Kwantyfikacja agregacji białek nierozpuszczalnych w Caenorhabditis elegans podczas starzenia za pomocą nowatorskiego, niezależnego od danych przepływu pracy akwizycji

Podsumowanie

Ten nowatorski przepływ pracy skutecznie ekstrahuje i izoluje nierozpuszczalne w SDS białka (insolublome) z Caenorhabditis elegans przy minimalnym materiale wyjściowym do ilościowej różnicowej analizy proteomicznej. Protokół wykorzystuje kompleksową, niezależną od danych analizę spektrometrii mas w celu ilościowego określenia insolublomu i analizy bioinformatycznej w celu uzyskania biologicznego wglądu w mechanizmy starzenia i patologie.

Streszczenie

My i inni wykazaliśmy, że proces starzenia prowadzi do nagromadzenia nierozpuszczalnych białek na całym proteomie. Zniszczenie genów kodujących nierozpuszczalne białka w ponad 40% przypadków powoduje wydłużenie życia C. elegans, co sugeruje, że wiele z tych białek jest kluczowymi determinantami procesu starzenia. Izolacja i identyfikacja ilościowa tych nierozpuszczalnych białek mają kluczowe znaczenie dla zrozumienia kluczowych procesów biologicznych zachodzących podczas starzenia. W tym miejscu przedstawiamy zmodyfikowany i ulepszony protokół, który szczegółowo opisuje, jak skuteczniej ekstrahować i izolować białka nierozpuszczalne w SDS (insolublome) z C. elegans, aby usprawnić przepływy pracy spektrometrii mas za pomocą nowatorskiej, bezznacznikowej ilościowej analizy proteomicznej. Ten ulepszony protokół wykorzystuje wysoce wydajny sonikator do lizy robaków, który znacznie zwiększa wydajność ekstrakcji białek i pozwala nam na użycie znacznie mniejszej ilości materiału wyjściowego (około 3000 robaków) niż w poprzednich protokołach (zwykle przy użyciu co najmniej 40 000 robaków). Późniejszą ilościową analizę proteomiczną insolublomu przeprowadzono przy użyciu akwizycji zależnej od danych (DDA) w celu odkrywania i identyfikacji białek oraz akwizycji niezależnej od danych (DIA) w celu kompleksowej i dokładniejszej kwantyfikacji białek. Analiza bioinformatyczna ilościowych białek dostarcza potencjalnych kandydatów, których można łatwo śledzić za pomocą innych metod molekularnych u C. elegans. Dzięki temu przepływowi pracy rutynowo identyfikujemy ponad 1000 białek i określamy ilościowo ponad 500 białek. Ten nowy protokół umożliwia skuteczne badania przesiewowe związków C. elegans. Tutaj zweryfikowaliśmy i zastosowaliśmy ten ulepszony protokół do dzikiego szczepu C. elegans N2-Bristol i potwierdziliśmy, że sędziwe robaki N2 dnia 10 wykazywały większą akumulację insolublomu niż młode robaki dnia 2.

Wprowadzenie

Homeostaza białek stopniowo spada wraz z wiekiem i powoduje zwiększoną agregację białek^1,2,3. Agregacja białek jest związana z kilkoma chorobami neurodegeneracyjnymi, w tym chorobą Alzheimera, chorobą Parkinsona, chorobą Huntingtona i stwardnieniem zanikowym bocznym⁴. Starzenie się jest uważane za główny czynnik ryzyka wystąpienia zaburzeń neurodegeneracyjnych związanych z agregacją białek. Białka, które mają skłonność do tworzenia nierozpuszczalnych agregatów, są często związane z toksycznością komórkową i dysfunkcją tkanek, co może dodatkowo przyspieszyć agregację innych białek5^,6,7. Alternatywnie, nierozpuszczalne agregaty białkowe mogą aktywować komórkowe mechanizmy obronne w celu usunięcia toksycznych oligomerycznych form białka z systemu. Zniszczenie wybranych genów kodujących nierozpuszczalne białka moduluje długość życia Caenorhabditis elegans (C. elegans) zarówno w kontekście choroby związanej z wiekiem, jak i normalnego starzenia się5^,8,9. W związku z tym badanie komórkowych i molekularnych mechanizmów agregacji białek ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia starzenia się i ostatecznie może doprowadzić do podejść do leczenia chorób neurodegeneracyjnych.

Nicień C. elegans stał się jednym z najczęściej wykorzystywanych organizmów modelowych do badania agregacji białek w starzeniu się i chorobach związanych z wiekiem ze względu na swoje unikalne cechy, takie jak stosunkowo krótka długość życia (około 2 tygodnie), łatwość uprawy i manipulacje genetyczne.

Zdolność do ekstrakcji i charakteryzowania nierozpuszczalnych białek odegrała kluczową rolę w określaniu zmian związanych z wiekiem związanych z agregacją białek w modelach C. elegans. Aby zbadać udział agregacji białek w normalnych procesach starzenia, my⁵ i inni² wcześniej wyekstrahowaliśmy i proteolitycznie strawiliśmy insolublom młodych i starszych C. elegans, znakowaliśmy chemicznie za pomocą odczynników iTRAQ ("znakowanie izobaryczne dla względnej i bezwzględnej kwantyfikacji"), a następnie określiliśmy ilościowo za pomocą metod opartych na MS. Stosując metodę znakowania izobarycznego i 120 mg mokrych robaków (około 40 000 robaków), byliśmy w stanie uzyskać znaczną głębokość i pokrycie insolublomu białkowego⁵. Analiza ilościowa wykazała, że 203 z 1200 zidentyfikowanych białek było znacznie wzbogaconych w insolublom starzejących się C. elegans w porównaniu z podobnymi frakcjami insolublomu od młodych robaków⁵. Niezależnie od tego, David i in. wykorzystali również przepływ pracy iTRAQ LC-MS/MS do zbadania zmian w agregatach białkowych z normalnym starzeniem się². Zaczynając od około 300 mg robaków, zidentyfikowali ~1000 nierozpuszczalnych białek za pomocą dwóch biologicznych powtórzeń i ustalili, że ~700 z około 1000 białek gromadziło się 1,5-krotnie lub więcej wraz z wiekiem w porównaniu z młodymi robakami². Ogólnie rzecz biorąc, te niezależne wyniki wskazują, że powszechna nierozpuszczalność i agregacja białek są nieodłączną częścią normalnego starzenia się i mogą wpływać zarówno na długość życia, jak i częstość występowania chorób neurodegeneracyjnych^2,5.

