Method Article

Śledzenie szczurów w komorach kondycjonowania instrumentalnego za pomocą uniwersalnej domowej kamery wideo i DeepLabCut

DOI:

10.3791/61409

⸱

June 15th, 2020

 ,  ,  ,  , 
1Basal Ganglia Pathophysiology Unit, Dept. Experimental Medical Science, Lund University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje, jak zbudować małą i wszechstronną kamerę wideo oraz jak wykorzystać uzyskane z niej filmy do trenowania sieci neuronowej do śledzenia pozycji zwierzęcia w komorach warunkowania instrumentalnego. Jest to cenne uzupełnienie standardowych analiz logów danych uzyskanych z testów kondycjonowania instrumentalnego.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komory warunkowania instrumentalnego są używane do przeprowadzania szerokiego zakresu testów behawioralnych w dziedzinie neuronauki. Rejestrowane dane są zwykle oparte na uruchomieniu czujników dźwigni i szturchnięcia nosa znajdujących się wewnątrz komór. Chociaż zapewnia to szczegółowy wgląd w to, kiedy i jak zwierzęta wykonują określone reakcje, nie może być używane do oceny zachowań, które nie uruchamiają żadnych czujników. W związku z tym ocena tego, jak zwierzęta ustawiają się i poruszają w komorze, jest rzadko możliwa. Aby uzyskać te informacje, badacze zazwyczaj muszą nagrywać i analizować filmy. Producenci komór kondycjonowania instrumentalnego zazwyczaj mogą dostarczyć swoim klientom wysokiej jakości zestawy kamer. Mogą one być jednak bardzo kosztowne i niekoniecznie pasują do komór innych producentów lub innych konfiguracji testów behawioralnych. Obecny protokół opisuje, jak zbudować niedrogą i wszechstronną kamerę wideo przy użyciu hobbystycznych komponentów elektronicznych. Dalej opisano, w jaki sposób korzystać z pakietu oprogramowania do analizy obrazu DeepLabCut do śledzenia stanu silnego sygnału świetlnego, a także pozycji szczura, na filmach zebranych z komory kondycjonowania instrumentalnego. Pierwsza z nich jest bardzo pomocna przy wyborze krótkich interesujących segmentów w filmach, które obejmują całe sesje testowe, a druga umożliwia analizę parametrów, których nie można uzyskać z dzienników danych wytwarzanych przez komory operacyjne.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W dziedzinie neuronauki behawioralnej, badacze często używają komór warunkowania instrumentalnego do oceny szerokiego zakresu różnych cech poznawczych i psychiatrycznych u gryzoni. Chociaż istnieje kilku różnych producentów takich systemów, zazwyczaj mają one pewne wspólne atrybuty i prawie ustandaryzowaną konstrukcję1,2,3. Komory mają zazwyczaj kształt kwadratu lub prostokąta, z jedną ścianą, którą można otworzyć, aby umieścić w niej zwierzęta, a jedną lub dwiema pozostałymi ścianami zawierającymi elementy, takie jak dźwignie, otwory do szturchania nosa, tacki z nagrodami, koła reakcji i różnego rodzaju światła1,2,3. Światła i czujniki znajdujące się w komorach służą zarówno do kontrolowania protokołu testowego, jak i śledzenia zachowań zwierząt1,2,3,4,5. Typowe systemy kondycjonowania instrumentalnego pozwalają na bardzo szczegółową analizę interakcji zwierząt z różnymi operandami i otworami obecnymi w komorach. Ogólnie rzecz biorąc, wszelkie sytuacje, w których czujniki są uruchamiane, mogą być rejestrowane przez system, a na podstawie tych danych użytkownicy mogą uzyskać szczegółowe pliki dziennika opisujące, co zwierzę robiło podczas określonych etapów testu4,5. Chociaż zapewnia to obszerną reprezentację wydajności zwierzęcia, może być używane tylko do opisywania zachowań, które bezpośrednio wywołują jeden lub więcej czujników4,5. W związku z tym aspekty związane z tym, jak zwierzę ustawia się i porusza wewnątrz komory podczas różnych faz testu, nie są dobrze opisane6,7,8,9,10. Jest to niefortunne, ponieważ takie informacje mogą być cenne dla pełnego zrozumienia zachowania zwierzęcia. Na przykład, może być użyty do wyjaśnienia, dlaczego niektóre zwierzęta osiągają słabe wyniki w danym teście6, do opisania strategii, które zwierzęta mogą rozwinąć, aby poradzić sobie z trudnymi zadaniami6,7,8,9,10, lub aby docenić prawdziwą złożoność rzekomo prostych zachowań11,12. Aby uzyskać takie informacje, badacze często korzystają z ręcznej analizy filmów6,7,8,9,10,11.

