Artykuł metodologiczny

Model hodowli komórkowej do badania roli interakcji neuron-glej w niedokrwieniu

9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61388

⸱

14 listopada 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Centro de Investigação em Ciências da Saúde (CICS-UBI), Universidade da Beira Interior, 2Faculdade de Ciências da Saúde, Universidade da Beira Interior

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy proste podejście wykorzystujące specyficzne podłoża hodowlane, które pozwala na tworzenie kultur wzbogaconych o neurony i astrocyty, lub kultur gleju neuronów z kory embrionalnej, o wysokiej wydajności i odtwarzalności.

Streszczenie

Udar niedokrwienny jest stanem klinicznym charakteryzującym się hipoperfuzją tkanki mózgowej, prowadzącym do niedoboru tlenu i glukozy, a w konsekwencji do utraty neuronów. Liczne dowody sugerują, że interakcja między komórkami glejowymi i neuronalnymi wywiera korzystne działanie po zdarzeniu niedokrwiennym. Dlatego, aby zbadać potencjalne mechanizmy ochronne, ważne jest opracowanie modeli, które pozwolą na badanie interakcji neuron-glej w środowisku niedokrwiennym. W niniejszym artykule przedstawiamy proste podejście do izolowania astrocytów i neuronów z kory embrionalnej szczura, które przy użyciu określonych pożywek hodowlanych umożliwia tworzenie kultur wzbogaconych w neurony lub astrocyty lub kultur gleju neuronów o wysokiej wydajności i odtwarzalności.

Aby zbadać wzajemne oddziaływanie między astrocytami a neuronami, proponujemy podejście oparte na systemie kohodowli, w którym neurony hodowane w szkiełkach nakrywkowych są utrzymywane w kontakcie z monowarstwą astrocytów pokrytych płytkami wielodołkowymi. Obie kultury są oddzielone od siebie małymi kulkami parafinowymi. Takie podejście pozwala na niezależną manipulację i zastosowanie specyficznych metod leczenia każdego typu komórek, co stanowi zaletę w wielu badaniach.

Aby symulować to, co dzieje się podczas udaru niedokrwiennego, hodowle są poddawane protokołowi deprywacji tlenu i glukozy. Protokół ten stanowi użyteczne narzędzie do badania roli interakcji neuron-glej w udarze niedokrwiennym.

Wprowadzenie

Według danych Światowej Organizacji Zdrowia, około 5,5 miliona ludzi umiera każdego roku z powodu udaru niedokrwiennego1. Stan ten charakteryzuje się przerwaniem przepływu krwi do określonego obszaru mózgu, co skutkuje odwracalną lub nieodwracalną utratą dopływu tlenu i składników odżywczych do tkanki, co zmienia funkcję tkanki i prowadzi do dysfunkcji mitochondriów, rozregulowania wapnia, ekscytotoksyczności glutaminianu, stanu zapalnego i utraty komórek2,3.

