Artykuł metodologiczny

Kinetyczna wizualizacja jednokomórkowych międzygatunkowych interakcji bakteryjnych

DOI:

10.3791/61376

⸱

5 sierpnia 2020

 ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, Carver College of Medicine, University of Iowa

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół obrazowania żywych komórek bakteryjnych pozwala na wizualizację interakcji między wieloma gatunkami bakterii na poziomie pojedynczej komórki w czasie. Obrazowanie poklatkowe pozwala na obserwację każdego gatunku bakterii w monokulturze lub kokulturze w celu zbadania interakcji międzygatunkowych w wielogatunkowych społecznościach bakteryjnych, w tym ruchliwości i żywotności poszczególnych komórek.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Społeczności wielomikroorganizmów są z natury wszechobecne, jednak badanie ich interakcji na poziomie pojedynczej komórki jest trudne. W związku z tym opracowano metodę opartą na mikroskopii do obserwacji interakcji międzygatunkowych między dwoma patogenami bakteryjnymi. Przedstawiono zastosowanie tej metody do badania interakcji między ruchliwym patogenem Gram-ujemnym, Pseudomonas aeruginosa, a nieruchliwym patogenem Gram-dodatnim, Staphylococcus aureus. Protokół ten polega na koinokulacji każdego gatunku między szkiełkiem nakrywkowym a podkładką agarozową, co utrzymuje komórki w jednej płaszczyźnie i pozwala na wizualizację zachowań bakterii zarówno w przestrzeni, jak i w czasie.

Ponadto, zademonstrowana tutaj mikroskopia poklatkowa jest idealna do wizualizacji wczesnych interakcji, które zachodzą między dwoma lub więcej gatunkami bakterii, w tym zmian w ruchliwości gatunków bakterii w monokulturze i w kokulturze z innymi gatunkami. Ze względu na charakter ograniczonej przestrzeni próbki w konfiguracji mikroskopowej, protokół ten ma mniejsze zastosowanie do badania późniejszych interakcji między gatunkami bakterii, gdy populacje komórek są zbyt wysokie. Istnieje jednak kilka różnych zastosowań protokołu, które obejmują wykorzystanie barwienia do obrazowania żywych i martwych komórek bakteryjnych, ilościowe określanie ekspresji genów lub białek za pomocą fluorescencyjnych reporterów oraz śledzenie ruchu komórek bakteryjnych zarówno w eksperymentach jednogatunkowych, jak i wielogatunkowych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Społeczności wielomikrobiologiczne są powszechne w przyrodzie, obejmując różne środowiska1,2,3 i ludzkie nisze4,5. Do najbardziej znanych infekcji wielodrobnoustrojowych w chorobach człowieka należą: biofilmy zębowe6, rany przewlekłe7,8, oraz infekcje dróg oddechowych u osób z przewlekłą obturacyjną chorobą płuc9, zapalenie płuc związane z respiratorem10, oraz choroba genetyczna mukowiscydoza (CF)11,12. Infekcje te często składają się z różnych gatunków drobnoustrojów; jednak ostatnio skupiono się na interakcjach między bakterią Gram-dodatnią Staphylococcus aureus a bakterią Gram-ujemną Pseudomonas aeruginosa. Badania obejmujące pacjentów jednocześnie zakażonych tymi organizmami oraz analizy in vitro ujawniają zarówno interakcje konkurencyjne, jak i kooperacyjne, które mogą mieć głęboki i nieoczekiwany wpływ na postęp choroby, przeżycie drobnoustrojów, zjadliwość, metabolizm i podatność na antybiotyki (szczegółowo omówione przez Hotterbeekx i in. 201713 oraz Limoli i Hoffman 20193).

Rosnące zainteresowanie interakcjami międzygatunkowymi podczas infekcji zaowocowało różnorodnymi metodami badania zachowań społeczności wielomikrobiologicznej. Zazwyczaj w badaniach tych wykorzystywano testy na płytkach lub bulionie w celu zbadania różnic fenotypowych między monokulturą a kokulturą. Na przykład hodowla P. aeruginosa i S. aureus na powierzchniach stałych pozwoliła na wizualizację zahamowania wzrostu lub zmian w fenotypie kolonii, pigmentacji lub produkcji polisacharydów14,15,16. Biofilmy gatunków mieszanych na powierzchniach biotycznych lub abiotycznych, a także kokulturacja gatunków bakterii w kulturach płynnych umożliwiły również pomiar zmian we wzroście, metabolizmie, tolerancji na antybiotyki, konkurencji i żywotności, a także ekspresji genów i białek17,18. Chociaż te eksperymenty z masowymi hodowlami ujawniły wgląd w to, w jaki sposób P. aeruginosa i S. aureus mogą wpływać na siebie nawzajem w skali społeczności, nie są w stanie odpowiedzieć na ważne pytania dotyczące interakcji zachodzących na poziomie pojedynczej komórki. Przedstawiona tutaj metoda uzupełnia podejścia do badania interakcji międzygatunkowych, koncentrując się na zmianach w ruchu, żywotności komórek i ekspresji genów pojedynczych komórek w społeczności kokulturowej w czasie.

