Ilościowe podejścia do oceny in vivo agregatów neuronalnych i ekstruzji organelli w dużych pęcherzykach egzoferyjnych u C. elegans

Podsumowanie

Ten protokół opisuje podejścia do wykrywania i ilościowego oznaczania dużych zagregowań i/lub organelli (~4 μm) wytwarzanych przez komórki C. elegans w postaci egzoferów związanych z błoną. Opisujemy szczepy, warunki wzrostu, kryteria punktacji, czas i rozważania mikroskopowe potrzebne do ułatwienia sekcji tego mechanizmu wydalania gruzu.

Streszczenie

Toksyczność nieprawidłowo sfałdowanych białek i dysfunkcja mitochondriów są kluczowymi czynnikami, które sprzyjają związanemu z wiekiem funkcjonalnemu spadkowi neuronów i chorobom neurodegeneracyjnym u różnych gatunków. Chociaż te neurotoksyczne wyzwania od dawna są uważane za nieodłączne od komórek, obecnie istnieją znaczne dowody na to, że nieprawidłowo sfałdowane białka chorób ludzkich pochodzące z jednego neuronu mogą pojawiać się w sąsiednich komórkach, co jest zjawiskiem proponowanym do promowania rozprzestrzeniania się patologii w ludzkiej chorobie neurodegeneracyjnej.

C. elegans dorosłe neurony, które wyrażają białka agregujące, mogą wydzielać duże (~4 μm) pęcherzyki otoczone błoną, które mogą zawierać zagregowane białka, mitochondria i lizosomy. Te duże pęcherzyki nazywane są "egzoferami" i różnią się od egzosomów (które są około 100 razy mniejsze i mają różną biogenezę). Wyrzucanie szczątków komórkowych w egzoferach może zachodzić przez konserwatywny mechanizm, który stanowi podstawową, ale wcześniej nierozpoznaną, gałąź proteostazy neuronalnej i kontroli jakości mitochondriów, istotną dla procesów, w których agregaty rozprzestrzeniają się w ludzkich chorobach neurodegeneracyjnych.

Podczas gdy egzofery były głównie badane u zwierząt, które wykazują wysoką kopię transgenicznego mCherry w neuronach dotykowych, te protokoły są równie przydatne w badaniu egzoferenezy przy użyciu fluorescencyjnie znakowanych organelli lub innych interesujących białek w różnych klasach neuronów.

Opisane tutaj są cechy fizyczne egzoferów C. elegans, strategie ich wykrywania, kryteria identyfikacji, optymalny czas na oznaczanie ilościowe oraz protokoły wzrostu zwierząt, które kontrolują stres, który może modulować poziom produkcji egzoferów. Przedstawione tutaj szczegóły protokołów powinny posłużyć do ustanowienia standardu analizy ilościowej egzoferów w różnych laboratoriach. Dokument ten ma służyć jako źródło informacji w tej dziedzinie dla laboratoriów dążących do opracowania mechanizmów molekularnych, za pomocą których wytwarzane są egzofery i za pomocą których egzofery są reagowane przez sąsiednie i odległe komórki.

Wprowadzenie

Neurotoksyczne wyzwania związane z agregatami i dysfunkcyjnymi mitochondriami od dawna uważane są za nieodłączne od komórki, ale ostatnio stało się jasne, że nieprawidłowo sfałdowane białka chorób ludzkich pochodzące z jednego neuronu mogą również rozprzestrzeniać się na sąsiednie komórki, promując patologię¹. Podobnie, mitochondria ssaków mogą zostać wysłane z komórki ich pierwotnej produkcji w celu degradacji transkomórkowej² lub w celu uratowania populacji mitochondriów w zagrożonych sąsiednich komórkach³. Na ogół zaobserwowano, że pęcherzyki o różnych rozmiarach przenoszą materiał komórkowy do sąsiednich komórek lub do płynnego otoczenia⁴. Niektóre wytłaczane pęcherzyki zbliżają się do wielkości przeciętnej somy neuronalnej (średni dotyk neuronu soma ~ 6 μm) i mogą pomieścić duże agregaty i organelle.

Uderzający przykład wytłaczania dużych pęcherzyków, które mogą przenosić agregaty białkowe i organelle, występuje w neuronach receptora dotyku C. elegans, które wyrażają konstrukt reporterowy o wysokiej liczbie kopii, kodując szkodliwy, podatny na agregację, odporny na degradację mCherry⁵. Wytłoczenia z neuronów dotykowych, zwane egzoferami, mają średnią średnicę ~4 μm, selektywnie obejmują mCherry lub inne agregaty i są dostarczane bezpośrednio do sąsiedniej tkanki podskórnej, która normalnie otacza neurony receptora dotyku. Tkanka podskórna próbuje degradacji opartej na lizosomach, ale niektóre niestrawne treści, takie jak agregaty mCherry, mogą być ponownie wytłaczane przez tkankę podskórną do wypełnionego płynem pseudocoelom zwierzęcia, z którego mCherry może zostać pobrana przez odległe komórki zmiatacze zwane celomocytami do długotrwałego przechowywania (Rysunek 1, Rysunek 2)⁵.

Duże, ekstrudowane pęcherzyki egzoferowe opuszczają komórkę otoczoną błoną plazmatyczną receptora dotyku i mogą zawierać zagregowane białka chorób ludzkich, mitochondria i lizosomy. Wydaje się, że proces produkcji egzoferów obejmuje sortowanie potencjalnie toksycznych gatunków (na przykład mCherry ulega ekspresji podatnej na agregację, jest oddzielany od rozpuszczalnych, nieszkodliwych białek, takich jak GFP, które pozostają głównie w somie neuronalnej). W ten sposób ukierunkowane wydalenie zagrażających istot jest realizowane przez neuron⁵. Wyzwanie proteostazy, takie jak stres wywołany przez knockdown autofagii, hamowanie proteasomu za pośrednictwem MG132 lub transgeniczna ekspresja ludzkich białek chorobowych, takich jak ekspandowana poliglutamina Q128 związana z chorobą Huntingtona lub związany z chorobą Alzheimera fragment Aβ_1-42, może zwiększyć liczbę neuronów, które wytwarzają egzofery⁵.

Ponieważ egzofery dopiero niedawno zostały udokumentowane, to, co wiadomo o ich biologii, zasługuje na opis. Egzofery zostały odkryte w neuronach receptorów dotyku C. elegans i są najlepiej przebadane. Istnieje sześć mechanosensorycznych neuronów dotykowych C. elegans, które mają ciała komórkowe rozmieszczone wokół ciała (Rysunek 3A) i nazywane są komórkami mikrotubul, ponieważ ich ultrastruktura zawiera charakterystyczne 15 mikrotubul protofilamentowych. Neurony receptora dotyku to przedni AVM (przedni brzuszny neuron mikrotubulowy), ALMR i ALML (przednie boczne neurony mikrotubul prawe i lewe), bardziej centralny PVM (tylny brzuszny neuron mikrotubulowy) oraz tylne PLMR i PLML (tylne boczne neurony mikrotubul prawe i lewe) w ogonie. Co ciekawe, sześć neuronów receptorów dotyku wytwarza egzofery w różnym tempie, pomimo ekspresji tego samego ofensywnego transgenu (Figura 3C). Spośród sześciu neuronów mechanosensorycznych receptorów dotyku, neuron ALMR ulega egzofergenezie częściej niż inne neurony dotykowe. Kwantyfikacja liczb egzoferów z neuronów dotykowych jest zatem zwykle ustalana poprzez skupienie się na ALMR.

Egzofereneza to dynamiczny proces, który zazwyczaj zaczyna się od obrzęku cytoplazmy neuronalnej (Rysunek 1A-B). Zawartość komórkowa, organelle lub agregaty białkowe są zbierane po jednej stronie somy neuronalnej, najczęściej w kierunku tylnego końca neuronu ALMR (z dala od wystającego neurytu), tworząc domenę przedegzopową (PED) (Figura 1B). Wczesny występ obserwuje się, gdy PED zaczyna wychodzić na zewnątrz, tworząc rozpoznawalny wystający pączek. Późny pączek jest definiowany, gdy najszersza średnica domeny przed-eksopherowej jest w przybliżeniu o 1/3 większa niż średnica zwężenia szyjki soma-eksophera (Ryc. 1C). Egzofery mogą być wyrzucane w prawie każdym kierunku z somy, ale większość egzoferów wychodzi z tyłu ciała komórki i pozostaje w przybliżeniu w tej samej płaszczyźnie ogniskowej, co soma źródłowa.

Eksofer może oddalać się od somy, z której pochodzi, gdy szyjka pąka zwęża się do cienkiego włókna. Egzosfery mogą pozostać przyczepione do somy za pośrednictwem tego włókna (Rysunek 1D, strzałka) i mogą później ulec odłączeniu. Zawartość komórkowa, taka jak wapń, agregaty i mitochondria, może być przenoszona za pośrednictwem tego włókna do dołączonego exopher⁵, chociaż większość wytłaczanego materiału jest umieszczana w komorze eksophera przez masowe pączkowanie. Egzofery uważa się za dojrzałe, gdy nie ma widocznej rurki łączącej lub cienkiego włókna, a eksofer jest całkowicie oddzielony od wysyłającej somy (Rysunek 1E).

