Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Pomiar wychwytu glukozy stymulowanego insuliną i skurczem w izolowanych i inkubowanych dojrzałych mięśniach szkieletowych myszy

6.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61398

⸱

16 maja 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Section of Molecular Physiology, Department of Nutrition, Exercise and Sports, University of Copenhagen, 2Section of Integrative Physiology, Department of Nutrition, Exercise and Sports, University of Copenhagen

W tym artykule

Podsumowanie

Nienaruszona regulacja wychwytu glukozy w mięśniach jest ważna dla utrzymania homeostazy glukozy w całym organizmie. Protokół ten przedstawia ocenę wychwytu glukozy stymulowanego insuliną i skurczem w izolowanych i inkubowanych dojrzałych mięśniach szkieletowych przy jednoczesnym określeniu wpływu różnych interwencji fizjologicznych na metabolizm glukozy w całym organizmie.

Streszczenie

Mięsień szkieletowy jest tkanką reagującą na insulinę i zazwyczaj pobiera większość glukozy, która dostaje się do krwi po posiłku. Ponadto doniesiono, że mięśnie szkieletowe mogą zwiększyć ekstrakcję glukozy z krwi nawet 50-krotnie podczas ćwiczeń w porównaniu z warunkami spoczynku. Wzrost wychwytu glukozy przez mięśnie podczas wysiłku fizycznego i stymulacji insuliną jest zależny od translokacji transportera glukozy 4 (GLUT4) z przedziałów wewnątrzkomórkowych do błony powierzchniowej komórek mięśniowych, a także fosforylacji glukozy do glukozo-6-fosforanu przez heksokinazę II. Izolacja i inkubacja mięśni myszy, takich jak m. soleus i m. extensor digitorum longus (EDL), jest odpowiednim modelem ex vivo do badania wpływu insuliny i skurczu indukowanego elektrycznie (model ćwiczeń) na wychwyt glukozy w dojrzałych mięśniach szkieletowych. W ten sposób model ex vivo pozwala na ocenę wrażliwości mięśni na insulinę i umożliwia dopasowanie produkcji siły mięśniowej podczas skurczu, zapewniając równomierną rekrutację włókien mięśniowych podczas pomiarów wychwytu glukozy przez mięśnie. Co więcej, opisany model nadaje się do badania związków farmakologicznych, które mogą mieć wpływ na wrażliwość mięśni na insulinę lub mogą być pomocne przy próbie określenia złożoności regulacyjnej wychwytu glukozy w mięśniach szkieletowych.

Tutaj opisujemy i udostępniamy szczegółowy protokół, jak mierzyć pobór glukozy stymulowany insuliną i skurczem w izolowanych i inkubowanych preparatach mięśni płaszczkowatych i EDL od myszy przy użyciu radioznakowanej [3H]2-deoksy-D-glukozy i [14C]mannitolu jako markera zewnątrzkomórkowego. Pozwala to na dokładną ocenę wychwytu glukozy w dojrzałych mięśniach szkieletowych przy braku czynników zakłócających, które mogą zakłócać nienaruszony model zwierzęcy. Ponadto dostarczamy informacji na temat żywotności metabolicznej inkubowanych mięśni szkieletowych myszy, co sugeruje, że zastosowana metoda ma pewne zastrzeżenia w pewnych warunkach podczas badania metabolizmu energii mięśniowej.

Wprowadzenie

Mięśnie szkieletowe posiadają zdolność do wydobywania dużych ilości glukozy z przestrzeni zewnątrzkomórkowej w odpowiedzi na insulinę i ćwiczenia. Pomaga to w utrzymaniu homeostazy glukozy w całym organizmie i zabezpiecza podaż glukozy w okresach dużego zapotrzebowania na energię. Ponieważ wykazano, że nienaruszona regulacja wychwytu glukozy w mięśniach szkieletowych jest ważna dla ogólnego stanu zdrowia i sprawności fizycznej1,2, pomiary wychwytu glukozy przez mięśnie w różnych warunkach spotkały się z dużym zainteresowaniem. U ludzi i zwierząt klamra hiperinsulinemiczno-euglikemiczna jest stosowana jako złoty standard do oceny wrażliwości na insulinę in vivo3,4. W przeciwieństwie do wyników uzyskanych z doustnego testu tolerancji glukozy, technika zaciskania hiperinsulinemiczno-euglikemicznego nie wymaga nienaruszonej funkcji przewodu pokarmowego ani wydzielania insuliny z trzustki, a tym samym pozwala na porównanie odpowiedzi na insulinę między osobami, które wykazują różnice w funkcji przewodu pokarmowego i/lub trzustki. Pomiary wychwytu glukozy przez mięśnie in vivo podczas ćwiczeń u ludzi są wykonywane często od 1960 roku5. Najpierw za pomocą technik równowagi tętniczo-żylnej6, a następnie za pomocą obrazowania za pomocą pozytonowej tomografii emisyjnej (PET) w połączeniu z pozytonowym analogiem glukozy, np. 18F-Fluoro-deoksy-glucose7. U gryzoni stymulowany wysiłkiem fizycznym wychwyt glukozy mięśniowej in vivo jest zwykle wykonywany przy użyciu radioaktywnych lub stabilnych analogów glukozy znakowanych izotopami8,9,10.

Metodą uzupełniającą pomiary poboru glukozy przez mięśnie in vivo, jest izolowanie i inkubacja małych mięśni od gryzoni, a następnie mierzenie wychwytu glukozy za pomocą radioaktywnych lub stabilnych analogów glukozy znakowanych izotopami11,12,13. Metoda ta pozwala na dokładne i wiarygodne określenie ilościowe wskaźników wychwytu glukozy w dojrzałych mięśniach szkieletowych i może być wykonywana w obecności różnych stężeń insuliny oraz podczas skurczu wywołanego stymulacją elektryczną. Co ważniejsze, pomiary wychwytu glukozy w izolowanych i inkubowanych mięśniach szkieletowych mają znaczenie przy badaniu fenotypu metabolicznego mięśni myszy, które przeszły różne interwencje (np. odżywianie, aktywność fizyczna, infekcje, terapie). Izolowany model mięśni szkieletowych jest również odpowiednim narzędziem do badania związków farmakologicznych, które mogą wpływać na wychwyt glukozy per se i/lub modyfikować wrażliwość na insulinę12,14. W ten sposób skuteczność związków przeznaczonych do regulacji metabolizmu glukozy w mięśniach może być testowana i oceniana w ściśle kontrolowanym środowisku przed kolejnymi testami in vivo na przedklinicznych modelach zwierzęcych.

