Artykuł metodologiczny

Połączenie nerwowo-mięśniowe in vitro indukowane z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

7.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61396

⸱

3 grudnia 2020

 ,  ,  , 
1Department of Clinical Application, Center for iPS Cell Research and Application (CiRA), Kyoto University, 2Department of Pediatrics, Kyoto Prefectural University of Medicine, 3Graduate Institute of Clinical Medicine, Taipei Medical University

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj udostępniamy protokół do generowania in vitro NMJ z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC). Ta metoda może indukować NMJ o dojrzałej morfologii i funkcji w ciągu 1 miesiąca w jednym dołku. Powstałe w ten sposób NMJ mogą być potencjalnie wykorzystane do modelowania powiązanych chorób, badania mechanizmów patologicznych lub badań przesiewowych związków leczniczych do terapii.

Streszczenie

Połączenie nerwowo-mięśniowe (NMJ) to wyspecjalizowana synapsa, która przekazuje potencjały czynnościowe z neuronu ruchowego do mięśni szkieletowych w celu mechanicznego ruchu. Architektura struktury NMJ wpływa na funkcje neuronu, mięśnia i wzajemne interakcje. Wcześniejsze badania opisywały wiele strategii poprzez kokulturację neuronów ruchowych i miotubek w celu wytworzenia NMJ in vitro ze złożonym procesem indukcji i długim okresem hodowli, ale miały trudności z odtworzeniem dojrzałej morfologii i funkcji NMJ. Nasz system indukcji NMJ in vitro jest skonstruowany poprzez różnicowanie ludzkiego iPSC w jednej szalce hodowlanej. Poprzez przełączenie miogennej i neurogennej pożywki indukcyjnej na indukcję, otrzymany NMJ zawierał składniki pre- i postsynaptyczne, w tym neurony ruchowe, mięśnie szkieletowe i komórki Schwanna w miesięcznej hodowli. Test funkcjonalny NMJ wykazał również, że skurcz miotub może być wywołany przez Ca++, a następnie hamowany przez kurarę, inhibitor receptora acetylocholiny (AChR), w którym sygnał stymulujący jest przekazywany przez NMJ. To proste i solidne podejście z powodzeniem pozwoliło na uzyskanie złożonej struktury NMJ z funkcjonalną łącznością. Ten ludzki NMJ in vitro, ze swoimi zintegrowanymi strukturami i funkcją, ma obiecujący potencjał w zakresie badania mechanizmów patologicznych i badań przesiewowych związków.

Wprowadzenie

Złącze nerwowo-mięśniowe (NMJ) to wyspecjalizowana synapsa, która przekazuje sygnały z neuronów ruchowych do mięśni szkieletowych w celu kontrolowania dobrowolnych ruchów mięśni1,2. Synapsa ta składa się z części pre- i postsynaptycznych. W części presynaptycznej neuron ruchowy uwalnia acetylocholinę (ACh) z pęcherzyków synaptycznych przez egzocytozę. ACh jest uwalniany z pęcherzyków synaptycznych w celu przekroczenia szczeliny synaptycznej i związania się z AChR w części postsynaptycznej, aby wywołać potencjał czynnościowy do skurczu mięśni3,4. Każde uszkodzenie tej delikatnej struktury może powodować choroby NMJ, w tym rdzeniowy zanik mięśni (SMA), wrodzone zespoły miasteniczne (CMS), miastenię (MG)5,6,7, itd. Choroby te znacznie pogarszają jakość życia pacjentów i niestety nie mają skutecznych metod leczenia ze względu na brak zrozumienia patologicznego mechanizmu. W tym badaniu naszym celem było wygenerowanie ludzkiego NMJ in vitro z ludzkich iPSC w celu dokładnego modelowania choroby i badań przesiewowych związków terapeutycznych.