Oprócz komórek naczyniowych, komórki neuronalne i glejowe są zaangażowane w patofizjologię udaru niedokrwiennego4. W szczególności astrocyty są niezbędne do utrzymania neuronów, a ostatnio wykazano, że odgrywają kluczową rolę w odpowiedzi na zmianę niedokrwienną5. Ten typ komórki glejowej pełni m.in. funkcje wsparcia strukturalnego, obrony przed stresem oksydacyjnym, syntezy neuroprzekaźników, stabilizacji komunikacji komórka-komórka6. Wraz z neuronami, astrocyty odgrywają bezpośrednią rolę w przekaźnictwie synaptycznym, regulując uwalnianie cząsteczek takich jak trifosforan adenozyny, kwas gamma-aminomasłowy i glutaminian7. Część uszkodzenia wywołanego niedokrwieniem jest spowodowana nadmiernym uwalnianiem glutaminianu i jego akumulacją w szczelinie synaptycznej, co prowadzi do nadmiernej aktywacji receptorów N-metylo-D-asparaginianu, aktywując kaskady sygnalizacyjne w dalszej części łańcucha, co ostatecznie prowadzi do ekscytotoksyczności8. Ponieważ astrocyty są w stanie usunąć glutaminian ze szczeliny synaptycznej i przekształcić go w glutaminę, mają kluczowe znaczenie w obronie przed ekscytotoksycznością, wywierając w ten sposób neuroprotekcyjne działanie na niedokrwienie. Komórki te odgrywają również rolę w zapaleniu nerwów wywołanym niedokrwieniem. Po uszkodzeniu niedokrwiennym aktywowane astrocyty ulegają zmianom morfologicznym (hipertrofii), namnażają się i wykazują wzrost ekspresji kwaśnego białka fibrylarnego gleju (GFAP). Mogą stać się reaktywne (astroglejoza), uwalniając prozapalne cytokiny, takie jak czynnik martwicy nowotworu-α, interleukina-1α i interleukina-1β, oraz wytwarzając wolne rodniki, w tym tlenek azotu i ponadtlenek, które z kolei mogą indukować śmierć neuronów9,10. W przeciwieństwie do tego, astrocyty reaktywne mogą również działać neuroprotekcyjnie, ponieważ uwalniają cytokiny przeciwzapalne, takie jak transformujący czynnik wzrostu-β, który jest regulowany w górę po udarze11. Co więcej, mogą generować bliznę glejową, która może ograniczać regenerację tkanek poprzez hamowanie kiełkowania aksonów; Jednak ta blizna glejowa może odizolować miejsce urazu od żywej tkanki, zapobiegając w ten sposób kaskadowej fali niekontrolowanych uszkodzeń tkanek12,13.

Dlatego konieczne jest ustanowienie modeli, które pozwolą badać interakcje neuron-glej w przypadku urazu niedokrwiennego, aby znaleźć strategie terapeutyczne, które ograniczą lub odwrócą skutki uszkodzenia niedokrwiennego. W porównaniu z innymi modelami używanymi do badania uszkodzeń niedokrwiennych, a mianowicie modelami in vivo14,15,16, kultury organotypowe17,18,19 i ostre plasterki mózgu20,21,22pierwotne hodowle komórkowe są mniej złożone, co umożliwia badanie indywidualnego udziału każdego typu komórek w patofizjologii udaru niedokrwiennego mózgu oraz tego, jak każdy typ komórki reaguje na możliwe cele terapeutyczne. Zazwyczaj, w celu zbadania interakcji między kulturami wzbogaconymi neuronami a kulturami wzbogaconymi w astrocyty, używa się neuronów i komórek glejowych pochodzenia posturodzeniowego23,24, lub postnatal glial cells and embryonic neurons25,26. W tym artykule zaproponowano proste podejście do ustanowienia kultur wzbogaconych w neurony lub astrocyty oraz kultur gleju neuronów z tej samej tkanki. Te pierwotne komórki są uzyskiwane z kory embrionalnej szczura, regionu często dotkniętego udarem27,28. Co więcej, dysocjacja tkanki odbywa się tylko za pomocą zabiegu mechanicznego. Dlatego protokół ten pozwala na izolację komórek na tym samym etapie rozwoju, w szybki i niedrogi sposób oraz z wysoką wydajnością i odtwarzalnością.

Wzajemne przenikanie się astrocytów i neuronów można badać za pomocą systemu kohodowlanego, w którym neurony hodowane w szkiełkach nakrywkowych są utrzymywane w kontakcie z monowarstwą astrocytów umieszczonych na płytkach wielodołkowych. Małe kulki parafinowe mogą być używane do zapewnienia separacji dwóch kultur komórkowych. Takie podejście pozwala na niezależną manipulację każdym typem komórek, zanim dojdzie do ich kontaktu. Na przykład, możliwe jest wyciszenie określonego genu w astrocytach i sprawdzenie, jak może on wpływać na wrażliwość neuronów lub ochronę przed uszkodzeniem wywołanym niedokrwieniem. Uznaną metodą wywoływania stanów podobnych do niedokrwiennych in vitro jest deprywacja tlenu i glukozy (OGD)3, która polega na zastąpieniu zwykłej atmosfery (95% powietrza i 5%CO2) atmosferą beztlenową (95% N2 i 5% CO2 ), związaną z pominięciem glukozy.