W pewnych warunkach, żywotność metaboliczna może stanowić wyzwanie w izolowanym i inkubowanym systemie modelowym mięśni szkieletowych. Rzeczywiście, brak układu krążenia w inkubowanych mięśniach powoduje, że dostarczanie substratów (np. tlenu i składników odżywczych) w pełni zależy od prostej dyfuzji między włóknami mięśniowymi a otaczającym środowiskiem. W związku z tym ważne jest, aby inkubowane mięśnie były małe i cienkie, a zatem stanowiły mniejszą barierę dla dyfuzji tlenu podczas inkubacji15. Szczególnie podczas długotrwałych inkubacji trwających kilka godzin, stany niedotlenienia mogą rozwinąć się z powodu niewystarczającego dopływu tlenu, co skutkuje wyczerpaniem energii mięśni15. Chociaż różne markery żywotności metabolicznej w inkubowanych mięśniach szczurów były już wcześniej opisywane wraz z identyfikacją ważnych zmiennych, które pomagają utrzymać żywotność mięśni szczurów15, kompleksowa ocena żywotności metabolicznej w małych inkubowanych mięśniach myszy jest nadal uzasadniona. W związku z tym obecnie zawartość glikogenu jest głównie stosowana jako marker żywotności metabolicznej w inkubowanych mięśniach szkieletowych myszy 16,17.

Tutaj opisujemy szczegółowy protokół pomiaru podstawowego, stymulowanego insuliną i skurczem wychwytu glukozy w izolowanych i inkubowanych mięśniach płaszczkowatych i EDL od myszy przy użyciu radioznakowanej [3H]2-deoksy-D-glukozy i [14C]mannitolu jako markera zewnątrzkomórkowego. W niniejszym badaniu wychwyt glukozy mierzono w okresie 10 minut, a metoda została przedstawiona z wykorzystaniem submaksymalnych i maksymalnych skutecznych stężeń insuliny oraz protokołu pojedynczego skurczu. Jednak opisane tutaj protokoły można łatwo modyfikować pod względem czasu inkubacji, dawkowania insuliny i protokołu stymulacji elektrycznej. Ponadto zapewniamy dokładną charakterystykę różnych markerów żywotności metabolicznej w inkubowanym mięśniu płaszczkowatym i mięśniu myszy EDL. Wyniki wskazują, że suplementacja glukozy do buforu inkubacyjnego jest niezbędna do zachowania żywotności metabolicznej mięśni inkubowanych przez 1 godzinę.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Procedury z udziałem zwierząt badawczych powinny być wykonywane zgodnie z odpowiednimi wytycznymi i lokalnymi przepisami. Wszystkie doświadczenia na zwierzętach wykorzystane w tym badaniu były zgodne z Europejską Konwencją o Ochronie Zwierząt Kręgowych wykorzystywanych do celów doświadczalnych i innych celów naukowych i zostały zatwierdzone przez Duński Inspektorat Doświadczeń na Zwierzętach.

1. Przygotowanie aparatury doświadczalnej i pętli do szwów

UWAGA: W tym badaniu użyj zintegrowanego systemu miografu paskowego z dostosowanymi hakami inkubacyjnymi do inkubacji izolowanych mięśni szkieletowych myszy (Rysunek 1). System ten pozwala mięśniom kąpać się w roztworze fizjologicznym z ciągłym natlenieniem (95%O2 i 5%CO2) i w stałej temperaturze. Kąpiel tkanki mięśniowej jest sprzężona z przetwornikiem siły do pomiaru produkcji siły mięśniowej podczas skurczu. Aby wywołać i zarejestrować reakcje miomechaniczne podczas skurczu, należy zastosować odpowiednio stymulator impulsów elektrycznych i program do zbierania danych. Stymuluj inkubowane mięśnie do skurczu za pomocą platynowych elektrod umieszczonych centralnie i po obu stronach mięśnia.

  1. Włącz system myograph i ogrzewaj komory do 30 °C. Otwórz oprogramowanie do gromadzenia danych kompatybilne z systemem myograph i skalibruj przetworniki siły, aby zapewnić porównywalność między zestawami danych.
  2. Zacznij od przecięcia ~16 cm pasm niewchłanialnego nylonowego szwu chirurgicznego. Użyj kleszczy, aby utworzyć pętlę o średnicy około 0,4 cm z pojedynczego pasma. Powtarzaj to, aż zostanie wyprodukowana wystarczająca liczba pętli. Każdy mięsień potrzebuje dwóch pętli - jednej dla ścięgna proksymalnego, a drugiej dla dystalnego.