Interakcje między pojedynczymi komórkami mogą znacznie różnić się od interakcji zachodzących w dużej społeczności komórek. Poprzez analizę pojedynczych komórek można określić ilościowo heterogeniczność w społeczności, aby zbadać, w jaki sposób przestrzenne rozmieszczenie komórek wpływa na dynamikę społeczności lub jak zmieniają się poziomy ekspresji genów i białek w poszczególnych członkach grupy. Śledzenie komórek może również zapewnić wgląd w to, jak pojedyncze komórki poruszają się i zachowują w czasie, przez wiele pokoleń. Śledząc jednocześnie ruchy komórek i zmiany w ekspresji genów, można uzyskać korelacje między fluktuacjami genów a odpowiadającymi im fenotypami. Opisano dotychczasowe protokoły badania poszczególnych gatunków bakterii na poziomie pojedynczej komórki. Badania te wykorzystują obrazowanie komórek na żywo w czasie w jednej płaszczyźnie i były przydatne do obserwacji fenotypów, takich jak podział komórek i podatność na antybiotyki19,20. Dodatkowa mikroskopia obrazowania na żywo została wykorzystana do monitorowania wzrostu, ruchliwości, kolonizacji powierzchni i tworzenia biofilmu pojedynczych gatunków bakterii21,22,23. Jednakże, podczas gdy badania te były wnikliwe w zrozumieniu fizjologii bakterii w monokulturze, eksperymenty mające na celu obserwację zachowania wielu gatunków bakterii w czasie w kokulturze są ograniczone.

Tutaj poprzednie protokoły używane do obrazowania pojedynczych gatunków zostały dostosowane do badania interakcji między P. aeruginosa i S. aureus. Organizmy te można różnicować pod wpływem kontrastu fazowego na podstawie morfologii ich komórek (P. aeruginosa to pałeczki, a S. aureus to ziarniaki). Opracowanie tej metody umożliwiło ostatnio wizualizację wcześniej nieopisanych zachowań motorycznych P. aeruginosa w obecności S. aureus24. Stwierdzono, że P. aeruginosa jest zdolna do wykrywania S. aureus na odległość i reagowania zwiększonymi i kierunkowymi ruchami pojedynczych komórek w kierunku skupisk komórek S. aureus. Stwierdzono, że ruch P. aeruginosa w kierunku S. aureus wymaga pilusów typu IV (TFP), wypustek przypominających włosy, których skoordynowane rozciąganie i cofanie generuje ruch zwany ruchliwością drgań25.

Te badania pokazują użyteczność tej metody do badania wcześniejszych interakcji między gatunkami. Jednak obrazowanie przy dużej gęstości komórek w późniejszych punktach czasowych interakcji jest trudne, biorąc pod uwagę, że nie można już zidentyfikować pojedynczych warstw komórek, co w większości przypadków stanowi problem podczas analizy po obrazowaniu. Biorąc pod uwagę to ograniczenie, metoda ta najlepiej nadaje się do wcześniejszych interakcji, które można następnie kontynuować tradycyjnymi testami makroskopowymi przy wyższych gęstościach komórek reprezentatywnych dla późniejszych interakcji. Dodatkowe ograniczenia tej metody obejmują niską przepustowość, ponieważ można obrazować tylko jedną próbkę na raz, oraz koszt mikroskopu, kamery i komory środowiskowej. Co więcej, mikroskopia fluorescencyjna stwarza zagrożenia dla komórek bakteryjnych, takie jak fototoksyczność i fotowybielanie, ograniczając w ten sposób częstotliwość uzyskiwania obrazów fluorescencyjnych. Wreszcie, płatki agarozowe stosowane w tej metodzie są bardzo podatne na zmiany w środowisku, co sprawia, że kontrola warunków takich jak temperatura i wilgotność ma kluczowe znaczenie, biorąc pod uwagę, że podkładki mogą zacząć się kurczyć lub rozszerzać, jeśli warunki nie są odpowiednie. Wreszcie, chociaż metoda ta nie naśladuje środowiska gospodarza, dostarcza wskazówek dotyczących tego, jak różne gatunki bakterii reagują na powierzchniach, które można śledzić w testach zaprojektowanych w celu naśladowania warunków środowiskowych/gospodarza.

Ta metoda różni się od poprzednich badań śledzących ruch pojedynczej komórki tym, że komórki są inokulowane między szkiełkiem nakrywkowym a podkładką agarozową, ograniczając komórki do powierzchni. Umożliwia to śledzenie komórek w czasie w jednej płaszczyźnie; Ogranicza jednak cykle przejściowego zaangażowania powierzchni obserwowane, gdy komórki są zanurzone w cieczy26. Dodatkową zaletą obrazowania bakterii pod podkładką agarozową jest to, że naśladuje makroskopowe testy inokulacji podpowierzchniowej na płytkach, klasycznie używane do badania ruchliwości drgań P. aeruginosa25. W tym teście komórki bakteryjne są inokulowane między dnem szalki Petriego a agarem, utrzymując komórki w jednej płaszczyźnie, gdy poruszają się po dnie szalki na zewnątrz od punktu zaszczepienia, podobnie jak w tym protokole mikroskopowym.