Egzofery wytwarzane przez neurony dotykowe C. elegans natychmiast napotykają tkankę podskórną, która otacza neuron dotykowy. Najczęściej pęcherzyk egzoferowy wydaje się przemieszczać w obrębie tkanki podskórnej do tyłu w kierunku ogona i może być dość daleko od somy, zanim zawartość egzoferu wydaje się być przeznaczona do degradacji (na przykład odległość może wynosić ~100 μm od somy (Rysunek 1F)). Fluorescencyjny pęcherzyk egzoferowy rozpada się na wiele mniejszych pęcherzyków w obrębie tkanki podskórnej, przybierając wygląd określany jako "gwiaździsta noc" (Ryc. 1G i Ryc. 2). W fazie "gwiaździstej nocy" można zaobserwować punktowy materiał fluorescencyjny rozproszony po syncytium podskórnym w wielu mniejszych punktach fluorescencji w porównaniu z pierwotnym pojedynczym egzoferem. Gwiaździsta noc może wyglądać na punktową w małym powiększeniu, a przy większym powiększeniu może wyglądać na punktową i/lub połączoną w sieć w obrębie tkanki podskórnej. Sygnał fluorescencyjny gwiaździstej nocy jest zazwyczaj ciemniejszy niż eksofer i fluorescencja wyrażana neuronalnie (Rysunek 2B-C). Uważa się, że dyspersja mCherry w wielu punktowych pęcherzykach obejmuje dojrzewanie fagosomu i fuzję z siecią endosomalną / lizosomalną komórki podskórnej. Niektóre materiały egzoferowe są prawdopodobnie degradowane w podskórnej sieci lizosomalnej, ale szczątkowe gatunki, które są odporne na degradację (takie jak agregaty mCherry) są wyrzucane z tkanki podskórnej do pseudocoelom, płynnego przedziału, który może zawierać resztki komórkowe. Materiał fluorescencyjny jest później pobierany przez odległe komórki zmiatacze zwane celomocytami (Rysunek 2C), które mogą koncentrować, przechowywać i ponownie próbować degradacji mCherry.

Zjawisko ekstruzji i transferu agregatów wydaje się być zachowane w całej typie, zostało odnotowane w modelach genetycznych, takich jak C. elegans5^,6^,7 i D. melanogaster^8,9, a także w wielu modelach ssaków. Egzoferowe ekstruzje zostały zgłoszone dla komórek ssaków¹⁰, co sugeruje, że konserwatywne mechanizmy mogą leżeć u podstaw wydalania agregatów i organelli. Produkcja egzoferów może być zatem konserwatywnym mechanizmem zarządzania resztkami komórkowymi, który stanowi podstawową, ale wcześniej nierozpoznaną, gałąź proteostazy neuronalnej i kontroli jakości mitochondriów, która, gdy jest niezrównoważona, może aktywnie przyczyniać się do chorób neurodegeneracyjnych. Identyfikacja cząsteczek biorących udział w rozróżnianiu i sortowaniu szczątków, transporcie do odrębnej lokalizacji subkomórkowej, ekstruzji, tworzeniu/rozcinaniu połączenia rurkowego łączącego somę i późny egzofer oraz rozpoznawaniu dużego wytłaczanego pęcherzyka do odległej degradacji przez sąsiednią komórkę pozostaje do przyszłych prac. Badania na modelach nicieni i much będą miały kluczowe znaczenie dla zdefiniowania mechanizmów zbierania i przenoszenia agregatów i organelli, wykorzystując bezstronne podejścia genetyczne i potężne narzędzia biologiczne oferowane przez te modele w celu identyfikacji uczestniczących cząsteczek w kontekście fizjologicznym.

Kluczowe pierwsze kroki w rozszyfrowywaniu mechanizmów działających w biologii egzoferów obejmują zdefiniowanie protokołów odtwarzalnej kwantyfikacji egzoferów in vivo. Model C. elegans oferuje szczególną zaletę dla takich wysiłków, ponieważ ciało jest przezroczyste, a egzofery można łatwo zaobserwować, gdy zawierają fluorescencyjnie znakowane białka lub organelle. Doniesiono, że egzofery są generowane przez neurony dopaminergiczne C. elegans, neurony czuciowe PDE i, ASE i ASER oraz neurony amfidowe wypełniające barwniki⁵. Ponieważ egzofery wytwarzane przez neurony receptorów dotyku są najlepiej scharakteryzowane, skupiono się tutaj na wykorzystaniu neuronów dotykowych do analizy egzoferów. Jednak podstawowe podejście można zastosować do pomiaru produkcji egzoferów z dowolnej komórki. Przedstawiono protokoły wykrywania i ilościowego oznaczania egzoferów wytwarzanych przez neurony receptora dotyku C. elegans, które transgenicznie eksprymują białko mCherry, z naciskiem na ładunki, które można monitorować, oraz ograniczenia czasowe w punktacji. W tym artykule zdefiniowano podejścia do identyfikacji egzoferów in vivo oraz ilościowe określenie warunków środowiskowych i genetycznych, które modulują produkcję egzoferów. Protokoły kładą nacisk na stałe warunki bezstresowe w celu określenia wyjściowej produkcji eksopferów i porównań między genotypami.

Protokół

1. Szczepy przydatne do wykrywania ekspoferów

1. Wybierz szczep, który wyraża fluorescencyjne ładunki w neuronach C. elegans, aby łatwo uwidocznić egzofery.
   UWAGA: Tabela 1 zawiera listę szczepów, które zostały użyte do wizualizacji egzoferów wytwarzanych w neuronach receptorów dotyku^5,11,12. Zasadniczo każdy typ komórki lub neuronu może być testowany pod kątem produkcji egzoferów za pomocą promotora specyficznego dla komórki lub tkanki do napędzania ekspresji białka fluorescencyjnego, które agreguje lub jest w inny sposób wybrane do wytłaczania.
2. Alternatywnie, użyj testu wypełniania barwnikiem, aby uwidocznić egzofery w neuronach głowy amphid, które są otwarte na środowisko i podatne na zasypywanie^5,13.

2. Podłoże wzrostu

1. Przygotuj standardowe pożywki hodowlane nicieni (NGM) do hodowli szczepów zgodnie ze standardowymi metodami^14,15.
   UWAGA: Brak pożywienia lub fluoro-deoksyurydyny (FuDR), powszechnie stosowanej do blokowania produkcji potomstwa i może dramatycznie wpłynąć na produkcję egzoferów. Utrzymuj populację w sposób ciągły (unikaj nawet krótkich okresów bakteryjnego wyczerpania pokarmem) i utrzymuj zwierzęta w stałej temperaturze.

3. Hodowla zwierząt ma kluczowe znaczenie dla stałej produkcji eksopherów

1. Hoduj zwierzęta na spójnych pożywkach i ze stałymi bakteryjnymi źródłami pożywienia. Zwierzętom nie może zabraknąć pokarmu bakteryjnego, nawet przez krótki czas, ponieważ ograniczenie pożywienia może radykalnie zmienić poziom produkcji eksopherów.
2. Utrzymuj jednolitość receptur i przygotowania pożywek przez cały czas trwania badania.
   UWAGA: Zmiana pożywki może wpłynąć na podstawowy poziom produkcji eksofera. Partie agaru mogą wpływać na wyjściowe poziomy eksofera, więc gdy partie zaopatrzenia ulegną zmianie, zanotuj datę. Wyrzuć talerze zapasowe po dwóch tygodniach, aby zapewnić zdrowe pożywienie bakteryjne i zapobiec wysuszeniu agaru, który powoduje zmiany w osmolarności agaru, które wpływają na poziom eksoferów.
3. W warunkach podstawowych należy utrzymywać zwierzęta w stałej temperaturze 20 °C. Hodowla zwierząt w zmiennych temperaturach (nawet tymczasowe zmiany temperatury) może powodować różnice w czasie maksymalnej produkcji eksoferów.
   UWAGA: Zmienność temperatury nie ogranicza się do warunków hodowli. Wahania temperatury podczas eksperymentów lub na stole laboratoryjnym mogą mieć wpływ. Na przykład temperatury w pomieszczeniu mikroskopowym nie powinny się drastycznie różnić od temperatury w inkubatorze hodowli lub na stole laboratoryjnym.
4. Nie należy stosować farmakologicznych interwencji przeciwpłodnościowych, ponieważ zapłodnione jaja mają kluczowe znaczenie dla wczesnej produkcji egzoferów u dorosłych.
   UWAGA: Należy unikać stosowania fluoro-deoksyurydyny (FuDR)¹⁶ lub C22¹⁷. Podczas przeprowadzania eksperymentów na zwierzętach na długości życia lub na starości, populacje zsynchronizowane pod względem wieku powinny być utrzymywane poprzez fizyczne usuwanie dorosłych osobników z ich mniejszego potomstwa poprzez zbieranie ich na świeże płytki rozsiane z bakteriami, a nie stosowanie powszechnych farmakologicznych interwencji przeciwpłodności.
5. Nie należy używać skażonych kultur; wznowić eksperymenty w przypadku biologicznego zagrożenia populacji lub płytki. Zanieczyszczenie bakteryjne lub grzybicze może wywoływać stres i zmiany metaboliczne u zwierząt i musi być nieobecne w populacjach doświadczalnych.
   1. Aby zmaksymalizować powtarzalne wyniki, przed eksperymentami należy utrzymywać kultury przez co najmniej dwa zdrowe, dobrze odżywione, wolne od zanieczyszczeń pokolenia w temperaturze 20 °C, aby uniknąć potencjalnych zmian epigenetycznych wywołanych przez środowisko.