2. Przygotowanie roztworów i pożywek inkubacyjnych

  1. Przygotowanie podstawowych pożywek inkubacyjnych
    1. Przygotować następujące roztwory podstawowe: 2,5 M chlorek sodu (NaCl, 250 ml), 0,5 M wodorowęglan sodu (NaHCO3, 250 ml), 0,5 M chlorek potasu (KCl, 50 ml), 0,25 M chlorek wapnia (CaCl2, 50 ml), 0,25 M diwodorofosforan potasu (KH2PO4, 50 ml), 0,25 M siarczan magnezu (MgSO4, 50 ml), 110 mM pirogronian sodu (Na-pirogronian, 100 ml), 500 mM D-mannitol (100 ml), 1 M 2-deoksy-D-glukoza (4 ml), 15% roztwór albuminy surowicy bydlęcej (BSA) dializowany z buforem Krebs-Ringer-Henseleit (KRH) (opisany poniżej w kroku 4) (100 ml).
      UWAGA: Do pomiaru wychwytu glukozy w spoczynku i skurczu potrzebne są dwa roztwory. Co więcej, każde pojedyncze stężenie insuliny używane do oceny wychwytu glukozy stymulowanego insuliną wymaga dwóch roztworów. Tak więc w sumie potrzeba sześciu różnych roztworów do pomiaru podstawowego, submaksymalnego wychwytu glukozy stymulowanego insuliną, insuliną i skurczem w izolowanych mięśniach szkieletowych myszy. W dalszej części "podstawowe pożywki inkubacyjne" odnoszą się do pożywek bez insuliny lub radioaktywnych znaczników. "Pożywki do inkubacji" odnoszą się do pożywek zawierających insulinę. "Pożywka do inkubacji wychwytu glukozy" odnosi się do pożywki zawierającej oprócz insuliny 2-deoksy-D-glukozę i radioaktywne znaczniki o stężeniu identycznym ze stężeniem stosowanym w "pożywce inkubacyjnej".
    2. Przygotować bufor KRH, uzupełniając wodę ultraczystą (ddH2O) NaCl (117 mM), NaHCO3 (24,6 mM), KCl (4,7 mM), CaCl2 (2,5 mM), KH2PO4 (1,2 mM) iMgSO4 (1,2 mM). Następnie zagazować bufor KRH 95%O2 i 5% CO2 przez co najmniej 10 minut. Pożądane pH buforu KRH powinno wynosić od 7,35 do 7,45 w temperaturze 30 °C. Jeżeli regulacja pH jest wykonywana w temperaturze pokojowej, pH buforu KRH powinno wynosić od 7,25 do 7,35.
    3. Dodać BSA (0,1%), na-pirogronian (2 mM) i D-mannitol (8 mM) do zagazowanego i dostosowanego do pH buforu KRH, aby uzupełnić podstawowe podłoże inkubacyjne. Przechowywać podstawowe podłoża inkubacyjne w szczelnie zamkniętym pojemniku, aby zminimalizować odgazowanieO2 iCO2 i umieścić pożywkę w temperaturze 30 °C.
      UWAGA: Zazwyczaj osmolarność suplementów KRH (tj. Na-pirogronianu, D-mannitolu i D-glukozy) jest utrzymywana na stałym poziomie przez cały eksperyment, aby uniknąć kurczenia się lub rozszerzania komórek mięśniowych. Opisany w niniejszym dokumencie protokół wykorzystuje osmolarność 10 mM dla suplementów KRH. Jeśli potrzebny jest bufor zawierający glukozę, należy zastąpić suplementy KRH w zależności od potrzeb, np. 5 mM D-glukozy i 5 mM D-mannitol.
    4. Aby uniknąć ewentualnych zanieczyszczeń związanych z BSA w buforze inkubacyjnym, należy dializować BSA w stosunku do KRH.
      1. Aby przygotować 15% roztwór podstawowy BSA dializowany z buforem KRH, należy rozpocząć od rozpuszczenia 300 g beztłuszczowego BSA klasy analitycznej w 900 ml buforu KRH. Następnie zagotuj rurkę dializacyjną w redestylowanej wodzie, aż rurka będzie miękka.
      2. Napełnij rurkę roztworem BSA-KRH i zabezpiecz końce przewodów. Rurkę z BSA-KRH umieścić w 5 litrach bufora KRH i pozostawić na noc w temperaturze 4 °C. Następnego dnia wymienić bufor KRH i pozostawić rurkę z BSA-KRH w buforze KRH na noc w temperaturze 4 °C.
      3. Na koniec pobrać roztwór BSA-KRH z rurki i dodać bufor KRH do końcowej objętości 2 l (tj. 15% roztworu podstawowego BSA-KRH). Podzielić 15% roztwór podstawowy BSA-KRH na podwielokrotności i przechowywać w zamrażarce w temperaturze ~-20 °C.
  2. Przygotowanie pożywek inkubacyjnych zawierających insulinę
    1. W przypadku pożywek inkubacyjnych zawierających submaksymalnie skuteczne stężenie insuliny, dodać 1 μl 100 mU/ml roztworu podstawowego insuliny na ml podstawowej pożywki inkubacyjnej (100 μU/ml insuliny).
    2. W przypadku pożywek inkubacyjnych zawierających maksymalne skuteczne stężenie insuliny dodać 1 μl 10 j./ml roztworu podstawowego insuliny na ml podstawowej pożywki inkubacyjnej (10 mU/ml insuliny).
  3. Przygotowanie pożywki do inkubacji wychwytu glukozy
    UWAGA: Obchodzenie się z materiałami radioaktywnymi jest dozwolone tylko na obszarze ograniczonym i kontrolowanym przez upoważniony personel, a niektóre uniwersytety, instytucje badawcze i firmy mogą wymagać uzyskania "Pozwolenia na użycie radioaktywności". Z materiałami i odpadami należy postępować zgodnie z odpowiednimi lokalnymi procedurami, wytycznymi i przepisami.
    1. Postępować zgodnie z tą samą procedurą, która została opisana w sekcji 2.1.2.
    2. Dodać BSA (0,1%), Na-pirogronian (2 mM), D-mannitol (7 mM) i 2-deoksy-D-glukozę (1 mM) do zagazowanego i dostosowanego pH buforu KRH.
    3. Dodać [3H]2-deoksy-D-glukozę (0,028 MBq/ml) i [14C]mannitol (0,0083 MBq/ml) do uzupełnionego buforu KRH, aby zakończyć pożywkę do inkubacji wychwytu glukozy. Przechowywać w temperaturze 30 °C. Jeśli [3H]2-deoksy-D-glukoza i [14C]mannitol są rozpuszczone w etanolu, przed użyciem należy usunąć etanol przez odparowanie za pośrednictwemN2.
    4. W przypadku pożywki do inkubacji wychwytu glukozy zawierającej submaksymalnie skuteczne stężenie insuliny, dodać 1 μl 100 mU/ml roztworu podstawowego insuliny na ml pożywki do inkubacji wychwytu glukozy (100 μU/ml insuliny).
    5. W przypadku pożywki do inkubacji wychwytu glukozy zawierającej maksymalnie skuteczne stężenie insuliny, dodać 1 μl 10 U/ml roztworu podstawowego insuliny na ml pożywki do inkubacji wychwytu glukozy (10 mU/ml insuliny).

3. Zwierzęta i sekcja mięśnia płaszczkowatego myszy i mięśnia EDL do inkubacji

UWAGA: Procedury z udziałem zwierząt badawczych powinny być wykonywane zgodnie z odpowiednimi wytycznymi i lokalnymi przepisami. Opisana procedura może być stosowana w przypadku wyhodowanych we własnym lub dostępnych na rynku samców i samic myszy o różnych szczepach i pochodzeniu genetycznym. Poniższa procedura jest przewidziana dla karmionych samic myszy C57Bl/6J. Myszy miały średnio 19 tygodni i ważyły 25 g. Myszy utrzymywano w cyklu jasne-ciemnym trwającym 12:12 godziny ze swobodnym dostępem do standardowej karmy dla gryzoni i wody. Eksperymenty na zwierzętach rozpoczęły się o ~ 9:00 czasu lokalnego, a wszystkie zwierzęta zostały uśmiercone w ciągu 2 godzin.