Opisana metoda jest odpowiednia do badania interakcji między neuronami i astrocytami w kontekście udaru niedokrwiennego, w prosty, szybki, powtarzalny i niedrogi sposób.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie użyte zwierzęta zostały wyhodowane w Centrum Badań nad Naukami o Zdrowiu CICS-UBI zgodnie z krajowymi wymaganiami etycznymi dotyczącymi badań na zwierzętach oraz z Europejską Konwencją o Ochronie Zwierząt Kręgowych Wykorzystywanych do Celów Doświadczalnych i Innych Celów Naukowych (Dyrektywa 2010/63/UE).

1. Kora zarodka szczura hodowla komórek pierwotnych

  1. Przygotowanie pożywki hodowlanej
    1. Przygotuj pożywkę neurobazalną (NBM), dodając następujące suplementy: 2% B27, 0,5 mM glutaminy, 25 μM glutaminianu i 120 μg/ml gentamycyny. Homogenizować, dostosować pH do 7,2 i sterylizować pożywkę za pomocą etapu filtracji próżniowej, używając filtra 0,22 μm. W przypadku hodowli komórek glejowych neuronów należy uzupełnić pożywkę do hodowli komórek NBM 10% inaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej (HI-FBS).
    2. Przygotować pożywkę Minimum Essential Medium Eagle (MEM) z następującymi dodatkami: wodorowęglan sodu 2,2 g/l, insulina z trzustki bydła 5 mg/l, D-glukoza bezwodna 3,4 g/l, penicylina (12 j/mL)/streptomycyna (12 μg/ml) i 10% HI-FBS. Homogenizować, dostosować pH do 7,2 i wysterylizować pożywkę za pomocą etapu filtracji.
  2. Przygotowanie materiałów i sprzętu
    1. Nakłuć końcową końcówkę plastikowej końcówki do mikropipet o pojemności 1 ml z boku na bok za pomocą igły o określonej średnicy (0,5 mm dla S; 0,6 mm dla M; 0,8 mm dla L) i uszczelnić otwór końcówki za pomocą płomienia.
    2. Wysterylizuj wszystkie szklane naczynia. Podczas sekcji należy przechowywać używane narzędzia (np. nożyczki, pęsetę, skalpel) zanurzone w 70% etanolu. Spryskaj materiały 70% etanolem przed wprowadzeniem ich do komory przepływu laminarnego.
    3. Ustawić temperaturę łaźni wodnej na 37 °C i umieścić pożywkę do hodowli komórkowych w łaźni wodnej przed rozpoczęciem zabiegu.
      UWAGA: W przypadku testów immunocytochemicznych powlekanie poli-D-lizyną należy wykonywać na płytkach wielodołkowych zawierających szkiełka nakrywkowe.
  3. Hodowla kory embrionalnej szczura
    1. Usuń zarodki szczura od samicy szczura rasy Wistar po 15-16 dniach ciąży (za 1 dzień rozwoju zarodkowego uważa się koniec krycia, który powinien trwać 24 godziny). W tym celu należy znieczulić samicę ketaminą (87,5 mg/kg) i ksylazyną (12 mg/kg) i usunąć zarodki. Następnie poddaj samicę szczura eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy, zgodnie ze standardowym protokołem.
    2. Umieść zarodki w sterylnej probówce o pojemności 50 ml, dodaj sól fizjologiczną z buforem fosforanowym (PBS), aż pokryje zarodki i szybko zabierz je do pomieszczenia hodowlanego.
    3. Pozostając w woreczku żółtkowym, umieść zarodki na szalce Petriego zawierającej 25 ml zimnego PBS. Za pomocą nożyczek i pęsety rozbij woreczek żółtkowy, usuń zarodek i przenieś go na inną szalkę Petriego, na której znajduje się również zimny PBS. PBS na szalce Petriego powinien wystarczyć do pokrycia całego zarodka.
      UWAGA: Zachowaj ostrożność podczas otwierania woreczka żółtkowego, aby nie uszkodzić zarodka. W 1.3.3 i 1.3.4 użyliśmy szalek Petriego o średnicy 90 mm umieszczonych na wierzchu okładów z lodu pokrytych chłonnym papierem, aby utrzymać PBS w niskiej temperaturze.
    4. W celu wypreparowania zarodka przenieś go na inną szalkę Petriego zawierającą 30 ml zimnego PBS. Umieść zarodek pod mikroskopem preparacyjnym i unieruchomij go za pomocą pęsety. Wykonaj początkowe nacięcie równolegle do kory, idąc od jamy ocznej do końca kufy i uważaj, aby nie odciąć głowy zwierzęciu.
    5. Ostrożnie usuń skórę głowy i opony mózgowe za pomocą pęsety, aby nie uszkodzić tkanki mózgowej kory mózgowej. Wykonaj następne nacięcie, aby oddzielić korę. Przenieść tkankę korową do probówki o pojemności 15 ml zawierającej 5 ml PBS za pomocą pipety Pasteura.
    6. Przeprowadzić mechaniczne trawienie tkanki mózgowej kory mózgowej za pomocą plastikowych końcówek o pojemności 1 ml przygotowanych w ppkt 1.2.1. Rozcieraj 10 razy zwykłą pipetą i powtarzaj proces za pomocą pipet z coraz mniejszymi otworami (L, M i S), aż kawałki się rozpadną.
    7. Po mechanicznym roztwarzaniu odwirować zawiesinę o stężeniu 400 x g przez 3 minuty. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad za pomocą odpowiedniej pożywki do hodowli komórkowych ogrzanej uprzednio w temperaturze 37 °C.
    8. Określić całkowitą liczbę komórek obecnych w zawiesinie komórek (gęstość komórek) za pomocą komory Neubauera, dokonać odpowiednich rozcieńczeń i pokryć komórki płytkami. Początkowa gęstość komórek została zdefiniowana na podstawie poprzedniego badania5.
      1. W przypadku hodowli wzbogaconej neuronami należy użyć 0,21 x 106 komórek/cm2 jako początkowej gęstości komórek i utrzymywać komórki w pożywce hodowlanej NBM bez HI-FBS.
      2. W przypadku hodowli neuronów glejowych należy użyć 0,14 x 106 komórek/cm2 jako początkowej gęstości komórek i utrzymywać komórki w pożywce hodowlanej NBM uzupełnionej 10% HI-FBS.
      3. W przypadku hodowli wzbogaconej o astrocyty użyj 0,26 x 106 komórek/cm2 jako początkowej gęstości komórek i utrzymuj komórki w MEM uzupełnione, jak wskazano wcześniej.
      4. Umieścić komórki w inkubatorze nastawionym na 37 °C, 95%O2 i 5% CO2,
        UWAGA: W przypadku dłuższych okresów hodowli należy dodać środek antymitotyczny, taki jak 27 μM 5-fluoro-2′-deoksyurydyna z 68 μM urydyną, aby zahamować wzrost komórek.

