Dostarczanie przeciwciał do mózgu za pomocą zogniskowanego skanowania ultrasonograficznego

Podsumowanie

Prezentowany tutaj jest protokół przejściowego otwierania bariery krew-mózg (BBB) albo ogniskowo, albo przez mózg myszy, w celu dostarczenia fluorescencyjnie znakowanych przeciwciał i aktywacji mikrogleju. Przedstawiono również metodę wykrywania dostarczania przeciwciał i aktywacji mikrogleju za pomocą histologii.

Streszczenie

Tylko niewielka część przeciwciał terapeutycznych skierowanych przeciwko chorobom mózgu jest pobierana przez mózg. Skoncentrowane ultradźwięki dają możliwość zwiększenia wychwytu przeciwciał i zaangażowania poprzez przejściowe otwarcie bariery krew-mózg (BBB). W naszym laboratorium opracowujemy podejścia terapeutyczne do chorób neurodegeneracyjnych, w których przeciwciało w różnych formatach jest dostarczane przez barierę krew-mózg za pomocą mikropęcherzyków, czemu towarzyszy zogniskowana aplikacja ultradźwięków przez czaszkę w celu celowania w wiele miejsc, podejście, które nazywamy ultrasonografią skaningową (SUS). Mechaniczne działanie mikropęcherzyków i ultradźwięków na naczynia krwionośne zwiększa transport parakomórkowy przez barierę krew-mózg poprzez przejściowe oddzielanie ścisłych połączeń i wzmacnia transcytozę pęcherzykową, umożliwiając skuteczne przenikanie przeciwciał i środków terapeutycznych. Co więcej, ultradźwięki ułatwiają również wychwyt przeciwciał ze śródmiąższowego mózgu do komórek mózgowych, takich jak neurony, gdzie przeciwciało rozprowadza się po całym ciele komórki, a nawet w procesach neurytycznych. W naszych badaniach przeciwciała znakowane fluorescencyjnie są przygotowywane, mieszane z przygotowanymi przez siebie mikropęcherzykami na bazie lipidów i wstrzykiwane myszom bezpośrednio przed zastosowaniem SUS do mózgu. Zwiększone stężenie przeciwciał w mózgu jest następnie oznaczane ilościowo. Aby wyjaśnić zmiany w normalnej homeostazie mózgu, fagocytoza mikrogleju może być wykorzystana jako marker komórkowy. Uzyskane dane sugerują, że ultradźwiękowe dostarczanie przeciwciał jest atrakcyjnym podejściem do leczenia chorób neurodegeneracyjnych.

Wprowadzenie

Ultrasonografia terapeutyczna to nowa technologia, której celem jest leczenie chorób mózgu w sposób nieinwazyjny, częściowo poprzez ułatwienie dostępu środków terapeutycznych do mózgu^1,2,3. Ponieważ tylko niewielka część przeciwciał terapeutycznych skierowanych przeciwko chorobom mózgu jest wychwytywana i zatrzymywana w brain⁴, ultradźwięki terapeutyczne oferują możliwość zwiększenia ich wychwytu i docelowego zaangażowania^5,6.

W naszym laboratorium rozwijamy metody leczenia chorób neurodegeneracyjnych, w których przeciwciało w różnych formatach jest dostarczane przez barierę krew-mózg (BBB) za pomocą mikropęcherzyków. Aby to osiągnąć, ultradźwięki są stosowane przez czaszkę do mózgu w wielu miejscach przy użyciu trybu skanowania, który nazywamy ultradźwiękiem skanującym (SUS)⁷. Mechaniczna interakcja między energią ultradźwięków, mikropęcherzykami wstrzykniętymi dożylnie i układem naczyniowym mózgu przejściowo oddziela ścisłe połączenia BBB w danej objętości sonikacji, umożliwiając przeciwciałom i innym ładunkom, w tym środkom terapeutycznym, skuteczne przekroczenie tej bariery^7,8,9. Co więcej, wykazano, że ultradźwięki ułatwiają wychwyt przeciwciał ze śródmiąższowego mózgu do komórek mózgowych, takich jak neurony, gdzie przeciwciało rozprowadza się po całym ciele komórki, a nawet w procesach neurytycznych^5,10.