Podczas nagrywania filmów z komór kondycjonowania instrumentalnego, wybór kamery jest krytyczny. Komory są zwykle zlokalizowane w kabinach izolacyjnych, a protokoły często wykorzystują kroki, w których nie świeci żadne światło widzialne3,6,7,8,9. Dlatego konieczne jest stosowanie oświetlenia w podczerwieni (IR) w połączeniu z kamerą czułą na podczerwień, ponieważ zapewnia ona widoczność nawet w całkowitej ciemności. Co więcej, przestrzeń dostępna do umieszczenia kamery w kabinie izolacyjnej jest często bardzo ograniczona, co oznacza, że duże korzyści przynosi posiadanie małych kamer, które wykorzystują obiektywy o szerokim polu widzenia (np. obiektywy typu rybie oko)9. Podczas gdy producenci systemów kondycjonowania instrumentalnego mogą często dostarczać swoim klientom wysokiej jakości konfiguracje kamer, systemy te mogą być drogie i niekoniecznie pasują do komór innych producentów lub konfiguracji do innych testów behawioralnych. Jednak zauważalną zaletą korzystania z samodzielnych kamer wideo jest to, że te konfiguracje często mogą łączyć się bezpośrednio z systemami kondycjonowania instrumentalnego13,14. Dzięki temu można je skonfigurować tak, aby rejestrowały tylko określone zdarzenia, a nie pełne sesje testowe, co może znacznie pomóc w następującej analizie.

Obecny protokół opisuje, jak zbudować tanią i wszechstronną kamerę wideo przy użyciu komponentów elektroniki hobbystycznej. Kamera wykorzystuje obiektyw typu rybie oko, jest czuła na oświetlenie w podczerwieni i posiada dołączony zestaw diod elektroluminescencyjnych IR (IR LED). Co więcej, jest zbudowany tak, aby miał płaski i smukły profil. Razem te aspekty sprawiają, że idealnie nadaje się do nagrywania filmów z większości dostępnych na rynku komór kondycjonowania instrumentalnego, a także innych konfiguracji testów behawioralnych. Protokół opisuje ponadto, jak przetwarzać filmy uzyskane za pomocą kamery i jak korzystać z pakietu oprogramowania DeepLabCut15,16, aby pomóc w wyodrębnianiu interesujących sekwencji wideo, a także śledzeniu ruchów zwierzęcia w nich. Częściowo pozwala to obejść wadę korzystania z samodzielnej kamery w porównaniu ze zintegrowanymi rozwiązaniami dostarczanymi przez producentów systemów kondycjonowania i stanowi uzupełnienie ręcznej oceny zachowań.

Podjęto wysiłki, aby napisać protokół w ogólnym formacie, aby podkreślić, że cały proces może być dostosowany do filmów z różnych testów warunkowania instrumentalnego. Aby zilustrować pewne kluczowe pojęcia, jako przykłady użyto filmów przedstawiających szczury wykonujące test czasu reakcji szeregowej 5 wyborów (5CSRTT)17.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury dotyczące obchodzenia się ze zwierzętami zostały zatwierdzone przez Komisję Etyczną ds. Badań na Zwierzętach w Malmö-Lund.

1. Budowa kamery wideo

UWAGA: Lista komponentów potrzebnych do budowy kamery znajduje się w Tabeli Materiałów. Zapoznaj się również z Rysunek 1, Rysunek 2, Rysunek 3, Rysunek 4, Rysunek 5.