2. System kokultury

  1. Przygotowanie materiałów
    1. Podgrzewać parafinę w temperaturze 150 °C w bloku grzewczym przez około 7 minut. Przechowywać w temperaturze 150 °C do zakończenia zabiegu. Następnie, za pomocą sterylnej szklanej pipety Pasteura o średnicy 1 mm, dodaj małą kroplę na wysterylizowane i pokryte PDL szkiełka nakrywkowe. Kulki parafinowe są nieregularne, ale mają średnicę około 2 mm. Kulki pozwolą na oddzielenie obu kultur o około 1,25 mm.
    2. Ponieważ parafina nie jest sterylna, umieść studzienkę z kulkami parafinowymi pod wpływem promieniowania ultrafioletowego na 15 minut.
    3. Aby ustalić kokulturę, przenieś szkiełko nakrywkowe z kulkami parafiny za pomocą pęsety uprzednio zanurzonej w 70% etanolu na 15 minut.
  2. Współkultura
    1. Gdy dwie kultury są gotowe do użycia (tj. po 7 dniach hodowli w warunkach wymienionych w kroku 1.3.8), przenieś neurony wysiane w szkiełkach nakrywkowych z kulkami parafinowymi do studzienek zawierających astrocyty.
    2. Na 24 godziny przed kontaktem dwóch kultur należy zmienić pożywkę hodowlaną neuronów i astrocytów na NBM uzupełnioną lub nie HI-FBS, w zależności od celu eksperymentu.
    3. Po umieszczeniu obu typów komórek w kontakcie, odczekaj 8-12 godzin przed rozpoczęciem różnych bodźców i procedur.
      UWAGA: Schematyczne przedstawienie systemu kokultur jest pokazane w Rysunek 1.