Przedstawiony tutaj protokół mikroskopii poklatkowej do wizualizacji interakcji międzygatunkowych składa się z: 1) przygotowania próbki bakteryjnej i podkładki agarozowej, 2) wyboru ustawień mikroskopu do akwizycji obrazowania oraz 3) analizy po obrazowaniu. Szczegółowa wizualizacja ruchu i śledzenia komórek może być wykonywana poprzez akwizycję obrazów w krótkich odstępach czasu za pomocą kontrastu fazowego. Mikroskopia fluorescencyjna może być również wykorzystana do określenia żywotności komórek lub ekspresji genów w czasie. Tutaj pokazujemy jeden przykład adaptacji do mikroskopii fluorescencyjnej poprzez dodanie barwników żywotności do padów agarozowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Pełny opis i numery katalogowe dla wszystkich materiałów eksploatacyjnych w tym protokole można znaleźć w Tabeli Materiałów.

1. Przygotowanie minimalnych nośników M8T

  1. Przygotować 1 l zasady M8 o minimalnej zawartości soli (5x) rozpuszczając 64 g Na2HPO4·7H2O, 15 g KH2PO4 i 2,5 g NaCl w 800 ml ultraczystej wody (UPW, rezystywność 18 MΩ/cm) w butelce o pojemności 2 l. pH do 7,6. Całkowita objętość do 1 l z wodą ultraczyste. Autoklaw przez 45 min.
  2. Przygotować 500 ml roztworu glukozy (20% w/v), rozpuszczając 100 g glukozy w 400 ml wody ultraczystej w butelce o pojemności 1 l. Kompletny roztwór do 500 ml z wodą ultraczynną. Autoklaw przez 45 min.
  3. Przygotować 500 ml roztworu tryptonu (20% w/v), rozpuszczając 100 g tryptonu w 400 ml wody ultratonowej. Uzupełnij do 500 ml z UPW. Autoklaw przez 45 min.
  4. Przygotuj 1 l minimalnej pożywki M8 + 10% tryptonu (M8T), dodając 200 ml 5 minimalnych soli M8 (1 x końcowy), 10 ml 20% glukozy (0,2% końcowej), 1 ml 1 MMgSO4 (1 mM końcowy) i 50 ml 20% tryptonu (1% końcowy) do 600 ml UPW. Kompletne do 1 l z wodą ultraczynną. Przefiltrować przez sterylny filtr 0,2 μm do sterylnej butelki do przechowywania pożywek o pojemności 500 ml.

Dzień 1:

2. Przygotowanie nocnych kultur bakteryjnych

  1. Zaszczepić 5 ml minimalnej ilości pożywki M8T pojedynczą kolonią P. aeruginosa lub S. aureus (w tym antybiotykami, jeśli jest to właściwe) i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C z napowietrzaniem nie dłużej niż 16 godzin
    UWAGA: Patogeny bakteryjne P. aeruginosa i S. aureus zostały użyte w tej metodzie, ponieważ są one zwykle koizolowane z przewlekłych infekcji, a badanie ich interakcji jest ważne, aby zrozumieć, w jaki sposób przyczyniają się one do wyników leczenia pacjentów podczas infekcji wielodrobnoustrojowych. Inne gatunki bakterii mogą być stosowane w zależności od przedmiotu badania.

Dzień 2:

3. Subkultura szczepów bakteryjnych

  1. Subkultura P. aeruginosa 1:500 i S. aureus 1:1000 w 5 ml świeżego M8T (w razie potrzeby należy dodać antybiotyki). Inkubować z napowietrzaniem w temperaturze 37 °C, aż kultury osiągną fazę połowy logarytmu (OD600 = ~0,3 - 0,5).

4. Przygotowanie materiałów do form padowych

  1. Przygotuj metalowe szpatułki, podgrzewając koniec płaskiej, zaokrąglonej szpatułki laboratoryjnej za pomocą palnika Bunsena, aż połowa płaskiego końca będzie mogła zostać zgięta pod kątem 90°. Podgrzej koniec kolejnej płaskiej, zaokrąglonej szpatułki laboratoryjnej i lekko zegnij ostatnie 10 mm do kąta 45 °C.
  2. Odetnij cztery rogi silikonowych foremek tak, aby foremki zmieściły się w naczyniu o średnicy 35 mm.
  3. Wysterylizuj szpatułki i pęsetę, dodając 70% etanolu i przepuszczając je przez płomień palnika Bunsena.
  4. Wyczyść naczynie i silikonowe foremki 70% etanolem i osusz je niestrzępiącymi się chusteczkami.

5. Przygotowanie płatków agarozowych

UWAGA: Podkładki są przygotowywane z minimalną ilością pożywki M8T jako źródła składników odżywczych dla bakterii używanych w tym protokole. Jednak składniki odżywcze stosowane w podkładkach mogą być modyfikowane dla różnych organizmów.

