Zastosowanie mikrodysekcji laserowej do odkrycia regionalnej transkryptomiki w ludzkiej tkance nerkowej

Summary

Opisujemy protokół laserowej mikrodysekcji podsegmentów ludzkiej nerki, w tym kłębuszka nerkowego, kanalika proksymalnego, grubej kończyny wstępującej, przewodu zbiorczego i śródmiąższu. RNA jest następnie izolowane z uzyskanych przedziałów i przeprowadza się sekwencjonowanie RNA w celu określenia zmian w sygnaturze transkryptomicznej w każdym podsegmencie.

Abstract

Analiza ekspresji genów w ludzkiej tkance nerkowej jest ważnym narzędziem do zrozumienia homeostazy i patofizjologii chorób. Konieczne jest zwiększenie rozdzielczości i głębokości tej technologii oraz rozszerzenie jej na poziom komórek w tkance. Chociaż zastosowanie sekwencjonowania RNA pojedynczego jądra i pojedynczej komórki stało się powszechne, sygnatury ekspresji komórek uzyskane w wyniku dysocjacji tkanek nie zachowują kontekstu przestrzennego. Mikrodysekcja laserowa (LMD) oparta na specyficznych markerach fluorescencyjnych pozwoliłaby na izolację określonych struktur i grup komórek o znanej lokalizacji, umożliwiając w ten sposób uzyskanie przestrzennie zakotwiczonych sygnatur transkryptomicznych w tkance nerkowej. Zoptymalizowaliśmy metodologię LMD, kierując się szybkim barwieniem opartym na fluorescencji, aby wyizolować pięć odrębnych przedziałów w ludzkiej nerce i przeprowadzić sekwencjonowanie RNA z cennych próbek ludzkiej tkanki nerkowej. Prezentujemy również parametry kontroli jakości umożliwiające ocenę adekwatności pobranych próbek. Przebieg pracy opisany w tym manuskrypcie pokazuje wykonalność tego podejścia do izolowania subsegmentowych sygnatur transkryptomicznych z dużą pewnością. Przedstawione tu podejście metodologiczne może być również zastosowane do innych typów tkanek z podstawieniem odpowiednich markerów przeciwciał.

Introduction

Postęp technologiczny w badaniu próbek tkanek poprawił zrozumienie stanu zdrowia i chorób w różnych narządach. Postępy te uwypukliły fakt, że patologia może rozpocząć się w ograniczonych regionach lub w określonych typach komórek, a mimo to ma istotne implikacje dla całego narządu. Dlatego w obecnej erze medycyny spersonalizowanej ważne jest zrozumienie biologii zarówno na poziomie komórki, jak i regionalnym, a nie tylko globalnie¹. Jest to szczególnie prawdziwe w nerce, która składa się z różnych wyspecjalizowanych komórek i struktur, które w różny sposób inicjują i/lub reagują na stres patologiczny. Patogeneza różnych rodzajów chorób nerek u ludzi wciąż nie jest dobrze poznana. Opracowanie metodologii badania zmian w ekspresji genów w określonych segmentach kanalików, strukturach lub obszarach śródmiąższu w ludzkiej nerce zwiększy zdolność do odkrywania zmian specyficznych dla regionu, które mogą informować o patogenezie choroby.

Próbki z biopsji ludzkiej nerki są ograniczonym i cennym zasobem. Dlatego technologie badające transkryptomikę w tkance nerkowej powinny być zoptymalizowane w celu oszczędzania tkanki. Dostępne metody badania transkryptomiki na poziomie komórkowym i regionalnym obejmują sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki (scRNaseq), pojedyncze jądrowe RNaseq (snRNaseq), hybrydyzację przestrzenną in situ i mikrodysekcję laserową (LMD). Ten ostatni doskonale nadaje się do precyzyjnej izolacji regionów lub struktur będących przedmiotem zainteresowania w obrębie skrawków tkanki, do sekwencjonowania i analizy RNA^2,3,4,5. LMD można zastosować do identyfikacji określonych typów lub struktur komórek na podstawie zwalidowanych markerów przy użyciu obrazowania opartego na fluorescencji podczas sekcji.