3. Niedobór tlenu i glukozy

  1. Przygotowanie pożywki hodowlanej
    1. Do eksperymentów OGD użyj Zrównoważonego Roztworu Soli Hanka (HBSS). Przygotować pożywkę HBSS z następującymi odczynnikami: 1,26 mM CaCl2, 5,36 mM KCl, 0,44 mM KH2PO4, 0,49 mM MgCl2, 139,9 mM NaCl, 4,17 mM NaHCO3, 3,38 mM Na2HPO4. Homogenizować i dostosować pH do 7,2. Wysterylizuj pożywkę przez filtrację.
      UWAGA: W razie potrzeby uzupełnij roztwór HBSS glukozą (HBSSglu+), dodając 5,56 mM glukozy. W przypadku kultur przekazanych do OGD nie należy uzupełniać pożywki HBSS glukozą (HBSSglu-).
  2. Procedura OGD
    1. 7 dni po wysianiu komórek należy usunąć pożywkę hodowlaną i przemyć dwukrotnie HBSSglu-. Po umyciu dodać pożywkę do hodowli komórkowych HBSSglu i umieścić basenik w komorze hipoksji.
    2. Uszczelnij komorę hipoksji i dodaj mieszaninę gazów zawierającą 95% N2/5% CO2 przez 4 minuty o przepływie 20 l/min w celu usunięcia tlenu znajdującego się wewnątrz komory. Następnie zatrzymać przepływ i umieścić komorę hipoksyjną w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 4 godziny lub 6 godzin, w zależności od rozległości zamierzonego niedokrwienia.
    3. Po okresie OGD należy zastąpić pożywkę HBSSglu- odpowiednią pożywką do pozostałych procedur.
      UWAGA: Eksperyment OGD ma na celu symulację warunków in vitro, na które cierpią komórki podczas zdarzenia niedokrwiennego, dlatego ważne jest, aby zaświadczyć, że wszystkie wcześniej używane pożywki zostały usunięte.

4. Test immunocytochemiczny

UWAGA: Wykonaj test immunocytochemiczny zgodnie z wcześniejszym opisem5.

  1. Krótko mówiąc, aby scharakteryzować różne kultury korowe, inkubować komórki przez noc w temperaturze 4 °C z króliczym anty-GFAP (1:2000) i mysim białkiem związanym z anty-mikrotubulami 2 (MAP2; 1:500); a następnie 1 godzinę w temperaturze pokojowej z następującymi przeciwciałami drugorzędowymi: anty-królikiem sprzężonym z Alexa Fluor 546 i anty-myszym sprzężonym z Alexa Fluor 488, oba w rozcieńczeniu 1:1000.
  2. Znakować jądra komórkowe przez inkubację z 2 μM Hoechst 33342 przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  3. Zamontuj szkiełka nakrywkowe w podłożu fluorescencyjnym i uzyskaj obrazy pod mikroskopem epifluorescencyjnym o 63-krotnym powiększeniu.