  1. Rozpuść 2% niskotopliwej agarozy w 10 ml M8T w czystej kolbie Erlenmeyera o pojemności 50 ml. Podgrzewać w kuchence mikrofalowej w krótkich odstępach czasu (2-5 s), aż agaroza znajdzie się w roztworze, aby zapobiec wykipieniu zawartości kolby. Po stopieniu ostudzić w łaźni wodnej o temperaturze 50 °C przez co najmniej 15 minut.
  2. Przygotuj foremki, wyrównując silikonowe wycięcie z otworem w naczyniu 35 mm i lekko postukaj szpatułką, aby przymocować silikon do naczynia i usunąć wszystkie pęcherzyki powietrza między formą a naczyniem.
  3. Po ostygnięciu odpipetować 915 μl stopionej agarozy do formy. Pozostaw uchyloną pokrywkę i pozostaw podkładkę do wyschnięcia w temperaturze pokojowej na 30 minut.
  4. Przykryj naczynie pokrywką i pozostaw w temperaturze pokojowej na dodatkowe 2 godziny.
  5. Przygotuj chusteczki nawilżające, szczelnie zwijając niestrzępiącą się chusteczkę. Umieść zwiniętą chusteczkę w sterylnej szalce Petriego i równomiernie dodaj 500 μl sterylnej wody na chusteczkę. Ogrzewać do 37 °C przez 1 godzinę.
  6. Podgrzewać podkładkę i sterylne naczynie o średnicy 35 mm do temperatury 37 °C przez 1 godzinę.

6. Przygotowanie komórek bakteryjnych i poduszek do zaszczepiania

  1. Zmierzyć OD600 każdej subkultury i rozcieńczyć P. aeruginosa do OD600 = 0,03, a S. aureus do OD600 = 0,10 w M8T wstępnie ogrzanym do 37 °C. Wymieszaj P. aeruginosa i S. aureus w stosunku 1:1 i wiruj.
    UWAGA: Jeśli szczepy wymagają antybiotyków, antybiotyki mogą być dodawane do subkultury nocnej i subkultury, ale nie powinny być dodawane podczas mieszania gatunków do obrazowania, jeśli wpływa to na inne gatunki w kokulturze. Stabilność plazmidu i wpływ antybiotyków na wszystkie gatunki w kokulturze będą musiały zostać określone dla każdego stosowanego organizmu/plazmidu.
  2. Odpipetować 1 μl kokultury równomiernie na dnie wstępnie podgrzanego, sterylnego naczynia nakrywkowego ze szkła o średnicy 35 mm.
  3. Usuń silikonowe wycięcie z formy za pomocą sterylnej pęsety.
  4. Wyjmij wacik z naczynia za pomocą sterylnych szpatułek.
    1. Wsuń lekko wygiętą szpatułkę pod krawędź podkładki, trzymając formę do góry nogami, aby upuścić ją na sterylną pokrywkę płytki Petriego.
      UWAGA: Uważaj, aby nie wysunąć podkładki na siłę, bo się rozerwie. Śledź, która strona podkładki jest na dole.
  5. Przenieś podkładkę do naczynia z komórkami bakteryjnymi, dnem do dołu, wsuwając szpatułkę pod kątem 90° pod podkładkę i umieszczając ją na wierzchu zaszczepionego szkiełka nakrywkowego. Użyj szpatułki pod kątem 90°, aby podkładka zrównała się z szkiełkiem nakrywkowym i delikatnie wyciśnij wszelkie pęcherzyki powietrza.
  6. Usuń nadmiar wilgoci z wilgotnych chusteczek, a następnie umieść wokół krawędzi naczynia, upewniając się, że nie dotyka podkładki. Próbka jest teraz gotowa do obrazowania.