  1. Dodać 4 ml wstępnie podgrzanej (30°C) podstawowej pożywki inkubacyjnej do każdej komory inkubacyjnej i upewnić się, że podstawowa pożywka inkubacyjna jest stale natleniona 95%O2 i 5% CO2 .
  2. Znieczulenie myszy należy podać dootrzewnowym wstrzyknięciem pentobarbitalu (10 mg/100 g masy ciała) lub innym dostępnym środkiem znieczulającym (np. tribromoetanolem).
    UWAGA: Należy pamiętać, że w niektórych krajach może być wymagana licencja na stosowanie pentobarbitalu i innych leków znieczulających. Zanim będzie można rozpocząć sekcję mięśni, znieczulenie każdego zwierzęcia musi być odpowiednio wywołane. Aby to zapewnić, testowane są odruchy ogona i nóg. Aby uzyskać optymalne wyniki, sekcja powinna być dobrze przećwiczona, aby uniknąć uszkodzenia mięśni podczas usuwania.
  3. Umieść znieczulone myszy leżące na podatności na tacę separacyjną (np. styropianową pokrywę) i w razie potrzeby przygwoźdź przednie i tylne łapy za pomocą igły.
  4. Usuń skórę z podudzia i upewnij się, że widoczne jest zarówno ścięgno Achillesa, jak i staw kolanowy.
    1. W przypadku rozwarstwienia mięśnia płaszczkowatego zacznij od przymocowania pojedynczej pętli szwu do ścięgna Achillesa. Przymocuj kleszcze do ścięgna Achillesa dystalnie pętli szwów i przetnij, aby uwolnić mięśnie płaszczkowate i brzuchaty łydki z łapy. Ostrożnie przesuń kleszczyki po myszy, odsłaniając w ten sposób mięsień płaszczkowaty.
    2. Przypnij kleszcze do szwów i umieść drugą pętlę szwów wokół ścięgna bliższego mięśnia płaszczkowatego. Następnie przeciąć ścięgno bliższe i wypreparować płaszczkowaty (w tym dwie dołączone pętle szwów) z mięśnia brzuchatego łydki. Szybko umieść mięsień płaszczkowaty w komorze inkubacyjnej, mocując każdą pętlę szwów do odpowiednich haczyków.
  5. Usuń powięź pokrywającą m. piszczelowy przedni (TA) za pomocą kleszczy. Jeśli zostanie wykonane prawidłowo, dystalne ścięgna mięśni TA i EDL powinny być przezroczyste białe i widoczne; i oddzielone od siebie.
  6. Przeciąć dystalne ścięgno mięśnia TA i wypreparować mięsień do późniejszych analiz (np. genotypowania). Za pomocą kleszczy delikatnie uwolnij mięsień EDL z otaczających tkanek, ale pozostaw mięsień nienaruszony i nie przecinaj ścięgien. Umieść jedną pętlę szwu wokół dystalnego ścięgna, a drugą pętlę szwu wokół bliższego ścięgna EDL.
  7. Następnie przetnij ścięgna uwalniające mięsień EDL za pomocą dwóch dołączonych pętli do szwów i szybko umieść mięsień w komorze inkubacyjnej, mocując każdą pętlę szwu do odpowiednich haczyków. Aby nie tracić napięcia podczas inkubacji, a zwłaszcza podczas indukowanego elektrycznie skurczu mięśni płaszczkowatych i EDL, bardzo ważne jest zamocowanie pętli szwów wokół ścięgien za pomocą ciasnych węzłów.
  8. Na koniec należy poddać zwierzę eutanazji poprzez np. zwichnięcie szyjki macicy.
  9. Po wypreparowaniu mięśni i umieszczeniu ich w komorach inkubacyjnych, dostosuj napięcie spoczynkowe każdego mięśnia do ~5 mN i wstępnie inkubuj mięśnie przez co najmniej 10 minut przed rozpoczęciem protokołu eksperymentalnego.

4. Stymulowany insuliną wychwyt glukozy w izolowanych mięśniach szkieletowych myszy

  1. Zgodnie z krokiem 3.9 zastąpić podstawowe podłoża inkubacyjne pożywkami inkubacyjnymi niezawierającymi insuliny (podstawowe podłoża inkubacyjne), submaksymalnym skutecznym stężeniem insuliny lub maksymalnym skutecznym stężeniem insuliny i pozostawić w komorach inkubacyjnych na 20 minut. Każdą komorę inkubacyjną należy rozmieścić na 1 minutę, dając w ten sposób czas na późniejsze pobranie mięśni.
  2. Pod koniec 20-minutowego okresu stymulacji zastąpić pożywkę inkubacyjną pożywką do inkubacji wychwytu glukozy zawierającą identyczne stężenie insuliny i pozostawić w komorach inkubacyjnych na 10 minut, ponownie z zachowaniem 1-minutowego odstępu między każdą komorą inkubacyjną.
  3. Po 10 minutach inkubacji w pożywce do inkubacji wychwytu glukozy delikatnie wyjmij mięśnie z komór inkubacyjnych i umyj je w lodowatej pożywce do inkubacji. Następnie szybko wysusz mięśnie na bibule filtracyjnej, zanim pętle szwów zostaną usunięte, a mięśnie zostaną zamrożone w ciekłym azocie. Konieczne jest, aby inkubowane mięśnie zostały szybko pobrane, jeśli chce się również zbadać różne wewnątrzkomórkowe metabolity i sygnalizację białkową oprócz wychwytu glukozy.
  4. Zebrać 100 μl pożywki do inkubacji wychwytu glukozy z każdej komory inkubacyjnej i przechowywać ją w temperaturze -20 °C. Ilość promieniotwórczości w tych próbkach zostanie uwzględniona w obliczeniach wychwytu glukozy przez mięśnie.

5. Wychwyt glukozy stymulowany skurczem w izolowanych mięśniach szkieletowych myszy

UWAGA: Aby wywołać skurcz izolowanych mięśni szkieletowych myszy, użyj następującego protokołu: 1 pociąg/15 s, każdy pociąg o długości 1 s składający się z impulsów 0,2 ms dostarczanych z częstotliwością 100 Hz. Jednak inne podobne protokoły wywołujące skurcz izolowanych mięśni szkieletowych myszy prawdopodobnie również będą działać. Co ważne, napięcie powinno być tak dostosowane, aby wygenerować maksymalny rozwój siły inkubowanego mięśnia, który jest zależny od układu doświadczalnego. Jeśli nie jest to zapewnione, możesz ryzykować, że nie wszystkie włókna mięśnia kurczą się. To z kolei może wywołać stronniczość w zbiorze danych.