4. Synchronizacja wieku dla oceny exopher poprzez bielenie, flotację sacharozy lub zbieranie larw L4

1. Utrzymuj populacje doświadczalne w tym samym wieku biologicznym, ponieważ wzorce wykrywania egzoferów różnią się w zależności od wieku dorosłego, a porównanie zwierząt w populacjach mieszanych wiekowo może zakłócić wyniki. Zawsze należy zapewnić pomyślną synchronizację populacji zwierząt doświadczalnych, sprawdzając morfologię sromu "białego półksiężyca" na etapie L4.
   UWAGA: Ogólnie rzecz biorąc, szczytowa produkcja egzoferów dla mechanosensorycznych neuronów ALMR C. elegans występuje w 2-3 dniu dorosłego (Ryc. 3D), mierzona od dni po etapie L4. Dorosły dzień 1 to 24 godziny po stadium larwalnym L4, które wyróżnia się morfologią sromu "białego półksiężyca" (Ryc. 5E).
2. Przygotuj zsynchronizowane populacje jaj poprzez bielenie ciężarnych dorosłych osobników.
   1. Zbieraj grawitacyjne dorosłe osobniki wypełnione jajami, myjąc zwierzęta rosnące na talerzu NGM. Aby przemyć, zalać płytkę 1 ml buforu M9, pipetować w górę i w dół, aby zebrać płyn z zawieszonymi zwierzętami i pipetować do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Granulować zwierzęta przez osiadanie grawitacyjne lub delikatne wirowanie za pomocą mini wirówki i usunąć supernatant.
   2. Dodać 150 μl 5M NaOH i 150 μL 6% podchlorynu sodu (wybielacza) w 1 ml w H₂O i mieszać przez inwersję przez około 5 minut.
      UWAGA: Świeży roztwór wybielający zapewnia, że naskórek zwierzęcia może zostać naruszony podczas zbioru jaj. Postęp w niszczeniu naskórka można monitorować pod mikroskopem preparacyjnym; Dorosłe osobniki powinny rozbijać i uwalniać jaja w momencie, w którym należy zatrzymać bielenie.
   3. Delikatnie odwirować za pomocą minirurki wirówkowej przez 20 s i usunąć supernatant. Dodać 1 ml buforu M9 i ponownie odwirować, pozostawiając około 100 μl na wierzchu osadu.
   4. Powtórz kroki 4.2.3 dwukrotnie, aby usunąć ślady roztworu wybielacza.
   5. Ponownie zawieś jaja w pozostałej objętości i przenieś na świeżo wysianą płytkę NGM. Dorosłe osobniki zostaną poddane lizie, ale w przygotowaniu powinno znaleźć się wiele żywotnych jaj.
3. Przygotuj zsynchronizowane populacje według czasowego składania jaj.
   1. Wybierz 20 dorosłych osobników grawiacznych na talerz NGM z nasionami, korzystając ze standardowych protokołów transferu¹⁴.
   2. Pozwól zwierzętom swobodnie pełzać i składać jaja przez 1,5 godziny (zmutowane szczepy o małych rozmiarach lęgów mogą wymagać wprowadzenia większej liczby dorosłych zwierząt).
   3. Usuń wszystkie dorosłe zwierzęta z talerza, zbierając, pozostawiając zsynchronizowaną populację jaj. Sprawdź płytki kilka godzin później, aby upewnić się, że żadne zdolne do życia osobniki dorosłe nie zostały pominięte podczas usuwania osobnika dorosłego.
4. Przygotuj zsynchronizowane populacje jaj poprzez selekcję jaj przez flotację sacharozy.
   1. Zebrać zwierzęta i jaja z pięciu płytek NGM, na których ciężkie zwierzęta składały jaja przez co najmniej 24 godziny, zalewając płytki roztworem M9 z 0,1% detergentem (takim jak Tween 20 lub Triton X-100) i zbierając do probówki o pojemności 15 ml. Dorosłe osobniki osadzać przez delikatne odwirowanie w temperaturze pokojowej (2 000 x g przez 30 s).
   2. Usunąć sklarowany osad i umyć zwierzęta trzykrotnie w 15 ml świeżego M9, wyrzucając supernatant po każdym myciu, upewniając się, że osad jest wzbogacony w zwierzęta i jaja.
   3. Zachować 2 ml supernatantu i ponownie zawiesić osad. Dodaj 2 ml sacharozy o stężeniu 60% objętości.
   4. Wirować przy 2000 x g przez 5 min. Roztwór będzie teraz wyświetlał górną fazę wysoko wzbogaconą w jaja.
   5. Przenieś około 2,5 ml górnej fazy do nowej probówki o pojemności 15 ml i dodaj 10 ml M9.
   6. Mieszać przez odwrócenie przez 1 min, a następnie odwirować 2000 x g przez 1 min.
   7. Usunąć supernatant i umyć osad wzbogacony w jaja w M9. 10-15 μl granulki jajecznej można rozprowadzić na świeżą płytkę NGM z nasionami OP50.
      UWAGA: Ta metoda przygotowuje dużą liczbę jaj; nie dopuścić do tego, aby zebranym zwierzętom zabrakło pokarmu OP50 E. coli.
5. Przygotuj zsynchronizowane populacje, wybierając zwierzęta na etapie rozwoju L4.
   1. Hoduj zwierzęta na wysianych płytkach NGM, jak opisano powyżej.
      UWAGA: C. elegans rozwija się w czterech odrębnych etapach. W temperaturze 20 °C nowo złożone jajo potrzebuje około 9 godzin, aby się wykluć (Rysunek 5A). Po wykluciu zwierzę przechodzi przez stadium larwalne 1 (L1) do stadium larwalnego 4 (L4), przy czym każdy etap trwa 8-12 godzin między każdym linieniem (Ryc. 5A-F). Dlatego na płytce przygotowanej przez zaszczepienie jajami powinno znajdować się wiele zwierząt L4 do pobrania około 40 godzin po wprowadzeniu jaj.
   2. Zidentyfikuj zwierzęta w stadium L4, lokalizując biały kształt półksiężyca rozwijającego się sromu (Rysunek 5E).
      UWAGA: Zwierzęta w stadium L4 są jednolite pod względem wielkości i pigmentacji ciała. Wybieraj zwierzęta z białym półksiężycem na świeżą płytkę wzrostową w celu zbadania zwierząt w inscenizacji. Następny dzień (~ 24 godziny później) powinien być liczony jako 1 dzień dla dorosłych.
   3. Oceniaj populację zwierząt dziennie w dniu dorosłości 2,
      UWAGA: Egzofery są zwykle oceniane w 2 dniu dorosłości, co jest szczytową produkcją egzoferów w warunkach podstawowych. Jednakże, ponieważ szczyt i czas egzoferenezy mogą być przesunięte przez badane zmiany środowiskowe lub genetyczne, zaleca się ocenianie populacji dorosłych zwierząt codziennie przez cztery dni, aby uzyskać najbardziej wszechstronny obraz (Rysunek 3D).

5. Wykrywanie egzoferów za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego

1. Obserwuj egzofery za pomocą pseudostereoskopowego mikroskopu preparacyjnego o dużym powiększeniu, który jest przystosowany do mikroskopii fluorescencyjnej.
2. Unieruchomić zwierzęta na płytkach NGM, pipetując 100-200 μl 10-100 mM roztworu lewamizolu/tetramizolu na powierzchnię płytki agarowej NGM. Po 2-4 minutach zwierzęta zostają sparaliżowane i można je obserwować bezpośrednio na płytce agarowej.
   UWAGA: Zabiegi unieruchamiania nie są absolutnie wymagane, więc przy wprawnym oku identyfikacja neuronów i obecność eksopherów mogą być ocenione poprzez wizualne śledzenie pełzających zwierząt pod mikroskopem na płytce podczas określania, czy egzofer został wyprodukowany, czy nie.
3. Obserwuj neurony fluorescencyjne przy użyciu całkowitego powiększenia 100x, aby uzyskać wykrywanie egzoferów pod mikroskopem.
   UWAGA: Ocenianie zdarzeń egzoferyjnych za pomocą mikroskopii preparacyjnej pozwala na stosunkowo łatwą obserwację dużej liczby zwierząt bezpośrednio na płytkach agarowych, na których są hodowane.
4. Obrazowanie na żywo i montaż szczepów reporterowych do badań egzoferowych przy użyciu mikroskopii konfokalnej
   1. Użyj mikroskopu konfokalnego, aby zobrazować na żywo dynamikę wewnątrzkomórkową i charakterystykę egzofergenezy.
      UWAGA: Obrazowanie na żywo jest korzystnym podejściem do obserwacji subtelnych szczegółów produkcji eksopherów, ponieważ produkcja egzoferów jest procesem dynamicznym.
   2. Ogranicz ruchy zwierząt w celu obrazowania na żywo w wysokiej rozdzielczości przy użyciu wygodnych metod, w tym wykorzystania lewamizolu lub tetramizolu w odległości 10-100 mM lub aplikacji hydrożelowych mikrogranulek polistyrenowych (o średnicach 15 μm, 30 μm lub 40 μm)¹⁸.
5. Przygotowanie szkiełek podstawowych do mikroskopii złożonej i konfokalnej
   1. Zamontuj 20-50 zwierząt w środku unieruchamiającym na szkiełku mikroskopowym. Do montażu przydatne są szkiełka cytologiczne wielokrotnego użytku z wypukłymi pierścieniami o średnicy 13 mm.
   2. Weź żywe zwierzęta do 5-20 μl środka paralitycznego, takiego jak 10-100 mM lewamizolu lub tetramizolu w namalowanym okręgu lub na podkładce agarowej.
   3. Odczekaj 4 minuty na paraliż, a następnie przykryj szkiełko szkiełkiem nakrywkowym (zalecane nr 11/2 (0,16 – 0,19 mm) lub nr 2 (0,17 – 0,25 mm).
6. Montaż małej liczby zwierząt
   1. Nie zgniataj zamontowanych zwierząt; obserwując tylko kilka (mniej niż 20) zwierząt na szkiełko, istnieje ryzyko zmiażdżenia niektórych zwierząt z powodu nierównomiernego nacisku szkiełka nakrywkowego. Ryzyko to można zminimalizować, używając niskoprocentowej podkładki agarozowej do montażu.
   2. Zrób 2-4% szkiełko z agarozy, a następnie dodaj 2-15 μl roztworu paraliżującego do podkładki. Należy pamiętać, że lewamizol i tetramizol przenikają do wkładki, zmniejszając ich efektywne stężenie.
   3. Zamontuj, zbierając zwierzęta do kropli o objętości 2-15 μl roztworu paraliżującego lub mikrogranulek spoczywających na podkładce agarowej. Umieść szkiełko nakrywkowe na wierzchu i sprawdź, czy zwierzęta są nienaruszone¹⁸.
7. Przygotowanie podkładki agarowej
   1. Aby przygotować 2% waciki agarowe, podgrzej 2% agarozę w roztworze M9 i mikrofalówkę, aż agaroza znajdzie się w stanie jednorodnym i stopionym.
   2. Aby uzyskać podkładkę agarową o wystarczającej jakości, naprzemiennie mieszaj i podgrzewaj w kuchence mikrofalowej z małą mocą przez mniej niż 20 sekund. Unikaj umieszczania pęcherzyków powietrza w podkładce, umieszczając wrzący agar na bloku grzewczym i pozwalając pęcherzykom wypłynąć na powierzchnię.
   3. Użyj pipety Pasteura, aby pobrać agar z głębi stopionego roztworu poniżej wyrośniętych pęcherzyków.
   4. Przygotuj dwa zaklejone taśmą szkiełka podstawowe i umieść po obu stronach czystego szkła mikroskopowego na płaskiej powierzchni. Aby wykonać zaklejone szkiełka, umieść dwa 5 cm paski taśmy laboratoryjnej na każdym szkiełku (Rysunek 6A).
   5. Za pomocą pipety Pasteura umieść pojedynczą kroplę agaru na czystym szkiełku mikroskopowym umieszczonym między zaklejonymi taśmą szkiełkach (Ryc. 6B).
   6. Ostrożnie i szybko przykryj kroplę stopionego agaru czwartym czystym szkiełkiem, umieszczając je w poprzek zaklejonych szkiełek (Rysunek 6Cc).
      UWAGA: Szkiełko powinno delikatnie wcisnąć stopiony agar w spłaszczony okrąg o grubości około 0,4 mm (grubość taśmy) (Rysunek 6D). Agar powinien szybko ostygnąć.
   7. Zdejmij górny slajd, zsuwając go (Rysunek 6E). Płatki agarowe szybko schną i najlepiej zużyć je w ciągu kilku minut. Po zdjęciu górnego suwaka natychmiast użyj podkładki żelowej do montażu zwierząt. Unikaj używania podpasek z pęcherzykami powietrza.
   8. Podkładki agarowe należy przechowywać do 30 minut między dwoma szklanymi szkiełkami. Wysuszony agar powoduje, że zwierzęta zbijają się w bryły i wysychają. Umieścić zwierzęta w 2-15 μl roztworu paraliżującego lub mikrogranulek i przykryć szkiełkiem nakrywkowym; prześwietlić zjeżdżalnię w ciągu 20 minut od paraliżu i zamontowania (Rysunek 6).
      UWAGA: Ponieważ warunki stresowe mogą zmieniać częstość wytrząsów, unikaj paralityków, którzy mogą indukować stres oksydacyjny (np. Azydek sodu) podczas badań przesiewowych w kierunku egzoferów.
8. Wykrywanie egzoferów za pomocą mikroskopu konfokalnego z wirującym dyskiem
   1. Obserwuj cechy biologiczne komórki, takie jak organelle i inna zawartość, za pomocą obiektywów z aperturą numeryczną 1,4 przy powiększeniu 63x i 100x.
   2. Korzystaj z oprogramowania zdolnego do sterowania sceną i akwizycji obrazu z wykorzystaniem akwizycji wielowymiarowej. Mikroskopy i oprogramowanie do przetwarzania obrazów powinny być również odpowiednie do obrazowania i gromadzenia danych, ponieważ etapy te obejmują standardowe podejścia do obrazowania.