Unikalne cechy regionalnej transkryptomiki wspomaganej mikrodysekcją laserową obejmują: 1) zachowanie przestrzennego kontekstu komórek i struktur, co uzupełnia technologie jednokomórkowe, w których komórki są identyfikowane przez ekspresję, a nie histologicznie; 2) technologia dostarcza informacji i jest informowana przez inne technologie obrazowania, ponieważ marker przeciwciał określa sygnatury ekspresji; 3) zdolność do identyfikacji struktur nawet wtedy, gdy markery zmieniają się w chorobie; 4) wykrywanie transkryptów o niskiej ekspresji w około 20 000 genów; i 5) niezwykła gospodarka tkankowa. Technologia jest skalowalna do biopsji nerki o grubości rdzenia mniejszej niż 100 μm niezbędnej do wystarczającego pozyskania RNA i umożliwia wykorzystanie zarchiwizowanych zamrożonych tkanek, które są powszechnie dostępne w dużych repozytoriach lub ośrodkach akademickich⁶.

W dalszej pracy szczegółowo opisujemy technologię transkryptomiki regionalnej i masowej, zoptymalizowaną za pomocą nowatorskiego protokołu szybkiego barwienia fluorescencyjnego do użytku z ludzką tkanką nerkową. Podejście to jest lepsze od klasycznych eksploracji LMD, ponieważ zapewnia oddzielne dane dotyczące ekspresji dla podsegmentów śródmiąższu i nefronu, w przeciwieństwie do zagregowanej ekspresji cewkowo-śródmiąższowej. Uwzględniono środki zapewnienia jakości i kontroli wdrożone w celu zapewnienia rygoru i odtwarzalności. Protokół umożliwia wizualizację komórek i regionów będących przedmiotem zainteresowania, co skutkuje zadowalającym pozyskiwaniem RNA z tych izolowanych obszarów, co umożliwia sekwencjonowanie RNA w dalszej kolejności.

Protocol

Badanie zostało zatwierdzone do użytku przez Institutional Review Board (IRB) na Uniwersytecie Indiana.

UWAGA: Użyj tego protokołu z tkanką nefrektomijną nerki (do 2 cm zarówno w wymiarach X, jak i Y) zakonserwowaną w związku o optymalnej temperaturze cięcia (OCT) i przechowywaną w temperaturze -80 °C. Wykonuj wszystkie prace w sposób ograniczający zanieczyszczenie RNA, używaj czystych rękawiczek jednorazowych i maski na twarz. Zadbaj o czystość wszystkich powierzchni. Sprzęt, dla którego zoptymalizowano ten protokół, to laserowy system mikrodysekcji z pulsacyjnym laserem UV.

1. Kriosekcja

1. Preparaty z membraną LMD PPS (poli(siarczek p-fenylenu) o średnicy 1,2 μm należy wystawić na działanie światła UV (w okapie z przepływem laminarnym do hodowli tkankowych) przez 30 minut, bezpośrednio przed kriosekcją. Przechowuj szkiełka w temperaturze pokojowej, aby zapewnić optymalne przyleganie tkanek.
2. Schłodzić kriostat do temperatury -20 °C. Oczyść powierzchnie robocze i zainstaluj nowe ostrze tnące.
3. Umieść małe pudełko na szkiełka (oczyszczone roztworem do odkażania powierzchni RNazy) w komorze kriostatu, aby przechowywać szkiełka ze świeżo ściętą chusteczką.
4. Przykleić próbkę w OCT do uchwytu na tkanki i pozostawić do zrównoważenia przez kilka minut, aby osiągnąć temperaturę komory i wzmocnić przyczepność między blokiem OCT a uchwytem. Wspomóż ten proces za pomocą ekstraktora ciepła.
5. Przyciąć próbkę do grubości 12 μm i przymocować ją do specjalistycznego szkiełka LMD za pomocą adaptera do szkiełka. Na każdym szkiełku znajduje się jedna sekcja nefrektomii na szkiełku lub do dwóch sekcji biopsji nerki na szkiełku. Szkiełka należy przechowywać w temperaturze -80 °C z wkładem ze środkiem osuszającym i w szczelnie zamkniętej plastikowej torbie, aby zapobiec gromadzeniu się nadmiaru wilgoci wewnątrz pudełka na szkiełka.
6. Oznacz każdy slajd identyfikatorem próbki, datą i numerem slajdu.
7. Szkiełka należy zużyć z próbkami w ciągu 10 dni od pierwotnej daty kriosekcji.