Badanie insolublomu pozwoliło nam określić, w jaki sposób wpływy środowiskowe mogą przyspieszać lub spowalniać proces starzenia. Klang i in. ustanowili bezznacznikowe proteomiczne przepływy pracy u C. elegans, aby zbadać rolę metalostazy w długowieczności¹⁰. W tym badaniu wykorzystano co najmniej 40 000 robaków do ekstrakcji insolublome¹⁰. Dane wykazały, że poziom żelaza, miedzi, wapnia i manganu wzrasta wraz z wiekiem i że karmienie robaków dietą o podwyższonym poziomie żelaza znacznie przyspieszyło związaną z wiekiem akumulację nierozpuszczalnych białek¹⁰. Korzystając z tego samego przepływu pracy w celu zbadania wpływu witaminy D na insolublom C. elegans, 38 białek określono ilościowo u młodych robaków (Dzień 2) i 721 białek u starzejących się robaków (Dzień 8). Żywienie witaminą D znacznie zmniejszyło nierozpuszczalność starzejących się robaków z 721 do 371 białek¹¹. Dalsze badania wykazały, że podawanie witaminy D tłumiło nierozpuszczalność białka wraz z wiekiem, promowało homeostazę białek i wydłużało życie robaków C.elegans N2 typu dzikiego¹¹. W związku z tym badanie insolublomu może pomóc w identyfikacji nowych modulatorów starzenia się i chorób związanych z wiekiem.

Podczas gdy badanie insolublomu było nieocenione w zrozumieniu procesu starzenia, zostało utrudnione przez wymóg zbierania dużych ilości materiału wyjściowego próbki. Groh i in. niedawno wprowadzili bezznacznikowy proces kwantyfikacji proteomicznej w celu zbadania nieodłącznych zmian agregacji białek u C. elegans wraz ze starzeniem się; Wymagało to jednak dużych ilości materiału wyjściowego (350 mg robaków ziemnych)12. W niniejszym raporcie ustaliliśmy ulepszony nowy protokół ekstrakcji i izolacji (Rysunek 1). Zastosowanie wysoce wydajnego sonikatora podczas lizy robaków znacznie poprawiło wydajność ekstrakcji, a następnie zmniejszyło ilość potrzebnego materiału wyjściowego z 40 000 do 3 000 robaków. Połączenie tego nowatorskiego protokołu izolacji insolublomu z bezznacznikowym przepływem pracy spektrometrii mas bez znaczników (DIA) pozwoliło na poprawę głębokości i pokrycia białek. Przedstawiony tutaj protokół jest ekonomiczny i łatwy do modyfikacji, aby umożliwić wykonywanie analiz insolublomów w innych systemach modelowych.

Protokół

UWAGA: Aby lepiej zrozumieć procedurę eksperymentalną, zobacz Rysunek 1 dla schematu przepływu pracy.

1. Masowa kultura zsynchronizowanego starzenia się C. elegans

1. Przygotowanie talerza
   1. Wlać 30 ml agaru NGM z lub bez 50 mM fluorodeoksyurydyny (FUdR) do każdej płytki o średnicy 90 mm i pozostawić płytki do wyschnięcia na 2 dni w okapach hodowlanych.
   2. Na dzień przed wysiewem płytki agarowej NGM zaszczepić 50 μl porcji zamrożonego glicerolu szczepu bakterii OP50 w 1 l wstępnie autoklawizowanej pożywki LB w kolbie o pojemności 2 l.
   3. Hodować bakterie w temperaturze 37 °C w inkubatorze z wytrząsaniem przy 250 obr./min przez 16 godzin.
   4. Po 16 godzinach odwirować kultury bakteryjne z prędkością 5 000 x g przez 10 minut.
   5. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić całkowicie osad bakteryjny w 40 ml autoklawowanego roztworu S-bazalnego (zawierającego 50 mM_{K 3}PO₄, 100 mM NaCl w wodzie) w celu wytworzenia 25 razy bardziej skoncentrowanej kultury OP50 E. coli.
   6. Dozować 2 ml 25x skoncentrowanej kultury bakteryjnej na każdą płytkę agarową NGM i równomiernie rozprowadzić, tak aby kultura bakteryjna pokryła całą powierzchnię agaru.
   7. Zdejmij pokrywki z płytek w kapturze do hodowli bakteryjnej na 2-3 godziny, aż płytki zostaną odpowiednio wysuszone.
      UWAGA: Upewnij się, że bakterie są równomiernie rozprowadzone, obracając płytki co 15 minut. Jest to ważne, ponieważ bakterie mają tendencję do koncentrowania się po jednej stronie płytki, co powoduje powstawanie regionów o niskiej gęstości bakteryjnej.
   8. Po wysuszeniu płytek zamknij pokrywki i pozostaw płytki w temperaturze pokojowej na 48 godzin, aby zapewnić całkowite wysuszenie źródła żywności OP50 E. coli.
      UWAGA: Talerze można przygotować 2 tygodnie wcześniej i przechowywać w temperaturze 4 °C przed użyciem.
2. Utrzymanie i przygotowanie zsynchronizowanych kohort C. elegans
   1. Aby uzyskać wymagany dopływ lizatu białkowego (1,0–1,5 mg) do izolacji frakcji nierozpuszczalnej w SDS, należy użyć około 3 000 zsynchronizowanych robaków na próbkę.
   2. Przenieś ~100 N2 grawitacyjnych dorosłych robaków typu dzikiego na płytkę z nasionami coli NGM 25x OP50 E. i utrzymuj robaki w temperaturze 20 °C przez ~ 72 godziny, aż szalka wypełni się grawitymi dorosłymi robakami.
   3. Odpipetować ~10 ml roztworu S-bazalu na każdą płytkę i zebrać wszystkie robaki do probówki o pojemności 15 ml.
      UWAGA: Ważne jest, aby podczas tego i wszystkich przyszłych kroków związanych z zbieraniem robaków używać końcówek o niskiej retencji lub pipet Pasteura, aby zapobiec utracie robaków w wyniku przyczepienia do powierzchni końcówek.
   4. Wirować próbkę z prędkością 520 x g przez 30 s. Po odwirowaniu usunąć supernatant. Aby wyeliminować wszelkie OP50 E. coli, dodaj 10 ml roztworu S-bazalu do osadu i ponownie odwiruj, a następnie usuń supernatant. Powtórz ten krok.
   5. Dodać 10 ml roztworu wybielającego podchloryn sodu (zawierającego 0,5 M KOH i 0,48% podchlorynu sodu w wodzie) do osadu robaka w stożkowej probówce o pojemności 15 ml i energicznie wirować przez 2 minuty w temperaturze pokojowej.
   6. Wirować przy 520 x g przez 30 s w temperaturze pokojowej, aby odwirować wszelkie niecałkowicie rozpuszczone ciała robaków i jaja. Następnie usunąć supernatant.
   7. Powtórzyć kroki 1.2.5 i 1.2.6, aby zapewnić całkowite usunięcie wszystkich ciał robaków i uwolnienie jaj (view probówka pod mikroskopem, aby się upewnić).
   8. Umyj granulkę jaja co najmniej 4 razy 10 ml roztworu S-bazal, aby zapewnić całkowite usunięcie roztworu wybielacza.
      UWAGA: Całkowite usunięcie wybielacza jest ważne, ponieważ pozostały wybielacz może utrudniać wylęganie się jaj.
   9. Pozostawić jaja zawieszone w 5 ml pożywki S-podstawowej w probówce o pojemności 15 ml i umieścić w rotorze w temperaturze 20 °C na 24 godziny, aby umożliwić wyklucie się jaj.
   10. Po 24 godzinach weź 10 μl roztworu larw S-bazal, aby policzyć liczbę robaków w nim. Użyć co najmniej trzech oddzielnych podwielokrotności po 10 μl roztworu larw S-bazalu do odtworzenia liczby robaków. Obliczyć średnią z trzech stężeń larw. Na podstawie średniego stężenia rozcieńczyć roztwór robaka, aby uzyskać ~ 3 000 larw na 200 μl roztworu.
       UWAGA: Pamiętaj, aby delikatnie potrząsnąć rurką, odwracając ją, ponieważ larwy mają tendencję do osiadania, jeśli nie są niezakłócone, co może wpłynąć na liczbę larw.
   11. Dobrze wymieszać i dodać 200 μl roztworu larw S-bazal na każdą z 90-milimetrowych płytek wysiewanych przez bakterie NGM.
       UWAGA: Dodaj krople roztworu larw S-bazal na całej płytce, aby równomiernie rozprowadzić larwy, aby uniknąć zubożenia bakterii w niektórych miejscach.
   12. Pozostawić roztwór podstawowy S do wyschnięcia, a następnie umieścić odwrócone płytki w inkubatorze o temperaturze 20 °C na 48 godzin.
   13. Po 48 godzinach zebrać robaki z płytki w roztworze S-base i przenieść je na świeżą płytkę z nasionami NGM zawierającą 50 mM FUDR i inkubować płytki w temperaturze 20 °C.
       UWAGA: Ważne jest, aby przenosić robaki na wczesnym etapie L4, aby zapewnić wydajność FUDR.
   14. Pobrać próbki młodych dorosłych z dnia 2 po 48 godzinach, dodając 10 ml roztworu S-podstawowego na płytkę i przenosząc roztwór do probówki o pojemności 15 ml. Pozwól robakom osiąść grawitacyjnie i usuń roztwór S-podstawowy, gdy stanie się klarowny.
   15. Umyj osad robaka 2-3x w 5 ml roztworu S-bazal, aby usunąć wszelkie przyczepione bakterie. Usunąć jak najwięcej roztworu S-bazalu i zamrozić granulki robaka (w probówkach o pojemności 15 ml) w kąpieli suchego lodu i etanolu. Zamrożone próbki przechowuje się w temperaturze -80 °C.
   16. Próbki robaków należy przenieść na świeżą płytkę NGM OP50 E. coli zawierającą FUDR co drugi dzień do 10 dnia. Zbierz i zamroź robaki zgodnie z opisem w krokach 1.2.14 i 1.2.15.
       UWAGA: Zacznij od większej liczby robaków dla próbek z dnia 10, aby uwzględnić utratę liczby robaków spowodowaną przenoszeniem i zakopywaniem.