  1. Przymocuj magnetyczny metalowy pierścień (który towarzyszy opakowaniu obiektywu typu rybie oko) wokół otworu podstawy aparatu (Rysunek 2A). Umożliwi to umieszczenie obiektywu typu rybie oko przed kamerą.
  2. Przymocuj moduł kamery do podstawy kamery (Rysunek 2B). Zapewni to pewną stabilność modułowi kamery i zapewni pewną ochronę obwodów elektronicznych.
  3. Otwórz porty kamery w module kamery i mikrokomputerze (Rysunek 1), delikatnie pociągając za krawędzie ich plastikowych klipsów (Rysunek 2C).
  4. Umieść taśmowy w portach aparatu tak, aby srebrne złącza były skierowane w stronę płytek drukowanych (Rysunek 2C). Zablokuj na miejscu, wciskając plastikowe zaciski portów kamery.
  5. Umieść mikrokomputer w plastikowej obudowie i włóż wymienioną kartę micro SD (Rysunek 2D).
    UWAGA: Karta micro SD będzie działać jako dysk twardy mikrokomputera i zawiera pełny system operacyjny. Wymieniona karta micro SD jest dostarczana z preinstalowanym menedżerem instalacji (New Out Of Box Software (NOOBS). Alternatywnie można zapisać obraz najnowszej wersji systemu operacyjnego mikrokomputera (Raspbian lub Rasberry Pi OS) na ogólnej karcie micro SD. Aby uzyskać pomoc w tym zakresie, zapoznaj się z oficjalnymi zasobami internetowymi18. Zaleca się użycie karty micro SD klasy 10 o pojemności 32 GB. Większe karty SD mogą nie być w pełni zgodne z wymienionym mikrokomputerem.
  6. Podłącz monitor, klawiaturę i mysz do mikrokomputera, a następnie podłącz jego zasilanie.
  7. Postępuj zgodnie z instrukcjami zawartymi w instrukcji instalacji, aby przeprowadzić pełną instalację systemu operacyjnego mikrokomputera (Raspbian lub Rasberry Pi OS). Po uruchomieniu mikrokomputera upewnij się, że jest podłączony do Internetu za pomocą Ethernet lub Wi-Fi.
  8. Wykonaj czynności opisane poniżej, aby zaktualizować wstępnie zainstalowane pakiety oprogramowania mikrokomputera.
    1. Otwórz okno terminala (Rysunek 3A).
    2. Wpisz "sudo apt-get update" (bez cudzysłowów) i naciśnij Enter (Rysunek 3B). Poczekaj na zakończenie procesu.
    3. Wpisz "sudo apt full-upgrade" (bez cudzysłowów) i naciśnij enter. Odpowiadaj przyciskami po wyświetleniu monitu i poczekaj na zakończenie procesu.
  9. W menu Start wybierz Preferencje i konfiguracje Raspberry Pi (Rysunek 3C). W otwartym oknie przejdź do zakładki Interfejsy i kliknij, aby włączyć kamerę i I2C. Jest to wymagane, aby mikrokomputer współpracował z kamerą i modułami IR LED.
  10. Zmień nazwę pliku uzupełniającego 1 na "Pi_video_camera_Clemensson_2019.py". Skopiuj go na pamięć USB, a następnie do folderu /home/pi mikrokomputera (Rysunek 3D). Ten plik jest skryptem języka Python, który umożliwia nagrywanie wideo za pomocą przełączników przycisków dołączonych w kroku 1.13.
  11. Wykonaj czynności opisane poniżej, aby edytować plik rc.local mikrokomputera. Spowoduje to, że komputer uruchomi skrypt skopiowany w kroku 1.10 i uruchomi diody podczerwieni dołączone w kroku 1.13 podczas uruchamiania.
    UWAGA: Ta funkcja automatycznego uruchamiania nie działa niezawodnie z płytami mikrokomputerowymi innymi niż wymieniony model.
    1. Otwórz okno terminala, wpisz "sudo nano /etc/rc.local" (bez cudzysłowów) i naciśnij enter. Spowoduje to otwarcie pliku tekstowego (Rysunek 4A).
    2. Użyj strzałek na klawiaturze, aby przesunąć kursor w dół do przestrzeni między "fi" a "exit 0" (Rysunek 4A).
    3. Dodaj następujący tekst, jak pokazano w Rysunek 4B, zapisując każdy ciąg tekstu w nowym wierszu:
      sudo i2cset -y 1 0x70 0x00 0xa5 &
      sudo i2cset -y 1 0x70 0x09 0x0f &
      sudo i2cset -y 1 0x70 0x01 0x32 &
      sudo i2cset -y 1 0x70 0x03 0x32 &
      sudo i2cset -y 1 0x70 0x06 0x32 &
      sudo i2cset -y 1 0x70 0x08 0x32 &
      sudo python /home/pi/Pi_video_camera_Clemensson_2019.py &
    4. Zapisz zmiany, naciskając Ctrl + x, a następnie y i Enter.
  12. ze sobą niezbędne komponenty, jak wskazano w Rysunek 5A i jak opisano poniżej.
    1. W przypadku dwóch kolorowych diod LED podłącz rezystor i żeński połączeniowy do jednej nogi, a żeński połączeniowy do drugiej (Rysunek 5A). Staraj się, aby były jak najkrótsze. Zwróć uwagę, która z elektrod diody LED jest ujemna (zwykle krótka), ponieważ musi być ona podłączona do masy na pinach wejścia/wyjścia ogólnego przeznaczenia (GPIO) mikrokomputera.
    2. W przypadku dwóch przełączników przyciskowych podłącz żeński rozruchowy do każdej nogi (Rysunek 5A). Spraw, aby były długie dla jednego z przełączników i krótkie dla drugiego.
    3. Aby zmontować moduł IR LED, postępuj zgodnie z instrukcjami dostępnymi w jego oficjalnych zasobach internetowych19.
    4. Przykryj lutowane połączenia rurkami termokurczliwymi, aby ograniczyć ryzyko zwarcia elementów.
  13. Wyłącz mikrokomputer i podłącz przełączniki i diody LED do jego pinów GPIO, jak pokazano w Rysunek 5B i opisano poniżej.
    UWAGA: Podłączenie komponentów do niewłaściwych pinów GPIO może spowodować ich uszkodzenie i/lub mikrokomputera, gdy kamera jest włączona.
    1. Podłącz jedną diodę LED tak, aby jej ujemny koniec łączył się z pinem #14, a jego dodatni koniec łączył się z pinem #12. Ta dioda LED zaświeci się, gdy mikrokomputer zostanie uruchomiony, a kamera będzie gotowa do użycia.
    2. Podłącz przełącznik przyciskowy za pomocą długich, tak aby jeden łączył się z pinem #9, a drugi z pinem #11. Ten przycisk służy do rozpoczynania i zatrzymywania nagrywania wideo.
      UWAGA: Skrypt sterujący kamerą został napisany w taki sposób, że ten przycisk nie odpowiada przez kilka sekund zaraz po rozpoczęciu lub zatrzymaniu nagrywania wideo.
    3. Podłącz jedną diodę LED tak, aby jej ujemny koniec łączył się z pinem #20, a jego dodatni koniec łączył się z pinem #13. Ta dioda LED będzie świecić, gdy kamera nagrywa wideo.
    4. Połącz przełącznik przyciskowy z krótkimi tak, aby jeden łączył się z pinem #37, a drugi z pinem #39. Ten przełącznik służy do wyłączania aparatu.
    5. Podłącz moduł IR LED zgodnie z opisem w jego oficjalnych zasobach internetowych19.