6. Rozpoznawanie neuronów dotyku i punktacja dla egzoferów z dosiadanymi zwierzętami

1. Zamontuj sparaliżowane dorosłe zwierzę (Rysunek 6).
2. Zidentyfikuj żądaną płaszczyznę Z. Użyj jasnego pola o małym powiększeniu (10-40x), aby zidentyfikować odpowiednią płaszczyznę Z zwierzęcia, zwracając uwagę na położenie zwierzęcia, orientację głowy-ogona i położenie sromu - które są punktami orientacyjnymi dla późniejszej identyfikacji neuronów i egzoferów (Rysunek 3A & Rysunek 5E).
3. Skoncentruj się na sygnale fluorescencyjnym wybranego reportera. Pozostając w tej samej płaszczyźnie Z, przełącz się na szerokokątne oglądanie fluorescencji z 10-40x dla wybranego reportera cytozolowego.
   UWAGA: W tym przykładzie ekspresja fluorescencyjna jest napędzana przez mechanosensoryczny promotor specyficzny dla neuronu dotykowego mec-4. Matryce o dużej liczbie kopii i różne fluorofory mają zmienność ekspresji, a tym samym zmienną intensywność fluorescencji. Dostosuj w razie potrzeby.
4. Przewiń w obrębie osi Z, aby obserwować głębię zwierzęcia i ekspresję fluorescencyjną w płaszczyźnie ogniskowej. Robiąc to, potwierdź orientację głowa-ogon; głowa/gardło będzie miało fluorescencyjny pierścień nerwowy i w tym przypadku ogon będzie zawierał 1-2 widoczne somy PLM (Rysunek 3A).
5. Zidentyfikuj neurony dotykowe
   1. Zidentyfikuj, czy zwierzę jest zamontowane po lewej, czy po prawej stronie (Rysunek 3A).
      UWAGA: Biorąc pod uwagę 3-wymiarowość zwierzęcia, najlepszą rozdzielczość obrazowania uzyskuje się po stronie najbliższej optyce.
   2. Zidentyfikuj somę (ALM, ALMR, AVM) poprzez obserwację - zacznij od głowy, aby zidentyfikować pierścień nerwowy i boczne procesy neuronalne.
   3. Przy powiększeniu 10-40x powoli przewijaj oś Z, aby zidentyfikować dołączony proces.
   4. Po zidentyfikowaniu procesu podążaj za nim w kierunku bocznym w kierunku tylnym w kierunku sromu, gdzie soma będzie widoczna, oznaczona okrągłym ciałem komórkowym na końcu procesu. Po znalezieniu najbardziej skoncentrowanej somy neuronalnej można ją zidentyfikować, używając innych neuronalnych punktów orientacyjnych w następujący sposób:
   5. Użyj AVM, pobliskiego neuronu brzusznego, aby pomóc w przypisaniu orientacji zwierzęcia. Jeśli neuron AVM znajduje się w tej samej płaszczyźnie co ALM, to zwierzę spoczywa na boku, a neuron poza tą płaszczyzną to ALMR . Jeśli neuron AVM nie znajduje się w tej samej płaszczyźnie co dany ALM, najbliższym neuronem dotykowym płaszczyzny ogniskowej jest ALML.
   6. Zidentyfikuj neuron PVM, inny brzuszny neuron dotykowy znajdujący się w pobliżu ogona, aby wskazać, czy przedni neuron dotykowy znajduje się w tej samej płaszczyźnie. Jeśli tak, obserwowany neuron dotyku to ALML.
   7. Poznaj położenie innych ciał somowych, w pobliżu obszaru zainteresowania (neurony fluorescencyjne zlokalizowane po obu stronach somy) i we wszystkich płaszczyznach Z, nawet jeśli nie jest możliwe uzyskanie wyraźnej ostrości najgłębszego zestawu neuronów.
      UWAGA: Identyfikacja wszystkich somy neuronów dotykowych jest ważna, ponieważ nieostra soma może być mylona z egzoferami.

7. Identyfikacja i punktacja dla egzosferów

Po znalezieniu neuronu dotykowego sprawdź, czy nie ma na nim dużych wypukłości (domen egzoferowych) wystarczająco dużych, aby można je było uznać za egzofer pączka (osiągający co najmniej 1/5 wielkości somy źródłowej) (Rysunek 1C).

1. UWAGA: Przeciętny egzofer mierzy około 2-8 μm średnicy, podczas gdy przeciętna soma zwierzęcia (ZB4065 bzIs166[Pmec-4::mCherry]) mierzy 6-10 μm u dorosłych osobników w dniu 2 (Ryc. 7B).
2. Jeśli nie zaobserwuje się domeny pączka lub egzoferu, sprawdź somę neuronalną pod kątem dołączonego cienkiego włókna emanującego z somy. Dołączone egzofery zwykle znajdują się bliżej pierwotnej somy i w podobnej płaszczyźnie Z.
   UWAGA: Egzosfery nie zawsze pozostają przyczepione do somy. Wykrycie dołączonego żarnika jest ostateczną wskazówką, że obiekt jest eksoferem.
3. Aby zidentyfikować nieprzyłączony egzofer, poszukaj jego zawartości. Egzofery mogą koncentrować wydalone białka fluorescencyjne i dlatego często są jaśniejsze niż soma.
   UWAGA: Zawartość egzoferów jest niejednorodna i zmienna. Organelle komórkowe, takie jak lizosomy i mitochondria, mogą być również wytłaczane w egzoferach (Rysunek 4C-E).
4. Szukaj nieprzyczepionych egzoferów w innych płaszczyznach ogniskowych niż płaszczyzna, w której znaleziono pierwotną somę. Chociaż zaobserwowano, że egzofery wystają z somy ALM w dowolnym kierunku, typowe jest, że egzofery wystają z somy, w kierunku tylnym od wyrostka neuronalnego.
5. Sprawdź, czy nie ma dużych, kulistych obiektów, które nie są ustawione i zidentyfikowane jako somy neuronalne. Egzofery mogą mieć nieregularny kształt, ale zazwyczaj są to struktury kuliste. Egzofery z czasem ulegają degradacji, więc starsze egzofery mają zwykle bardziej nieregularny kształt.
   UWAGA: Dojrzałe lub starsze egzofery odróżnia się od rozproszonego etapu "gwiaździstej nocy" poprzez jaśniejszą intensywność fluorescencji egzoferów i ich sferyczny kształt.
6. Zbadaj fenotyp "gwiaździstej nocy" jako dowód na wcześniejszą egzofergenezę. Egzofery przechodzą w fazę "gwiaździstej nocy", gdy egzofer rozpada się na mniejsze pęcherzyki, a otaczająca go tkanka podskórna próbuje zdegradować zawartość eksofera (Rysunek 1G, 2B, 3B i 7A).
   UWAGA: Etap gwiaździstej nocy jest oznaczony przez pofragmentowane i rozproszone (czasami połączone) jednostki fluorescencyjne, które utraciły integralność strukturalną i wykazują słabą fluorescencję w porównaniu z neuronami dotykowymi i strukturami egzoferów.
7. Szukaj przykładów "wielu zdarzeń egzopherowych". Egzofery są zwykle wytwarzane jako pojedyncze wystąpienie (1 egzofer emanujący z 1 somy), ale w pewnych okolicznościach więcej niż jeden egzofer może zostać uwolniony z jednej somy (Rysunek 7D).
   UWAGA: Dojrzałe egzofery mogą rozkładać się na wiele pęcherzyków, ponieważ ulegają degradacji w tkance podskórnej. Rozróżnienie, czy każdy egzofer został wygenerowany przez niezależne zdarzenie egzofergenezy, czy też jeden oryginalny egzofer podzielił się, tworząc dodatkowy pęcherzyk, można określić tylko na podstawie obserwacji poklatkowej.
8. Należy pamiętać, że nie wszystkie nieprawidłowości morfologiczne dojrzewają do egzoferów.
   1. Nie nacinaj rozdętej somy jako egzofera. Od czasu do czasu można zaobserwować rozszerzoną lub spiczastą somę (zwłaszcza z wiekiem lub pod wpływem stresu), ale rozszerzenie bez wyraźnego miejsca zwężenia nie jest oceniane jako egzofer.
   2. Odrzuć małe, rozdzielone pąki, które nie osiągają 1/5 wielkości somy w kwantyfikacji zdarzenia egzoferu.
   3. Nie licz wyrostków neurytów jako egzoferii. Dojrzałe neuryty mogą się dramatycznie rozszerzać wraz z wiekiem (zwykle w kierunku przeciwnym do procesu neuronalnego), a białko fluorescencyjne może migrować do dystalnego końca takich struktur¹⁹.
      UWAGA: Te wyrostki neurytów nie są egzoferami, ponieważ mają wyraźny wzorzec rozwojowy w ciągu dni i tygodni, nie tworzą pąków i nie odrywają się (Ryc. 7E).
9. Zidentyfikuj jednostki fluorescencyjne, które nie są eksoferami.
   UWAGA: Ważne jest, aby zorientować się, czym jest fluorescencja tła, aby zapewnić prawidłową identyfikację wytłaczanej jednostki fluorescencyjnej w porównaniu z autofluorescencją.
   1. Transgeniczna ekspresja fluorescencyjna a autofluorescencja. Nie należy mylić autofluorescencji z ekspresją transgeniczną. Prawdziwy sygnał eksofera nie będzie znajdował się w jelicie ani jelitach (potwierdzenie DIC może być wykorzystane do identyfikacji tych tkanek), a sygnał eksophera będzie znacznie jaśniejszy niż autofluorescencja tła.
      UWAGA: Autofluorescencja jest spowodowana pigmentacją fluorescencyjną jelit ziarnistych i kumuluje się wraz z wiekiem. Jest niejednorodny, zwłaszcza gdy ogląda się go na różnych długościach fal.
   2. Sygnał z zarodków. Nie należy mylić sygnału zarodkowego z egzofergenezą. Potwierdź podejrzenia dotyczące sygnału zarodka, przełączając się z oświetlenia fluorescencyjnego na oświetlenie jasnego pola i sprawdzając powiązania sygnału z komórkami jajowymi w macicy.
   3. Poza samolotem lub pobliskimi ciałami soma. Unikaj mylenia somy poza płaszczyzną z egzoferem, identyfikując wszystkie pobliskie ciała soma, nawet nieostre somy na początku obserwacji.
      UWAGA: W przypadku oceniania egzoferów z ALMR zidentyfikuj i uwzględnij lokalizację somy AVM i ALMR. Więcej szczegółów na temat identyfikacji ciał soma opisano w Rysunek 3A.