2. Ekstrakcja frakcji nierozpuszczalnej SDS z robaków

1. Rozmrozić zamrożony osad robaka na lodzie w obecności 900 μl lodowatego koktajlu buforowego do lizy robaków zawierającego 20 mM zasady Tris, pH 7,4, 100 mM NaCl, 1 mM MgCl₂ i inhibitora proteazy wolnego od EDTA. Krótko odwirować próbki, aby zapewnić całkowite ponowne zawieszenie osadu robaka w buforze do lizy.
2. Umieść probówki o pojemności 15 ml w kąpieli sonizacyjnej i ustaw na 10 cykli sonikacji (30 s na każdy cykl i 30 s na każdy cykl) z wysoką intensywnością. Powtarzaj do pięciu cykli (upewnij się, że robaki są w pełni zlizowane).
3. Wirować lizat o masie 3 000 x g przez 4 minuty w chłodni. Po odwirowaniu wyrzucić osad zawierający jakiekolwiek resztki robaków i ostrożnie przenieść supernatant do świeżych, wstępnie schłodzonych probówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml na lodzie.
4. Określ ilościowo stężenie białka za pomocą testu BCA. Przenieść podwielokrotności lizatu, zwykle zawierające około 1 mg białka, do świeżych, wstępnie schłodzonych probówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml.
5. Odwirować lizat białkowy przez 15 minut przy 20 000 x g w chłodni.
6. Nie naruszając osadu, przenieść supernatant do świeżej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml i zachować go jako frakcję białkową rozpuszczalną w wodzie.
7. Przemyć osad z poprzedniego etapu w 500 μl buforu do lizy robaków zawierającego 1% SDS w temperaturze pokojowej i odwirować przy 20 000 x g przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Usunąć supernatant i zapisać jako frakcję rozpuszczalną w SDS. Powtórz ten krok mycia dwa razy, aby usunąć frakcję rozpuszczalną w SDS. Pozostały osad po trzeciej rundzie prania definiuje się jako 1% frakcję białkową nierozpuszczalną w SDS.
8. Zawiesić nierozpuszczalne w SDS osady białkowe w 60 μl 70% kwasu mrówkowego i energicznie wirować, aby rozpuścić białka. Powtórz energiczne wirowanie tyle razy, ile to konieczne, aby rozpuścić osad.
9. Sonikować osad przez 30 minut w łaźni wodnej ultradźwiękowej w temperaturze pokojowej.
   UWAGA: Nierozpuszczalny osad SDS jest zwykle trudny do rozpuszczenia w buforze. Jednak w końcu cały pellet powinien zostać rozpuszczony na tym etapie.
10. Suszyć próbki w koncentratorze próżniowym przez 1 godzinę, aby całkowicie usunąć roztwór kwasu mrówkowego.
11. Dodać 40 μl 1x bufor żelowy do próbki LDS do wysuszonego osadu i podgrzewać próbkę do 95 °C przez 10 minut. Krótko odwirować i odwirować próbki. Załaduj 13 μL na żel 4-12% NUPAGE Bis-Tris i uruchom żel. Wybarwić żel fluorescencyjnym barwnikiem białkowym do obrazowania. Zachowaj resztę próbki do analizy spektrometrii mas (MS).
12. Załaduj pozostałą próbkę do 4-12% żelu Bis-Tris i uruchom na około 20 minut w celu roztrawienia w żelu MS.