2. Projektowanie interesującego protokołu warunkowania instrumentalnego

UWAGA: Aby używać DeepLabCut do śledzenia postępu protokołu w filmach nagranych z komór operacyjnych, protokoły behawioralne muszą być skonstruowane w określony sposób, jak wyjaśniono poniżej.

  1. Ustaw protokół tak, aby używał światła w pomieszczeniu komory lub innego silnego sygnału świetlnego jako wskaźnika określonego kroku w protokole (takiego jak rozpoczęcie poszczególnych prób lub sesji testowej) (Rysunek 6A). Sygnał ten będzie określany jako "wskaźnik kroku protokołu" w pozostałej części tego protokołu. Obecność tego sygnału pozwoli na śledzenie postępu protokołu w nagranych filmach.
  2. Ustaw protokół tak, aby rejestrował wszystkie interesujące odpowiedzi z indywidualnymi znacznikami czasu w odniesieniu do momentu, gdy wskaźnik kroku protokołu staje się aktywny.

3. Nagrywanie filmów ze zwierzętami wykonującymi test behawioralny będący przedmiotem zainteresowania

  1. Umieść kamerę na górze komór operacyjnych, tak aby rejestrowała widok z góry obszaru wewnątrz (Rysunek 7).
    UWAGA: Jest to szczególnie przydatne do uchwycenia ogólnej pozycji i postawy zwierzęcia w komorze. Unikaj umieszczania lampek kontrolnych kamery i modułu diody LED podczerwieni w pobliżu obiektywu kamery.
  2. Uruchom aparat, podłączając go do gniazdka elektrycznego za pomocą zasilającego.
    UWAGA: Przed pierwszym użyciem korzystne jest ustawienie ostrości aparatu za pomocą małego narzędzia dołączonego do modułu aparatu.
  3. Użyj przycisku podłączonego w kroku 1.13.2, aby rozpocząć i zatrzymać nagrywanie wideo.
  4. Wyłącz aparat, wykonując następujące czynności.
    1. Naciśnij i przytrzymaj przycisk podłączony w kroku 1.13.4, aż dioda LED podłączona w kroku 1.13.1 zgaśnie. Spowoduje to zainicjowanie procesu wyłączania kamery.
    2. Poczekaj, aż zielona dioda LED widoczna na górze mikrokomputera (Rysunek 1) przestanie migać.
    3. Odłącz zasilacz aparatu.
      UWAGA: Odłączenie zasilacza, gdy mikrokomputer jest nadal uruchomiony, może spowodować uszkodzenie danych na karcie micro SD.
  5. Podłącz kamerę do monitora, klawiatury, myszy i urządzenia pamięci masowej USB i pobierz pliki wideo z pulpitu.
    UWAGA: Nazwy plików są zgodne z datą i godziną rozpoczęcia nagrywania wideo. Jednak mikrokomputer nie ma wewnętrznego zegara i aktualizuje ustawienie czasu tylko wtedy, gdy jest podłączony do Internetu.
  6. Konwertuj nagrane filmy z .h264 na .MP4, ponieważ ten ostatni działa dobrze z DeepLabCut i większością odtwarzaczy multimedialnych.
    UWAGA: Można to osiągnąć na wiele sposobów. Jeden z nich jest opisany w pliku uzupełniającym 2.