8. Punktacja i statystyki

1. Egzofery partytury jako binarne (tak, jest egzofer/nie, nie ma eksofera).
2. Rozważ detekcję egzoferu jako "zdarzenie egzopherowe" dla danego neuronu. Zdarzenie egzoferu może polegać na obserwacji pojedynczego wygaszacza w pobliżu somy lub wielu egzoferów.
   UWAGA: Aby określić ilościowo liczbę poszczególnych zdarzeń egzofergenezy, użyj obserwacji poklatkowej.
3. Policz zdarzenia egzoferów na konkretną zidentyfikowaną komórkę, ponieważ różne komórki nie wytwarzają egzoferów w tym samym tempie (patrz na przykład Rysunek 3C). Neurony ALMR wytwarzają najwięcej podstawowych egzoferów w szczepach opisanych w niniejszym dokumencie, a zatem często jest to komórka wybrana do kwantyfikacji egzoferów z neuronów receptora dotyku.
4. Dla celów statystycznych, ogólnie, należy przeprowadzić co najmniej 3 próby biologiczne, na co najmniej 30 zwierzętach ocenianych w każdym badaniu, wraz z odpowiednią liczbą obserwacji wymaganą do analizy zakłócenia.
   1. W przypadku wielu badań obejmujących jedną lub dwie mutacje/terapie w porównaniu z kontrolą, test Cochrana-Mantela-Haenszela jest odpowiedni do wyznaczenia wartości p.
   2. W przypadku badań obejmujących więcej niż dwie mutacje w leczeniu w porównaniu z grupą kontrolną właściwe jest również zastosowanie binarnej analizy regresji logistycznej w celu oceny istotności dla dowolnej liczby kategorycznych predyktorów.

Wyniki

Do pomiaru egzofer można wykorzystać wiele reporterów fluorescencyjnych. Egzofer neuronów dotykowych są łatwo wizualizowane in vivo poprzez fluorescencyjne znakowanie białek, które mogą zostać wyeksudowane, znakowanie organelli zdolnych do ekstruzji lub znakowanie błon komórkowych. Tabela 1 przedstawia ekspresyjne w neuronach dotykowych reportery fluorescencyjne wykorzystywane do monitorowania egzofer, a reprezentatywne przykłady zamieszczono na Rysunku 4. Ładunki, o których wiadomo, że są wydalane w egzoferach, obejmują fuzję domeny N-końcowej ludzkiej huntingtiny z rozszerzonym poliglutaminą (Q128) (Rysunek 4B), lizosomy znakowane GFP za pomocą białka błony stowarzyszonej z lizosomami (LMP-1) (Rysunek 4C) oraz mitochondria znakowane GFP zlokalizowanym w macierzy (Rysunek 4D). Cytoplazmatyczne GFP nie jest silnie wydalane i jest preferencyjnie zatrzymywane w somie⁵, choć GFP może słabo wizualizować egzofery (Rysunek 4A). Gdy GFP jest połączone z białkami, które są wydalane, znacznik ten może służyć do wizualizacji egzofer. Istotne jest, że dzięki znakowaniu różnych białek można odpowiedzieć na szeroki zakres pytań dotyczących wydalania specyficznych ładunków i organelli, a także białek i błon tworzących egzofery.

Układ pseudo-stereomikroskopu jest skutecznym narzędziem do obserwacji egzoforów u zwierząt na płytkach z agarem. Układ ten stanowi hybrydę technologii mikroskopii złożonej i stereoskopowej, obejmującą optykę o wysokiej aperturze numerycznej dla każdego powiększenia, technologię pseudo-stereo (oddzielne obiektywy nad podstawą stereoskopową) oraz przełącznik zoomu umożliwiający obserwację przy powiększeniach pośrednich między zainstalowanymi obiektywami. Taki mikroskop powinien być wyposażony w okularowe powiększenie 10x oraz obiektywy o mocy wystarczającej do obserwacji morfologii neuronów i produkcji egzoforów w celu wysokoprzepustowej oceny (obiektyw 2x stosowany do skanowania/wybierania, obiektyw 10x stosowany do identyfikacji i oceny).

Chociaż możliwości powiększenia standardowych stereomikroskopów zazwyczaj zapewniają rozdzielczość wystarczającą do zobaczenia sieci neuronów dotykowych wykazujących ekspresję białek fluorescencyjnych, standardowe mikroskopy dissectingowe nie są wystarczające do obserwacji detali podkomórkowych egzoferów, takich jak połączenia rurkowate somy z egzoferem. Takie obserwacje wymagają zastosowania mikroskopii konfokalnej (szczegóły dotyczące sprzętu znajdują się w Tabeli Materiałów).

Badania nad ilościowym oznaczaniem eksoforów wymagają rygorystycznej kontroli w celu wyeliminowania stresów eksperymentalnych. Utrzymywanie spójnych warunków wzrostu jest niezbędne dla powtarzalnej produkcji eksoforów. Bardziej szczegółowo, produkcja eksoforów jest reakcją na stres, zatem regularne dokarmianie, stała temperatura oraz wzrost wolny od kontaminacji na przestrzeni kolejnych pokoleń są krytyczne dla powtarzalności wyników. W podstawowych warunkach wzrostu przy wysokiej ekspresji mCherry w neuronach produkcja eksoforów jest stosunkowo niska (5-25% ALMR produkuje eksoforów), jednak niektóre stresory, w tym stres osmotyczny i oksydacyjny, mogą zwiększyć częstotliwość ich powstawania. Choć ekspresję mCherry można uznać za stres, konsekwencją wrażliwości poziomu eksoforów na stres jest fakt, że przy odpowiedniej kontroli wprowadzenie stresu eksperymentalnego może być strategią ułatwiającą indukcję i obserwację eksoforogenezy.

Harmonogram i przewidywane poziomy produkcji egzosfer. Egzosfery są praktycznie nieobecne podczas rozwoju larwalnego. Okres szczytowej produkcji egzosfer w młodym wieku dorosłym wydaje się być silnie ograniczony do dni 1–4 życia imago, najczęściej będąc widocznym w 2. lub 3. dniu dorosłości. Ponieważ ten szczyt może nieco przesunąć się w czasie, najpełniejsza ocena profilu produkcji egzosfer polega na codziennym punktowaniu wielu prób w dniach 1–4 życia imago. Zazwyczaj ALMR produkuje jedną główną egzosferę, a pęcherzyk utrzymuje się przez co najmniej 24 godziny. Egzosfera może zostać wytworzona dość szybko (w najszybszym przypadku w ciągu kilku minut). Najczęściej we wczesnym wieku dorosłym jeden neuron produkuje tylko jedną główną egzosferę, jednak możliwa jest produkcja wielu egzosfer.

Ogólnie produkcja egzofer przez ALMR wykazujące ekspresję mCherry w warunkach bazalnych wynosi od 5-25% badanych ALMR w optymalnym przedziale czasowym 2-3 dnia życia osobników dorosłych (Rycina 3D). Kryzysy proteostazy⁵, a także narażenie na inne stresory mogą modulować poziom egzofer. Stres lub perturbacje genetyczne mogą zwiększyć produkcję egzofer do poziomu wykrywalności sięgającego 90% neuronów ALMR wytwarzających wypustki egzoferalne.