Choroba Alzheimera charakteryzuje się patologią β amyloidu i tau¹¹, a wiele modeli zwierzęcych jest dostępnych do analizy mechanizmów patogennych i walidacji strategii terapeutycznych. Podejście SUS, w którym ultradźwięki są stosowane sekwencyjnie w całym mózgu, gdy są powtarzane przez kilka sesji leczenia, może zmniejszyć patologię blaszek amyloidowych w mózgach myszy z mutacją białka prekursorowego amyloidu (APP) odkładającą β amyloid i aktywować mikroglej, który wychwytuje amyloid, prowadząc do poprawy funkcji poznawczych⁷. Otwarcie BBB za pomocą ultradźwięków i mikropęcherzyków zmniejsza również patologię tau u transgenicznych myszy pR5, K3 i rTg4510 tau^5,12,13. Co ważne, podczas gdy mikroglej usuwa zewnątrzkomórkowe złogi białkowe, jednym z podstawowych mechanizmów usuwania patologii wewnątrzneuronalnych indukowanych przez SUS jest aktywacja autofagii neuronalnej¹².

Tutaj opisujemy eksperymentalny proces, w którym fluorescencyjnie znakowane przeciwciała są przygotowywane, a następnie mieszane z wewnętrznymi mikropęcherzykami na bazie lipidów, a następnie wstrzykiwane po oczodołach znieczulonym myszom. Wstrzyknięcie zadoczodołowe jest alternatywą dla iniekcji do żyły ogonowej, która okazała się równie skuteczna i łatwiejsza do wielokrotnego wykonywania. Bezpośrednio po tym następuje zastosowanie SUS do mózgu. Aby określić wychwyt przeciwciał terapeutycznych, myszy są uśmiercane, a następnie określa się ilościowo zwiększone stężenie przeciwciał w mózgu. Jako wskaźnik zastępczy zmiany homeostazy mózgu, aktywność fagocytarna mikrogleju jest określana przez histologię i wolumetryczną rekonstrukcję 3D.

Wygenerowane dane sugerują, że ultradźwiękowe dostarczanie przeciwciał jest potencjalnie atrakcyjnym podejściem do leczenia chorób neurodegeneracyjnych. Protokół może być podobnie stosowany do innych kandydatów na leki, a także do ładunków modelowych, takich jak znakowany fluorescencyjnie dektrans o określonych rozmiarach¹⁴.

Protokół

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez komisję etyki zwierząt Uniwersytetu Queensland.

1. Przygotowanie mikropęcherzyków we własnym zakresie

1. Odważyć stosunek molowy 1,2-distearoilo-sn-glicero-3-fosfocholiny i 1,2-distearoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloaminy-N-[amino(glikolu polietylenowego)-2000] (soli amonowej) w stosunku molowym. Wymagane jest 0,5 mg mieszaniny lipidów na 1 ml roztworu mikropęcherzyków. Alternatywnie, lipidy można kupić już w chloroformie, jeśli używasz wstępnie rozpuszczonych lipidów, przejdź do kroku 1.3.
2. Rozpuść lipid w małej objętości chloroformu w szklanej zlewce.
3. Odparować chloroform za pomocą parownika lub strumienia azotu.
4. Ponownie nawodnić wysuszony film lipidowy za pomocą 10 ml roztworu PBS + 10% glicerolu + 10% glikolu propylenowego, który został przefiltrowany przez filtr 0,22 μm.
5. Umieścić uwodniony roztwór lipidowy w sonikatorze łaźni wodnej ustawionym na 55 °C (powyżej temperatury topnienia lipidów) i sonikować aż do całkowitego rozpuszczenia.
6. Podwielokrotny roztwór lipidów przelać do autoklawowanych fiolek HPLC o pojemności 1,5 ml i zakręcić nakrętki przegród.
7. Za pomocą strzykawki o pojemności 5 ml wyposażonej w igłę 27 G należy odessać całe powietrze z fiolki i wytworzyć podciśnienie w fiolce.
8. Dodaj oktofluoropropan do fiolki za pomocą dołączonej strzykawki, pobierając gaz z kanistra. Napełnij fiolkę 1-2 ml oktafluoropropanu, odczytując objętość w strzykawce.
9. Uszczelnij każdą fiolkę folią parafinową i wstaw do lodówki.
10. W dniu eksperymentu doprowadzić fiolkę do temperatury pokojowej, dodać 0,5 ml 0,9% roztworu NaCl do fiolki, a następnie umieścić fiolkę w amalgamatorze i mieszać przez 45 s (ustawiony czas) w celu wytworzenia mikropęcherzyków.