7. Ustawianie mikroskopu do obrazowania na żywo

  1. Ogrzać komorę środowiskową do temperatury 37 °C co najmniej 2 godziny przed rozpoczęciem eksperymentu.
  2. Włącz wszystkie komponenty, w tym mikroskop, komputer i źródła światła, aby uzyskać obrazowanie w jasnym polu i fluorescencji.
  3. Otwórz oprogramowanie do obrazowania i upewnij się, że źródła światła są podłączone i działają.
  4. Wykonaj Köhler illumination27, aby wyrównać wszystkie płaszczyzny obrazu.
    1. Najpierw ustaw ostrość zaznaczonego szkiełka nakrywkowego za pomocą obiektywu 20x za pomocą "atrapy" szalki. Upewnij się, że wieżyczka skraplacza jest ustawiona w pozycji "otwartej".
      UWAGA: Oświetlenie Köhlera należy wykonać dla każdego unikalnego obiektywu/próbki, aby prawidłowo wyrównać płaszczyzny obrazu. Jednak ostrość i wyrównanie z "manekinem" czaszy na mniejszym powiększeniu przyspiesza ustawianie na żywych próbkach przy większym powiększeniu, aby ograniczyć czas między ustawieniem a czasem rozpoczęcia eksperymentu.
    2. Ustaw ostrość skraplacza.
      1. Zamknij przysłonę polową.
        UWAGA: Powinien pojawić się otwór w kształcie ośmiokąta. Jeśli kondensator jest całkowicie nieostry, całe pole view (FOV) będzie ciemne.
      2. Obracaj pokrętłami ostrości kondensatora, aż krawędzie ośmiokąta będą wyraźne.
        UWAGA: Natężenie światła będzie się zwiększać, gdy płaszczyzny obrazu zbliżą się do prawidłowego wyrównania.
    3. Wyrównaj skraplacz.
      1. Wyśrodkuj kondensator polowy, regulując pokrętła wyrównujące.
        UWAGA: Ośmiokąt powinien być wyśrodkowany do środka pola widzenia. Pokrętła wyrównujące różnią się w zależności od mikroskopu. Na przykład niektóre kondensatory mikroskopowe mają pokrętła, podczas gdy inne mają wymagające śrubokręta.
    4. Ustaw ostrość żarnika lampy i wyreguluj przysłonę kondensatora.
      1. Umieść teleskop fazowy lub soczewkę Bertranda na drodze światła, aby obserwować tylną płaszczyznę ogniskowej obiektywu.
        UWAGA: Powinny istnieć dwa koncentryczne okręgi.
      2. Obróć pokrętło ostrości obiektywu Bertrand, aż pierścienie będą wyglądać wyraźnie.
      3. Usuń soczewkę Bertranda ze ścieżki światła.
    5. Otwórz przysłonę pola, aż ośmiokąt znajdzie się tuż poza polem widzenia.
    6. Zmień obiektyw na 100x i wsuń pasujący pierścień fazowy na miejsce przed dodaniem kropli olejku immersyjnego i umieść przygotowane naczynie na próbkę.
    7. Wykonaj oświetlenie Köhlera na obiektywie 100x za pomocą naczynia na próbki bakterii.
  5. Skoncentruj się na bakteriach, używając tylko precyzyjnej regulacji. Gdy bakterie w polu widzenia zostaną skupione przez okular, przełącz ścieżkę światła na kamerę, naciskając przycisk kamery na mikroskopie.
  6. Kliknij opcję Faza w oprogramowaniu do obrazowania.
  7. Dostosuj procentową ilość emitowanego światła LED DIA, wybierając źródło światła w oprogramowaniu i ręcznie wprowadzając żądany procent światła, który ma być użyty, lub przesuwając pasek na skali procentowej światła.
  8. Dostosuj czas ekspozycji światła DIA LED, klikając źródło światła i ręcznie wprowadzając żądany czas ekspozycji lub wybierając czas ekspozycji z dostarczonego menu rozwijanego.
    UWAGA: Czas naświetlania będzie się różnić w zależności od używanego aparatu.
  9. Jeśli korzystasz z fluorescencji, dostosuj ustawienia kamery w każdym odpowiednim kanale (np. TxRed, GFP), klikając interesujący Cię kanał fluorescencyjny.
    1. Ustaw procent emitowanego światła fluorescencyjnego, a następnie dostosuj czas ekspozycji (jak wykonano w krokach 7.7 i 7.8 dla światła DIA LED).
    2. Alternatywnie zmień głębię bitową, aby dostosować zakres dynamiczny, wybierając jedną z pozostałych opcji głębi bitowej z menu rozwijanego kontrolek wizualizacji.
  10. Wybierz interesujące Cię pozycje XY, klikając opcję XY w menu sterowania akwizycją.
    1. Przesuń pozycję sceny za pomocą joysticka lub klikając i przeciągając FOV na ekranie, a następnie kliknij puste pole, aby zapisać współrzędne X i Y określonej pozycji.
      UWAGA: W przypadku akwizycji poklatkowej zaleca się wybór nie więcej niż trzech różnych pozycji XY, jak to możliwe
      2. względem siebie.
  11. Włącz system idealnego ustawiania ostrości (PFS), klikając pole PFS na karcie XY w menu sterowania akwizycją lub naciskając przycisk PFS na panelu sterowania joysticka.
  12. Obracaj pokrętłami precyzyjnej regulacji, aby skupić się na komórkach bakteryjnych.
  13. Kliknij przycisk PFS dla każdej pozycji XY, gdy komórki znajdą się w żądanej płaszczyźnie ostrości.
    UWAGA: PFS kompensuje dryft w osi Z podczas eksperymentów poklatkowych. Jest to konieczne, aby utrzymać skupienie komórek bakteryjnych w czasie. Różni producenci mają różne systemy wynagrodzeń.
  14. Wybierz warunki akwizycji obrazu, w tym interwał akwizycji i częstotliwość dla każdego kanału (np. kontrast fazowy i każdy fluorofor), wybierając z opcji w menu elementów sterujących akwizycją.
    UWAGA: W prezentowanych tutaj eksperymentach obrazy z kontrastem fazowym są pozyskiwane w odstępach co 5-10 s, natomiast obrazy fluorescencyjne w kanałach GFP i TxRed są rejestrowane co 20 minut.
  15. Rozpocznij obrazowanie po skonfigurowaniu ustawień mikroskopu i akwizycji.

8. Opcjonalnie: Modyfikacje dla obrazowania żywych/martwych

  1. Rozpuść 2% agarozy w 10 ml M8T i pozostaw do ostygnięcia w łaźni wodnej o temperaturze 50 °C przez co najmniej 15 minut.
  2. Dodać 1 mM jodku propidyny do stopionej agarozy.
  3. Po schłodzeniu odpipetować 915 μl agarozy w przygotowanej formie.
  4. Pozostaw uchyloną pokrywkę i pozostaw podkładkę do wyschnięcia w temperaturze pokojowej na 30 minut. Chronić przed światłem.
  5. Przykryj naczynie pokrywką i pozostaw w temperaturze pokojowej na dodatkowe 2 godziny.
  6. Przygotuj chusteczki nawilżające.
    1. Zwiń szczelnie niestrzępiący się papier, wytrzyj.
    2. Umieść chusteczkę na sterylnej szalce Petriego i dodaj do niej 500 μl sterylnej wody.
    3. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
  7. Inkubować podkładkę i sterylne naczynie o średnicy 35 mm w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
  8. Przystąpić do zaszczepiania naczynia zgodnie ze wskazaniami w sekcji 6: Przygotowanie komórek bakteryjnych i płatków do zaszczepiania.