2. Mikrodysekcja laserowa

1. Bezpośrednio przed barwieniem należy przygotować Mieszankę Przeciwciał (Ab-Mix) w 10% BSA w PBS wolnym od RNaz, dodając: 4 μL FITC-Phalloidin, 1,5 μL DAPI, 2 μL przeciwciała Tamm-Horsfall Protein (THP) bezpośrednio sprzężonego z Alexa Fluor 546, 3,3 μL inhibitora RNazy i 89,2 μL 10% BSA w PBS (do uzyskania objętości 100 μL).
   UWAGA: Zamiast przeciwciała THP można zastosować przeciwciała alternatywne. Na przykład 2 μl przeciwciała megalina/LRP2, bezpośrednio sprzężonego z Alexa Fluor 568, można użyć do znakowania kanalika proksymalnego. Ab-Mix zawiera przeciwciało LRP2 lub THP (do wizualizacji odpowiednio kanalików proksymalnych lub grubych kończyn wstępujących). Inne przeciwciała mogą być walidowane zgodnie z potrzebami użytkownika.
2. Umyj szkiełko w lodowatym (-20 °C) 100% acetonie przez 1 minutę i przenieś do komory wilgotnościowej.
3. Umyj górną część szkiełka PBS wolnym od RNaz przez 30 sekund. Powtórz.
4. Umyj górną część szkiełka 10% BSA w PBS wolnym od RNaz przez 30 sekund. Powtórz.
5. Nakładaj Ab-Mix na 5 minut.
6. Umyj górną część szkiełka 10% BSA w PBS wolnym od RNaz przez 30 sekund. Powtórz.
7. Suszyć szkiełko na powietrzu przez 5 minut i załadować je na platformę do cięcia mikrodywekcji laserowej.
8. Zainstalować probówki zbiorcze (autoklawowane probówki do mikrowirówek o pojemności 0,5 ml) odpowiednie do pracy PCR, zawierające 50 μl buforu ekstrakcyjnego z zestawu do izolacji RNA.
9. Kontynuuj z LMD. Ukończ każdą sesję LMD w ciągu maksymalnie 2 godzin.
   1. Zbierz obrazy immunofluorescencyjne przed i po LMD, używając kamery mikroskopowej do walidacji sekcji pod kątem zmienności między operatorami, a także do celów archiwalnych, szkolenia i oceny jakości wykonanego protokołu. Aby uzyskać 0,5 – 1 ng RNA, wymagane jest minimum 500 000^μm2 powierzchni. Często wymaga to użycia przekrojów o grubości do 8 x 12 μm, aby uzyskać wystarczającą ilość materiału dla wszystkich podsegmentów będących przedmiotem zainteresowania.
   2. Zidentyfikuj obszary zainteresowania na podstawie barwienia, morfologii i lokalizacji, a następnie wytnij je za pomocą lasera o mocy większej niż 40,
      UWAGA: Oto kryteria sekcji. Kanalik proksymalny jest zdefiniowany przez znakowanie FITC-falloidyną i LRP2. Grube wznoszące się ramię jest definiowane przez oznakowanie THP. Kanał zbiorczy jest zdefiniowany przez morfologię jądrową (DAPI) i brak innych zabarwień. Kłębuszek nerkowy jest zdefiniowany przez FITC-falloidynę i morfologię. Śródmiąższ definiuje się jako obszar między barwionymi kanalikami.
10. Uzyskaj sygnatura wyrażenia przekroju poprzecznego, umieszczając dwie sekcje 12 μm na szkiełku LMD i analizując całe sekcje w buforze ekstrakcyjnym.
11. Po zakończeniu procesu LMD zamknij probówki do mikrowirówki zbierającej i energicznie nimi potrząśnij, aby upewnić się, że zawartość przesunęła się z nasadki na dno probówki
12. Odwirować probówki o sile 3 000 x g przez 30 s.
13. Inkubować probówki w łaźni wodnej o temperaturze 42 °C przez 30 minut.
14. Odwirować probówki o masie 3 000 x g przez 2 minuty.
15. Przenieść supernatant do nowej probówki o pojemności 0,5 ml i przechowywać w temperaturze -80 °C.

3. Izolacja RNA

UWAGA: Dla tego protokołu izolacji RNA dostosowaliśmy protokół z komercyjnego zestawu do izolacji RNA. Protokół producenta został zmodyfikowany tak, aby spełniał wymagania kontroli jakości określone dla projektu.