2. Kontrola jakości mikropęcherzyków za pomocą licznika redlic

1. Wyjąć roztwór mikropęcherzyków z amalgamatora i odpuścić gaz z fiolki, przekłuwając przegrody igłą o sile 19 G.
2. Rozcieńczyć roztwór mikropęcherzyków, wykonując dwuetapowe seryjne rozcieńczenia w stosunku 1:5 000, dodając 100 μl roztworu mikropęcherzyków do 5 ml przefiltrowanego roztworu przepływowego za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml z igłą 19 G, a następnie pobierając 100 μl rozcieńczonego roztworu mikropęcherzyków w stosunku 1:50 i pipetując do 10 ml przefiltrowanego roztworu przepływowego w kuwecie za pomocą pipety.
3. Sprawdź, czy zbiornik elektrolitu ma wystarczający przepływ roztworu i czy zbiornik na odpady jest pusty.
4. Umieść kuwetę na platformie licznika redlic i zablokuj ją na miejscu. Do pobierania próbki należy użyć otworu 30 μm.
5. W oprogramowaniu załaduj standardową metodę operacyjną (SOM), a następnie wybierz opcję Edytuj SOM | stężenie. Wprowadź rozcieńczenie 5000x.
6. W oprogramowaniu wybierz odpowiednią nazwę pliku. Na przykład microbubble_1_date.
7. Załaduj i zabezpiecz kuwetę na platformę.
8. W oprogramowaniu wybierz Uruchom| Wyświetlić podgląd i sprawdzić, czy stężenie próbki jest mniejsze niż 10%. Jeśli liczba ta jest wyższa niż 10%, należy przeprowadzić nowe rozcieńczenie mikropęcherzyków o wyższym współczynniku rozcieńczenia.
9. Wybierz opcję "Start", aby rozpocząć pobieranie próbki w celu uzyskania początkowego odczytu.
10. Po każdym pomiarze przepłukać otwór licznika redlic przefiltrowanym roztworem przepływowym. Powtórz kroki 2.2-2.9, aby uzyskać 3 powtórzenia.
11. Umieść kuwetę z rozcieńczonym roztworem mikropęcherzyków w łaźni wodnej sonikatora i sonikuj przez 30 sekund.
12. Odmierzyć roztwór za pomocą sonikowanych mikropęcherzyków i oznaczyć jako pustą.
13. W oprogramowaniu odejmij końcowy odczyt od początkowego odczytu. Spowoduje to odjęcie wszelkich cząstek, które nie są mikropęcherzykami i nie zawierają gazu.
14. Wybierz opcję Wyświetl wyniki w oprogramowaniu, aby wyświetlić stężenie mikropęcherzyków, rozkład wielkości, średni rozmiar i stężenie objętościowe.

3. Znakowanie przeciwciałami fluorescencyjnymi

1. Otrzymać 1 mg/ml roztworu mysiej IgG w PBS bez żadnych dodatków.
2. Oznaczyć 1 mg mysiej IgG za pomocą AlexaFluor 647 w 0,1 M buforze wodorowęglanowym sodu, postępując zgodnie z instrukcjami producenta znajdującymi się w zestawie. Ta ilość znakowanej fluorescencyjnie IgG jest wystarczająca do przeprowadzenia tej procedury na 5-7 dorosłych myszach, u których podaje się dawkę przeciwciał 5 mg / kg.
3. Dodać barwnik do roztworu IgG w 0,1 M buforze wodorowęglanu sodu i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
4. Oczyść znakowane fluorescencyjnie przeciwciało, pipetując roztwór przeciwciała do kolumny wirowej i odwirowując przy 1,000 x g przez 5 minut. Wolny barwnik pozostanie w łożu kolumny.
5. Użyj spektrofotometru, aby zmierzyć stężenie białka. Zmierzyć absorbancję sprzężonego roztworu przy 280 nm i 650 nm (A280 i A650). Obliczyć stężenie białka w próbce, korzystając z równania:
   Stężenie białka (M) = [A280 - (A650 x 0,03)] x współczynnik rozcieńczenia / 203 000.
6. Użyj spektrofotometru, aby obliczyć stopień oznakowania za pomocą równania:
   Barwnik molowy na białko molowe = A650 x współczynnik rozcieńczenia / 239 000 x stężenie białka (M).
   UWAGA: Dopuszczalny stopień znakowania to 3-7 moli barwnika na białko molowe, a zazwyczaj uzyskiwany stopień znakowania wynosi około 6.