4. Analizowanie filmów za pomocą DeepLabCut

UWAGA: DeepLabCut to pakiet oprogramowania, który pozwala użytkownikom zdefiniować dowolny obiekt zainteresowania w zestawie klatek wideo, a następnie użyć ich do trenowania sieci neuronowej w śledzeniu pozycji obiektów w pełnometrażowych filmach15,16. Ta sekcja zawiera ogólny zarys tego, jak używać DeepLabCut do śledzenia stanu wskaźnika kroku protokołu i pozycji głowy szczura. Instalacja i użytkowanie DeepLabCut jest dobrze opisane w innych opublikowanych protokołach15,16. Każdy krok można wykonać za pomocą określonych poleceń Pythona lub graficznego interfejsu użytkownika DeepLabCut, zgodnie z opisem w innym miejscu15,16.

  1. Utwórz i skonfiguruj nowy projekt DeepLabCut, wykonując czynności opisane w16.
  2. Użyj funkcji przechwytywania klatek DeepLabCut, aby wyodrębnić 700–900 klatek wideo z jednego lub więcej filmów nagranych w sekcji 3.
    UWAGA: Jeśli zwierzęta różnią się znacznie pigmentacją sierści lub innymi cechami wizualnymi, zaleca się, aby 700-900 wyodrębnionych klatek wideo zostało podzielonych na filmy z różnymi zwierzętami. Dzięki temu jedna wyszkolona sieć może być używana do śledzenia różnych osób.
    1. Upewnij się, że dołączono klatki wideo, które wyświetlają zarówno aktywny (Rysunek 8A), jak i nieaktywny (Rysunek 8B) stan wskaźnika kroku protokołu.
    2. Upewnij się, że dołączyłeś klatki wideo, które obejmują zakres różnych pozycji, postaw i ruchów głowy, które szczur może pokazać podczas testu. Powinno to obejmować klatki wideo, w których szczur stoi nieruchomo w różnych obszarach komory, z głową skierowaną w różnych kierunkach, a także klatki wideo, w których szczur aktywnie się porusza, wchodzi w otwory nosowe i wchodzi do koryta ze śrutem.
  3. Użyj zestawu narzędzi do etykietowania DeepLabCut, aby ręcznie zaznaczyć pozycję głowy szczura w każdej klatce wideo wyodrębnionej w kroku 4.2. Użyj kursora myszy, aby umieścić etykietę "głowa" w centralnej pozycji między uszami szczura (Rysunek 8A,B). Dodatkowo, zaznacz położenie światła w komorze (lub innego wskaźnika kroku protokołu) w każdej klatce wideo, w której aktywnie świeci (Rysunek 8A). Pozostaw światło w domu nieoznaczone w ramkach, w których jest nieaktywne (Rysunek 8B).
  4. Użyj funkcji "utwórz zestaw danych treningowych" i "trenuj sieć" DeepLabCut, aby utworzyć zestaw danych treningowych z klatek wideo oznaczonych w kroku 4.3 i rozpocząć trenowanie sieci neuronowej. Upewnij się, że wybrałeś "resnet_101" dla wybranego typu sieci.
  5. Zatrzymaj trenowanie sieci, gdy strata trenowania ustabilizuje się poniżej 0,01. Może to potrwać do 500 000 iteracji szkoleniowych.
    UWAGA: W przypadku korzystania z komputera z procesorem graficznym z około 8 GB pamięci i zestawem treningowym składającym się z około 900 klatek wideo (rozdzielczość: 1640 x 1232 pikseli) stwierdzono, że proces trenowania trwa około 72 godzin.
  6. Użyj funkcji analizy wideo DeepLabCut, aby przeanalizować filmy zebrane w kroku 3, korzystając z sieci neuronowej przeszkolonej w kroku 4.4. Spowoduje to wyświetlenie pliku .csv z listą śledzonych pozycji głowy szczura i wskaźnika kroku protokołu w każdej klatce wideo analizowanych filmów. Ponadto utworzy oznaczone pliki wideo, w których śledzone pozycje są wyświetlane wizualnie (filmy 1-8).
  7. Oceń dokładność śledzenia, wykonując czynności opisane poniżej.
    1. Skorzystaj z wbudowanej funkcji oceny DeepLabCut, aby uzyskać automatyczną ocenę dokładności śledzenia sieci. Jest to oparte na klatkach wideo, które zostały oznaczone etykietami w kroku 4.3 i opisuje, jak daleko od ręcznie umieszczonej etykiety znajduje się średnio pozycja śledzona przez sieć.
    2. Wybierz co najmniej jedną krótką sekwencję wideo (po około 100–200 klatek wideo każda) w oznaczonych filmach wideo uzyskanych w kroku 4.6. Przejrzyj sekwencje wideo, klatka po klatce i zanotuj, w ilu klatkach etykiety poprawnie wskazują pozycje głowy, ogona itp. szczura, a w ilu klatkach etykiety są umieszczone w błędnych pozycjach lub nie są pokazane.
      1. Jeśli etykieta części ciała lub obiektu jest często gubiona lub umieszczana w błędnym miejscu, zidentyfikuj sytuacje, w których śledzenie nie powiedzie się. Wyodrębnij i dodaj oznaczone klatki z tych okazji, powtarzając kroki 4.2. oraz 4.3. Następnie ponownie przetrenuj sieć i ponownie przeanalizuj filmy, powtarzając kroki 4.4-4.7. Ostatecznie powinna zostać osiągnięta dokładność śledzenia na poziomie >90%.