5. Analiza statystyczna

  1. Wyrazić dane jako procent całkowitej liczby komórek lub jako procent kontroli i przedstawić jako średni błąd standardowy ± średniej (SEM) z co najmniej 3 niezależnych doświadczeń przeprowadzonych w trzech egzemplarzach.
  2. Przeprowadź analizę statystyczną za pomocą oprogramowania (GraphPad Software Inc., San Diego, CA), korzystając z niesparowanego testu t Studenta. Wyniki uznano za istotne, gdy wartości p < 0,05.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Aby scharakteryzować hodowle, w każdym typie hodowli korowej przeprowadzono immunocytochemię w celu oceny liczby komórek wykazujących ekspresję GFAP lub MAP2, które są powszechnie stosowanymi markerami astrocytów i neuronów (Rycina 2). Analiza ta wykazała, że w hodowlach wzbogaconych w astrocyty 97% komórek wykazywało ekspresję GFAP (Rycina 2A). W przypadku hodowli wzbogaconej w neurony 78% komórek wykazywało ekspresję MAP2, 4% komórek wykazywało ekspresję GFAP,...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisana tutaj metoda polega na izolacji astrocytów i neuronów z embrionalnej tkanki korowej szczura, co pozwala na utworzenie kultur wzbogaconych w neurony lub astrocyty lub kultur gleju neuronów. Został on zaadaptowany z poprzedniego badania naszej grupy5, w którym opisano izolację kultur embrionalnych wzbogaconych w neurony i neuronów neuronów oraz scharakteryzowano te dwie kultury. Korzystając z tych kultur, Roque i in. odkryli, że astrocyty odgrywają kluczową rolę w reagowaniu na uszkodzenie n...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie pozostają w konflikcie interesów.

Podziękowania

Autorzy dziękują za wsparcie finansowe ze strony Fundação para a Ciência e a Tecnologia poprzez projekty UIDB/00709/2020, POCI-01-0145-FEDER-029311 oraz stypendium SFRH/BD/135936/2018 dla JP, przez ''Programa Operacional do Centro, Centro 2020' poprzez projekt CENTRO-01-0145-FEDER-000013 oraz finansowanie dla PPBI-Portugalskiej Platformy BioObrazowania poprzez projekt POCI-01-0145-FEDER-022122.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
24-dołkowe płytki hodowlaneThermo Fischer Scientific142475
95% N2/5% CO2 butlagazowa ArLí quido
Anty-mysz sprzężona z Alexa Fluor 488InvitrogenA11001rozcieńczenie 1/1000; okres inkubacji - 1 h w temperaturze pokojowej
Anty-królik skoniugowany z Alexa Fluor 546InvitrogenA11010rozcieńczenie 1/1000; okres inkubacji - 1 h w temperaturze pokojowej
suplement B27 (50x)Gibco17504-044
Dako Fluorescencyjny środek montażowyDakoS3023
D-glukoza bezwodnaFisher ScientificG/0450/603,4 g/L
Mikroskop epifluorescencyjnyZeissAxioObserver Z1x63x
obiektyw Płodowa surowica bydlęca (FBS)BiochromS061510%
gentamycynaSigma-AldrichG1272120 µ g/ml
glutaminianuSigma-AldrichG841525µ M
GlutaminaSigma-AldrichG31260,5 mM
Hoechst 33342InvitrogenH13992 &mikro; M; okres inkubacji - 10 min w temperaturze pokojowej
Komora inkubacyjna do hipoksjiStemcell Technologies27310Komora służąca do indukcji OGD
Insulina z trzustki bydlęcejSigma-AldrichI55005 mg/L
KetaminaSigma-AldrichK-00287,5 mg/Kg
Minimum Essential Medium Eagle mediumSigma-AldrichM0268rozgrzać do 37 ° C przed użyciem
Mysz Anti-MAP2Santa Cruz BiotechnologySc-74421rozcieńczenie 1/500; okres inkubacji przez noc w temperaturze 4 & stopni; C
Podłoże neuropodstawoweGibco21103-049rozgrzać do 37 ° C przed użyciem
Pastylki parafinowe do histologiiSigma-Aldrich1.07164Punkt krzepnięcia 56-58° C
ParaformaldehydSigma -AldrichP61484% w PBS
Penicilin/StreptomycynaBiochromA 2213penicylina (12U / ml) / streptomycyna (12&mikro; g / mL)
Poli-D-lizynaSigma-AldrichP1024
Królik Anti-GFAPDAKOZ0334rozcieńczenie 1/2000; okres inkubacji przez noc w temperaturze 4 & stopni; C
Wodorowęglan soduFisherScientific S/4240/602,2 g/L
KsylazynaSigma-AldrichX112612 mg/kg

