and technologies. Frontiers in Integrative Neuroscience. 10, 38(2016).
  7. Szablowski, J. O., Lee-Gosselin, A., Lue, B., Malounda, D., Shapiro, M. G. Acoustically targeted chemogenetics for the non-invasive control of neural circuits. Nature Biomedical Engineering. 2, 475-484 (2018).
  8. Elias, W. J., et al. A pilot study of focused ultrasound thalamotomy for essential tremor. New England Journal of Medicine. 369, 640-648 (2013).
  9. Burgess, A., Hynynen, K. Noninvasive and targeted drug delivery to the brain using focused ultrasound. ACS Chemical Neuroscience. 4, 519-526 (2013).
  10. Kinoshita, M., McDannold, N., Jolesz, F. A., Hynynen, K. Noninvasive localized delivery of Herceptin to the mouse brain by MRI-guided focused ultrasound-induced blood-brain barrier disruption. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 103, 11719-11723 (2006).
  11. Samiotaki, G., Acosta, C., Wang, S., Konofagou, E. E. Enhanced delivery and bioactivity of the neurturin neurotrophic factor through focused ultrasound-mediated blood-brain barrier opening in vivo. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 35, 611-622 (2015).
  12. O'Reilly, M. A., Waspe, A. C., Chopra, R., Hynynen, K. MRI-guided disruption of the blood-brain barrier using transcranial focused ultrasound in a rat model. Journal of Visualized Experiments. (61), e3555(2012).
  13. Thévenot, E., et al. Targeted delivery of self-complementary adeno-associated virus serotype 9 to the brain, using magnetic resonance imaging-guided focused ultrasound. Human gene Therapy. 23, 1144-1155 (2012).
  14. Hsu, P. -H., et al. Noninvasive and targeted gene delivery into the brain using microbubble-facilitated focused ultrasound. PloS One. 8, 58682(2013).
  15. Wang, S., Olumolade, O. O., Sun, T., Samiotaki, G., Konofagou, E. E. Noninvasive, neuron-specific gene therapy can be facilitated by focused ultrasound and recombinant adeno-associated virus. Gene Therapy. 22, 104(2015).
  16. Downs, M. E., et al. Long-Term Safety of Repeated Blood-Brain Barrier Opening via Focused Ultrasound with Microbubbles in Non-Human Primates Performing a Cognitive Task. PLoS One. 10, 0125911(2015).
  17. Lipsman, N., et al. Blood-brain barrier opening in Alzheimer's disease using MR-guided focused ultrasound. Nature Communications. 9, 2336(2018).
  18. Carpentier, A., et al. Clinical trial of blood-brain barrier disruption by pulsed ultrasound. Science Translational Medicine. 8, 343(2016).
  19. Sternson, S. M., Roth, B. L. Chemogenetic Tools to Interrogate Brain Functions. Annual Reviews Neurosciences. 37, 387-407 (2014).
  20. Alexander, G. M., et al. Remote control of neuronal activity in transgenic mice expressing evolved G protein-coupled receptors. Neuron. 63, 27-39 (2009).
  21. Zhu, H., et al. Chemogenetic inactivation of ventral hippocampal glutamatergic neurons disrupts consolidation of contextual fear memory. Neuropsychopharmacology. 39, 1880-1892 (2014).
  22. Choi, J. J., Pernot, M., Small, S. A., Konofagou, E. E. Noninvasive, transcranial and localized opening of the blood-brain barrier using focused ultrasound in mice. Ultrasound in Medicine & Biology. 33, 95-104 (2007).
  23. Thévenot, E., et al. Targeted delivery of self-complementary adeno-associated virus serotype 9 to the brain, using magnetic resonance imaging-guided focused ultrasound. Human Gene Therapy. 23, 1144-1155 (2012).
  24. Hynynen, K., McDannold, N., Vykhodtseva, N., Jolesz, F. A. Noninvasive MR imaging-guided focal opening of the blood-brain barrier in rabbits. Radiology. 220, 640-646 (2001).
  25. Yang, F. -Y., Fu, W. -M., Chen, W. -S., Yeh, W. -L., Lin, W. -L. Quantitative evaluation of the use of microbubbles with transcranial focused ultrasound on blood-brain-barrier disruption. Ultrasonics Sonochemistry. 15, 636-643 (2008).
  26. Vardy, E., et al. A New DREADD Facilitates the Multiplexed Chemogenetic Interrogation of Behavior. Neuron. 86, 936-946 (2015).