3. Trawienie w żelu z proteazą trypsyny w celu wyizolowania białek do analizy SM

1. Przygotuj następujące roztwory (świeże): 25 mM NH₄HCO₃ (pH 7–8), 25 mM NH₄HCO₃ w 50% acetonitrylu (ACN, pH 7–8) i 50% ACN w 5% kwasie mrówkowym.
2. Każdy plasterek żelu pokrój w kostkę na małe kawałki (zwykle <1 mm²) i umieść je w silikonowanych probówkach o pojemności 0,65 ml.
3. Dodać około 100 μl (lub tyle, aby pokryć) 25 mM roztworu NH₄HCO₃/50% ACN i wirować w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Wyekstrahować supernatant i przenieść do oddzielnej probówki (do wyrzucenia). Powtórz ten krok jeszcze dwa razy.
4. Kawałki żelu należy całkowicie wysuszyć w koncentratorze próżniowym (~20 min).
5. Przygotuj świeże roztwory i dodaj ~100 μL (lub tyle, aby pokryć) 10 mM DTT w 25 mM NH₄HCO₃ do wysuszonych kawałków żelu (użyj świeżo przygotowanego NH₄HCO₃). Wiruj i krótko zakręć. Pozostawić reakcję zachodzącą w temperaturze 56 °C przez 1 godzinę i z wytrząsaniem przy 1400 obr./min na mieszalniku.
6. Usunąć supernatant i dodać 100 μl 55 mM jodoacetamidu (IAA) w 25 mM NH₄HCO₃ do kawałków żelu. Wiruj i krótko zakręć. Pozwól, aby reakcja postępowała w ciemności przez 45 minut przy natężeniu kierunkowym.
7. Usunąć supernatant i wyrzucić. Umyj kawałki żelu, dodając ~100 μL 25mM NH₄HCO₃ i wirując przez 10 minut. Krótko odwirować i usunąć supernatant, odrzucając ten ostatni.
8. Odwodnić kawałki żelu, dodając ~100 μL (lub tyle, aby pokryć) 25 mM NH₄HCO₃ w 50% ACN do kawałków żelu i wirować przez 10 minut. Następnie krótko obrócić, aby usunąć i wyrzucić supernatant. Powtórz ten krok dwa razy lub nawet po raz trzeci, jeśli kawałki żelu nie są całkiem suche, na co wskazuje mniejszy rozmiar kawałków żelu i mętny biały kolor.
9. Kawałki żelu należy całkowicie wysuszyć w koncentratorze próżniowym (~20 min).
10. Początkowo dodaj 15 μl roztworu trypsyny (250 ng trypsyny) do każdej próbki, a następnie dodaj tyle 25 mM NH₄HCO₃ , aby pokryć kawałki żelu (~100 μL). Wirować przez 10 minut. Następnie krótko odwirować i inkubować w temperaturze 4 °C w chłodni przez 30 minut bez mieszania.
11. W razie potrzeby dodaj 25 mM NH₄HCO₃, aby całkowicie pokryć kawałki żelu. Wirować i inkubować w temperaturze 37 °C przez noc przez 16–20 godzin przy 1400 obr./min na mieszalniku.
12. Następnego dnia krótko zwiruj i odwiruj trawienie. Dodać około 100 μl wody klasy HPLC, odwirować, parafilmować probówkę i sonikować w sposób ciągły przez 10 minut. Wirować krótko po sonikacji.
13. Przenieś roztwór wytrawiający, reprezentujący ekstrakcję wodną, do czystej silikonowanej probówki o pojemności 0,65 ml.
14. Dodaj ~100 μL 50% ACN/5% kwasu mrówkowego do kawałków żelu (tyle, aby je przykryć), wirować 10 minut w temperaturze pokojowej, krótko wirować i zebrać roztwór, a następnie powtórz raz. Zebrać wszystkie roztwory zawierające wyekstrahowane peptydy z tego kroku i z poprzedniego kroku 3.13 w jednej probówce.
15. Zwiruj wyekstrahowane trawienie. Peptydy należy całkowicie wysuszyć w koncentratorze próżniowym (~2 h).
16. Dodać 30 μl 0,2% kwasu mrówkowego, aby ponownie zawiesić peptydy w mieszalniku w chłodni na 10 minut.
17. Wirować próbki w temperaturze 1850 x g w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Odessać roztwór peptydu i przenieść do nowej, czystej probówki silikonowanej o pojemności 0,65 ml. Następnie odsolić roztwór peptydów za pomocą końcówek odsalających C18 (patrz poniżej).

4. Odsalanie strawionych peptydów za pomocą końcówki odsalającej C18

1. Ustaw pipetę na 10 μl i załóż końcówkę odsalającą C18. Zwilż końcówkę odsalającą, odpipetowując 10 μl 100% ACN, a następnie wyrzucając ją. Powtórz ten krok 2 razy.
2. Umyj końcówkę odsalającą C18, odpipetowując 10 μl 50% ACN, 49,8% wody i 0,2% FA, a następnie wyrzucając ją. Powtórz ten krok 2 razy.
3. Zrównoważyć końcówkę odsalającą C18, pipetując 10 μl 0,2% FA w wodzie, a następnie wyrzucając ją. Powtórz ten krok 2 razy.
4. Ustawić pipetę na 10 μl i załadować peptydy z roztworu do żywicy, pipetując strawione peptydy przez żywicę w górę i w dół 15x.
   UWAGA: Powtarzające się działanie zapewni związanie wszystkich peptydów z żywicą końcówek odsalających.
5. Przetrawione peptydy związane z żywicą należy odsalić, odpipetowując 10 μl 0,2% FA w wodzie, a następnie wyrzucając je. Powtórz ten krok 4 razy, aby zakończyć etap odsalania.
6. W nowej probówce wymyj peptydy za pomocą 10 μl 50% ACN, 49,8% wody i 0,2% FA, pipetując w górę iw dół 10 razy. Powtórz ten krok raz, aby wymyć trawienie białka po raz drugi w tej samej probówce.
7. Całkowicie wysuszyć odsolone peptydy w koncentratorze próżniowym (~20 min).
8. Ponownie zawiesić peptydy w 15 μl peptydów 0,2% FA + 1 μL iRT (indeksowany czas retencji). Voxtex przez 10 minut, odwirować przy 12 000 x g przez 2 minuty, a następnie przenieść do fiolki z automatycznym samplerem w celu analizy stwardnienia rozsianego (patrz poniżej).

5. Analiza spektrometrii mas trawionych peptydów przy użyciu DDA i DIA

UWAGA: Próbki mogą być analizowane przy użyciu metod DDA lub DIA LC-MS/MS. W tym badaniu próbki analizowano przy użyciu systemu nano-LC 2D HPLC sprzężonego ze spektrometrem masowym o wysokiej rozdzielczości.