Bibliografia

  1. Donkor, E. S. Stroke in the 21(st) Century: A Snapshot of the Burden, Epidemiology, and Quality of Life. Stroke Research and Treatment. 2018, 3238165(2018).
  2. Dirnagl, U., Iadecola, C., Moskowitz, M. A. Pathobiology of ischaemic stroke: an integrated view. Trends in Neurosciences. 22 (9), 391-397 (1999).
  3. Woodruff, T. M., et al. Pathophysiology, treatment, and animal and cellular models of human ischemic stroke. Molecular Neurodegeneration. 6 (1), 11(2011).
  4. Berezowski, V., Fukuda, A. M., Cecchelli, R., Badaut, J. Endothelial cells and astrocytes: a concerto en duo in ischemic pathophysiology. International Journal of Cell Biology. 2012, 176287(2012).
  5. Roque, C., Baltazar, G. Impact of Astrocytes on the Injury Induced by In vitro Ischemia. Cellular and Molecular Neurobiology. 37 (8), 1521-1528 (2017).
  6. Ransom, B. R., Ransom, C. B. Astrocytes: multitalented stars of the central nervous system. Methods in Molecular Biology. 814, 3-7 (2012).
  7. Halassa, M. M., Fellin, T., Haydon, P. G. The tripartite synapse: roles for gliotransmission in health and disease. Trends in Molecular Medicine. 13 (2), 54-63 (2007).
  8. Forder, J. P., Tymianski, M. Postsynaptic mechanisms of excitotoxicity: Involvement of postsynaptic density proteins, radicals, and oxidant molecules. Neuroscience. 158 (1), 293-300 (2009).
  9. Basic Kes, V., Simundic, A. M., Nikolac, N., Topic, E., Demarin, V. Pro-inflammatory and anti-inflammatory cytokines in acute ischemic stroke and their relation to early neurological deficit and stroke outcome. Clinical Biochemistry. 41 (16-17), 1330-1334 (2008).
  10. Gursoy-Ozdemir, Y., Can, A., Dalkara, T. Reperfusion-induced oxidative/nitrative injury to neurovascular unit after focal cerebral ischemia. Stroke. 35 (6), 1449-1453 (2004).
  11. Cekanaviciute, E., et al. Astrocytic transforming growth factor-beta signaling reduces subacute neuroinflammation after stroke in mice. Glia. 62 (8), 1227-1240 (2014).
  12. Huang, L., et al. Glial scar formation occurs in the human brain after ischemic stroke. International Journal of Medical Sciences. 11 (4), 344-348 (2014).
  13. Rodriguez-Grande, B., et al. The acute-phase protein PTX3 is an essential mediator of glial scar formation and resolution of brain edema after ischemic injury. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 34 (3), 480-488 (2014).
  14. Cheng, X., et al. Dynamic Alterations of Brain Injury, Functional Recovery, and Metabolites Profile after Cerebral Ischemia/Reperfusion in Rats Contributes to Potential Biomarkers. Journal of Molecular Neuroscience. 70 (5), 667-676 (2020).
  15. Wang, X., et al. Dual role of intrauterine immune challenge on neonatal and adult brain vulnerability to hypoxia-ischemia. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 66 (6), 552-561 (2007).
  16. Panahpour, H., Farhoudi, M., Omidi, Y., Mahmoudi, J. An In vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke. Journal of Visualized Experiments. (133), e57156(2018).
  17. Laake, J. H., Haug, F. M., Wieloch, T., Ottersen, O. P. A simple in vitro model of ischemia based on hippocampal slice cultures and propidium iodide fluorescence. Brain Research Protocols. 4 (2), 173-184 (1999).
  18. Cimarosti, H., Kantamneni, S., Henley, J. M. Ischaemia differentially regulates GABA(B) receptor subunits in organotypic hippocampal slice cultures. Neuropharmacology. 56 (8), 1088-1096 (2009).