4. Ustawienie ultrasonograficzne

1. Korzystając ze zogniskowanego systemu ultradźwiękowego, dodaj dystans 5 mm do bolusa wodnego, aby ustawić ognisko ultradźwiękowe 9 mm poniżej dna bolusa wodnego.
2. Napełnij bolus wodny około 300 ml wody dejonizowanej, która była odgazowywana za pomocą odgazowywanego odgazowywacza liniowego przez 20 minut (zawartość tlenu powinna być poniżej 3 ppm). Umieść układ pierścieniowy w wypełnionym bolusie wodnym i użyj lusterka dentystycznego, aby sprawdzić, czy na powierzchni nie ma pęcherzyków powietrza. Jeśli znajduje się na powierzchni, usuń układ pierścieniowy i zastąp go bolusem wodnym.
3. Uruchom aplikację. W menu kształtu fali wybierz opcję Ustaw cykl pracy przebiegu. Ustawienia to PRF (Hz) 10, cykl pracy 10%, ostrość 80 mm, częstotliwość środkowa 1 MHz, amplituda (szczytowe podciśnienie MPa) 0,65 MPa, indeks mechaniczny = 0,65. Naciśnij Set, aby zdefiniować przebieg i zapisać go w pamięci.
   UWAGA: Zogniskowany system ultradźwiękowy jest wstępnie skalibrowany przez producenta na podstawie pomiarów wykonanych przez skalibrowany hydrofon.
4. W oprogramowaniu systemu zogniskowanego systemu ultrasonograficznego zdefiniuj plan leczenia. Wymaga to zdefiniowania regionu leczenia składającego się z wielu indywidualnych miejsc leczenia i zdefiniowania działań, które należy podjąć w każdym z tych miejsc leczenia. W tym przypadku strefa leczenia to jedna półkula mózgu myszy.
5. W oknie kontrolera ruchu przejdź do zakładki Skanowanie i wprowadź wartość start, stop i inkrementacja dla ruchu w wymiarze x oraz wartość start, stop i inkrementacja dla ruchu w kierunku y. Wprowadź wartości dla X: start -4, stop 3,50 i Y: -3,00, stop 3, Increment 1,5, # pętle: 1.
6. Zdefiniuj działania dla leczonych miejsc. W oknie kontrolera ruchu wybierz przycisk Zdarzenie. W oknie Edycja skryptu należy wybrać listę czynności, które będą wykonywane w kolejności wybranej dla każdego miejsca zabiegowego. Ustaw Typ ruchu na siatkę rastrową w górnej części okna skryptu. Na karcie zdarzeń wybierz Dodaj akcje, aby przenieść je do panelu skryptu, a następnie dodaj Przenieś synchronicznie, Rozpocznij wyzwalacz arb, czekaj, Zatrzymaj wyzwalacz arb. Kliknij akcję oczekiwania i wybierz czas oczekiwania 6 000 ms.
   UWAGA: Te ustawienia spowodują, że leczenie będzie siatką 6 x 5 punktów zabiegowych oddalonych od siebie o 1.5 mm, przy czym czas trwania każdego miejsca będzie wynosił 6 sekund. Całkowity czas sonikacji mózgu myszy wynosi około 3 minut. Ten rozmiar siatki zabiegowej jest odpowiedni dla dorosłych myszy C57/Bl6 o wadze około 30 g. Rozmiar siatki punktów zabiegowych można regulować w górę lub w dół w zależności od wielkości myszy.