Poprzednie badania wykazały możliwość generowania in vitro NMJ za pomocą strategii współhodowli. Generowane są odpowiednio neurony ruchowe i miorurki szkieletowe. Te dwa typy komórek mogą być generowane z pierwotnych kultur tkanek ludzkich lub mysich lub indukowane z komórek macierzystych8,9,10,11, a następnie hodowane wspólnie w celu utworzenia NMJ. Dalsze zastosowania obejmują łączenie współhodowanego NMJ w mikroprzepływowe urządzenia 3D oraz wykorzystanie jednostek optogenetycznych do ilościowych testów funkcjonalnych12,13. Jednak strategie te wymagają długiego okresu hodowli i wymagają walki, aby uzyskać jednocześnie podstawowe składniki NMJ, albo neuron ruchowy, albo miorurkę szkieletową. Jeszcze jeden ważny składnik NMJ, komórka Schwanna, nie może być generowany w tych systemach hodowlanych. Zaawansowany system hodowli, który zawiera miotubę, neuron ruchowy i komórkę Schwanna, jest pożądany, ponieważ może zaoferować wiarygodny i solidny model do badań NMJ.

Różnicowanie miogeniczne 1 (MYOD1) jest dobrze znanym regulatorem miogennym dla miogenezy14. Skuteczna metoda różnicowania miogenicznego, w której zastosowano MYOD1 do wprowadzenia iPSC do miotubek, została opracowana w poprzednim badaniu15. W związku z tym indukowaliśmy miotube'y poprzez nadekspresję MYOD1 w iPSCs15 i wykazano wysoką skuteczność różnicowania miogenicznego. Co ciekawe, komórki neuronalne pojawiły się wraz z miotubami spontanicznie po 10 dniu. Pojawienie się komórek neuronalnych w kulturze miogennej skłoniło nas do opracowania strategii generowania NMJ in vitro w jednym naczyniu. Tutaj przedstawiamy strategię generowania NMJ poprzez nadekspresję MYOD1 w ludzkich iPSC w celu indukcji neuronów miogennych i ruchowych w tej samej naczyniu hodowlanej. Neurony ruchowe są indukowane spontanicznie przez kilka czynników neurotroficznych (GDNF, BDNF, NT3 itp.)8, a tymczasem komórki Schwanna mogą być również indukowane16,17. Poprzez interakcje między miotubami, neuronami ruchowymi i komórkami Schwanna, powstaje dojrzały NMJ18. Metoda ta może skutecznie generować funkcjonalny NMJ, umożliwiając potencjalne badanie mechanizmów patologicznych i badania przesiewowe związków terapeutycznych.

Protokół

1. Przygotowanie płytek pokrytych macierzą zewnątrzkomórkową (ECM)

  1. Rozcieńczyć ECM (patrz tabela materiałów) lodowatym 1x PBS do końcowego stężenia 2%.
    1. Dodaj 1 ml ECM do 49 ml 1x PBS w plastikowej tubie o pojemności 50 ml. Dobrze wymieszaj, kilkakrotnie pipetując w górę i w dół.
  2. Umieść 1 szkiełko nakrywkowe w każdym dołku na płytce 6-dołkowej. Dodaj 1,5 ml 2% ECM do każdej studzienki.
  3. Inkubować płytkę studzienki z 2% ECM przez 2 godziny w temperaturze 37 °C.
  4. Odessać ECM z płytki studzienki i przechowywać płytkę w temperaturze 4 °C przed użyciem.

2. Zróżnicowanie iPSC w kierunku NMJ

  1. Wysiewać 4 x 105 iPSC na basenik na płytce 6-dołkowej przygotowanej w sekcji 1. Upewnij się, że komórki na szkiełku nakrywkowym są wstępnie osadzone w studzience.
    UWAGA: W tym badaniu wykorzystano linię komórkową 201B7MYOD iPS, dar od laboratorium dr Sakurai'a15.
    1. Usuń pożywkę z iPSC na 6 cm naczyniu hodowlanym i umyj iPSC raz za pomocą 1x PBS.
    2. Dodać 1 ml roztworu oddzielającego komórki do naczynia i inkubować przez 10 minut w temperaturze 37 °C.
    3. Dodaj 3 ml pożywki z embrionalnych komórek macierzystych naczelnych (ES) do naczynia i delikatnie odpipetuj 3 razy.
    4. Zebrać supernatant, który zawiera odłączone iPSC, do plastikowej probówki o pojemności 50 ml i odwirować przy 160 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut.
    5. Ostrożnie odessać supernatant, ponownie zawiesić iPSC w 3 ml pożywki dla komórek ES naczelnych z 10 μM Y27632 i policzyć liczbę komórek za pomocą hemocytometru.
    6. Rozcieńczyć iPSC pożywką z komórek ES naczelnych i 10 μM Y27632 do stężenia 2 x 105 komórek/ml. Dodać 2 ml iPSC na szkiełko nakrywkowe wstępnie osadzone w studzience opisanej w sekcji 1.
  2. Indukcja iPSC do NMJ
    1. W dniu 1, 24 godziny po wysianiu iPSC na płytkę 6-dołkową, usunąć pożywkę hodowlaną i zastąpić ją 2 ml świeżej pożywki z komórek ES naczelnych zawierającej 1 μg/ml doksycykliny do każdego dołka.
    2. Zmienić pożywkę z 2 ml miogenicznej pożywki różnicującej (MDM) (Tabela 1) zawierającej 1 μg/ml doksycykliny (stężenie końcowe) do każdej studzienki. Odświeżaj podłoże codziennie od 2 do 10 dnia.
    3. Od 11 dnia zmieniaj pożywkę na 2 ml pożywki NMJ (Tabela 1) do każdego dołka. Odświeżaj pożywkę co 3-4 dni, a następnie do 30 dnia.
  3. Obserwuj zróżnicowany NMJ za pomocą mikroskopii odwróconej fazy w 30 dniu. NMJ można wykorzystać do następującej analizy.