  1. Wykonując krok 3.9, umieść platynowe elektrody centralnie i po obu stronach mięśni. Rozpocznij skurcz mięśni natychmiast po zastąpieniu podstawowej pożywki inkubacyjnej pożywką do inkubacji wychwytu glukozy. Jeśli to możliwe, rozmieść każdą komorę inkubacyjną na 1 minutę, dając w ten sposób czas na późniejszy zbiór mięśni. Pamiętaj, aby rejestrować produkcję siły z każdego inkubowanego mięśnia.
  2. Po 10 minutach skurczu w pożywce do inkubacji wychwytu glukozy należy usunąć elektrody platynowe, delikatnie pobrać mięśnie z komór inkubacyjnych i umyć je w lodowato zimnej pożywce do inkubacji. Następnie szybko osusz mięśnie na bibule filtracyjnej, zanim pętle szwów zostaną usunięte, a mięśnie zamrożone w ciekłym azocie. Cała procedura pobierania mięśni powinna być wykonana tak szybko, jak to możliwe.
  3. Zebrać 100 μl pożywki do inkubacji wychwytu glukozy z każdej komory inkubacyjnej i przechowywać ją w temperaturze -20 °C. Ilość promieniotwórczości w tych próbkach zostanie uwzględniona w obliczeniach wychwytu glukozy przez mięśnie.

6. Homogenizacja i przetwarzanie mięśni szkieletowych

UWAGA: Procedura podana poniżej dla homogenizacji mięśni umożliwia określenie zarówno wychwytu glukozy, jak i sygnalizacji miokomórkowej za pomocą western blotting w tym samym zestawie próbek mięśni.

  1. Homogenizować każdy mięsień w 400 μl lodowatego buforu o pH 7,5 zawierającym 10% glicerolu, 20 mM pirofosforanu sodu, 1% IGEPAL CA-630 (NP-40), 2 mM fluorku fenylometylosulfonylu (rozpuszczonego w izopropanolu), 150 mM NaCl, 50 mM HEPES, 20 mM β-glicerofosforanu, 10 mM fluorku sodu (NaF), 1 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA), 1 mM kwasu glikoloeterodiaminotetraoctowego (EGTA), 10 μg/ml aprotyniny, 10 μg/ml leupeptyny, 3 mM benzamidyny i 2 mM ortowanadanu sodu za pomocą stalowych kulek i lizera tkankowego (2 x 45 s przy 30 Hz). Obracać wszystkie homogenaty od końca do końca przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C, po czym odwirować je w temperaturze 16 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Zebrać lizat (supernatant), który jest używany do oznaczania wychwytu glukozy przez mięśnie.

7. Oznaczanie znakowanej radioaktywnie 2-deoksyglukozy i mannitolu

  1. Dodać 150 μl każdego lizatu mięśniowego i 25 μl pożywki do inkubacji wychwytu glukozy z każdej komory inkubacyjnej w celu oddzielenia fiolek do liczenia płynów scyntylacyjnych zawierających 2 ml płynnego płynu scyntylacyjnego. Ponadto należy przygotować dwie fiolki do ślepej kontroli, zawierające tylko 3 ml płynnego płynu scyntylacyjnego. Zamknąć wszystkie fiolki i dokładnie wymieszać, wirując każdą fiolkę przez ~5 sekund.
  2. Umieścić fiolki w płynnym liczniku scyntylacyjnym i zmierzyć radioaktywność [3H]2-deoksy-D-glukozy i [14C]mannitolu zgodnie z wytycznymi producenta. Zapisać DPM (rozpady na minutę) dla każdej fiolki do płynnego scyntylacji.

8. Obliczanie wskaźników wychwytu glukozy przez mięśnie

  1. Użyć lizatu z kroku 6.1 w celu zmierzenia całkowitego stężenia białka w każdej próbce mięśniowej przy użyciu standardowych metod oznaczania ilościowego białka (np. kwasu bicynchoninowego lub testów Bradforda). Obliczyć ilość białka (mg) dodanego do każdej fiolki scyntylacyjnej.
    UWAGA: Szybkość wychwytu glukozy dla każdej próbki mięśniowej oblicza się, odejmując ilość [3H]2-deoksy-D-glukozy znajdującej się w przestrzeni zewnątrzkomórkowej od całkowitej ilości [3H]2-deoksy-D-glukozy w próbce mięśniowej przy użyciu [14C]mannitolu jako markera zewnątrzkomórkowego. Przyjmuje się, że [3H]2-deoksy-D-glukoza i [14C]mannitol wykazują podobne właściwości dyfuzyjne w tkance mięśniowej podczas inkubacji. Wykonaj następujące obliczenia:
  2. Zacznij od odjęcia [3H] i [14C] DPM ślepych próbek kontrolnych od wszystkich próbek mięśni i pożywki.
  3. Określ przestrzeń zewnątrzkomórkową mięśni w μL (μL-ECS):
    [14kategorii]Mięsień DPM / ([14C]Nośnik DPM / Mobj.)
  4. Oblicz ilość [3H]DPM w przestrzeni zewnątrzkomórkowej mięśni ([3H]DPMECS):
    μL-ECS × ([3H]DPM nośnik / Mvol)
  5. Oblicz ilość [3H]DPM w przestrzeni wewnątrzkomórkowej mięśni ([3H]DPMICS):
    [3godz.]Mięsień DPM− [3H]DPMECS
  6. Obliczać szybkość wychwytu glukozy przez mięśnie (μmol / g białka / godzinę):
    [3godz.]DPMICS / ([3H]DPM podłoża / Mobj.) / [2-deoksy-D-glukoza])) / mg białka) / Th
    UWAGA: Dla wszystkich powyższych równań
    [14kategorii]DPMmięsień to ilość promieniotwórczości [14C]mannitolu w próbce mięśniowej;
    [14kategorii]Pożywka DPM to ilość promieniotwórczości [14C]mannitolu w próbce pożywki;
    [3godz.]DPMmięsień to ilość radioaktywności [3H]2-deoksy-D-glukozy w próbce mięśniowej;
    [3godz.]PożywkaDPM to ilość radioaktywności [3H]2-deoksy-D-glukozy w próbce pożywki;
    [3godz.]DPMECS to ilość [3H]2-deoksy-D-glukozy radioaktywności w przestrzeni zewnątrzkomórkowej mięśni;
    [3godz.]DPMICS to ilość radioaktywności [3H]2-deoksy-D-glukozy w przestrzeni wewnątrzkomórkowej mięśni;
    μL-ECS to przestrzeń zewnątrzkomórkowa mięśni w μL;
    Mvol oznacza objętość (μl) pożywki inkubacyjnej użytej do zliczania scyntylacyjnego (np. '25', jak wspomniano powyżej);
    Th jest współczynnikiem czasu używanym do obliczania szybkości wychwytu na godzinę (tj. "1/6" w przypadku inkubacji mięśni z pożywką do wychwytu glukozy przez 10 minut)
  7. Weź pod uwagę to przykładowe obliczenie. [3H] i [14C] DPM ślepych próbek kontrolnych (odpowiednio 17 i 6) zostały odjęte od wartości DPM wymienionych poniżej.
    [14kategorii]Mięsień DPM: 343
    [14kategorii]Nośnik DPM: 11846
    [3godz.]Mięsień DPM: 4467
    [3godz.]Nośnik DPM: 39814
    M objętość: 25
    mg białka: 0,396 (w 150 μl lizacie białek mięśniowych)
    [2-deoksy-D-glukoza]: 1 (mM)
    Th: 1/6 (h)
    μL-ECS = 343 DPM / (11846 DPM / 25 μL) = 0,724 μL
    [3godz.]ECS dla programu DPM: 0,724 μL × (39814 DPM / 25 μL) = 1153 DPM
    [3godz.]ICS programu DPM: 4467 DPM - 1153 DPM = 3314 DPM
    Wychwyt glukozy: ((3314 DPM / (39814 DPM / 25 μL) / 1 mmol/L) / 0,396 mg białka) / (1/6 godziny) = 31,53 μmol / g białka / godzinę