5. Przygotowanie zwierząt

1. Zważ mysz za pomocą wagi z dokładnością do 0.1 g.
2. Znieczulić mysz 90 mg/kg ketaminy i 6 mg/kg ksylazyny dootrzewnowo. Test na brak odruchów ze szczypnięciem palca u nogi. Alternatywnie, myszy można znieczulić izofluranem za pomocą odpowiedniego wziewnego aparatu znieczulającego z odpowiednią maską na twarz. W przypadku stosowania izofluranu mysz należy umieścić na poduszce grzewczej podczas badania ultradźwiękami, aby zapobiec hipotermii.
3. Za pomocą elektrycznej maszynki do golenia zgolić sierść z głowy zwierzęcia, następnie nałóż krem do depilacji patyczkiem kosmetycznym, pozostaw na 2-3 minuty lub do momentu, aż włosy zostaną wytarte do czysta wilgotnym kawałkiem gazy. Uważaj, aby krem do depilacji nie dostał się do oczu myszy.
4. Zaznacz środek głowy myszy trwałym markerem. Przetwornik ma otwór w środku, a ostrość przetwornika i ognisko można wyrównać wizualnie.
5. Napełnij małą łódkę wagową, która wcześniej miała odcięte dno i zastąpiona folią przyklejoną do dna łodzi wagowej żelem ultradźwiękowym. Służy to jako podkładka dystansowa 8 mm i zapewnia dobre sprzężenie z główką myszy oraz umożliwia wizualną kontrolę ostrości przetwornika wyrównanego z główką myszy.

6. Przygotowanie mikropęcherzyków

1. Podgrzej fiolkę z mikropęcherzykami do temperatury pokojowej. Aby aktywować, dodaj 0,5 ml 0,9% roztworu NaCl do fiolki i umieść w amalgamatorze, aby mieszać przez 45 sekund w celu wytworzenia mikropęcherzyków.
2. Odpowietrzyć fiolkę, przekłuwając przegrodę igłą o sile 27 G.

7. Leczenie ultradźwiękami

1. Odwrócić fiolkę z mikropęcherzykami i delikatnie pobrać 1 μl/g masy ciała. Do tego dodać roztwór znakowanego fluorescencyjnie przeciwciała i delikatnie wymieszać w strzykawce. Maksymalna wstrzykiwana objętość wynosi 150 μl.
   UWAGA: Mikropęcherzyki przygotowane we własnym zakresie są około 60-krotnie mniej skoncentrowane niż mikropęcherzyki stosowane klinicznie (np. Mikropęcherzyki Definity). Dostosuj objętość lub stężenie w taki sposób, aby liczba wstrzykiwanych mikropęcherzyków była podobna do tych stosowanych klinicznie (tj. Definitywność 1,2 x 10⁸ mikropęcherzyków/kg masy ciała).
2. Wstrzyknąć roztwór mikropęcherzyków i przeciwciał zadoczodoczodołowo, uważając, aby wstrzykiwać delikatnie i powoli. Następnie nałóż maść okulistyczną na oczy myszy.
3. Umieść mysz w uchwycie na głowę (patrz Tabela materiałów) i zamocuj nos myszy. Następnie umieść małą łódkę do ważenia wypełnioną żelem ultradźwiękowym na czubku głowy.
4. Obniż bolus wodny, aż znajdzie się na żelu ultradźwiękowym w łodzi do ważenia.
5. Użyj joysticka, aby przesunąć ostrość przetwornika na środek głowy. Wybierz opcję Resetuj początek układu współrzędnych na karcie ruchu.
6. Wybierz opcję Zakończ skanowanie. Kroki 7.3-7.6 zajmą 2 minuty.
7. Aby zachować spójność, ustaw timer, aby zapewnić 2-minutowe opóźnienie między wstrzyknięciem mikropęcherzyków a wybraniem pełnego skanowania.
8. Po zakończeniu zabiegu nałóż maść okulistyczną na oczy i umieść mysz w rozgrzanej komorze regeneracyjnej. Jeśli podczas zabiegu zaobserwuje się hipotermię, pod myszą można umieścić podkładkę rozgrzewającą, aby zapewnić dodatkowe ciepło podczas zabiegu.