9. Analiza danych

  1. Identyfikacja komórek
    1. Otwórz plik obrazu w oprogramowaniu do obrazowania i przytnij go tak, aby zawierał tylko te klatki, które mają być używane do śledzenia, powiększone do interesujących komórek i tylko w kanale kontrastu fazowego.
      UWAGA: Przycięty plik można zapisać jako nowy plik, w którym dane śledzenia mogą być przechowywane bez ingerencji w oryginalny plik.
    2. Wybierz opcję, aby wybrać obszary zainteresowania (ROI) w menu kontrolek analizy i zdefiniować ROI, śledząc pojedyncze komórki bakteryjne lub klastry komórek w pierwszej klatce, która ma być używana do analizy.
      UWAGA: Zwroty akcji można zdefiniować ręcznie lub jako pliki binarne.
      1. Ręczne definiowanie zwrotu z inwestycji
        1. Prześledź obwód każdej pojedynczej komórki bakteryjnej lub klastrów komórek, aby ręcznie zdefiniować ROIs.
          UWAGA: W oprogramowaniu analitycznym P. aeruginosa lub inne komórki w kształcie pręcików można śledzić ręcznie, wybierając ROI elipsy i rysując elipsę dostosowaną do wielkości komórki bakteryjnej. Alternatywnie można wybrać opcję Wielokątny zwrot z inwestycji, aby śledzić zwroty akcji o nietradycyjnych kształtach, takie jak klastry komórek.
      2. Zidentyfikuj binarne ROI
        1. Kliknij opcję Binarny do ROI, aby zdefiniować binarne ROI.
          UWAGA: Obiekty są definiowane w warstwie binarnej w oparciu o oddzielenie komórek bakteryjnych o ciemniejszych pikselach od jaśniejszego tła w kanale kontrastu fazowego.
        2. Aby określić próg komórek, wybierz opcję Próg w menu kontrolek analizy. Wybierz interesujący Cię kanał i przesuń paski na histogramie fluorescencji, aby dostosować wartości progowe interwału.
          UWAGA: Binarną identyfikację obiektów dla ROI można również zdefiniować na obrazach fluorescencyjnych poprzez progowanie komórek bakteryjnych. Progowanie określa, które intensywności fluorescencji są uważane za obiekty i jakie intensywności fluorescencji stanowią tło.
  2. Śledzenie komórek
    1. Aby ręcznie śledzić ROI, wybierz następną klatkę w sekwencji obrazowania i dostosuj położenie ROI, klikając i przeciągając każdy ROI, aby wyrównać się z nową pozycją oryginalnej komórki bakteryjnej.
      UWAGA: Jeśli komórki bakteryjne nie zmieniły pozycji, nie trzeba przesuwać ROI.
    2. Powtórz te czynności we wszystkich kolejnych klatkach, dla których mają być śledzone komórki.
    3. W miarę podziału komórek zdefiniuj komórki potomne jako nowe ROI, zgodnie z opisem w kroku 9.1, i rozpocznij śledzenie nowo podzielonych komórek.
      UWAGA: Jeśli komórki są identyfikowane jako binarne, użyj funkcji Śledź pliki binarne, aby automatycznie śledzić ROI w wybranych klatkach.
    4. Po prześledzeniu komórek we wszystkich zaznaczonych klatkach wyeksportuj dane do analizy.
    5. Otwórz arkusz kalkulacyjny danych i zidentyfikuj pomiary wymagane do analizy (np. prędkość obiektu, przyspieszenie lub długość ścieżki).
      UWAGA: W przypadku pomiaru kierunkowości wymagane są pomiary długości ścieżki i długości linii. Długość linii jest miarą odległości euklidesowej lub odległości prostej od początku ścieżki do krawędzi kolonii S. aureus. Długość ścieżki jest miarą skumulowanej odległości lub sumy segmentów ścieżki ze wszystkich klatek. Kierunkowość można obliczyć jako stosunek odległości euklidesowej, D(E), (długość linii), do skumulowanej odległości, D(A), (długość ścieżki).
  3. Kwantyfikacja fluorescencji
    1. Zdefiniuj zwrot z inwestycji dla fluorescencyjnych komórek bakteryjnych zgodnie z opisem w kroku 9.1.
    2. Powtórz śledzenie lub ruch ROI dla komórek bakteryjnych lub klastrów w pozostałych ramkach fluorescencyjnych.
    3. Eksportuj wygenerowaną tabelę do pliku arkusza kalkulacyjnego w celu analizy intensywności fluorescencji.