9. SDS-PAGE i analizy western blot

  1. Przygotować lizaty mięśni płaszczkowatych i EDL w buforze Laemmli i podgrzewać przez 5 minut w temperaturze 96 °C.
  2. Oddziel równe ilości białka mięśniowego za pomocą SDS-PAGE na żelach do samodzielnego odlewania i przenieś białka do błon z polifluorku winylidenu za pomocą półsuchego blottingu.
  3. Następnie inkubuj błony w soli fizjologicznej buforowanej Tris, zawierającej 0,05% mleka Tween 20 i 2% odtłuszczonego mleka, a następnie sonduj błony z odpowiednimi przeciwciałami pierwszorzędowymi i drugorzędowymi.
  4. Wykrywaj białka za pomocą chemiluminescencji i wizualizuj je za pomocą cyfrowego systemu obrazowania.

10. Glikogen mięśniowy, nukleotydy, mleczan, kreatyna i fosfokreatyna

  1. Użyj kwasu nadchlorowego do ekstrakcji EDL i próbek mięśni płaszczkowatych.
  2. Następnie zneutralizuj próbki i przeanalizuj je pod kątem mleczanu, kreatyny i fosfokreatyny, jak opisano wcześniej18.
  3. Analizować zawartość nukleotydów w EDL i mięśniu płaszczkowatym za pomocą HPLC z odwróconymi fazami po ekstrakcji w kwasie nadchlorowym.
  4. Określić zawartość glikogenu mięśniowego w homogenacie całych mięśni jako jednostki glikozylowe po hydrolizie kwasowej metodą fluorometryczną, jak opisano wcześniej18.

11. Statystyki

  1. Wykonuj analizy statystyczne za pomocą oprogramowania do analiz statystycznych.
  2. Do oceny różnic statystycznych między wartościami przedstawionymi w tabeli 1 należy użyć testu dwukierunkowej analizy wariancji (ANOVA).
  3. Użyj niesparowanych testów t Studenta, aby ocenić statystyczne różnice w wychwycie glukozy między EDL a płaszczkowatym w każdej grupie przedstawionej w Rysunek 2. Przedstaw dane jako średnie ± błędu standardowego średniej (SEM). P < 0,05 jest uważane za statystycznie istotne.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Jak pokazano na Rysunku 2, podstawowe tempo wychwytu glukozy było podobne w izolowanych mięśniach soleus i EDL samic myszy. Było to zgłaszane już wielokrotnie wcześniej12,13,19,20. W odpowiedzi na podmaksymalne stężenie insuliny (100 µU/mL) wychwyt glukozy wzrósł odpowiednio około 0,8 i 0,6 razy, osiągając 12 i 9 µmol/g białka/h w m...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Nienaruszona regulacja wychwytu glukozy w mięśniach szkieletowych jest ważna dla zachowania ogólnego stanu zdrowia1. W związku z tym badanie wychwytu glukozy przez mięśnie często służy jako podstawowy odczyt przy ocenie różnych interwencji zmieniających zdrowie. Tutaj opisujemy metodę ex vivo pomiaru wychwytu glukozy w izolowanym i inkubowanym mięśniu płaszczkowatym i EDL od myszy w odpowiedzi na insulinę i skurcze wywołane elektrycznie. Metoda jest szybka i niezawodna oraz pozwala na precyzyjną k...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez granty z Duńskiej Rady ds. Niezależnych Badań - Nauk Medycznych (FSS8020-00288B) oraz Fundacji Novo Nordisk (NNF160C0023046). Prace te były również wspierane przez grant badawczy dla Rasmusa Kjøbsteda z Duńskiej Akademii Diabetologicznej, który jest finansowany przez Fundację Novo Nordisk, grant numer NNF17SA0031406. Autorzy pragną podziękować Karinie Olsen, Becinie Bolmgren i Irene Bech Nielsen (Wydział Żywienia, Ćwiczeń i Sportu, Wydział Nauk Ścisłych, Uniwersytet Kopenhaski) za ich kompetentną pomoc techniczną.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
[14C]D-mannitolAmerykańskie chemikalia znakowane radioznakiem, Inc.ARC 0127
[3H]2-deoksy-D-glukoza Amerykańskie chemikalia znakowane radioaktywnie, Inc.ART 0103A
2-Deoksy-D-glukozaSigmaD8375
4-0 USP niesterylny chirurgiczny nylonowy szewAparat Harvarda51-7698
Streptawidyna/HRP (sprzężony)DAKOP0397Służy do wykrywania białka ACC
Akt2przeciwciało Sygnalizacja komórkowa3063
AMPKα 2 przeciwciałoSanta CruzSC-19131
aprotyninaSigmaA1153
benzamidynaSigmaB6505
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)SigmaA7030
CaCl2Merck1020831000
siła)Duńska Myo Technology A/S300041
ChemiluminescencjaMiliporyWBLUF0500
D-glukozaMerck1084180100
D-MannitolSigmaM4125
Program do zbierania danychNational InstrumentsLabVIEW wersja oprogramowania 7.1
Rurki do dializyViskingDTV.12000.09 Rozmiar nr 9
Cyfrowy system obrazowaniaBioRadChemiDoc MP
EDTA Sigma EDSE9884
EGTASigmaE4378
Elektryczny stymulator impulsówDigitimerD330 MultiStim System
GlicerolSigmaG7757
HEPESSigmaH7637
IGEPAL CA-630 SigmaI8896
InsulinaNovo NordiskActrapid, 100 IE/ml
KClMerck1049361000
KH2PO4Merck104873025
leupeptynaSigmaL2884
MgSO4Merck1058860500
System miografu paskowegoDuńska technologia Myo A/SModel 820MS
Na-orthovanadateSigmaS6508
Na-pirofosforanSigma221368
Na-pirogronianSigmaP2256
NaClMerck106041000
NaFSigmaS1504
NaHCO3VWR27778260
pACC Ser212 przeciwciało Sygnalizacja komórkowa3661
pAkt Thr308przeciwciało Sygnalizacja komórkowa9275
pAMPK Przeciwciało Thr172Sygnalizacja komórkowa2531
fluorek fenylometylosulfonyluSigmaP7626
Platynowe elektrodyDuńska technologia Myo A/S300145
pTBC1D4 Ser588Sygnalizacja komórkowa8730
Licznik scyntylacyjnyPerkin ElmerTri-Carb-2910TR
Płyn scyntylacyjny Perkin Elmer6013329
Oprogramowanie do analiz statystycznychSystatSigmaPlot wersja 14
TBC1D4 przeciwciałoAbcamab189890
TissueLyser II Qiagen85300
Woda ultraczystaMerckMilli-Q Reference A+ System
β-glicerofosforanSigmaG9422
Zestaw kalibracyjny ( mięśni