RNAi oparta na karmieniu w celu badania roli specyficznych genów w eksoferogenezie. Nicienie C. elegans podleganie wyciszaniu genów metodą RNAi najczęściej odbywa się poprzez karmienie zwierząt zmodyfikowanym szczepem E. coli HT115, który ekspresuje dwuniciowy RNA (dsRNA) nakierowany na wybrany gen²⁰. Bakterie HT115 mogą być stosowane podczas oceny obecności eksoferów w RNAi opartej na karmieniu⁵. Choć za pomocą tej techniki można nakierować RNAi na transkrypty w większości tkanek, neurony wykazują większą oporność. Wrażliwość na RNAi można skalibrować, wykorzystując zwierzęta ekspresujące transgeniczny transporter dsRNA SID-1 pod promotorem specyficznym dla neuronów. W ten sposób tkanka neuronalna może zostać uwrażliwiona na RNAi²¹.

Tkankowo specyficzne wyciszenie wybranego genu można osiągnąć poprzez ekspresję składnika endogennego metabolizmu RNAi w mutantach wykazujących niedobór tego składnika. Na przykład: białko Argonaute RDE-1 może być eksprimowane specyficznie w neuronach zwierząt mutantów rde-1, aby uzyskać wyciszenie wybranego genu wyłącznie w neuronach, gdy zwierzęta są poddane interwencji RNAi celującej w ten gen.

Stosując standardowe protokoły RNAi dla nicieni^20,22, poddanie rodziców na etapie L4 działaniu RNAi i umożliwienie ich potomstwu rozwoju poprzez konsumpcję zmodyfikowanych bakterii HT115 aż do osiągnięcia dorosłości pozwala uzyskać silny knock-down genetyczny; należy jednak zwrócić uwagę na potencjalne opóźnienia rozwojowe indukowane przez RNAi, ponieważ zwierzęta doświadczalne mogą rozwijać się inaczej niż kontrola z pustym wektorem. Ważne jest, aby zawsze uwzględnić kontrolę z pustym wektorem w celu porównania z próbą negatywną. Bakterie HT115 mogą być wykorzystane podczas oceny egzoforów w RNAi podawanym drogą pokarmową. Należy jednak zauważyć, że niektóre geny skutecznie zmieniają tempo egzoforogenezy nawet podczas krótszych okresów ekspozycji na RNAi⁵. Jeśli celowanie w określone geny prowadzi do zaburzeń rozwojowych, należy unikać poddawania zwierząt knock-downowi przez całe życie; zwierzęta można po prostu przenieść na etapie L4 na płytki z RNAi w celu ekspozycji od etapu L4 do dorosłego dnia D2 lub D3.

Nazwa szczepu	Genotyp	Opis	Procent egzoforów	Bibliografia
SK4005	zdIs5[Pmec-4GFP	Ekspresja cytozolowa GFP w neuronach dotykowych.	1-8% ALM	Rycina 4A, Melentijevic 2017
ZB4065	bzIs166[Pmec-4::mCherry]	Nadekspresja mCherry (bzIs166) w neuronach dotykowych generuje zarówno sygnał cytozolowy, jak i agregaty mCherry. bzIs166 jest induktorem eksoforów. Agregaty mCherry są predyktorami eksoforogenezy i są preferencyjnie usuwane w eksoforach.	3-20% ALM (warunki normalne). 20-80% ALM (warunki głodówki).	Rycina 4B, Melentijevic 2017
ZB4067	bzIs167[Pmec-4mitogfp Pmec-4mCherry4]; igIs1[Pmec-7YFP Pmec-3htt57Q128::cfp lin-15+];	YFP znakuje cytoplazmę mec-7 neurony dotykowe. Współwyrażany Q128::CFP tworzy agregaty i indukuje egzofory. CFP preferencyjnie wycisza.	~25%	Rycina 4C, Meletijevic 2017
ZB4509	bzIs166[Pmec-4mCherry]; bzIs168[Pmec-7LMP-1::GFP]	bzIs168 LMP-1::GFP znakuje błony plazmatyczne oraz błony lizosomalne. bzIs168 może być wykorzystywany do identyfikacji błon neuronalnych, egzoferów (ponieważ są one otoczone błoną) oraz struktur błon lizosomalnych.	3-20% ALM	Rycina 4D, Melentijevic 2017
ZB4528	bzIs166[Pmec-4mCherry]; zhsEx17 [Pmec-4mitoLS::ROGFP]	Allel zhsEx17 jest reporterem zlokalizowanym w mitochondriach, który zmienia długość fali szczytowego pobudzenia z 405 nm (utleniony) na 476 nm (zredukowany) w zależności od lokalnego środowiska utleniającego. Jest on eksprymowany w neuronach dotykowych i może być stosowany samodzielnie do identyfikacji mitochondriów w neuronach dotykowych oraz w mitoeksoforach.	3-20% proteo-eksoforów ALM. Trwa ilościowe oznaczenie % mito-eksoforów ALM.	Rycina 4E, Melentijevic 2017, Cannon 2008, Ghose 2013

Tabela 1. Szczepy wykorzystane do wizualizacji neuronów czuciowych, eksoforów neuronów czuciowych oraz zawartości eksoforów.

Rycina 1: Etapy egzoferogenezy. Proces tworzenia i wydalania egzoferu nazywa się „egzoferogenezą”. Dynamiczny proces formowania się egzoferu może trwać od kilku minut do kilku godzin. Przedstawiono przykłady morfologii somy i egzoferu w konkretnych krokach dynamicznego procesu egzoferogenezy w szczepie ZB4065 bzIs166[P_mec-4mCherry], który wykazuje wysoką produkcję egzoferów. Wszystkie obrazy przedstawiają neurony ALM dorosłych osobników w 2. dniu życia, wykonane przy użyciu obiektywu 100x. (A) Normalna soma. Dorosły mechanosensoryczny neuron dotyku ALM transgenicznie wykazujący ekspresję P_mec-4mCherry. Przedstawiona morfologia somy jest typowa dla młodych dorosłych neuronów w tym szczepie, z mCherry skoncentrowanym w cytoplazmie. (B) Wczesna faza pączkowania. Pierwszy obserwowalny etap egzoferogenezy obejmuje polaryzację wybranych materiałów cytoplazmatycznych do krawędzi błony somy. Krok ten często towarzyszy ekspansja lub obrzęk somy. W przypadku neuronów dotyku domena przedegzoferowa (PED) rozciąga się do otaczającej hypodermis (tutaj niewidocznej). Zauważalne jest większe stężenie materiału mCherry w domenie wczesnego pąka. (C) Późna faza pączkowania. W wyniku dalszej polaryzacji komórkowej i ekspansji domeny przedegzoferowej staje się widoczne przewężenie między somą a egzoferem (strzałka). Zdarzenie to sygnalizuje przejście do późnej fazy pączkowania. Chociaż w późnym stadium pączkowania komórka wykazuje wyraźne miejsce przewężenia oraz oddzielne domeny somy i egzoferu, nie jest ona jeszcze całkowicie oddzielona od somy; pączkujący egzofer może być połączony grubym szypułką (strzałka). Domenę pączkującą uznaje się za wczesny egzofer, gdy średnica domeny egzoferu jest w przybliżeniu o ⅓ większa niż średnica miejsca przewężenia/szypułki. (D) Faza wczesnego egzoferu. Wczesne egzofery mogą być połączone szypułką z opuszczaną somą — średnica tego połączenia może się zmniejszać w miarę oddalania się egzoferu od somy. Materiał cytoplazmatyczny może być transportowany z somy do egzoferu poprzez tę rurkę, choć większość materiału zostaje załadowana podczas procesu wypączkowania. Egzofery mogą oddzielać się od somy, jak przedstawiono w (E); oddzielone egzofery uznaje się za egzofery dojrzałe (F). Dojrzały egzofer może przemieszczać się przez otaczającą tkankę hypodermis, oddalając się od opuszczonej somy. (G) Rozpad oznakowanego mCherry egzoferu na mniejsze pęcherzyki w obrębie hypodermis skutkuje rozproszonym, punktowym wyglądem materiału mCherry, najprawdopodobniej w momencie wniknięcia do hypodermis endolizosomalnej sieci. Rozproszony sygnał punktowy nazywany jest fazą „gwieździstego nieba”. Degradacja niektórych zawartości egzoferu jest prawdopodobnie przeprowadzana przez lizosomy hypodermis, jednak część materiału nie zostaje w pełni zdegradowana i jest często ponownie wydalana przez hypodermis do pseudocelomy. Przebieg transportu mCherry po egzoferogenezie opisano bardziej szczegółowo na Rycynie 2. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Rycina 2: mCherry wydzielone z neuronów dotykowych w egzoforach angażuje otaczającą sieciową strukturę lizosomalną hipodermy, lecz może zostać później wydzielone do pseudocelomy, gdzie koelomocyty mogą magazynować lub degradować mCherry. (A) Schematyczne podsumowanie transportu mCherry wydzielonego w egzoforach przez organizm po wyrzuceniu z neuronów. Podczas egzoferegenezy wybrane treści komórkowe, takie jak mCherry, ulegają lokalizacji i wypączkowują z wysyłającego somy neuronu w niezależnym pęcherzyku otoczonym błonami plazmatycznymi neuronu i hipodermy. Ponieważ neurony dotykowe są zanurzone w tkance hipodermy, w miarę wypączkowania domeny egzoforu, przemieszcza się ona głębiej w hipodermę. Egzofor może przechodzić przez hipodermę, a po godzinach lub dniach jego zawartość może ulec fragmentacji w obrębie sieci endolizosomalnej hipodermy. mCherry może pojawić się w postaci rozproszonych punktów w całej hipodermie, co określa się mianem etapu „gwieździstej nocy”. Po kilku dniach część mCherry może przedostać się z hipodermy do otaczającej pseudocelomy, gdzie komórki żerne zwane koelomocytami mogą uzyskać dostęp do mCherry i pobrać je w celu magazynowania. (B) Przykład wyglądu pęcherzyków mCherry w etapie gwieździstej nocy. Obraz somy ALM znakowanej mCherry z dużymi fragmentami egzoforów i pęcherzykami gwieździstej nocy. Szczep ZB4065 bzIs166[P_mec-4mCherry]. (C) Przykład koncentracji mCherry w odległych koelomocytach. Widok boczny dorosłego osobnika w 10. dniu życia (szczep ZB4065 bzIs166[P_mec-4mCherry]) wykazujący koncentrację mCherry w koelomocytach (strzałki). Widoczne są również niektóre pęcherzyki gwieździstej nocy. Zazwyczaj koncentracja w koelomocytach staje się widoczna około 5. dnia życia dorosłego osobnika. (B dół) Schematyczne odwzorowanie (B), gdzie neurony dotykowe i ich wypustki oraz najjaśniejsze fragmenty egzoforów obrysowano na czerwono; rozproszone małe pęcherzyki na różnych głębokościach Z przedstawiono w jasnoróżowym kolorze. (C dół) Wersja schematyczna obrazu (C), pokazująca wypustkę neuronalną na czerwono, gwieździstą noc na różowo i koelomocyty na zielono. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rycina 3: Mechanosensoryczne neurony dotyku wytwarzają egzofery na różnych poziomach przy precyzyjnym profilu czasowym. (A) (Góra) Schematyczne przedstawienie mechanosensorycznych neuronów dotyku w relacji przestrzennej do kluczowych punktów anatomicznych C. elegans, w tym pompującego gardła i gęstego od neuronów pierścienia nerwowego w głowie zwierzęcia, wulwy w środkowej części ciała oraz zwężonego ogona. (Dół) Fluorescencyjnie znakowane neurony dotyku wykazujące ekspresję GFP widziane od góry i od lewej strony (obrazy zaadaptowane z WormAtlas). Czerwona ramka zaznacza obszar, w którym zazwyczaj znajdują się egzofery ALM. (B) Widok przy dużym powiększeniu regionu środkowego ciała, w którym powstają egzofery pochodzące z ALM w szczepie wykazującym ekspresję [P_mec-4mCherry]. Przedstawiono neurony AVM i ALMR, a także egzoferę ALMR wraz z mCherry starry night. Neurony ALMR najchętniej wytwarzają egzofery. (C) Mechanosensoryczne neurony dotyku ALMR chętniej wytwarzają egzofery w porównaniu do innych neuronów dotyku u hermafrodyt w warunkach bazalnych. Wskazano produkcję egzofer mechanosensorycznych neuronów dotyku w 2. dniu dorosłości, ocenianą dla poszczególnych neuronów receptorowych dotyku. Szczep: ZB4065 bzIs166[P_mec-4mCherry], N>150, słupki błędów to SEM. (D) Neurony dotyku ALMR wytwarzają więcej egzofer w 2. i 3. dniu dorosłości w porównaniu ze stadium adolescentalnym L4 lub zwierzętami w starszym wieku. Szczep: ZB4065 bzIs166[P_mec-4mCherry], N>150, słupki błędów to SEM. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej ryciny.