1. Dodać 250 μl kondycjonowanego buforu (CB) do każdej kolumny oczyszczającej RNA (PC) i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
2. Odwirować wszystkie komputery przez 1 minutę przy 16 000 x g.
3. Dodaj 50 μl 70% etanolu (dostarczonego w zestawie) do probówek z próbkami tkanek. Dobrze wymieszać próbki, pipetując w górę i w dół. Nie wirować. Nie odwirowywać.
4. Przenieść mieszaninę do kondycjonowanych komputerów PC i wirować przez 2 minuty przy 100 x g (w celu związania RNA), a następnie szybko odwirować przez 30 s przy 16 000 x g (w celu usunięcia przepływu). Powtórz ten krok, jeśli dla danego podsegmentu dostępna jest więcej niż 1 probówka z próbkami tkanek.
5. Dodać 100 μl buforu płuczącego 1 (WB1) do komputerów i wirować przez 1 minutę przy 8 000 x g.
6. Przygotować 40 μl DNazy na każdą próbkę (dodać 5 μl DNazy do 35 μl buforu RDD). Następnie dodać 40 μl mieszaniny bezpośrednio na membranę PC i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
7. Dodać 40 μl WB1 na membranę PC i wirować przez 15 s przy 8 000 x g.
8. Dodać 100 μl buforu płuczącego 2 (WB2) na membranę PC i wirować przez 1 minutę przy 8 000 x g.
9. Dodać 100 μl WB2 na membranę PC, wirować przez 2 minuty przy 16 000 x g, a następnie bezpośrednio przez wirowanie przez 1 minutę przy 16 000 x g.
10. Przenieś komputer do nowej probówki o pojemności 0,5 ml.
11. Dodać 12 μl buforu elucyjnego (EB) na membranę i inkubować przez 7 minut w temperaturze pokojowej. W związku z tym końcowa objętość wszystkich połączonych wypreparowanych próbek tkanek wynosi 12 μl na podsegment.
12. Odwirowywać próbki przez 1 minutę przy 1 000 x g, a następnie przez 2 minuty przy 16 000 x g.
13. Przenieś 2 μl do świeżej probówki w celu analizy bioanalizatorem (aby zapobiec zamarzaniu i rozmrażaniu).
14. Przechowywać wszystkie probówki w temperaturze -80 °C do momentu, gdy będą gotowe do dalszej obróbki.

4. Sekwencjonowanie RNA

1. Oceń każdą próbkę, przeznaczoną do sekwencjonowania, pod kątem jakości za pomocą komercyjnego bioanalizatora i chipa dedykowanego do pomiaru małych ilości RNA.
2. Przed przygotowaniem biblioteki i sekwencjonowaniem wymagane są następujące parametry kontroli jakości (QC): Ilość RNA większa niż 4 ng dla objętości i większa niż 0,5 – 1 ng dla każdego podsegmentu; Procent transkryptów dłuższych niż 200 nukleotydów (DV200) musi być większy niż 25% dla próbek LMD (optymalna > 75%).
3. Przeprowadź przygotowanie biblioteki za pomocą komercyjnego zestawu do przygotowania biblioteki cDNA przeznaczonego dla małych ilości zdegradowanego RNA. W przypadku zestawu komercyjnego wymienionego w suplemencie sugerujemy użycie opcji 2, która wymaga minimalnego DV200 wynoszącego 25% i braku fragmentacji. Niektóre technologie sekwencjonowania mogą wymagać wyższych minimalnych progów DV200, takich jak 30%⁷.
4. Dodaj adaptery i indeksy cDNA.
5. Oczyść biblioteki RNAseq za pomocą technologii kulek magnetycznych.
6. Zuboż rybosomalne cDNA za pomocą komercyjnego zestawu do usuwania rRNA przed etapem amplifikacji biblioteki RNAseq.
7. Oczyść końcową bibliotekę RNAseq za pomocą technologii kulek magnetycznych przy stężeniu biblioteki cDNA 2 ng/μl.
8. Przeprowadzić sekwencjonowanie RNA sparowanego końca 75 pz w komercyjnym systemie sekwencjonowania z 30 milionami odczytów/próbkę dla objętości i 100 milionami odczytów/próbkę dla odcinków podsegmentowych.
9. Używaj referencyjnego RNA (25 μg) przy każdym cyklu sekwencjonowania, aby umożliwić kontrolę efektu partii. Początkowe stężenie naszego referencyjnego RNA wynosi 1 μg/μl, podczas gdy końcowe stężenie wykorzystywane w sekwencjonowaniu wynosi 25 ng/μL. Uruchom referencyjne RNA jako oddzielną próbkę podczas przygotowywania biblioteki i uruchamiaj ze wszystkimi próbkami LMD za każdym razem.
10. Przeprowadzaj analizę danych za pomocą aplikacji FastQC w celu oceny jakości sekwencjonowania, odczytów międzygenowych i mitochondrialnych oraz w celu określenia odczytów przypisywanych genowi.
11. Użyj Integrative Genomics Viewer (IGV) do wyrównania i edgeR/rbamtools do miar ekspresji transkryptu.
12. Usuń próbki z mniej niż 100 000 odczytów. Kwantyl normalizuje nieprzetworzone odczyty w zestawie danych po odfiltrowaniu genów o niskiej ekspresji na progu zdefiniowanym przez użytkownika.
13. Określ ilościowo wyrażenie jako stosunek podsegmentu będącego przedmiotem zainteresowania do średniej wszystkich innych podsegmentów i transformacji log2. Względna ekspresja tego samego genu może być porównywana między podsegmentami i próbkami; jednak porównywanie względnej ekspresji między dwoma różnymi genami ze względu na potencjalne różnice w degradacji między genami i gatunkami RNA nie jest idealne.
14. Przeprowadź analizę wzbogacenia, aby porównać ekspresję genów dla zestawu producentów specyficznych dla każdego podsegmentu nefronu, podczas gdy referencyjne próbki RNA są porównywane między partiami. Za dopuszczalny uważa się efekt partii w granicach 1 odchylenia standardowego od średniej wyrażenia o wartości R > 0,9. Dodatkowa normalizacja jest wymagana w celu uzyskania wyższego wyniku efektu wsadowego. Każdy przebieg, który odbiega od zaakceptowanego efektu wsadowego, może zostać oflagowany. Q30 powinien być większy niż >90% dla każdego przebiegu sekwencjonowania.