    4. W arkuszu kalkulacyjnym danych poszukaj kolumny z "Średnią intensywnością", która reprezentuje średnią intensywność fluorescencji dla śledzonego zwrotu z inwestycji w komórkę bakteryjną (komórki) bakteryjną.
    5. Wykres wartości średniej intensywności pokazuje, jak wyglądają zmiany fluorescencji w czasie.
      UWAGA: Zmiany fluorescencji w czasie reprezentują fluktuację ekspresji genu dla gena znakowanego fluorescencyjnie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pomyślne użycie opisanej metody spowoduje serię klatek, które generują wideo, w którym można obserwować interakcje międzygatunkowe w czasie. Schemat w Rysunek 1 przedstawia wizualizację przedstawiającą kluczowe kroki związane z przygotowaniem materiałów do obrazowania. Zastosowanie tej metody pozwoliło na wykazanie, że komórki P. aeruginosa wykazują różne zachowania w monokulturze i w kokulturze z S. aureus. W porównaniu z komórkami P. aeruginosa w monokulturze, kt...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawione tutaj metody opisują protokół obrazowania interakcji między gatunkami bakterii na żywych komórkach na poziomie pojedynczej komórki z modyfikacjami do innych zastosowań, w tym śledzenia komórek i monitorowania żywotności komórek. Metoda ta otwiera nowe możliwości badania zachowań mikroorganizmów w pojedynczych komórkach w kokulturze z innymi gatunkami na przestrzeni czasu. W szczególności protokół pokazuje przydatność tej metody kokultury w obserwacji zachowań bakterii na powierzchni, szczególnie podczas bad...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez fundusze z Cystic Fibrosis Foundation Postdoc-to-Faculty Transition Award LIMOLI18F5 (DHL), Cystic Fibrosis Foundation Junior Faculty Recruitment Award LIMOLI19R3 (DHL) oraz NIH T32 Training Grant 5T32HL007638-34 (ASP). Dziękujemy Jeffreyowi Meisnerowi, Minsu Kimowi i Ethanowi Garnerowi za podzielenie się wstępnymi protokołami i poradami dotyczącymi obrazowania i tworzenia elektrodów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Agarozowe podkładki
35 mm Naczynie ze szklanym dnem i 20 mm Micro-well #1.5 Szklana osłonaCellvisD35-20-1.5-NJedna do foremek do wacików agarozowych, jedna do eksperymentu
KimWipesKimberly-Clark Professional06-666A Niskotopliwa
agarozaNu-Sieve GTG/Lonza50081Do robienia wacików agarozowych
Szpatułki okrągłodenneVWR82027-492
Szpatułki okrągłe stożkoweVWR82027-530
Izolatory silikonowe, Press-to-Seal, 1 dołek, średnica D 2,0 mm 20 mm, silikon/klejSigma-AldrichS6685-25EADo form do wabek agarozowych
Sterylne płytki Petriego, 85 mmKord-Valmark /sprzedawane przez RPI2900
PęsetaVWR89259-944
M8T Minimalne podłoże
D (+) GlukozaRPIG32045
KH2PO4RPIP250500
MgSO4Sigma-Aldrich208094
NaClRPIS23025
Na2HPO4.7H2OSigma-Aldrich230391
TryptoneBD BiosciencesDF0123173
Mikroskop
Andor Sona 4.2B-11Andor770261354,2 megapiksela podświetlany sCMOS, 11 μ m pixel, 95% QE, 48 kl./s, USB 3.0, F-mount.
Kostka filtra GFPNikon96372Kostka filtra
Kostka filtra TxRedNikon96375Kostka filtra
H201-NIKON-TI-S-ERInkubator Okolab77057447Stagetop
Nikon NIS-Elements AR ze śledzeniem GA3 oraz 2D i 3DNikon77010609, MQS43110, 77010603, MQS42950Oprogramowanie do analizy danych
Nikon Ti2 ZaćmienieNikonMikroskop model Ti2-E
CFI Plan Apo ƛ Obiektyw 20x (0,75NA)NikonMRD00205Obiektyw
CFI Plan Apo ƛ 100x olej Ph3 DM obiektyw (1.45NA)NikonMRD31905Objective
ThermoBox z wbudowanymi termowentylatoramiTokai HitTI2TB-E-BKObudowa
szczepy bakteryjne
Pseudomonas aeruginosa PA14 (WT)PMID: 7604262Prototrof
nieśluzowatyPseudomonas aeruginosa PA14 (WT) pSMC21 (Ptac-GFP)PMID: 9361441
Pseudomonas aeruginosa PAO1 (WT) pPrpoD-mKate2PMID: 26041805
Staphylococcus aureus USA300 LAC (WT)PMID: 23404398USA300 Szczep oporny na metycylinę CA LAC bez plazmidów
Staphylococcus aureus USA300 LAC (WT) pCM29 (sarAP1-sGFP)PMID: 20829608
Staphylococcus aureus USA300 LAC Δ agrBDCAPMID: 31713513
żywotna plama
Propidium jodekInvitrogenL7012ŻYWY/MARTWY&handel; BacLight i handel; Zestaw do żywotności bakterii
.