1. Użyj systemu HPLC w połączeniu z układem HPLC opartym na chipie bezpośrednio połączonym ze kwadrupolowym spektrometrem masowym czasu przelotu (można również użyć innych konfiguracji i systemów LC-MS).
2. Analizuj próbki przy użyciu HPLC-ESI-MS/MS z odwróconymi fazami.
   1. Zbuduj protokół chromatograficzny, aby załadować próbkę peptydów na chip przedkolumnowy C18. Przemyć i odsolić załadowane peptydy rozpuszczalnikiem (0,1% kwasu mrówkowego) przez 10 minut przy natężeniu przepływu 2 μl/min.
   2. Przenieść peptydy do chipa C18 kolumny analitycznej i eluować z szybkością przepływu 300 nL/min z 3-godzinnym gradientem przy użyciu ruchomej fazy A (2% acetonitrylu, 0,1% kwasu mrówkowego) i B (98% acetonitrylu, 0,1% kwasu mrówkowego). Pierwszy etap elucji składa się z gradientu liniowego od 5% B do 35% B w okresie 80 minut.
   3. Zwiększ ruchomą fazę B do 80% w ciągu 5 minut, a następnie utrzymuj ruchomą fazę B na poziomie 80% przez 8 minut, zanim zmienisz na 5% B, aby ponownie wyrównać kolumnę przez 25 minut.
3. Skonfiguruj metodę przyrządu MS dla DDA i zdefiniuj parametry przyrządu w następujący sposób.
   1. Użyj następujących parametrów dla Eksperymentu 1: Skanowanie jonów prekursorowych MS1 od m/z 400–1500 (czas akumulacji 250 ms); ustaw próg intensywności, aby wyzwolić skanowanie MS/MS dla jonów o stanach naładowania od 2 do 5 do 200 zliczeń; ustaw dynamiczne wyłączanie jonów prekursorowych na 60 s).
   2. W eksperymencie 2 należy użyć następujących parametrów: Skanowanie jonów produktu MS/MS z zakresem skanowania MS2 od m/z 100–1500 (czas akumulacji 100 ms na każdy z 30 skanów jonów produktu na cykl); ustaw rozrzut energii zderzenia na CES=5 i zaznacz "tryb skanowania jonów produktu o wysokiej czułości".
      UWAGA: Metoda akwizycji DDA jest używana do tworzenia bibliotek spektralnych zgodnie z opisem w kroku 6.3 (patrz poniżej). Tutaj uzyska widma MS/MS dla 30 najliczniejszych jonów prekursorowych po każdym skanowaniu MS1 na cykl; Całkowity czas cyklu wynosi około 3,3 s.
4. Uzyskaj DIA. Skonfiguruj metodę MS instrumentu dla DIA i zdefiniuj parametry instrumentu w następujący sposób.
   1. Użyj następujących parametrów dla Eksperymentu 1: Skan jonów prekursorowych MS1 z m/z 400-1250 (czas akumulacji 250 ms).
   2. Użyj następujących parametrów dla Eksperymentu 2: Skanowanie jonów produktu MS/MS dla 64 zmiennych segmentów SWATH z zakresem skanowania MS2 od m/z 100-1500 (czas akumulacji 45 ms na każdy z 64 skanów jonów produktu na cykl); ustaw rozrzut energii zderzenia na CES=10, zaznacz 'tryb skanowania jonów produktu o wysokiej czułości'.
      UWAGA: Użyj metody akwizycji DIA/SWATH z 64 zmiennymi oknami, zgodnie z opisem Schilling et al.¹³, aby przeprowadzić kwantyfikację bez znaczników z całkowitym czasem cyklu wynoszącym około 3,2 s. W przypadku akwizycji DDA, zamiast używać kwadrupola Q1 do przesyłania jonu prekursorowego o wąskim zakresie masy do komórki zderzeniowej, stosuje się zakres o zmiennej szerokości okna (na przykład m/z 5–90) do przyrostowego przechodzenia przez pełny zakres m/z (m/z 400–1250) z 64 segmentami SWATH, czas akumulacji 45 ms dla każdego segmentu, co daje czas cyklu wynoszący 3,2 sekundy, który obejmuje jedno skanowanie MS1 z czasem akumulacji 250 ms. Zmienna szerokość okna jest dostosowywana zgodnie ze złożonością typowego prądu jonów MS1 obserwowanego w określonym zakresie m/z za pomocą algorytmu SCIEX 'kalkulator zmiennego okna'¹³ (węższe okna są stosowane do 'zajętych' zakresów m/z, szersze okna są stosowane do zakresów m/z z niewielką ilością eluujących jonów prekursorowych). Na innych platformach MS można również wdrożyć alternatywne strategie wyboru okien DIA.

6. Analiza danych

UWAGA: Niektóre ustawienia analizy danych powinny być dostosowane do konkretnych warunków eksperymentalnych. Na przykład wybrana baza danych białek (plik fasta) będzie zależała od gatunku, z którego przygotowano próbkę (w tym protokole użyliśmy C. elegans).

1. Użyj wyszukiwarki baz danych MS, aby przeanalizować akwizycje DDA i zidentyfikować białka. Wygeneruj metodę wyszukiwarki darabase w następujący sposób:
   1. W polu Parametry opisu próbki wybierz opcję Identyfikacja; w obszarze Typ próbki wybierz opcję Kwas jodooctowy; w obszarze Alkilowanie cysteiny wybierz Trypsyna; w obszarze Trawienie (zakładając C-końcowe rozszczepienie lizyny i argininy) wybierz nazwę spektrometru mas w obszarze Instrument; i wybierz Caenorhabditis elegans w obszarze Gatunki.
   2. W polu Specific Processing parameters (Określone parametry przetwarzania) zaznacz pole Biological modifications (Modyfikacje biologiczne), w obszarze ID Focus (Fokus identyfikatora) wybierz pozycję SwissProt, w obszarze Database (Baza danych) zaznacz opcję Exact ID, w obszarze Search Effort (Wysiłek wyszukiwania) wybierz wartość 0,05 (10%) w obszarze Detected Protein Threshold (Próg wykrytego białka) i zaznacz pole wyboru Run False Discovery Rate Analysis (Uruchom analizę współczynnika fałszywych odkryć) w obszarze False Discovery Rate Analysis (Uruchom analizę współczynnika fałszywych odkryć)Jakość wyników. Zapisz metodę wyszukiwarki i prześlij surowe pliki MS do wyszukiwarki bazy danych w celu przetworzenia, korzystając z wygenerowanej metody.
      UWAGA: W procesie iteracyjnym wszystkie skany MS i MS/MS zostały automatycznie ponownie skalibrowane przez wyszukiwarkę na podstawie początkowych adnotacji i wyników.
2. Kliknij Eksportuj podsumowanie peptydów po zakończeniu wyszukiwania i przefiltruj wszystkie wyniki identyfikacji peptydów według progu ufności 99 w programie Excel (wskaźnik fałszywych odkryć (FDR) = 1%).
3. Zbuduj biblioteki spektralne MS/MS do dalszego przetwarzania pliku surowych danych DIA i do dalszej względnej kwantyfikacji danych.
   1. Otwórz oprogramowanie do analizy ilościowej DIA. Wybierz kartę Biblioteka, a następnie (u dołu strony) kliknij Generuj bibliotekę spektralną z "Wyszukiwarki bazy danych" i otwórz raport FDR "Wyszukiwarka baz danych" (plik arkusza kalkulacyjnego *FDR.xlsx), który został automatycznie wygenerowany w ramach procesu przeszukiwania bazy danych surowych plików danych DDA.
   2. Kliknij przycisk Dalej, wybierz schemat ustawień biblioteki i kliknij przycisk Dalej. Wybierz Uniprot_Caenorhabditis elegans _proteome jako bazę danych, a następnie kliknij przycisk Zakończ, zostanie wygenerowana biblioteka spektralna.
4. Użyj oprogramowania do analizy ilościowej DIA, aby przeanalizować akwizycję DIA w celu kompleksowej kwantyfikacji względnej białka. Potok analizy danych DIA jest opisany w następujący sposób.
   1. Aby przeanalizować i określić ilościowo peptydy, otwórz oprogramowanie do analizy ilościowej DIA w celu skonfigurowania schematu analizy przy użyciu schematu szablonu. Schemat szablonu jest dostępny w oprogramowaniu po kliknięciu Ustawienia, następnie Analiza DIA, a na końcu Ustawienia fabryczne BGS.
   2. Skonfiguruj parametry w schemacie szablonu w następujący sposób:
      1) w polu identyfikacja wybierz lokalizację PTM (probability cutoff = 0,75).
      2) w obszarze Kwantyfikacja wybierz Ilość grupy głównej jako Suma ilości peptydów, ustaw Grupę główną N jako Maksimum 7 i Min 1, wybierz Ilość grupy podrzędnej jako Ilość prekursora sumy i ustaw Grupę podrzędną N jako Maksimum 10 i Min 1, a następnie wybierz Filtrowanie danych jako Rzadkość Qvalue i nie wybieraj normalizacji przebiegu krzyżowego.
5. Wykonaj względną analizę kwantyfikacyjną.
   1. Wybierz kartę Pipeline, kliknij przycisk Set up a DIA Analysis from File (Konfiguruj analizę DIA z pliku), otwórz interesujące Cię pliki surowe MS DIA (na przykład: próbka i kontrola), kliknij przycisk Przypisz bibliotekę spektralną, wybierz bibliotekę, która została wygenerowana w wersji 6.3, kliknij przycisk Załaduj, a na koniec kliknij przycisk Dalej.
   2. Wybierz schemat analizy skonfigurowany w wersji 6.5.1 i kliknij przycisk Dalej. Wybierz odpowiednią bazę danych fasta file (w tym protokole: Uniprot_Caenorhabditis elegans_proteome) i kliknij Dalej. Zdefiniuj konfigurację warunku i przypisz różne warunki zgodnie z przykładami, a następnie kliknij przycisk Dalej.
   3. Przejrzyj przegląd analizy (podsumowanie konfiguracji eksperymentu) i przejdź do katalogu wyjściowego, a następnie kliknij przycisk Zakończ. Na koniec kliknij przycisk Uruchom potok, aby przeprowadzić analizę ilościową bez etykiet.
      UWAGA: Moduły statystyczne w oprogramowaniu do analizy ilościowej DIA automatycznie przeprowadzają analizę FDR, generują mapy cieplne i wykresy wulkanów porównujące różne warunki, generują listy zidentyfikowanych i ilościowo określonych peptydów i białek oraz dostarczają wartości Q wraz ze względnymi zmianami fałdowania porównującymi różne warunki. W tym przypadku warunki próbkowania obejmowały robaki w wieku 10 dnia z dwiema kontrpróbami biologicznymi i młode robaki dnia 2 z dwiema kontrpróbami biologicznymi jako kontrolę.