5. Uzyskiwanie współrzędnych dla punktów zainteresowania w komorach operacyjnych

  1. Użyj DeepLabCut, jak opisano w kroku 4.3, aby ręcznie zaznaczyć punkty zainteresowania w komorach operacyjnych (takie jak otwory w kształcie nosa, dźwignie itp.) w jednej klatce wideo (Rysunek 8C). Są one wybierane ręcznie w zależności od zainteresowań specyficznych dla badania, chociaż zawsze należy uwzględnić pozycję wskaźnika kroku protokołu.
  2. Pobierz współrzędne zaznaczonych punktów zainteresowania z pliku .csv, który DeepLabCut automatycznie zapisuje w folderze projektu w sekcji "dane oznaczone".

6. Identyfikacja segmentów wideo, w których aktywny jest wskaźnik kroku protokołu

  1. Załaduj pliki .csv uzyskane z analizy wideo DeepLabCut w kroku 4.6 do wybranego oprogramowania do zarządzania danymi.
    UWAGA: Ze względu na ilość i złożoność danych uzyskanych z DeepLabCut i systemów kondycjonowania instrumentalnego, zarządzanie danymi najlepiej odbywa się za pomocą zautomatyzowanych skryptów analitycznych. Aby rozpocząć, zapoznaj się z przewodnikami dla początkujących dostępnymi gdzie indziej20,21,22.
  2. Zwróć uwagę, w których segmentach wideo wskaźnik kroku protokołu jest śledzony w promieniu 60 pikseli od pozycji uzyskanej w sekcji 5. Będą to okresy, w których wskaźnik kroku protokołu jest aktywny (Rysunek 6B).
    UWAGA: W przypadku segmentów wideo, w których wskaźnik kroku protokołu nie świeci, oznaczone wideo może wydawać się wskazywać, że DeepLabCut nie śledzi go w żadnej pozycji. Jednak rzadko tak się dzieje, a zamiast tego jest zwykle śledzony w wielu rozproszonych lokalizacjach.
  3. Wyodrębnij dokładny punkt początkowy dla każdego okresu, w którym aktywny jest wskaźnik kroku protokołu (Rysunek 6C: 1).

7. Identyfikacja interesujących segmentów wideo

  1. Rozważ punkty, w których wskaźnik kroku protokołu staje się aktywny ( Rysunek 6C: 1) oraz znaczniki czasu odpowiedzi zarejestrowanych przez komory operacyjne (sekcja 2, Rysunek 6C: 2).
  2. Na podstawie tych informacji określisz, które segmenty filmu obejmują konkretne interesujące wydarzenia, takie jak interwały między badaniami, odpowiedzi, pobieranie nagród itp. (Rysunek 6C: 3, Rysunek 6D).
    UWAGA: W tym celu należy pamiętać, że opisana tutaj kamera nagrywa filmy z prędkością 30 kl./s.
  3. Zwróć uwagę na konkretne klatki wideo, które obejmują te interesujące wydarzenia.
  4. (Opcjonalnie) Edytuj pliki wideo z pełnymi sesjami testowymi, aby uwzględnić tylko określone segmenty, które Cię interesują.
    UWAGA: Można to osiągnąć na wiele sposobów. Jeden z nich jest opisany w pliku uzupełniającym 2 i 3. Jest to bardzo pomocne przy przechowywaniu dużej liczby filmów, a także może sprawić, że przeglądanie i prezentowanie wyników będzie wygodniejsze.

8. Analiza pozycji i ruchów zwierzęcia podczas określonych segmentów wideo

  1. Podziel na części pełne dane śledzenia pozycji głowy uzyskane z DeepLabCut w kroku 4.6, aby uwzględnić tylko segmenty wideo wymienione w sekcji 7.
  2. Oblicz położenie głowy zwierzęcia w stosunku do jednego lub więcej punktów odniesienia wybranych w sekcji 5 (Rysunek 8C). Umożliwia to porównywanie śledzenia i pozycji w różnych filmach.
  3. Przeprowadź odpowiednią dogłębną analizę pozycji i ruchów zwierzęcia.
    UWAGA: Przeprowadzona konkretna analiza będzie silnie specyficzna dla badania. Poniżej podano kilka przykładów parametrów, które można przeanalizować.
    1. Wizualizuj ślady ścieżek, wykreślając wszystkie współrzędne wykryte w wybranym okresie na jednym wykresie.
    2. Przeanalizuj odległość od danego punktu zainteresowania przy użyciu następującego wzoru:
      figure-protocol-1
    3. Analizuj zmiany prędkości podczas ruchu, obliczając odległość między śledzonymi współrzędnymi w kolejnych klatkach i dzieląc przez 1/fps kamery.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wydajność kamery wideo