3. Barwienie immunofluorescencyjne (IF)

  1. W 30 dniu odessać pożywkę hodowlaną z płytki 6-dołkowej. Utrwal kulturę NMJ, dodając 2 ml 4% paraformaldehydu do każdej studzienki przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
  2. Przemyć próbki 3 razy, dodając 2 ml 1x PBS do każdej studzienki (3 minuty na każde przemycie).
  3. Próbki należy przepuszczać 0,1% Tritonem/PBS przez 10 minut.
  4. Powtórz krok 3.2.
  5. Zablokować próbki 0,5% BSA na 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  6. Powtórz krok 3.2.
  7. Próbki należy inkubować z pierwszorzędowymi przeciwciałami w temperaturze 4 °C przez noc. Rozcieńczenie przeciwciał jest następujące: wysepka 1 (1 μg/ml), łańcuch ciężki miozyny (MYH) (1/300), neurofilamenty (NF) (1 μg/ml), S-100 (1/300), białko pęcherzyków synaptycznych 2 (SV2) (1 μg/ml), Tuj1 (1/1000).
  8. Powtórz krok 3.2.
  9. Próbki inkubować z przeciwciałami drugorzędowymi w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Stężenie zastosowanych przeciwciał drugorzędowych jest następujące: skoniugowane anty-mysie IgG 488 (0,1 μg/ml), anty-królicze IgG 488 sprzężone (0,1 μg/ml).
  10. Powtórz krok 3.2.
  11. Próbki należy inkubować z aBTX-647 (0,5 μg/ml) do barwienia AChR i z DAPI (1 μg/ml) do barwienia jądra.
  12. Powtórz krok 3.2.
  13. Podnieść szkiełko nakrywkowe za pomocą kleszczyków z płytki 6-dołkowej i umieścić je w 50% roztworze glicerolu/PBS na szkiełku mikroskopowym.

4. Skaningowa mikroskopia elektronowa (SEM)

  1. Utrwalić kulturę NMJ za pomocą 4% paraformaldehydu i 1% aldehydu glutarowego przygotowanych w 0,1 M buforze fosforanu potasu w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
  2. Próbki należy przemyć 3 razy, zanurzając je w 0,1 M buforze fosforanu potasu w temperaturze pokojowej (10 minut na każde przemycie).
  3. Odwodnić próbki przy rosnących stężeniach etanolu (dwukrotnie 50%, 70%, 90%, 95% i 100%). Zanurzyć próbki w każdym stężeniu etanolu na 10 minut.
  4. Wysuszyć próbki w suszarce w punkcie krytycznym (-30 °C, 0,1 Torr).
  5. Pokryć próbki powlekarką jonową Pt (platyna) (30 mA przez 3 min; grubość Pt wynosi około 20 nm).
  6. Obserwacje próbek za pomocą SEM przy napięciu 5 kV.

5. Transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM)

  1. Użyj skrobaka do komórek, aby pobrać tkankę z płytki hodowlanej NMJ. Uformuj tkankę w małą kulkę (3 mm3) za pomocą żyletki i sklej przez żelowanie, aby utworzyć kawałek owinięty żelem. Utrwalić kawałek owinięty żelem za pomocą 2% paraformaldehydu i 2% aldehydu glutarowego przygotowanych w 0,1 M buforze fosforanu potasu w temperaturze 4 °C przez noc.
  2. Przemyć próbki 3 razy, zanurzając je w 0,1 M buforze fosforanu potasu (15 minut na każde przemycie) w temperaturze pokojowej.
  3. Utrwalić próbki 1% tetratlenkiem osmu przygotowanym w podwójniedestylowanym H2Oprzez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Ten krok należy wykonać w okapie chemicznym.
  4. Powtórz krok 5.2.
  5. Odwodnić próbki przy rosnących stężeniach etanolu (dwukrotnie 50%, 70%, 90%, 95% i 100%). Zanurzyć próbki w każdym stężeniu etanolu na 10 minut.
  6. Odessać 100% etanol. Infiltrować próbki o rosnących proporcjach objętości żywicy epoksydowej do mieszanin 100% etanolu (1:3, 1:1 i 3:1). Delikatnie mieszaj każdą mieszaninę przy 10 obr./min przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  7. Zastąp mieszaninę epoksydowo-etanolową czystą żywicą epoksydową i delikatnie mieszaj przy 10 obr./min przez 4 godziny w temperaturze pokojowej.
  8. Po 4 godzinach odświeżyć żywicę epoksydową świeżą żywicą epoksydową i delikatnie mieszać z prędkością 10 obr./min przez noc w temperaturze pokojowej.
  9. Zanurzyć próbki w kapsułkach do zatapiania ze świeżą żywicą epoksydową i utwardzić próbki w piecu w temperaturze 65 °C przez noc.
  10. Ultramikrotomia
    1. Grubo przyciąć bloki próbki pod mikroskopem preparacyjnym, aby uzyskać prawidłową orientację.
    2. Drobno przyciąć grubo przycięte bloki szklanym nożem na ultramikrotomie, aby uzyskać gładkie powierzchnie.
    3. Przygotuj ultracienkie sekcje o długości 70 nm z dobrze przyciętych bloków za pomocą diamentowego noża. Odzyskaj ultracienkie sekcje za pomocą siatek miedzianych o siatkach 200 pokrytych formą węglową.
    4. Ultracienkie odcinki zawierające kratki zabarwić nasyconym octanem uranylu przygotowanym w podwójnie destylowanymH2Oprzez 30 minut i przemyć kratki 3 razy podwójnie destylowanymH2O(10 minut na każde pranie).
    5. Następnie porównaj ultracienkie skrawki z cytrynianem ołowiu Reynoldsa19 (2,5%) przez 5 minut i umyj przegotowanymH2Owstępnie schłodzonym do temperatury pokojowej 3 razy (10 minut na każde pranie). Umieść kilka granulek wodorotlenku sodu wokół obszaru barwienia, aby zapobiec wytrącaniu się CO2 na sekcjach.
  11. Obserwować ultracienkie przekroje za pomocą TEM przy napięciu 70 kV.

6. Skurcze mięśni i kurara

  1. Aby wywołać skurcz rurki mięśniowej, dodaj 25 mM CaCl2 do pożywki hodowlanej w kroku 2.3. Ruch miotub można zaobserwować w ciągu 1\u20122 min.
  2. Umieść 6-dołkową płytkę na stoliku odwróconego mikroskopu. Nagraj film ze skurczem miotubówki za pomocą mikroskopii żywych komórek.
  3. Aby zatrzymać skurcz rurki mięśniowej, dodaj kurarę do pożywki hodowlanej (300 ng/ml). Następnie nagraj film zgodnie z krokiem 6.2.
  4. Otwórz plik filmowy za pomocą oprogramowania do analizy wektorów ruchu, a następnie kliknij przycisk Analiza ruchu, aby przeanalizować film.
    UWAGA: Skurcz myotubes jest pokazany jako grafika ruchu w czasie. Filmy są oznaczone kolorami, aby pokazać prędkość ruchu myotubes. Kolorowe błyszczące sygnały wskazują ruchy miotubes, gdzie kolor czerwony pokazuje najszybszą prędkość ruchu, a kolor niebieski pokazuje najwolniejszą prędkość ruchu.