8. Pobieranie i przetwarzanie tkanek

1. W interesującym nas czasie po podaniu ultradźwięków (co najmniej 1 godzina w celu wykrycia wysokiego poziomu przeciwciał w mózgu) głęboko znieczulić mysz przedawkowaniem roztworu Pentobarbitonu (100 mg / kg) i perfuzję przezsercową myszy za pomocą 30 ml PBS. Dobra perfuzja jest wymagana do specyficznego wykrycia znakowanych fluorescencyjnie przeciwciał, które zostały dostarczone do mózgu.
2. Zebrać mózg i utrwalić przez zanurzenie w 4% PFA na 24 godziny w temperaturze 4 °C, a następnie przemyć PBS.
3. Zobrazuj mózg w skanerze podczerwieni, umieszczając mózg na tacy i uzyskując obraz w kanale 700 nm.
   UWAGA: Po utrwaleniu mózg jest usuwany z PFA, myty w PBS i dzielony na sekcje. Alternatywnie można go umieścić w roztworze krioprotektantu z glikolu etylenowego na 24 godziny w temperaturze 4 °C lub do momentu zanurzenia, a następnie przenieść do nowej fiolki zawierającej krioprotektant i umieścić w temperaturze -20 °C w celu długotrwałego przechowywania.
4. Przekrój zimny mózg w PBS za pomocą wibratomu. Przyklej mózg do platformy i wytnij odcinki 30-40 μm i zbierz do PBS.
   UWAGA: Autofluorescencja lizosomalna (powszechna w skrawkach zwierząt starszych niż około 12 miesięcy) powinna być bielona przez nocne oświetlenie skrawków w komorze świetlnej, w temperaturze pokojowej i w PBS zawierającym azydek (0,02%) w celu zablokowania wzrostu bakterii.

9. Barwienie tkanek i akwizycja obrazu

1. Przenieść skrawki do roztworu blokującego (5% BSA w 0,2% Triton/PBS) przez 2 godziny w temperaturze pokojowej, następnie umyć skrawki 3x, zastępując roztwór 0,2% Tritonem/PBS.
2. Inkubować skrawki w temperaturze 4 °C przez noc z pierwszorzędowymi przeciwciałami przeciwko Iba1 (rozcieńczenie 1:1 000) i CD68 (rozcieńczenie 1:500), w 0,2% Trytonie/PBS, a następnie 3-krotne przemycie 0,2% Tritonem/PBS.
3. Inkubować sekcje przez 2 godziny w temperaturze pokojowej z fluorescencyjnymi przeciwciałami drugorzędowymi (rozcieńczenie 1:500), a następnie 3 razy przemywać tylko 0,2% Tritonem/PBS.
   UWAGA: Jądra można również barwić roztworem DAPI (0,5 μg/ml).
4. Przenieś sekcje na szkiełko podstawowe i szkiełko nakrywkowe z twardymi nośnikami montażowymi. Odczekaj wystarczająco dużo czasu, aby podłoże montażowe zestaliło się przed wizualizacją i akwizycją obrazu (przez noc).
5. Za pomocą mikroskopu konfokalnego uzyskaj obrazy stosu z (głębokość co najmniej 10 μm i rozmiar kroku 0,3 μm, 10 obrazów na zwierzę) obszaru mózgu docelowego za pomocą ultrasonografii za pomocą mikroskopu konfokalnego i obiektywu o powiększeniu co najmniej 40.
   UWAGA: Zachowaj ostrożność, aby uzyskać obrazy w zakresie dynamiki sygnału, unikając niedoświetlenia/prześwietlenia. Zapisz pliki obrazów w odpowiednim formacie oprogramowania używanym przez mikroskop.