Wyniki

Tradycyjne metody lizy robaków mają różne wady. Na przykład, metody sonikacji oparte na sondzie i ubijaczce perełkowej wytwarzają nadmierne ciepło, umożliwiając bezpośredni kontakt metalowej końcówki lub kulek z próbkami, co skutkuje zmiennym odzyskiem białka i denaturyzacją białka. Mielenie ciekłego azotu, a następnie sonikacja w buforze do lizy, może być czasochłonne i wymaga dużej liczby robaków. Ze względu na ograniczenia tradycyjnych metod lizy robaków, wcześniejsze przepływy pracy związane ze stwardnieniem rozsianym, takie jak metody znakowania iTRAQ lub metody bezznacznikowe, które były historycznie stosowane w systemie modelu C. elegans w celu uzyskania ilościowych informacji o insolublomie, wymagają dużego wkładu materiału wyjściowego (co najmniej 40 000 robaków). Aby uzyskać taką liczbę robaków, wymagana jest pracochłonna praca nad hodowlą robaków. Ponadto metody etykietowania wymagają drogich izobarycznych etykiet chemicznych. Metody oznaczania ilościowego bez znaczników są opłacalne i mają łatwiejsze i prostsze metody przygotowania i etykietowania próbek, ale wymagają znacznie dużej liczby robaków, aby osiągnąć wystarczające pokrycie analizą MS.

Sonicator, którego użyliśmy, znacznie zwiększa efektywność i powtarzalność lizy robaków poprzez lizę wielu próbek robaków jednocześnie w sonikatorze w kąpieli wodnej o kontrolowanej temperaturze bez zanieczyszczenia krzyżowego¹⁴, co znacznie zmniejsza ilość wymaganego materiału wyjściowego robaka. Łącząc wysoce wydajną metodę sonikacji i ilościowe podejście do stwardnienia rozsianego bez znakowania DIA, byliśmy w stanie solidnie określić ilościowo insolublom starszych i młodych robaków przy użyciu ~3,000 robaków. Tutaj przetestowaliśmy i zweryfikowaliśmy skuteczność protokołu oraz porównaliśmy nierozpuszczalność starych i młodych robaków ze szczepu robaków typu dzikiego, N2-Bristol C. elegans. Zastosowaliśmy ten protokół do ekstrakcji i wyizolowania insolublomu od ~ 3,000 starszych i młodych N2 C. elegans (dwie kontrpróby biologiczne dla każdego stanu), a następnie przeprowadziliśmy analizę MS za pomocą kwadrupolowego spektrometru masowego czasu przelotu lub innych systemów MS przy użyciu kombinacji akwizycji zależnej od danych (DDA) i akwizycji niezależnej od danych (DIA / SWATH) w celu identyfikacji i kwantyfikacji białek. Nierozpuszczalne białka najpierw analizowano na żelu Bis-Tris o gradicji 4-12% w celu określenia ilości białka w każdej próbce insolublomu. Jak wykazano w Rysunek 2, próbka insolublomu od robaków w wieku N2 (pasy 2 i 3, eksperymenty replikacji biologicznej) zawiera znacznie więcej białka niż próbki od młodych robaków N2 (pasy 1 i 4, eksperymenty repliki biologicznej).

Po trawieniu w żelu, profile białkowe insolublomu zostały przeanalizowane przez HPLC-MS. Korzystając z tego przepływu pracy, możemy ogólnie zidentyfikować 1000–1500 białek i określić ilościowo 500–1000 białek z frakcji nierozpuszczalnej w SDS o wysokiej odtwarzalności (dane niepublikowane). Tutaj byliśmy w stanie określić ilościowo 989 białek z nierozpuszczalnego N2-Bristol C. elegans, analizując dane DIA i usuwając nadmiarowość: 768 białek zostało znacznie wzbogaconych, a 27 białek uległo znacznemu zmniejszeniu w insolublomie starzejącego się robaka N2 (Dzień 10) w porównaniu z młodymi (dzień 2) przy użyciu zmiany fałdowania co najmniej 1,5 i wartości Q mniejszej niż 0,01 (Rysunek 3A). Jak widać na wykresie histogramu (Rysunek 3B), zmiana fałdowania znacząco zmienionych białek wykazuje rozkład normalny. Wykazano, że starzejące się robaki są znacznie wzbogacone o insolublom: największa zaobserwowana zmiana wykazała, że względna obfitość białka w insolublomie była 592 razy wyższa u starych i młodych robaków; W przypadku 32 białek względna obfitość białka w insolublomie była >250 razy wyższa u starych i młodych robaków, co wskazuje na dramatyczne zmiany w insolublomie wraz z wiekiem.