Wyniki

Stosując naszą strategię różnicowania, w hodowli w 30. dniu zaobserwowano komponenty presynaptyczne i postsynaptyczne złącza neuromięśniowego (NMJ). Komponenty NMJ zostały indukowane i dobrze rozwinięte w pojedynczej studzience, a ich morfologia oraz rozmieszczenie w NMJ zostały wykazane za pomocą mikroskopii IF (Rycina 1). Schemat blokowy na Rycynie 1A podsumowuje przebieg czasowy progresji różnicowania NMJ. Barwienie neurofilamentów (NF), pęcherzyków synaptycznych (SV2) oraz AChR (Rycina 1B,C) wskazuje neurony. Pojedyncze obrazy barwienia NF oraz SV2 przedstawiono na Rycynie uzupełniającej 1. Barwienie alfa-bungarotoksyną wskazuje AChR (Rycina 1C). Obraz złożony pokazuje względne rozmieszczenie neuronu ruchowego i AChR w NMJ (Rycina 1D,E). Drugi zestaw barwień IF wskazuje neuron ruchowy za pomocą Tuj1 i Islet 1 (Rycina 1G,H) oraz postsynaptyczne miotuby za pomocą ciężkiego łańcucha miozyny (Rycina 1I). Komórki Schwanna w hodowli NMJ zostały również znakowane przeciwciałem S-100 (Rycina uzupełniająca 2).

Aby dodatkowo potwierdzić tożsamość komponentów NMJ, zastosowano SEM do szczegółowej analizy morfologicznej. Morfologia dojrzałego NMJ z rozszerzonymi zakończeniami aksonalnymi, aksonami i włóknami mięśniowymi przedstawiona jest na Rysunku 2A,B. Wykonano TEM, aby ujawnić dojrzałą ultrastrukturę komponentów NMJ, w tym presynaptyczne zakończenie aksonalne z pęcherzykami synaptycznymi oraz część postsynaptyczną, oddzieloną szczeliną synaptyczną (Rysunek 2C‒E). Fałdy stykowe zaznaczono żółtą przerywaną linią, która wskazuje miejsce połączenia neuronu z włóknami mięśniowymi (Rysunek 2C). Dojrzałe zakończenia aksonalne zawierające pęcherzyki synaptyczne przedstawiono na Rysunku 2D,E (żółte strzałki). Wyniki morfologiczne wykazują, że komponenty NMJ zostały skutecznie indukowane i dojrzały.

Aby ocenić funkcję NMJ in vitro, przeprowadzono analizę ruchu poprzez stymulację neuronu ruchowego za pomocą CaCl2 w celu wywołania skurczów miotubul. Wyniki wykazały, że Ca2+ może wywołać skurcze mięśni. Skurcze te mogły zostać przerwane przez kurarę. NMJ wykazywało wyraźne sygnały ruchu, które zanikły po zastosowaniu kurary (Rycina 3). Efekt ten potwierdza, że sygnały z neuronu ruchowego były przekazywane przez NMJ, wyzwalając skurcz mięśnia. Podsumowując, dane z mikroskopii IF, SEM i TEM zademonstrowały rozkład przestrzenny, morfologię oraz dojrzałość komponentów NMJ w strukturze NMJ in vitro wytworzonej zgodnie z opisanym powyżej protokołem. Analiza ruchu potwierdziła funkcjonalność NMJ in vitro, co wskazuje na potencjalne zastosowanie tej metody w opracowywaniu strategii terapeutycznych.

figure-results-1
Rysunek 1: Schemat indukcji NMJ i obrazy IF hodowli NMJ. (A) Schemat przebiegu różnicowania NMJ. (B‒F) Wykrywanie komponentów NMJ: neurofilamentów (NF), pęcherzyków synaptycznych (SV2) oraz AChR. Białe strzałki na panelu D wskazują NMJ. (G‒K) Komponenty przed- i postsynaptyczne NMJ. Tuj1 i Islet1 wskazują neuron ruchowy, a ciężki łańcuch miozyny (MYH) wskazuje miotubę. a-BTX, alfa-bungaratoksyna. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rycina 2: Obrazy SEM i TEM dojrzałego NMJ. (A) Rozkład przestrzenny komponentów NMJ pokazuje zakończenie aksonu zakotwiczone na powierzchni włókna mięśniowego (Mf). (B) Powiększenie NMJ pokazuje zakończenia aksonów. (C) Ultrastruktura dojrzałego NMJ z presynaptycznym zakończeniem aksonu (czerwone groty strzałek) i pęcherzykami synaptycznymi (Sv), szczeliną synaptyczną (Sc) oraz częściami postsynaptycznymi (czerwone strzałki). Fałdy synaptyczne (jf) zaznaczono żółtą przerywaną linią. Ax, akson. (D, E) Obrazy przy dużym powiększeniu pokazują pęcherzyki synaptyczne w zakończeniach aksonów (żółte strzałki). Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-3
Rycina 3: Analiza skurczu miotubul w modelu NMJ in vitro. Skurcz miotubul wywołano za pomocą 25 mM CaCl22 roztwór (zielona linia). Skurcze zostały zahamowane po podaniu kurary (żółta linia). Prosimy również o zapoznanie się z Film uzupełniający 1 i Dodatkowy film 2. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Film uzupełniający 1: Skurcz miotubek wywołany przez Ca++. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Film uzupełniający 2: Przedstawiono znacznie słabszy skurcz miotubul po zastosowaniu kurary. Aby pobrać ten film, kliknij tutaj.