Reprezentatywne wyniki zostały zebrane w komorach kondycjonowania instrumentalnego dla szczurów o powierzchniach podłogi 28,5 cm x 25,5 cm i wysokości 28,5 cm. Po zamontowaniu obiektywu typu rybie oko kamera rejestruje całą powierzchnię podłogi i duże części otaczających ścian, gdy jest umieszczona nad komorą (Rysunek 7A). W ten sposób można uzyskać dobry widok, nawet jeśli kamera jest umieszczona poza środkiem na górze komory. Powinn...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten opisuje, jak zbudować niedrogą i elastyczną kamerę wideo, która może być używana do nagrywania filmów z komór kondycjonowania instrumentalnego i innych konfiguracji testów behawioralnych. Dalej pokazano, jak używać DeepLabCut do śledzenia silnego sygnału świetlnego w tych filmach i jak można to wykorzystać, aby pomóc w identyfikacji krótkich interesujących segmentów wideo w plikach wideo, które obejmują pełne sesje testowe. Na koniec opisano, w jaki sposób wykorzystać śledzenie głowy szczura do uzupełnienia ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chociaż materiały i zasoby fundacji Raspberry Pi zostały wykorzystane i zacytowane w tym manuskrypcie, fundacja nie była aktywnie zaangażowana w przygotowanie lub wykorzystanie sprzętu i danych w tym manuskrypcie. To samo dotyczy Pi-Supply. Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prace te były wspierane przez granty ze Szwedzkiej Fundacji Mózgu, Szwedzkiej Fundacji Parkinsona oraz Szwedzkich Funduszy Rządowych na Badania Kliniczne (M.A.C.), a także fundacji Wenner-Gren (M.A.C, E.K.H.C), fundacji Åhlén (M.A.C) i fundacji Blanceflor Boncompagni Ludovisi, née Bildt (S.F).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Karta micro SD 32 Gb z fabrycznie zainstalowanym nowym oprogramowaniem Our Of Box (NOOBS)Rezystor Pi hut (https://thpihut.com)Rezystor 330 Ohm 32 GB
The Pi hut (https://thpihut.com)100287Ten artykuł dotyczy pakietu z rezystorami mieszanymi, w którym znajdują się rezystory 330-omowe.
Moduł kamery (kamera Raspberry Pi NoIR v.2)Chata Pi (https://thpihut.com)100004
taśmowy kamery (króciec kamery Raspberry Pi Zero)Chata Pi (https://thpihut.com)MMP-1294Jest to potrzebne tylko wtedy, gdy używany jest Raspberry Pi zero. Jeśli używana jest inna płytka Raspberry Pi, do elementu kamery dołączony jest odpowiedni taśmowy
do kamery Kolorowe diody LEDChata Pi (https://thpihut.com)ADA4203Ten artykuł dotyczy pakietu z mieszanymi kolorami diod LED. Można użyć dowolnego koloru.
połączeniowe żeńsko-żeńskieChata Pi (https://thpihut.com)Moduł LED IR ADA266
(Bright Pi)Zasilanie Pi (https://uk.pi-supply.com)PłytaPIS-0027
(płytka Raspberry Pi Zero z wlutowanymi złączami)Chata Pi (https://thpihut.com)102373Można również użyć innych płytek Raspberry Pi, chociaż metoda automatycznego uruchamiania skryptu Pythona działa tylko z Raspberry Pi zero. Jeśli używasz innych modeli, skrypt języka Python musi zostać uruchomiony ręcznie.
Przełącznik wciskanyChatka Pi (https://thpihut.com)ADA367
Raspberry PiChatka Pi (https://thpihut.com)102032
Obudowa Raspberry Pi ZeroChatka Pi (https://thpihut.com)102118
Raspberry Pi, Mod my pi, statyw do aparatu z magnetycznym obiektywem typu rybie oko i magnetycznym metalowym pierścieniemChatka Pi (https://thpihut.com)MMP-0310-ZESTAW
główna mikrokomputera zasilający