Po wyodrębnieniu listy nierozpuszczalnych białek, które są znacznie zwiększone u starzejących się robaków i zidentyfikowanych przez bazę robaków (WS271), przeprowadzono analizę szlaku KEGG i ontologii genów (GO) w celu określenia szlaków, które są wzbogacone w starzejącym się insolublomie, aby uzyskać biologiczny wgląd w to, jak odnoszą się one do starzenia. Analiza szlaku KEGG białek zidentyfikowanych w tym badaniu pokazuje wzbogacenie kilku szlaków obejmujących rybosomy, mitochondria, proteasom i spliceosom (Figura 4A). Analiza ontologii genów pokazuje, że insolublom od starzejących się robaków zawiera wiele białek w określonych kategoriach, w tym białka mitochondrialne, rozwojowe, determinanty długości życia dorosłych i białka rybosomalne (Rysunek 4B i tabela uzupełniająca 1A). Następnie porównaliśmy listę białek zidentyfikowanych w tym badaniu z wcześniej opublikowanymi pracami Davida i wsp.² i Mark et al.¹¹, jak pokazano na diagramach Venna (Rysunek 5A,5B). Porównanie wykazało znaczące pokrywanie się zidentyfikowanych białek 394/721 i 444/721 odpowiednio z badaniem Davida i wsp. (Ryc. 5A) i Marka i wsp. (Rycina 5B). Szlaki biologiczne ujawnione w analizie KEGG insolublomu z tego badania zostały również zidentyfikowane w przeszłości, potwierdzając w ten sposób naszą metodologię (Tabela uzupełniająca 1B). Identyfikacja tych szlaków i białek sugeruje, że mogą one służyć jako kandydaci do dalszych badań biologicznych w odniesieniu do ich funkcji w kontekście starzenia.

Podsumowując, użycie efektywnej metody sonikacji umożliwia lizę wielu próbek robaków w tym samym czasie w środowisku o dobrze kontrolowanych temperaturach i zmniejszonym zanieczyszczeniu krzyżowym, aby osiągnąć wysoki poziom białka przy znacznie mniejszej ilości wyjściowego materiału robaków. Połączenie wydajnej metody sonikacji z przepływem kwantyfikacji białek bez znaczników DIA dostarczyło wiarygodnych i powtarzalnych wyników w zakresie kwantyfikacji nierozpuszczalnych białek robaków.

Rysunek 1. Eksperymentalny przebieg pracy protokołu. C. elegans hodowano i zbierano w różne dni. Po lizie robaków za pomocą sonikatora, 1% frakcję białka nierozpuszczalnego w SDS (insolublome) wyekstrahowano i wyizolowano z lizatu. Nierozpuszczalny roztwór był następnie trawiony przez trawienie trypsyny w żelu i oznaczany ilościowo za pomocą spektrometrii mas DIA, a następnie poddany analizie bioinformatycznej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2. Żel SDS-PAGE izolowany przez insolublom młode i stare robaki szczepu N2-Bristol. Insolublomy młodych i starych robaków szczepu N2-Bristol przeanalizowano za pomocą SDS-PAGE w celu określenia ilości obecnego białka. Żel SDS-PAGE został wybarwiony fluorescencyjnym barwnikiem białkowym w celu uwidocznienia prążków białkowych. Pasy 1 i 4: Insolublom z dwóch biologicznych replikacji eksperymentów na młodych robakach N2 (Dzień 2). Pasy 2 i 3: Insolublom z dwóch biologicznych replik eksperymentów na starzejących się robakach N2 (dzień 10). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3. Zidentyfikowano kandydatów na białka wykazujących znaczące zmiany w starszym i młodym insolublomie oraz ich rozkładach zmian fałdowania. (A) Wykres wulkaniczny do ilościowego oznaczania insolublomu dojrzałych i młodych robaków N2-Bristol. Kandydaci z bezwzględną zmianą krotności >=1,5 i wartością Q <0,01 są pokazani jako czerwone kropki. (B) Wykres histogramu dla rozkładu zmian fałdowania znacznie wzbogaconych białek nierozpuszczalnych w SDS w próbkach starszych i młodych robaków. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4. Analiza szlaku KEGG i ontologii genów (GO). (A) Analiza szlaku KEGG insolublomu dnia 10 ułożonego zgodnie z wartością p z bardzo istotną ścieżką pokazaną na górze. (B) Analiza ontologii genów pokazuje, że substancja rozpuszczalna starzejących się robaków jest wzbogacona o wiele białek w określonych kategoriach, w tym białka mitochondrialne, rozwojowe, determinanty długości życia dorosłego i białka rybosomalne. Widok wykresu rozrzutu wizualizuje terminy GO w "przestrzeni semantycznej", w której bardziej podobne terminy są umieszczone bliżej siebie. Kolor bąbelka odzwierciedla wartość p uzyskaną w analizie STRING, natomiast jego rozmiar odzwierciedla ogólność terminu GO w bazie danych UniProt-GOA. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5. Nakładanie się białek insolublomu zidentyfikowano w dniu 10 insolublomu, porównując to badanie z badaniami (A) David et al.² i (B) Mark et al.¹¹. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela uzupełniająca 1 (związana z Rysunek 4 i Rysunek 5). (A) Ontologia genów (proces biologiczny) analizowana za pomocą bazy danych STRING. (B) Szczegółowa lista białek i szlaków KEGG zidentyfikowanych w tym badaniu wraz z kodami kolorystycznymi obrazującymi ich pokrywanie się z opublikowaną pracą. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

W niniejszym protokole przedstawiamy ulepszoną metodę przygotowania próbki do ekstrakcji nierozpuszczalnych białek z C. elegans. Zastępując tradycyjną lizę robaków (np. sonikację sondą lub techniki ubijania kulek) wydajnym sonikatorem, zwiększyliśmy wydajność ekstrakcji nierozpuszczalnego białka i zmniejszyliśmy liczbę robaków potrzebnych do bezznacznikowej analizy MS z 40 000 robaków do 3 000 robaków. Do identyfikacji białek na podstawie danych DDA wykorzystano wyszukiwarkę baz danych, a bibliotekę spektralną C. elegans zbudowano przy użyciu oprogramowania do analizy ilościowej DIA i odpowiednich wyników wyszukiwania w bazie danych DDA (importowanie raportów plików FDR generowanych przez wyszukiwarkę bazy danych). Względną kwantyfikację danych dotyczących insolublomu C. elegans w wieku i młodości przeprowadzono przy użyciu oprogramowania do analizy ilościowej DIA w celu przetworzenia nowego zestawu danych DIA i wygenerowanej biblioteki spektralnej.

W protokole kluczowe znaczenie ma kilka kroków. Krótka długość życia C. elegans sprawia, że jest to idealny system do badania starzenia się w porównaniu z innymi eukariontami, takimi jak komórki ssaków, ale kluczowe znaczenie ma wyizolowanie jednorodnej populacji robaków podczas badania zjawiska związanego ze starzeniem się. FUDR został użyty w tym protokole do uzyskania zsynchronizowanych starzejących się robaków. Ważne jest, aby przenieść robaki na wczesnym etapie L4 na płytkę wysiewaną NGM zawierającą FUDR, aby zapewnić jej skuteczność. Podczas lizy ślimakowej przy użyciu wydajnego sonikatora, temperatura łaźni wodnej musi być ustawiona na 4 °C, a sonikacja na 30 s ON i 30 s OFF, aby zapobiec przegrzaniu próbek. Po pierwszej rundzie sonikacji przez 10 cykli (10 minut) ważne jest, aby sprawdzić pod mikroskopem, aby upewnić się, że wszystkie robaki zostały skutecznie zmielone. Jeśli nie, potrzebne są kolejne cykle sonikacji. Podczas procesu trawienia w żelu każdy plasterek żelu musi zostać pokrojony w kostkę na kawałki o odpowiedniej wielkości (<1^mm2) – jeśli są zbyt małe, mogą zostać utracone w procesie przygotowania próbki, a jeśli są zbyt duże, trawienie może być niewystarczające.