Rycina uzupełniająca 1: Obrazy pojedynczego barwienia neurofilamentów (NF, białe strzałki) w kulturze połączeń nerwowo-mięśniowych (NMJ). Obrazy pojedynczego barwienia pęcherzyków synaptycznych (SV2, białe strzałki) w kulturze NMJ. Kliknij tutaj, aby pobrać tę rycinię.

Rysunek uzupełniający 2: Komórki Schwanna znakowane przeciwciałem S-100 w hodowli NMJ. Aby pobrać ten rysunek, kliknij tutaj.

Pożywka do różnicowania miogenicznego (MDM)MEM-alpha500mL
100mM 2-ME1117μL
Doxycyklina1μg/mL
KSR56mL (stężenie końcowe 10%)
Pen/Strep2.5mL
łącznie560mL
100mM 2-merkaptoetanolu2-merkaptoetanol7μL
woda d.d.993μL
łącznie1000μL
Pożywka NMJPożywka Neurobasal (NB)500mL
B271x (stężenie zapasu 50x)
BDNF10ng/mL
GDNF10ng/mL
N21x (stężenie zapasu 100x)
NT310ng/mL
Pen/Strep2.5mL

Tabela 1: Skład pożywki.

Dyskusja

Wcześniejsze badania opisywały metody tworzenia NMJ in vitro z wyrafinowanymi metodami, które wymagają długotrwałej hodowli 8,10,12,13,20. Osiągnięcia te prowadzą do progresji NMJ in vitro. Jednak skomplikowane metodologie utrudniały dostęp do badań nad NMJ. Nasz protokół pozwala uniknąć kohodowli w celu wydajnego i solidnego generowania NMJ w jednym dołku. W naszym systemie indukcji zaobserwowano trzy typy komórek w NMJ, w tym miotuby, neurony ruchowe i komórki Schwanna18. Ponadto zweryfikowano dojrzałą morfologię i funkcję.

Opierając się na naszym poprzednim badaniu, początkowa gęstość komórek jest krytycznym czynnikiem tworzenia NMJ, a różne gęstości komórek indukują różną liczbę NMJ w kulturze18. Niska gęstość komórek (< 1 x 104 / cm2) indukowała małą liczbę neuronów, co jest niekorzystne dla tworzenia NMJ. Chociaż przygotowanie większej gęstości komórek zajęłoby znacznie więcej czasu i zasobów (> 1 x 105/cm2), zalecamy, aby gęstość komórek wynosiła od 1,5 x 104/cm2 do 5 x 104/cm2 przy użyciu naszego protokołu. NMJ generowany przez ten protokół jest niejednorodną tkanką z wieloma typami komórek, która jest bliższa naśladowaniu warunków fizjologicznych. Stwierdzono, że miorurki równomiernie rozmieszczają się na szalce hodowlanej, ale neurony ruchowe pojawiają się losowo, z czego zjawisko to powoduje nierównomierne rozmieszczenie NMJ w hodowli. Ten NMJ nadaje się do badań jakościowych zamiast analizy wymagającej jednorodnych systemów hodowli. Użyliśmy również innych linii komórkowych, eq., H9 (linia komórkowa ES)18 i A11 (linia komórkowa iPS, dane nie pokazane) do wygenerowania NMJ za pomocą tego protokołu. NMJ może być z powodzeniem generowany pod względem morfologii i funkcji. Niemniej jednak warunki hodowli muszą być zoptymalizowane dla różnych linii komórkowych.