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lamichhane, J. R., Venturi, V. Synergisms between microbial pathogens in plant disease complexes: a growing trend. Frontiers in Plant Science. 6, 385(2015).
  2. Cursino, L., et al. Identification of an operon, Pil-Chp, that controls twitching motility and virulence in Xylella fastidiosa. Molecular Plant-Microbe Interactions. 24 (10), 1198-1206 (2011).
  3. Limoli, D. H., Hoffman, L. R. Help, hinder, hide and harm: what can we learn from the interactions between Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus during respiratory infections. Thorax. 74, 684-692 (2019).
  4. Gabrilska, R. A., Rumbaugh, K. P. Biofilm models of polymicrobial infection. Future Microbiology. 10 (12), 1997-2015 (2015).
  5. Nobile, C. J., Mitchell, A. P. Microbial biofilms: e pluribus unum. Current Biology. 17 (10), 349-353 (2007).
  6. Marino, P. J., et al. Community analysis of dental plaque and endotracheal tube biofilms from mechanically ventilated patients. Journal of Critical Care. 39, 149-155 (2017).
  7. Frank, D. N., et al. Microbial diversity in chronic open wounds. Wound Repair and Regeneration. 17, 163-172 (2009).
  8. Fazli, M., et al. Nonrandom distribution of Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus in chronic wounds. Journal of Clinical Microbiology. 47 (12), 4084-4089 (2009).
  9. Shimizu, K., et al. Pathogens in COPD exacerbations identified by comprehensive real-time PCR plus older methods. International Journal of Chronic Obstructive Pulmonary Disease. 10, 2009-2016 (2015).
  10. Behnia, M., Logan, S. C., Fallen, L., Catalano, P. Nosocomial and ventilator-associated pneumonia in a community hospital intensive care unit: a retrospective review and analysis. BMC Research Notes. 7, 232(2014).
  11. Maliniak, M. L., Stecenko, A. A., McCarty, N. A. A longitudinal analysis of chronic MRSA and Pseudomonas aeruginosa co-infection in cystic fibrosis: a single-center study. Journal of Cystic Fibrosis. 15 (3), 350-356 (2016).
  12. Limoli, D. H., et al. Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa co-infection is associated with cystic fibrosis-related diabetes and poor clinical outcomes. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 35 (6), 947-953 (2016).
  13. Hotterbeekx, A., Kumar-Singh, S., Goossens, H., Malhotra-Kumar, S. In vivo and in vitro interactions between Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus spp. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7 (106), (2017).
  14. Smith, K., et al. Aspergillus fumigatus enhances elastase production in Pseudomonas aeruginosa co-cultures. Medical Mycology. 53, 645-655 (2015).
  15. Michelson, C. F., et al. Staphylococcus aureus alters growth activity, autolysis, and antibiotic tolerance in a human host-adapted Pseudomonas aeruginosa lineage. Journal of Bacteriology. 196 (22), 3903-3911 (2014).
  16. Ngamdee, W., et al. Competition between Burkholderia pseudomallei and B. thailandensis. BMC Microbiology. 15, 56(2015).
  17. Heir, E., Møretrø, T., Simessen, A., Langsrud, S. Listeria monocytogenes strains show larger variations in competitive growth in mixed culture biofilms and suspensions with bacteria from food processing environments. International Journal of Food Microbiology. 275, 46-55 (2018).
  18. Lutz, C., Thomas, T., Steinberg, P., Kjelleberg, S., Egan, S. Effect of interspecific competition on trait variation in Phaeobacter inhibens biofilms. Environmental Microbiology. 18 (5), 1635-1645 (2016).
  19. Meisner, J., et al. FtsEX is required for CwlO peptidoglycan hydrolase activity during cell wall elongation in Bacillus subtilis. Molecular Microbiology. 89 (6), 1069-1083 (2013).
  20. Coates, J., et al. Antibiotic-induced population fluctuations and stochastic clearance of bacteria. eLife. 7, 32976(2018).
  21. Korber, D. R., Lawrence, J. R., Sutton, B., Caldwell, D. E. Effect of laminar flow velocity on the kinetics of surface recolonization by Mot+ and Mot- Pseudomonas fluorescens. Microbial Ecology. 18, 1-19 (1989).
  22. Lawrence, J. R., Korber, D. R., Caldwell, D. E. Behavioral analysis of Vibrio parahaemolyticus variants in high- and low- viscosity microenvironments by use of digital image processing. Journal of Bacteriology. 174 (17), 5732-5739 (1992).
  23. Lawrence, J. R., Wolfaardt, G. M., Korber, D. R. Determination of diffusion coefficients in biofilms by confocal laser microscopy. Applied and Environmental Microbiology. 60 (4), 1166-1173 (1994).
  24. Limoli, D. H., et al. Interspecies interactions induce exploratory motility in Pseudomonas aeruginosa. eLife. 8, 47365(2019).
  25. Burrows, L. Pseudomonas aeruginosa twitching motility: type IV pili in action. Annual Review of Microbiology. 66 (1), 493-520 (2012).
  26. Lee, C. K., et al. Multigenerational memory and adaptive adhesion in early bacterial biofilm communities. PNAS. 115 (17), 4471-4476 (2018).
  27. Tolosa, A., et al. Enhanced field-of-view integral imaging display using multi-Köhler illumination. Optical Society of America. 22 (26), 31853-31863 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

ledzenie pojedynczych kom rekmikroskopia poklatkowaPseudomonas aeruginosaStaphylococcus aureusprzygotowanie pod o a agarozowegoobrazowanie fluorescencyjnebarwienie ywotno ci kom rekanaliza ekspresji gen wkwantyfikacja ruchliwo ci

Powiązane artykuły