  19. Cho, S., et al. Spatiotemporal evidence of apoptosis-mediated ischemic injury in organotypic hippocampal slice cultures. Neurochemistry International. 45 (1), 117-127 (2004).
  20. Dong, W. Q., Schurr, A., Reid, K. H., Shields, C. B., West, C. A. The Rat Hippocampal Slice Preparation as an Invitro Model of Ischemia. Stroke. 19 (4), 498-502 (1988).
  21. Tamura, R., et al. Neuroprotective effects of adenosine deaminase in the striatum. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 36 (4), 709-720 (2016).
  22. Dennis, S. H., et al. Oxygen/Glucose Deprivation Induces a Reduction in Synaptic AMPA Receptors on Hippocampal CA3 Neurons Mediated by mGluR1 and Adenosine A(3) Receptors. Journal of Neuroscience. 31 (33), 11941-11952 (2011).
  23. Bar El, Y., Kanner, S., Barzilai, A., Hanein, Y. Activity changes in neuron-astrocyte networks in culture under the effect of norepinephrine. PLoS One. 13 (10), (2018).
  24. Kuszczyk, M. A., et al. Blocking the Interaction between Apolipoprotein E and A beta Reduces Intraneuronal Accumulation of A beta and Inhibits Synaptic Degeneration. American Journal of Pathology. 182 (5), 1750-1768 (2013).
  25. Skaper, S. D., Facci, L. Central Nervous System Neuron-Glia co-Culture Models and Application to Neuroprotective Agents. Methods in Molecular Biology. 1727, 63-80 (2018).
  26. Fang, A., et al. Effects of astrocyte on neuronal outgrowth in a layered 3D structure. BioMedical Engineering OnLine. 18 (1), 74(2019).
  27. Fernando, G., Yamila, R., Cesar, G. J., Ramon, R. Neuroprotective Effects of neuroEPO Using an In vitro Model of Stroke. Behavioral Sciences. 8 (2), (2018).
  28. Zhao, L. R., Willing, A. Enhancing endogenous capacity to repair a stroke-damaged brain: An evolving field for stroke research. Progress in Neurobiology. 163, 5-26 (2018).
  29. Crandall, J. E., Jacobson, M., Kosik, K. S. Ontogenesis of microtubule-associated protein 2 (MAP2) in embryonic mouse cortex. Brain Research. 393 (1), 127-133 (1986).
  30. Chamak, B., Fellous, A., Glowinski, J., Prochiantz, A. MAP2 expression and neuritic outgrowth and branching are coregulated through region-specific neuro-astroglial interactions. Journal of Neuroscience. 7 (10), 3163-3170 (1987).
  31. Almeida, A., Medina, J. M. A rapid method for the isolation of metabolically active mitochondria from rat neurons and astrocytes in primary culture. Brain Research Protocols. 2 (3), 209-214 (1998).
  32. Bessa, A., et al. GPER: A new tool to protect dopaminergic neurons. Biochim Biophys Acta. 1852 (10), Pt A 2035-2041 (2015).
  33. De Simone, U., Caloni, F., Gribaldo, L., Coccini, T. Human Co-culture Model of Neurons and Astrocytes to Test Acute Cytotoxicity of Neurotoxic Compounds. International Journal of Toxicology. 36 (6), 463-477 (2017).
  34. Yang, L., Shah, K. K., Abbruscato, T. J. An in vitro model of ischemic stroke. Methods in Molecular Biology. 814, 451-466 (2012).
  35. Holloway, P. M., Gavins, F. N. Modeling Ischemic Stroke In Vitro: Status Quo and Future Perspectives. Stroke. 47 (2), 561-569 (2016).
  36. Rossi, D. J., Brady, J. D., Mohr, C. Astrocyte metabolism and signaling during brain ischemia. Nature Neuroscience. 10 (11), 1377-1386 (2007).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Model udaru niedokrwiennegodeprywacja tlenu i glukozykokultura astrocyt w i neuron wzarodkowa kora szczurapierwotna hodowla kom reksystem sfer parafinowychtechnika izolacji kom rekanaliza immunohistochemicznamikroskopia fluorescencyjna

Powiązane artykuły