Chemicznie wywołany skurcz miotubek i hamowanie zależne od kurary potwierdziły, że nasz NMJ in vitro jest funkcjonalny i może być potencjalnie zastosowany do praktycznych testów. Spontaniczne skurcze mięśni obserwowano losowo po 3–4 tygodniach hodowli, ale można było tego uniknąć, wydłużając czas hodowli nawet do dwóchmiesięcy18.

Opublikowano różne strategie wytwarzania in vitro NMJ na różnych etapach dojrzewania, ale NMJ wytworzony in vitro w naszym systemie wykazał znaczną dojrzałość, ponieważ możemy zaobserwować przejście podjednostek gamma do epsilon AChR podczas hodowli18. Dojrzałość jest ważnym czynnikiem branym pod uwagę w modelowaniu choroby za pomocą NMJ21 in vitro. Podsumowując, NMJ in vitro ze zintegrowanymi komponentami strukturalnymi, dojrzałością i funkcją jest potencjalnie przydatny w rozwoju terapeutycznym.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy Dr. Sakurai za uprzejme udostępnienie 201B7MYOD. Badania nad mikroskopią elektronową były wspierane przez Keiko Okamoto-Furuta i Haruyasu Kohda (Wydział Badań Mikroskopowych Elektronów, Centrum Badań Anatomicznych, Podyplomowa Szkoła Medyczna, Uniwersytet w Kioto). Przeciwciało monoklonalne zostało opracowane przez HHMI/Columbia University, uzyskane z Developmental Studies Hybridoma Bank, utworzonego przez National Institute Child Health and Human Development NIH i utrzymywanego na Wydziale Biologii Uniwersytetu Iowa. Dziękujemy również Shiori Oshimie, Kazuhiro Nakagawie i Eriko Matsui za analizę wektorów ruchu. Prace te były finansowane przez Japońskie Towarzystwo Promocji Nauki KAKENHI, granty o numerach 16H05352 i 20H03642 (dla MKS); Fundusz Badań nad Komórkami iPS (do CYL i MKS); Fundacja Badań Medycznych i Farmaceutycznych im. Mochidy Memorial (do MKS); Fundacja Naukowa Takeda (do MKS); oraz grant z Programu Badań nad Chorobami Nieuleczalnymi z wykorzystaniem komórek iPS specyficznych dla choroby, który był wspierany przez Japońską Agencję Badań i Rozwoju Medycznego (17935400 dla CYL i MKS, a 17935423 dla MKS).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Średni, czynniki wzrostu i odczynnikiItemMarkaCat. Numer
2-merkaptoetanolNacalai tesque21418-42
B27, GibcoGibco12587-001
BDNFR & D Systems248-BD
Roztwór do odłączania komórek, AccumaxSTEMCELL Technologies#07921
Suszarka punktu krytycznegoHitachiES-2030
DoksycyklinaTakara631311
ECM, Matrigel (obniżony czynnik wzrostu)Corning356230
GDNFR & D Systems212-GD
Żelowanie, żel IPGeno StaffPG20-1
Powlekarka jonowaJEOLJEC3000FC
iPSC medium, mTeSRSTEMCELL Technologies85850
KnockOut SR (KSR)Gibco10828-028
mikroskopia żywych komórekMikroskop NikonEclipse Ti
MEM-alphaGibco12571-071
Oprogramowanie do analizy wektorów ruchuSonySI8000
N2, GibcoGibco17502-048
Podłoże neuropodstawoweGibco21103-049
NT3R & D Systems267-N3
Pożywka komórkowa ES naczelnychReproCellRCHEMD001
SEMHitachiS-4700
TEMHitachiH7650
Y27632Wako Chemicals GmbH253-00513
Przeciwciała<strong>Marka Kat. LiczbaRozcieńczenia
Sondy molekularneB35450,5 ug/ml
Wysepka 1DSHB40,2D61/100
Łańcuch ciężki miozyny (MYH)MiliporeSigmaA4.10251/300
Neurofilamenty (NF)MiliporeSigmaMAB52541/500
S-100Abcamab148491/300
Białko pęcherzyków synaptycznych 2 (SV2)DSHBSV21/50
Tuj1CovanceMMS435P1/1000