Results

Próbki

Prezentujemy dane z dziewięciu referencyjnych nefrektomii (3 próbki uzyskane na Uniwersytecie Indiana i 6 próbek uzyskanych dzięki Projektowi Medycyny Precyzyjnej Nerek), wykorzystując protokół szybkiego barwienia fluorescencyjnego do izolowania segmentów nefronu nerkowego i obszarów śródmiąższowych. Wycinki wykorzystane w tym procesie uzyskano od zmarłych dawców nerek lub niedotkniętych nefrektomią guza. Próbki te nie miały patologicznych dowodów choroby, jak uwidoczni...

Discussion

Transkryptomika oparta na LMD jest użyteczną technologią, która zakotwicza ekspresję genów w określonych obszarach tkanki. Podstawy tej technologii i jej potencjalne zastosowanie w nerkach zostały opisane wcześniej⁸. Jednak optymalizacja, modernizacja i usprawnienie sekcji opartej na fluorescencji, ukierunkowanej specjalnie na preparację o wysokiej dokładności w celu sekwencjonowania RNA, jest mniej wszechobecne. Ponieważ metodologia ta jest przestrzennie osadzona w tkance, może potencjalnie ujawn...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aceton	Sigma-Aldrich	270725-1L
Koraliki AMPure	Beckman Coulter	A63880
Bioanalizator	Agilent	2100
BSA	VWR	0332-100G
DAPI	ThermoFisher	62248
Wkład osuszający	Bel-Art	F42046-0000
Bufor DNAse	Qiagen	79254	RDD jest zawarty w pakage
Mikroskop do mikrodysekcji laserowej	Leica	LMD6500
Przeciwciało Megalin/LRP2	Abcam	ab76969	Bezpośrednio sprzężone z probówkami do mikrowirówek Alexa Fluor 568
	TermoFisher	AB-0350
Kamera mikroskopowa	Leica	DFC700T
PBS ( Bez RNA)	VWR	K812-500ML
Phalloidyna (Oregon Green 488)	Zestaw	O7466
PicoPure	Applied Biosystems	KIT0204
Szkiełka z membraną PPS	Leica	11505268
qPCR Odniesienie dla człowieka Całkowite RNA 25 i mikro; g	Takara Clontech	636690
RNA 6000 Eukariont Całkowite RNA Pico Chip	Agilent	5067-1513
RNAse Away	ThermoFisher	7000
Inhibitor RNAzy	Sekwencer ThermoFisher	AM2696
(HiSeq lub NovaSeq)	Illumina	NA
SMARTer Stranded Total RNAseq Pico Input v2	Takara Clontech
Przeciwciało białkowe Tamm-Horsfall	R& D Systems	AF5144	Bezpośrednio sprzężony z Alexa Fluor 546
Tissue-Tek® O.C.T. Compound	Sakura	4583