Bibliografia

  1. DeFronzo, R., Tripathy, D. Skeletal muscle insulin resistance is the primary defect in type 2 diabetes. Diabetes Care. 32, suppl_2 157-163 (2009).
  2. Coyle, E. F., et al. Carbohydrate feeding during prolonged strenuous exercise can delay fatigue. Journal of Applied Physiology: Respiratory, Environmental and Exercise Physiology. 55 (1), Pt 1 230-235 (1983).
  3. Kim, J. K. Hyperinsulinemic-euglycemic clamp to assess insulin sensitivity in vivo. Methods in Molecular Biology. 560, 221-238 (2009).
  4. Ayala, J. E., Bracy, D. P., McGuinness, O. P., Wasserman, D. H. Considerations in the design of hyperinsulinemic-euglycemic clamps in the conscious mouse. Diabetes. 55 (2), 390-397 (2006).
  5. Richter, E. A., Hargreaves, M. Exercise, GLUT4, and skeletal muscle glucose uptake. Physiological Reviews. 93 (3), 993-1017 (2013).
  6. Sanders, C. A., Levinson, G. E., Abelmann, W. H., Freinkel, N. Effect of exercise on the peripheral utilization of glucose in man. The New England Journal of Medicine. 271, 220-225 (1964).
  7. Barrington, S. F., Maisey, M. N. Skeletal muscle uptake of fluorine-18-FDG: effect of oral diazepam. Journal of Nuclear Medicine Official Publication, Society of Nuclear Medicine. 37 (7), 1127-1129 (1996).
  8. Fentz, J., et al. AMPKα is critical for enhancing skeletal muscle fatty acid utilization during in vivo exercise in mice. FASEB Journal. 29 (5), 1725-1738 (2015).
  9. Maarbjerg, S. J., et al. Genetic impairment of AMPKalpha2 signaling does not reduce muscle glucose uptake during treadmill exercise in mice. American Journal of Physiology, Endocrinology and Metabolism. 297 (4), 924-934 (2009).
  10. Stöckli, J., et al. The RabGAP TBC1D1 plays a central role in exercise-regulated glucose metabolism in skeletal muscle. Diabetes. 64 (6), 1914-1922 (2015).
  11. Jørgensen, S. B., et al. Knockout of the alpha2 but not alpha1 5'-AMP-activated protein kinase isoform abolishes 5-aminoimidazole-4-carboxamide-1-beta-4-ribofuranosidebut not contraction-induced glucose uptake in skeletal muscle. The Journal of Biological Chemistry. 279 (2), (2004).
  12. Kjøbsted, R., et al. Prior AICAR stimulation increases insulin sensitivity in mouse skeletal muscle in an AMPK-dependent manner. Diabetes. 64 (6), 2042-2055 (2015).
  13. Lantier, L., et al. AMPK controls exercise endurance, mitochondrial oxidative capacity, and skeletal muscle integrity. FASEB Journal. 28 (7), 3211-3224 (2014).
  14. Cokorinos, E. C., et al. Activation of skeletal muscle AMPK promotes glucose disposal and glucose lowering in non-human primates and mice. Cell Metabolism. 25 (5), 1147-1159 (2017).
  15. Bonen, A., Clark, M. G., Henriksen, E. J. Experimental approaches in muscle metabolism: hindlimb perfusion and isolated muscle incubations. The American Journal of Physiology. 266, 1-16 (1994).
  16. van Breda, E., Keizer, H. A., Glatz, J. F., Geurten, P. Use of the intact mouse skeletal-muscle preparation for metabolic studies. Evaluation of the model. The Biochemical Journal. 267 (1), 257-260 (1990).
  17. Sogaard, P., et al. Effects of fibre type and diffusion distance on mouse skeletal muscle glycogen content in vitro. Journal of Cellular Biochemistry. 107 (6), 1189-1197 (2009).
  18. Lowry, O. H., Passonneau, J. V. Typical fluorometric procedures for metabolite assays. A Flexible System of Enzymatic Analysis. , 68-92 (1972).
  19. Jensen, T. E., et al. Contraction-stimulated glucose transport in muscle is controlled by AMPK and mechanical stress but not sarcoplasmatic reticulum Ca(2+) release. Molecular Metabolism. 3 (7), 742-753 (2014).
  20. Kristensen, J. M., Treebak, J. T., Schjerling, P., Goodyear, L., Wojtaszewski, J. F. P. Two weeks of metformin treatment induces AMPK-dependent enhancement of insulin-stimulated glucose uptake in mouse soleus muscle. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 306 (10), 1099-1109 (2014).
  21. Szekeres, F., et al. The Rab-GTPase-activating protein TBC1D1 regulates skeletal muscle glucose metabolism. AJP: Endocrinology and Metabolism. 303 (4), 524-533 (2012).
  22. Pehmøller, C., et al. Genetic disruption of AMPK signaling abolishes both contraction- and insulin-stimulated TBC1D1 phosphorylation and 14-3-3 binding in mouse skeletal muscle. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 297 (3), 665-675 (2009).
  23. Ryder, J. W., Bassel-Duby, R., Olson, E. N., Zierath, J. R. Skeletal muscle reprogramming by activation of calcineurin improves insulin action on metabolic pathways. The Journal of Biological Chemistry. 278 (45), 44298-44304 (2003).
  24. Long, Y. C., Glund, S., Garcia-Roves, P. M., Zierath, J. R. Calcineurin regulates skeletal muscle metabolism via coordinated changes in gene expression. The Journal of Biological Chemistry. 282 (3), 1607-1614 (2007).