Rysunek 4: Przykłady niektórych reporterów fluorescencyjnych znakujących zawartość egzofer.Prostym sposobem obserwacji egzofer jest tworzenie zwierząt transgenicznych, które wykazują ekspresję fluoroforów z promotorów neuronalnych. Fluorofory umożliwiają wizualizację egzofer, a ekspresja transgeniczna indukuje agregację i/lub proteostres, co zwiększa egzoferezę. Egzofery wytwarzane przez neurony amfid można obserwować również w warunkach naturalnych, stosując wypełnianie barwnikiem w celu ich wizualizacji. Przedstawiono przykłady powszechnie stosowanych szczepów do obserwacji egzofer, (E) egzofera, (S) soma. (A) Soma i egzofera neuronu ALM dorosłego osobnika szczepu SK4005 zdIs5[P_mec-4GFP], do fotografii użyto obiektywu 100x, pasek skali 3μm. W tym szczepie mierzone są egzofery zawierające rozpuszczalne GFP, jednak produkcja egzofer występuje rzadko. Fuzja GFP z białkami, które w innych badaniach są preferencyjnie usuwane w egzoferach, potwierdza, że fuzje GFP można wykryć w dojrzałych egzoferach. (B) Soma i egzofera ALM dorosłego osobnika szczepu ZB4065 bzIs166[P_mec-4mCherry], który wykazuje ekspresję mCherry i indukuje produkcję egzofer w neuronach dotyku. Do fotografii użyto obiektywu 100x, pasek skali 5 μm. (C) Soma i egzofera ALM dorosłego osobnika szczepu ZB4067 bzIs167[P_mec-4mitogfp P_mec-4mCherry4]; igIs1[P_mec-7YFP P_mec-3htt57Q128::cfp lin-15+]; do obrazu htt57Q128::CFP użyto selektywnego kanału niebieskiego. Egzofera zawiera agregaty htt57Q128::CFP (strzałki), które wydają się być bardziej skoncentrowane w egzoferze niż w somie. Do fotografii użyto obiektywu 40x, pasek skali 5μm. (D-E) Egzofery mogą zawierać organelle, a znakowanie specyficzne dla organelli białkami fluorescencyjnymi umożliwia monitorowanie ich usuwania. (D) Marker błony lizosomalnej LMP-1::GFP zarysowuje błonę somy i egzofery, słabo znakuje błony plazmatyczne (lokalizacja w błonie plazmatycznej jest etapem transportu w kierunku celowania lizosomalnego) i silnie znakuje organelle lizosomalne. Przedstawiono somę ALM dorosłego osobnika koekspresującą P_mec-4mCherry oraz P_mec-7LMP-1::GFP, który lokalizuje się w błonach i lizosomach. Do somy przylega egzofera wraz z innymi mniejszymi wypustkami, które prawdopodobnie są fragmentami egzofer (strzałki). Struktury GFP-dodatnie znajdują się w somie oraz w dużej egzoferze, szczep: ZB4509 bzIs166[P_mec-4mCherry]; bzIs168[P_mec-7LMP-1::GFP]. Do fotografii użyto obiektywu 100x, pasek skali 5 μm. E) Marker mitochondrialny GFP może być użyty do identyfikacji mitochondriów w somie i egzoferach. Przedstawiono somę ALM dorosłego osobnika wykazującą ekspresję P_mec-4mCherry oraz mito::ROGFP, który lokalizuje się w macierzy mitochondrialnej. Samo mito::ROGFP, bez mCherry, może być również łatwo wykorzystane do identyfikacji neuronów i oceny występowania egzofer zawierających mitochondria. Szczep: ZB4528 bzIs166[P_mec-4mCherry]; zhsEx17 [P_mec-4mitoLS::ROGFP]. Do fotografii użyto obiektywu 100x; pasek skali 5μm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rycina 5: Cykl rozwojowy C. elegans i identyfikacja stadium L4. (A) W temperaturze 20 °C jajo po złożeniu przez matkę wykluwa się w ciągu około 9 godzin. (B) Nowo wykluty osobnik znajduje się w pierwszym stadium larwalnym (L1) i przechodzi linienie do larwy L2 po 12 godzinach. (C) Zwierzęta pozostają w stadium L2 oraz w (D) stadium larwalnym L3 przez około 8 godzin każde. (E) Młode osobniki uznaje się za czwarte stadium larwalne (L4), które charakteryzuje się wyraźnie widoczną, rozwijającą się wulgą, przypominającą biały półksiężyc w okolicy środka ciała. Obecność tego białego półksiężyca umożliwia łatwą identyfikację i wybiór osobników w stadium L4 w celu stworzenia zsynchronizowanych kultur, co ułatwia późniejszą ocenę obecności egzoferów. Zwierzęta pozostają w stadium L4 przez około 10 godzin przed ostatnim linieniem do stadium dorosłych osobników z jajami, F) rozpoznawalnych po rozwijających się jajach, widocznej spermatece oraz rozpoczęciu składania jaj. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Rycina 6: Przygotowanie podkładki agarowej na szkiełku mikroskopowym. (A) Przygotuj dwa szkiełka z jednym paskiem taśmy laboratoryjnej przyklejonym wzdłuż górnej krawędzi. Pomiędzy nie włóż szkiełko mikroskopowe bez taśmy, zgodnie z ilustracją. B) Nanieś kroplę stopionego agarozy na wierzch szkiełka. (C) Ostrożnie połóż czyste szkiełko na kropli, dociskając agarozę do formy spłaszczonego kolistego podkładu. (D) Usuń szkiełka z taśmą, które służyły do uzyskania równomiernego spłaszczenia agaru, niezbędnego do stworzenia jednorodnej podkładki. (E) Zdejmij górne szkiełko po wyschnięciu podkładki agarowej. (F) Nanieś pipetą roztwór paraliżujący (lewamizol lub tetramizol) na podkładkę agarową. (G) Przenieś odpowiednio rozwinięte zwierzęta do roztworu paraliżującego. (H) Ostrożnie przykryj zwierzęta szkiełkiem nakrywką i upewnij się, że są żywe. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Rycina 7: Cechy egzoforów i kryteria identyfikacji egzoforów. (A) Ogólne kryteria identyfikujące egzoforię. (B) Porównanie średnic somy wysyłającej i wydzielonego eksoforu, pomiar w μmSomy dorosłych komórek ALM, N=35, szczep: ZB4065 bzIs166[P_mec-4mCherry] - 6.53 μm średnia wielkość somy i 3.83 μm średnia wielkość egzosfery. (C) Definiowanie kryteriów różnicowania między domeną eksoforu a pączkującym eksoforem. (DNajczęściej pojedyncze neurony tworzą jeden duży egzofer, który później dzieli się lub fragmentuje, gdy hipodermis próbuje zdegradować jego zawartość. Niemniej jednak obok jednego neuronu dotykowego można zaobserwować wiele egzoferów, co może wynikać z wielokrotnych zdarzeń tworzenia egzoferów przez jeden neuron lub alternatywnie z pączkowania bądź fragmentacji samych egzoferów. Pochodzenie wielu struktur przypominających egzofery można określić wyłącznie za pomocą mikroskopii poklatkowej. Na górze przedstawiono somę neuronu dotykowego ALMR z pojedynczym, oddalonym egzoferem. Na dole przedstawiono somę neuronu dotykowego ALMR z wieloma wypustkami przypominającymi egzofery.E) Wspólne cechy morfologiczne somat neuronów dotykowych ALM u osobników dorosłych, które mogą zostać pomylone z zdarzeniami egzoferycznymi. Góra po lewej - Powiększone ciało komórki ALM, bez wyraźnej domeny egzosfery lub miejsca zwężenia. Środek góry - Neurony mogą posiadać niewielkie wypustki zewnątrzkomórkowe, które mogą być analogiczne do eksoforów, lecz nie spełniają kryteriów dotyczących wielkości, aby zostać uznanymi za eksofory. Prawy górny róg – Wraz z wiekiem neurony czuciowe mogą wytwarzać wypustki wzdłuż swojego mniejszego neurytu. Często na końńcu takiej wypustki neurytu może gromadzić się materiał mCherry. Nie uznaje się tego za eksofer, jeśli zgromadzone mCherry nie spełnia wymogów dotyczących stosunku wielkości eksofera do somy. Dół przedstawia dorosłe neurony ALM, które spełniają kryteria definiujące domenę egzoforu lub egzofor. lewy dolny róg - soma ALM z wyraźną domeną egzoferu, która selektywnie obejmuje cytosol mCherry oraz agregaty znakowane mCherry. Miejsce zwężenia domeny egzoferu zostało zaznaczone strzałkami i spełnia kryteria wielkości (co najmniej 1/5^th (wielkość somy). Największa średnica domeny egzoferu jest niemal o ⅓ większa od średnicy miejsca zwężenia, co spełnia kryteria zdarzenia egzoferowego. Dół środek - soma ALM z wyraźnym pączkującym egzoforem, który spełnia kryteria wielkości. Widoczne jest wyraźne miejsce przewężenia. Prawy dolny róg - Soma ALM z przyczepionym wypełnionym mCherry eksoforem, który spełnia wymagania dotyczące rozmiaru eksoforów. Eksofor jest połączony cienkim filamentem łączącym. Wszystkie obrazy pochodzą z linii ZB4065 bzIs166[P_mec-4mCherry]. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Dyskusja