Bibliografia

  1. Hong, I. H. K., Etherington, S. J. Neuromuscular Junction. eLS. , John Wiley & Sons, Ltd. (2001).
  2. Sanes, J. R., Lichtman, J. W. Development of the vertebrate neuromuscular junction. Annual Review of Neuroscience. 22, 389-442 (1999).
  3. Jones, R. A., et al. Cellular and Molecular Anatomy of the Human Neuromuscular Junction. Cell Reports. 21 (9), 2348-2356 (2017).
  4. Slater, C. R. The Structure of Human Neuromuscular Junctions: Some Unanswered Molecular Questions. International Journal of Molecular Sciences. 18 (10), 2183(2017).
  5. Comley, L. H., Nijssen, J., Frost-Nylen, J., Hedlund, E. Cross-disease comparison of amyotrophic lateral sclerosis and spinal muscular atrophy reveals conservation of selective vulnerability but differential neuromuscular junction pathology. Journal of Comparative Neurology. 524 (7), 1424-1442 (2016).
  6. Shigemoto, K., et al. Muscle weakness and neuromuscular junctions in aging and disease. Geriatrics & Gerontology International. 10, 137-147 (2010).
  7. Abicht, A., Müller, J., Lochmüller, H. Congenital Myasthenic Syndromes. GeneReviews. , (2016).
  8. Faravelli, I., et al. Motor neuron derivation from human embryonic and induced pluripotent stem cells: experimental approaches and clinical perspectives. Stem Cell Research & Therapy. 5 (4), 87-100 (2014).
  9. Demestre, M., et al. Formation and characterisation of neuromuscular junctions between hiPSC derived motoneurons and myotubes. Stem Cell Research. 15 (2), 328-336 (2015).
  10. Yoshida, M., et al. Modeling the early phenotype at the neuromuscular junction of spinal muscular atrophy using patient-derived iPSCs. Stem Cell Reports. 4 (4), 561-568 (2015).
  11. Vilmont, V., Cadot, B., Ouanounou, G., Gomes, E. R. A system for studying mechanisms of neuromuscular junction development and maintenance. Development. 143 (13), 2464-2477 (2016).
  12. Uzel, S. G. M., et al. Microfluidic device for the formation of optically excitable, three-dimensional, compartmentalized motor units. Science Advances. 2 (8), 1501429(2016).
  13. Santhanam, N., et al. Stem cell derived phenotypic human neuromuscular junction model for dose response evaluation of therapeutics. Biomaterials. 166, 64-78 (2018).
  14. Davis, R. L., Weintraub, H., Lassar, A. B. Expression of a single transfected cDNA converts fibroblasts to myoblasts. Cell. 51 (6), 987-1000 (1987).
  15. Tanaka, A., et al. Efficient and reproducible myogenic differentiation from human iPS cells: prospects for modeling Miyoshi Myopathy in vitro. PLoS One. 8 (4), 61540(2013).
  16. Furlan, A., Adameyko, I. Schwann cell precursor: a neural crest cell in disguise. Developmental Biology. 444, 25-35 (2018).
  17. Jessen, K. R., Mirsky, R. Schwann Cell Precursors; Multipotent Glial Cells in Embryonic Nerves. Frontiers in Molecular Neuroscience. 12 (69), (2019).
  18. Lin, C. Y., et al. iPSC-derived functional human neuromuscular junctions model the pathophysiology of neuromuscular diseases. JCI Insight. 4 (18), (2019).
  19. Reynolds, E. S. The use of lead citrate at high pH as an electron-opaque stain in electron microscopy. Journal of Cell Biology. 17 (1), 208-212 (1963).
  20. Steinbeck, J. A., et al. Functional Connectivity under Optogenetic Control Allows Modeling of Human Neuromuscular Disease. Cell Stem Cell. 18 (1), 134-143 (2016).
  21. Bucchia, M., Merwin, S. J., Re, D. B., Kariya, S. Limitations and Challenges in Modeling Diseases Involving Spinal Motor Neuron Degeneration in vitro. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 61(2018).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

r nicowanie ludzkich iPSCneurony ruchowemi nie szkieletowekom rki Schwannastymulacja chlorkiem wapniainhibicja kurarembarwienie immunofluorescencyjnemikroskopia odwr conatransmisyjna mikroskopia elektronowa

Powiązane artykuły