  25. Bloemberg, D., Quadrilatero, J. Rapid determination of myosin heavy chain expression in rat, mouse, and human skeletal muscle using multicolor immunofluorescence analysis. PloS One. 7 (4), 35273(2012).
  26. Roche, S. M., Gumucio, J. P., Brooks, S. V., Mendias, C. L., Claflin, D. R. Measurement of maximum isometric force generated by permeabilized skeletal muscle fibers. Journal of Visualized Experiments. (100), e52695(2015).
  27. Park, K. H., et al. Ex vivo assessment of contractility, fatigability and alternans in isolated skeletal muscles. Journal of Visualized Experiments. (69), e4198(2012).
  28. Tullson, P. C., Terjung, R. L. Adenine nucleotide metabolism in contracting skeletal muscle. Exercise and Sport Sciences Reviews. 19, 507-537 (1991).
  29. Wojtaszewski, J. F., Jakobsen, A. B., Ploug, T., Richter, E. A. Perfused rat hindlimb is suitable for skeletal muscle glucose transport measurements. The American Journal of Physiology. 274 (1), Pt 1 184-191 (1998).
  30. Hansen, P. A., Gulve, E. A., Holloszy, J. O. Suitability of 2-deoxyglucose for in vitro measurement of glucose transport activity in skeletal muscle. Journal of AppliedPhysiology. 76 (2), 979-985 (1994).
  31. Watson-Wright, W. M., Tan, M. H., Bonen, A. Insulin binding and 2-deoxy-D-glucose uptake in fast- and slow-twitch mouse skeletal muscle at 18 and 37 degrees C. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 62 (12), 1460-1465 (1984).
  32. Hansen, P. A., Marshall, B. A., Chen, M., Holloszy, J. O., Mueckler, M. Transgenic overexpression of hexokinase II in skeletal muscle does not increase glucose disposal in wild-type or Glut1-overexpressing mice. The Journal of Biological Chemistry. 275 (29), (2000).
  33. Virkamäki, A., Rissanen, E., Hämäläinen, S., Utriainen, T., Yki-Järvinen, H. Incorporation of [3-3H]glucose and 2-[1-14C]deoxyglucose into glycogen in heart and skeletal muscle in vivo: implications for the quantitation of tissue glucose uptake. Diabetes. 46 (7), 1106-1110 (1997).
  34. Bhave, G., Neilson, E. G. Body fluid dynamics: back to the future. Journal of the American Society of Nephrology JASN. 22 (12), 2166-2181 (2011).
  35. Eckel-Mahan, K., Sassone-Corsi, P. Metabolism and the circadian clock converge. Physiological Reviews. 93 (1), 107-135 (2013).
  36. Dyar, K. A., et al. Muscle insulin sensitivity and glucose metabolism are controlled by the intrinsic muscle clock. Molecular Metabolism. 3 (1), 29-41 (2014).
  37. Basse, A. L., et al. Skeletal muscle insulin sensitivity show circadian rhythmicity which is independent of exercise training status. Frontiers in Physiology. 9, 1198(2018).
  38. Segal, S. S., Faulkner, J. A. Temperature-dependent physiological stability of rat skeletal muscle in vitro. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 248 (3), 265-270 (1985).
  39. Wallberg-Henriksson, H. Glucose transport into skeletal muscle. Influence of contractile activity, insulin, catecholamines and diabetes mellitus. Acta Physiologica Scandinavica. Supplementum. 564, 1-80 (1987).
  40. Alkhateeb, H., Chabowski, A., Bonen, A. Viability of the isolated soleus muscle during long-term incubation. Applied Physiology, Nutrition, and Metabolism. 31 (4), 467-476 (2006).
  41. Cleland, P. J., Rattigan, S., Clark, M. G. Glucose-induced loss of exercise-mediated 3-0-methyl glucose uptake by isolated rat soleus and epitrochlearis muscles. Hormone and Metabolic Research. 22 (2), 121-122 (1990).
  42. Gulve, E. A., Cartee, G. D., Holloszy, J. O. Prolonged incubation of skeletal muscle in vitro: prevention of increases in glucose transport. The American Journal of Physiology. 261 (1), Pt 1 154-160 (1991).
  43. Deshmukh, A. S., et al. Deep proteomics of mouse skeletal muscle enables quantitation of protein isoforms, metabolic pathways, and transcription factors. Molecular & Cellular Proteomics. 14 (4), 841-853 (2015).
  44. Rudich, A., Klip, A. Push/pull mechanisms of GLUT4 traffic in muscle cells. Acta physiologica Scandinavica. 178 (4), 297-308 (2003).
  45. Kjøbsted, R., et al. Enhanced muscle insulin sensitivity after contraction/exercise is mediated by AMPK. Diabetes. 66 (3), 598-612 (2017).
  46. Kjøbsted, R., et al. TBC1D4 is necessary for enhancing muscle insulin sensitivity in response to AICAR and contraction. Diabetes. 68 (9), 1756-1766 (2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

stymulacja insulinąstymulacja skurczowamięsień soleus myszymięsień EDL myszyglukoza znakowana izotopowomigotanie w cieczyanaliza Western blotsekcja mięśni
Pomiar wychwytu glukozy stymulowanego insuliną i skurczem w izolowanych i inkubowanych dojrzałych mięśniach szkieletowych myszy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.