10. Analiza obrazu

1. Przekonwertuj pliki mikroskopii z-stack za pomocą importera plików oprogramowania do analizy obrazu.
2. Otwórz przekonwertowane pliki w oprogramowaniu i dostosuj intensywność kanału Iba1, aby obserwować komórki mikrogleju.
3. Przytnij pojedynczą komórkę mikrogleju, rysując wokół niej ramkę, wybierz "przytnij" i zapisz nowy plik.
4. Zbuduj renderowanie powierzchni 3D sygnału IBA1 poprzez:
   1. Otwórz jednokomórkowy plik Imaris wygenerowany w poprzednim kroku.
   2. Dodaj powierzchnię do pliku.
   3. Wybierz kanał odpowiadający barwieniu Iba1.
   4. Zastosuj próg, który powinien zachodzić na barwienie Iba1
   5. Należy wybrać tylko tę strukturę, która tworzy interesującą nas komórkę mikrogleju
5. Zakończ proces
   1. Uzyskać i zapisać objętość barwienia Iba1
   2. Tworzenie renderingu powierzchni 3D barwienia CD68
   3. Wewnątrz podzbioru powierzchni IBA1 zamaskuj kanał CD68 i usuń woksele na zewnątrz barwienia IBA1
   4. Dodawanie nowej powierzchni do pliku
   5. Wybierz kanał odpowiadający barwieniu CD68
   6. Zastosuj próg, który powinien zachodzić na barwienie CD68 i być jak najbardziej zbliżony do objętości barwienia
   7. Zakończ proces, ponieważ w tym pliku będą obecne tylko wewnątrzmikroglejowe struktury CD68, a zatem nie wymagają one kolejnego kroku filtrowania progowego
   8. Uzyskać i zapisać liczbę i średnią objętość dodatnich struktur CD68
   9. Obliczyć względną objętość struktur CD68 na odpowiadające im struktury IBA1 jako miarę aktywacji mikrogleju w stanie fagocytarnym.

Wyniki

Korzystając z tego protokołu, fluorescencyjnie znakowane przeciwciała są dostarczane do mózgu i mogą być wykryte, wraz z aktywacją mikrogleju. Wniosek, który można wyciągnąć, jest taki, że zastosowanie skoncentrowanych ultradźwięków i mikropęcherzyków znacznie zwiększa wychwyt przeciwciał przez mózg i może dostarczać przeciwciała do całego mózgu lub półkuli myszy, gdy są używane w trybie skanowania. Rysunek 1 pokazuje urządzenie do aplikacji ultrasonograficznej TIPS (oznaczone różne komponen...

Dyskusja

Przeciwciała znakowane fluorescencyjnie mogą być dostarczane do mózgu za pomocą zogniskowanych ultradźwięków wraz z mikropęcherzykami aplikowanymi w trybie skanowania. Dostarczanie przeciwciał, morfologię mikrogleju i powiększenie lizosomów można wykryć za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej po skanowaniu ultradźwięków. Mikroglej może pobierać do swoich lizosomów przeciwciała i antygeny, z którymi przeciwciała związały się w procesie za pośrednictwem receptora Fc⁴.

Istn...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
1,2-distearoilo-sn-glycero-3-fosfocholine	Avanti	850365C
1,2-distearoilo-sn-glycero-3-fosphoethanolamine-N-[amino(polietylenoglikol)-2000]	Avanti	880128C
AlexaFluor 647 Zestaw do znakowania przeciwciał	Thermo Fisher	A20186
CD68	AbD Serotec	MCA1957GA	Użyj rozcieńczenia
1:1000Chloroform	Sigma-Aldrich	372978
Licznik redlic (Multisizer 4e)
Glicerol	Sigma-Aldrich	G5516
Kozia anty-królicza IgG, Alexa Fluor 488	Thermo FIsher	A-11008	Użyj rozcieńczenia 1:500
Kozia anty-królicza IgG, Alexa Fluor 488	Thermo Fisher	A-11077	Użyj rozcieńczenia
1:500uchwyt na głowę (model SG-4N, Narishige Japonia)
Przeciwciało Iba1	Wako	019-19741	Użyj rozcieńczenia 1:1000
Oprogramowanie do analizy obrazu	Beckman Coulter	#8547008
Rozwiązanie przepływu Isoflow	Beckman Coulter	B43905
System obrazowania w bliskiej podczerwieni Odyssey Fc	Licor	2800-03
Oktafluoropropan	Arcadophta	0229NC
Glikol propylenowy	Sigma-Aldrich	P4347
TIPS (system sondy do obrazowania terapii)	Philips	Research TIPS_007
	Bitplane