Zapotrzebowanie na znacznie mniejszą ilość materiału wyjściowego znacznie zmniejsza pracochłonność związaną z hodowlą robaków w celu uzyskania próbek do analiz insolubolomów. Jednak ekstrakcja i izolacja 1% frakcji białkowej nierozpuszczalnej w SDS obejmuje wiele etapów płukania i wymagane jest ostrożne obchodzenie się z próbką, aby uniknąć utraty próbki i zapewnić powtarzalne wyniki. Ilość materiału wygenerowanego do analizy stwardnienia rozsianego jest wystarczająca na ~3 wstrzyknięcia do późniejszej analizy DDA i DIA, ale nie pozwala na zaoszczędzenie na przyszłe eksperymenty. Ponadto, pomimo potencjalnie mylących skutków¹⁵, użyliśmy najniższego możliwego stężenia FUdR do sterylizacji robaków podczas procesu starzenia. Przyszłe badania mogą obejść stosowanie FUdR poprzez stosowanie sterylnych mutantów lub ręczne przenoszenie i zbieranie robaków.

Zastosowanie wysoce wydajnego sonikatora do lizy robaków pozwala na wydajną ekstrakcję insolublomu, umożliwiając dobre pokrycie białkami i opłacalną analizę DIA MS bez znaczników w celu ilościowego określenia insolublomu przy użyciu znacznie zmniejszonej liczby robaków. Znacznie zmniejsza to nakład pracy, umożliwiając badanie przesiewowe pod kątem większej liczby warunków w jednym eksperymencie. Ponadto bezznacznikowy przepływ pracy MS DIA jest ekonomiczny i zapewnia głębokość i pokrycie białka na poziomach porównywalnych z metodami znakowania, takimi jak iTRAQ, TMT lub SILAC. Model C. elegans to szybki system przesiewowy do badań nad starzeniem się. Przepływ pracy można łatwo modyfikować i stosować do badania starzenia się i chorób związanych z wiekiem w tym i innych organizmach. Na przykład w trwających badaniach stosujemy ten przepływ pracy do badania profili białkowych insolublomu i proteostazy w różnych modelach C. elegans w chorobie Alzheimera (AD), w tym robakach Abeta, tau i podwójnych robakach Abeta/tau z różnymi interwencjami lekowymi lub bez nich, w celu przyszłych wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Użyte szczepy
Esherichia coli OP50	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)
N2 (Bristol)	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)
Buffer/Solution
NGM (Pożywka do wzrostu nicieni)			Receptura: 3 i thinsp; g / L NaCl, 23 i cienkie; g/L agaru; 2,5 i cienkie; pepton g/l; 1 i cienkie; mM CaCl2, 5&cienkie; mg / L cholesterolu, 1 i thinsp; mM MgSO4, 25 i cienkie; mM KH2PO4
S-podstawowy roztwór			Przepis: 5,85 g/L NaCl, 1g/L K2HPO4, 6 g/L KH2PO4, H2O do 1 l
roztworu			Przepis: Wymieszaj 0,5 ml 5 N NaOH z 1 ml podchlorynu sodu (5%) i zwiększ objętość do 5 ml z H20.
Materiał/ Sprzęt
Agar	Difco Granulowany agar, BD Biosciences	90000-782
Urządzenie soniczne Bioruptor Plus	Diagenode, USA	B01020001
Cholesterol	Sigma	c8503
2'-deoksy-5-fluorourydyna	VWR	TCD2235
Glicerol	Bulion Millipore Sigma	356350-1000ML
LB, Miller	Millipore Sigma	60801-450
Dodecylosiarczan sodu (SDS?	Sigma	L4509-250G
Chlorek sodu	Sigma	59888
M880 Kąpiel ultradźwiękowa, 117 V, mieści 5,5 galona	VWR, USA	89375-458
Siarczan magnezu	Sigma	M506
Chlorek magnezu		Płytka
NGM	Jednorazowe szalki Petriego VWR	25384-342
Bufor do próbek NuPAGE LDS (4X)	Thermo Fisher Scientific	NP0007
Żele białkowe NuPAGE, 4-12%	Invitrogen	NP 0335BOX
Koktajl proteazy inhibiotr ()	Test
Pierce Thermo	Fisher Scientific	23225
Podchloryn sodu 5%	VWR	JT9416-1
SYPRO Ruby Protein Gel Stain	Thermo Fisher Scientific	S12000
MS Sekcja
Acetonitryl, Burdick and Jackson LC-MS	Honeywell International Inc., Charlotte, NC, USA	36XL66
Kolumna Agilent Zorbax 300Extend C18	Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA, USA	770995-902
Amon wodorowęglan	Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA	9830 (1 kg)
Dithiothreitol (DTT)	Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA	D9779-5G
Eppendorf Thermomixer Compact	Eppendorf AG, Hamburg, Niemcy	T1317-1EA
Kwas mrówkowy	Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA	F0507-500ML
Indeksowany standard peptydu normalizującego czas retencji (iRT)	Biognosys AG, Schlieren, Zurych, Szwajcaria	Ki-3002-2
Jodoacetamid (IAA)	Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA	I1149-25G
Metanol, klasa HPLC	Honeywell International Inc., Charlotte, NC, USA	34885
Pułapka Nano cHiPLC ChromXP C18-CL, 200 um x 6 mm, 3 um, 120A. (układ przedkolumnowy) (układ ChromXP C18-CL 200 um x 6 mm, 3 um, 300 A)	Sciex LLC, Framingham, MA, USA	804-00006
Nano cHiPLC ChromXP 75 um na 15cm, C18-CL, 3 um, 120 A (układ kolumny analitycznej)	Sciex LLC, Framingham, MA, USA	804-00001
Spektrometr masowy Orthoganol kwadrupol czasu przelotu (QqTOF)	Sciex LLC, Framingham, MA, USA	Za wycenę
ProteinPilot 5.0	Sciex LLC, Framingham, MA, USA	pobieranie oprogramowania Sciex
Savant SPD131DDA Koncentrator Speedvac	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	SPD131DDA-115
Liofilizowana trypsyna klasy sekwencjonującej	Life Technologies	23225
Spectronaut	Biognosys AG, Schlieren, Zurych, Szwajcaria	Wtyczka SW-3001
SWATH 2.0 do PeakView 2.2	Sciex LLC, Framingham, MA, USA	pobieranie oprogramowania Sciex
System HPLC Ultra Plus nano-LC 2D	Sciex LLC, Eksigent Division, Framingham, MA, USA	Model # 845
Water, Burdick and Jackson LC-MS	Honeywell International Inc., Charlotte, NC, USA	600-30-76
Binarny system pomp HPLC Waters 1525	Waters Corp., Milford, MA, USA	WAT022939
Waters 2487 Detektor UV o podwójnej długości fali	Waters Corp., Milford, MA, USA	WAT081110
Automatyczny podajnik próbek Waters 717plus	Waters Corp., Milford, MA, Stany Zjednoczone	WAT022939
Waters Fraction Collector III	Waters Corp., Milford, MA, Stany	Zjednoczone 186001878