  27. Thompson, K. J., et al. DREADD Agonist 21 Is an Effective Agonist for Muscarinic-Based DREADDs in Vitro and in Vivo. ACS Pharmacology and Translational Sciences. 1, 61-72 (2018).
  28. Gomez, J. L., et al. Chemogenetics revealed: DREADD occupancy and activation via converted clozapine. Science. 357, 503-507 (2017).
  29. Nagai, Y., et al. Deschloroclozapine: a potent and selective chemogenetic actuator enables rapid neuronal and behavioral modulations in mice and monkeys. bioRxiv. , 854513(2019).
  30. Thompson, K. J., et al. DREADD Agonist 21 Is an Effective Agonist for Muscarinic-Based DREADDs in Vitro and in Vivo. ACS Pharmacology and Translational Science. 1, 61-72 (2018).
  31. Bullitt, E. Expression of c-fos-like protein as a marker for neuronal activity following noxious stimulation in the rat. Journal of Comparative Neurology. 296, 517-530 (1990).
  32. Mahler, S. V., Aston-Jones, G. CNO Evil? Considerations for the use of DREADDs in behavioral neuroscience. Neuropsychopharmacology. 43, 934(2018).
  33. Gruber, B., Froeling, M., Leiner, T., Klomp, D. W. J. RF coils: A practical guide for nonphysicists. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 48, 590-604 (2018).
  34. Treat, L. H., McDannold, N., Vykhodtseva, N., Hynynen, K. Transcranial MRI-guided focused ultrasound-induced blood-brain barrier opening in rats. IEEE. 2, 998-1000 (2004).
  35. Choi, J. J., Pernot, M., Small, S. A., Konofagou, E. E. Feasibility of transcranial, localized drug-delivery in the brain of Alzheimer's-model mice using focused ultrasound. IEEE. 2, 988-991 (2005).
  36. Cobbold, R. S. Foundations of Biomedical ultrasound. , Oxford university press. (2006).
  37. Younan, Y., et al. Influence of the pressure field distribution in transcranial ultrasonic neurostimulation. Medical Physics. 40, 082902(2013).
  38. McDannold, N., Vykhodtseva, N., Hynynen, K. Targeted disruption of the blood-brain barrier with focused ultrasound: association with cavitation activity. Physics in Medicine and Biology. 51, 793-807 (2006).
  39. Branda, C. S., Dymecki, S. M. Talking about a Revolution: The Impact of Site-Specific Recombinases on Genetic Analyses in Mice. Developmental Cell. 6, 7-28 (2004).
  40. Jendryka, M., et al. Pharmacokinetic and pharmacodynamic actions of clozapine-N-oxide, clozapine, and compound 21 in DREADD-based chemogenetics in mice. Scientific Reports. 9, 4522(2019).
  41. Manvich, D. F., et al. The DREADD agonist clozapine N-oxide (CNO) is reverse-metabolized to clozapine and produces clozapine-like interoceptive stimulus effects in rats and mice. Scientific Reports. 8, 3840(2018).
  42. Martinez, V. K., et al. Off-Target Effects of Clozapine-N-Oxide on the Chemosensory Reflex Are Masked by High Stress Levels. Frontiers in Physiology. 10, 521(2019).
  43. Gomez, J. L., et al. Chemogenetics revealed: DREADD occupancy and activation via converted clozapine. Science. 357, 503-507 (2017).
  44. Bonaventura, J., et al. High-potency ligands for DREADD imaging and activation in rodents and monkeys. Nature Communications. 10, 1-12 (2019).
  45. Roth, B. L. DREADDs for Neuroscientists. Neuron. 89, 683-694 (2016).
  46. Aschauer, D. F., Kreuz, S., Rumpel, S. Analysis of Transduction Efficiency, Tropism and Axonal Transport of AAV Serotypes 1, 2, 5, 6, 8 and 9 in the Mouse Brain. PLoS One. 8, 76310(2013).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Akustycznie celowana chemogenetykawektory wirusowe AAVaktywacja mikropęcherzykówcelowanie pod kontrolą rezonansu magnetycznegokomponenty wydrukowane w 3Diniekcja do żyły ogonowejwzmocnienie sygnału T1
Zogniskowane ultradźwięki indukowane otwieraniem bariery krew-mózg w celu celowania w struktury mózgu i oceny neuromodulacji chemogenetycznej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.