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pritchett, K., Mulder, G. B. Operant conditioning. Contemporary Topics in Laboratory Animal Science. 43 (4), (2004).
  2. Clemensson, E. K. H., Novati, A., Clemensson, L. E., Riess, O., Nguyen, H. P. The BACHD rat model of Huntington disease shows slowed learning in a Go/No-Go-like test of visual discrimination. Behavioural Brain Research. 359, 116-126 (2019).
  3. Asinof, S. K., Paine, T. A. The 5-choice serial reaction time task: a task of attention and impulse control for rodents. Journal of Visualized Experiments. (90), e51574(2014).
  4. Coulbourn instruments. Graphic State: Graphic State 4 user's manual. Coulbourn instruments. , Holliston, Massachusetts. 12-17 (2013).
  5. Med Associates Inc. Med-PC IV: Med-PC IV programmer's manual. Med Associates Inc. , St. Albans, Vermont. 21-44 (2006).
  6. Clemensson, E. K. H., Clemensson, L. E., Riess, O., Nguyen, H. P. The BACHD rat model of Huntingon disease shows signs of fronto-striatal dysfunction in two operant conditioning tests of short-term memory. PloS One. 12 (1), (2017).
  7. Herremans, A. H. J., Hijzen, T. H., Welborn, P. F. E., Olivier, B., Slangen, J. L. Effect of infusion of cholinergic drugs into the prefrontal cortex area on delayed matching to position performance in the rat. Brain Research. 711 (1-2), 102-111 (1996).
  8. Chudasama, Y., Muir, J. L. A behavioral analysis of the delayed non-matching to position task: the effects of scopolamine, lesions of the fornix and of the prelimbic region on mediating behaviours by rats. Psychopharmacology. 134 (1), 73-82 (1997).
  9. Talpos, J. C., McTighe, S. M., Dias, R., Saksida, L. M., Bussey, T. J. Trial-unique, delayed nonmatching-to-location (TUNL): A novel, highly hippocampus-dependent automated touchscreen test of location memory and pattern separation. Neurobiology of Learning and Memory. 94 (3), 341(2010).
  10. Rayburn-Reeves, R. M., Moore, M. K., Smith, T. E., Crafton, D. A., Marden, K. L. Spatial midsession reversal learning in rats: Effects of egocentric cue use and memory. Behavioural Processes. 152, 10-17 (2018).
  11. Gallo, A., Duchatelle, E., Elkhessaimi, A., Le Pape, G., Desportes, J. Topographic analysis of the rat's behavior in the Skinner box. Behavioural Processes. 33 (3), 318-328 (1995).
  12. Iversen, I. H. Response-initiated imaging of operant behavior using a digital camera. Journal of the Experimental Analysis of Behavior. 77 (3), 283-300 (2002).
  13. Med Associates Inc. Video monitor: Video monitor SOF-842 user's manual. Med Associates Inc. , St. Albans, Vermont. 26-30 (2004).
  14. Coulbourn Instruments. Coulbourn Instruments. , Available from: https://www.coulbourn.com/product_p/h39-16.htm (2020).
  15. Mathis, A., et al. DeepLabCut: markerless pose estimation of user-defined body parts with deep learning. Nature Neuroscience. 21 (9), 1281-1289 (2018).
  16. Nath, T., Mathis, A., Chen, A. C., Patel, A., Bethge, M., Mathis, M. W. Using DeepLabCut for 3D markerless pose estimation across species and behaviors. Nature Protocols. 14 (7), 2152-2176 (2019).
  17. Bari, A., Dalley, J. W., Robbins, T. W. The application of the 5-chopice serial reaction time task for the assessment of visual attentional processes and impulse control in rats. Nature Protocols. 3 (5), 759-767 (2008).
  18. Raspberry Pi foundation. Raspberry Pi foundation. , Available from: https://thepi.io/how-to-install-raspbian-on-the-raspberry-pi/ (2020).
  19. Pi-supply. Pi-supply. , Available from: https://learn.pi-supply.com/make/bright-pi-quickstart-faq/ (2018).
  20. Python. Python. , Available from: https://wiki.python.org/moin/BeginnersGuide/NonProgrammers (2020).
  21. MathWorks. MathWorks. , Available from: https://mathworks.com/academia/highschool/ (2020).
  22. Cran.R-Project.org. Cran.R-Project.org. , Available from: https://cran.r-project.org/manuals.html (2020).
  23. Liu, Y., Tian, C., Huang, Y. Critical assessment of correction methods for fisheye lens distortion. The international archives of the photogrammetry, remote sensing and spatial information sciences. , (2016).
  24. Pereira, T. D., et al. Fast animal pose estimation using deep neural networks. Nature Methods. 16 (1), 117-125 (2019).
  25. Graving, J. M., et al. DeepPoseKit, a software toolkit for fast and robust animal pose estimation using deep learning. Elife. 8 (47994), (2019).
  26. Geuther, B. Q., et al. Robust mouse tracking in complex environments using neural networks. Communications Biology. 2 (124), (2019).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Operant Conditioning ChambersVideo Camera SetupDeepLabCut TrackingRat Head TrackingVideo Frame AnalysisInfrared IlluminationProtocol Step IndicatorNeural Network TrainingCSV File OutputBehavioral Test Analysis

Related Articles