Charakterystyka molekularnych mechanizmów eliminacji agregatów i organelli in vivo w postaci dużych egzoferów jest w powijakach. Pytania dotyczące przeznaczenia ładunków do wydalenia, spolaryzowanego zbierania tych ładunków w komórce, regulacji decyzji o wytwarzaniu egzoferów, maszynerii pośredniczącej w wytłaczaniu oraz interakcji egzoferów z maszynerią degradacyjną w sąsiedniej komórce, wszystkie pozostają do rozwiązania. Co więcej, wizualizacja in vivo połączeń rurkowych, które mogą przechodzić przez materiał biologiczny, w tym wapń, agregaty i mitochondria, jest sama w sobie interesującą i niedostatecznie zbadaną biologią. Pytania o to, dlaczego niektóre komórki są bardziej podatne na produkcję egzoferów niż inne, również pozostają nierozwiązane, ale mogą zacząć być genetycznie preparowane za pomocą podejść opisanych w tym protokole.

W niniejszym protokole szczegółowo opisano podejścia do osiągania powtarzalnej punktacji produkcji eksopferów, ze zwróceniem uwagi na odróżnianie egzoferów od pobliskich komórek somów, czas analiz w celu uchwycenia szczytu produkcji eksopferów oraz ścisłą kontrolę warunków wzrostu w celu wyeliminowania niezamierzonych stresów, które mogą modulować poziomy eksoferów. Zarówno rozróżnienie dużego wczesnego egzoferu, jak i dyspersja "gwiaździstej nocy" w otaczającej tkance podskórnej mogą być ilościowo określone ilościowo jako dowód na wytwarzanie egzoferów. Biorąc to pod uwagę, neurony wyrażające mCherry w warunkach podstawowych są najczęściej związane z 5-25% neuronów określonego typu wytwarzających egzofer. Kontrolowane wprowadzenie warunków stresu może być zastosowane w celu zwiększenia produkcji eksopferów do wykrywania nawet 90% neuronów wytwarzających ekstruzje, co jest szczególnie przydatne w genetycznych lub farmakologicznych badaniach przesiewowych modyfikatorów.

W ludzkiej chorobie neurodegeneracyjnej duże agregaty mogą przenosić się z chorych neuronów do sąsiednich komórek, aby sprzyjać rozprzestrzenianiu się patologii. Mechanizm egzoferii może transpirować za pośrednictwem konserwatywnego mechanizmu używanego do ekstruzji agregatów w całej gromadzie. Zdefiniowanie cząsteczek in vivo , które albo zwiększają efektywność tego procesu (co uważa się za bardziej skuteczną kontrolę proteostazy), albo go blokują, może zostać wykorzystane do opracowania nowych strategii zwalczania wielu chorób neurodegeneracyjnych. W związku z tym opisany tutaj protokół może być stosowany do klasycznych badań przesiewowych mutagenezy genetycznej, badań przesiewowych RNAi całego genomu, które systematycznie niszczą geny w celu identyfikacji wzmacniaczy i supresorów, lub do badań interwencyjnych leków, które identyfikują potencjalne modyfikatory farmakologiczne tego procesu. Podejście jest proste, choć nieco pracochłonne. Egzofery są tak duże, że można je oglądać za pomocą mikroskopu preparacyjnego o dużym powiększeniu. Mimo to neurony C. elegans są stosunkowo małe i patrzenie na ich organelle lub błony wymaga obrazów konfokalnych o większej mocy i jest powolnym procesem. Opcje zapewniające wyższą przepustowość mogą obejmować metody obrazowania o wysokiej zawartości w formacie płytek wielodołkowych.

Zastosowanie ustandaryzowanego podejścia do punktacji egzoferów powinno leżeć u podstaw skoordynowanej genetycznej analizy procesu, w którym neurony mogą organizować i eliminować szczątki komórkowe.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
95B Naukowa kamera CMOS	Fotometria Prime
1,000 μ L końcówki o niskiej retencji	Pipeta serologiczna Sarstedt
10 ml	Appleton Woods	CC214
10 μ L końcówki o niskiej retencji	Sarstedt	70.1130.105
13% podchloryn sodu	Acros Organics	AC219255000
15 ml probówki wirówkowe	Fisher Scientific	05-539-12
Kolby Erlenmeyera o pojemności 2 l	Zaopatrzenie laboratorium naukowego	FLA4036
Pipeta serologiczna 25 ml	Appleton Woods	CC216
300 μ L końcówki o niskiej retencji	Sarstedt	70.765.105
50 ml pipeta serologiczna	Appleton Woods	CC117
5-fluoro-2'-deoksyurydyna 98%	Alfa Aesar	L16497.ME
9 cm sterylne szalki Petriego	Fisher Scientific	11309283
etanol absolutny	Vwr	20821.33
Agar	Sigma Aldrich	A1296
C. elegans szczep dziki	Dostarczany przez CGC	N2	C. elegans szczep
dwuwodny chlorek wapnia	Sigma Aldrich	C3881
cholesterol	Acros	110190250
dwuzasadowy fosforan sodu	Sigma Aldrich	S3264
E. coli szczep OP50	Dostarczany przez CGC	Op50	Szczep E coli
Mikroskop standardowy FBS10	Instrumenty Meyera	KSC 410-1-100-1	FBS10 Standard z podstawą płytkową, głowicą trójokularową 100/100 i
270 mm	Fisherbrand	FB50255
Heraeus Multifuge X3R	Thermofisher scientific	75004515
Rozsiewacze do zaszczepiania	Fisher Scientific	11821741
LB medium kapsułki	MP biomedicals	3002-031
LDI – Oświetlacz diod laserowych	89 North
lewamizol	Sigma Aldrich	16595-80-5
M4 multipette	Eppendorf	4982000012
siarczan magnezu	Sigma Aldrich	M7506
monozasadowy fosforan potasu	Sigma Aldrich	P0662
Multitron Standard inkubator wytrząsający	Infors HT
Nalgene 1 L Naczynia wirówkowe	Fisher Scientific	3120-1000
Pipeta P10	Pipeta Eppendorf Research Plus	3123000020
P1000	Pipeta Eppendorf Research Plus
P200	Eppendorf Research Plus	3123000055
pipeta 2	VWR	612-0927
Mikrogranulki polistyrenowe	Sigma Aldrich	MFCD00131491
RC5C plus wirówka podłogowa	Sorvall	9900884
Szkiełka cytologiczne wielokrotnego użytku z pierścieniem	ThermoFisher Scientific	22037242
SK4005 zdIs5[Pmec-4GFP]	contract Driscoll lab		GFP wyrażany w neuronach dotykowych
chlorek sodu	Sigma Aldrich	13422
Wodorotlenek sodu	Fisher Chemical	S/4880/53
Tactrol 2 Autoklaw	Priorclave
Triton-X	Thermofisher scientific	28313
Tween 20	Sigma Aldrich	9005-64-5
X-Light V2 Spinning Disk Confocal Unit	CrestOptics
ZB4065 bzIs166[Pmec-4mCherry]	kontrakt Driscoll lab		mCherry wyrażony w neuronach dotykowych
ZB4067 bzIs167[Pmec-4mitogfp Pmec-4mCherry4]; igIs1[Pmec-7YFP Pmec-3htt57Q128::cfp lin-15+]	kontrakt Driscoll lab		Q128 wyrażony w neuronach dotykowych
ZB4509 bzIs166[Pmec-4mCherry]; bzIs168[Pmec-7LMP-1::GFP]	kontrakt Driscoll lab		mitoROGFP wyrażony w neuronach dotykowych
ZB4528 bzIs166[Pmec-4mWiśnia]; zhsEx17 [Pmec-4mitoLS::ROGFP]	kontrakt Driscoll laboratoryjny		marker autofagii wyrażony w neuronach
dotykowych ZEISS Axio Vert.A1	Zeiss

szklaną pipetą zmiennoogniskową FisherbrandINFO28573