Pozyskiwanie ludzkiego mikrogleju z tkanki mózgowej dorosłego człowieka

Podsumowanie

Ten protokół jest wydajną, opłacalną i solidną metodą izolowania pierwotnego mikrogleju od żywej, dorosłej, ludzkiej tkanki mózgowej. Wyizolowany pierwotny mikroglej ludzki może służyć jako narzędzie do badania procesów komórkowych w homeostazie i chorobie.

Streszczenie

Mikroglej to wrodzone komórki odpornościowe ośrodkowego układu nerwowego (OUN). Mikroglej odgrywa kluczową rolę podczas rozwoju, w utrzymaniu homeostazy oraz podczas infekcji lub urazu. Kilka niezależnych grup badawczych podkreśliło kluczową rolę, jaką mikroglej odgrywa w chorobach autoimmunologicznych, zespołach autozapalnych i nowotworach. Aktywacja mikrogleju w niektórych chorobach neurologicznych może bezpośrednio uczestniczyć w procesach patogennych. Pierwotny mikroglej jest potężnym narzędziem do zrozumienia odpowiedzi immunologicznych w mózgu, interakcji komórka-komórka i rozregulowanych fenotypów mikrogleju w chorobie. Pierwotne mikroglej naśladuje właściwości mikrogleju in vivo lepiej niż unieśmiertelnione linie komórkowe mikrogleju. Mikroglej u dorosłych ludzi wykazuje odmienne właściwości w porównaniu z mikroglejem ludzkiego płodu i gryzoni. Protokół ten zapewnia skuteczną metodę izolacji pierwotnego mikrogleju z mózgu dorosłego człowieka. Badanie tych mikrogleju może dostarczyć krytycznych informacji na temat interakcji komórka-komórka między mikroglejem a innymi populacjami komórkowymi rezydentnymi w OUN, w tym oligodendrocytami, neuronami i astrocytami. Ponadto mikroglej z różnych ludzkich mózgów może być hodowany w celu scharakteryzowania unikalnych odpowiedzi immunologicznych dla medycyny spersonalizowanej i niezliczonych zastosowań terapeutycznych.

Wprowadzenie

Ośrodkowy układ nerwowy (OUN) składa się ze złożonej sieci neuronów i komórek glejowych¹. Wśród komórek glejowych mikroglej funkcjonuje jako wrodzone komórki odpornościowe klasy CNS ^2,< sup class = "xref">3. Mikroglej jest odpowiedzialny za utrzymanie homeostazy w zdrowym OUN ⁴. Mikroglej odgrywa również ważną rolę w rozwoju neurologicznym, przycinając synapsy². Mikroglej ma kluczowe znaczenie dla patofizjologii kilku chorób neurologicznych, w tym między innymi; Choroba Alzheimera⁵, choroba Parkinsona⁶, udar^{7, stwardnienie} rozsiane⁸, urazowe uszkodzenie mózgu⁹, ból neuropatyczny¹⁰, uraz rdzenia kręgowego¹¹ oraz nowotwory mózgu, takie jak glejaki¹².

Badania związane z homeostazą i chorobami OUN wykorzystują mikroglej gryzoni ze względu na brak efektywnych kosztowo i czasowo protokołów izolacji pierwotnego mikrogleju u ludzi¹³. Mikroglej gryzoni przypomina pierwotny ludzki mikroglej pod względem ekspresji genów, takich jak Iba-1, PU.1, DAP12 i receptor M-CSF, i okazał się skuteczny w zrozumieniu zarówno normalnego, jak i chorego mózgu¹³. Co ciekawe, ekspresja kilku genów związanych z odpornością, takich jak TLR4, MHC II, Siglec-11 i Siglec-3, różni się między ludźmi i gryzoniami microglia¹³. Ekspresja kilku genów różni się również w ekspresji czasowej i w chorobach neurodegeneracyjnych u obu gatunków^14,15. Te znaczące różnice sprawiają, że ludzki mikroglej jest niezbędnym modelem do badania funkcji mikrogleju w homeostazie i chorobie. Pierwotny ludzki mikroglej może być również skutecznym narzędziem do przedklinicznych badań przesiewowych potencjalnych kandydatów na leki¹⁶. Wyżej wymienione powody podkreślają rosnące zapotrzebowanie na opłacalne protokoły izolacji pierwotnego ludzkiego mikrogleju.

Opracowaliśmy protokół izolacji pierwotnego ludzkiego mikrogleju z tkanki mózgowej dorosłego człowieka pobranej w wyniku okna chirurgicznego stworzonego do resekcji guza lub innych resekcji chirurgicznych. Metoda ta znacznie różni się od istniejących metod. Udało nam się wyizolować i wyhodować mikroglej po czasie tranzytu wynoszącym około 75 minut od miejsca pobrania tkanek do rozpoczęcia protokołu izolacji w laboratorium. Użyliśmy supernatantu komórek fibroblastów L929 do promowania wzrostu izolowanego mikrogleju. Metoda ta koncentruje się w szczególności na hodowli i rozwoju tylko pierwotnego mikrogleju. Otrzymana przygotowana kultura składa się w około 80% z mikrogleju. Podczas gdy inne protokoły zapewniają wzbogaconą hodowlę mikrogleju poprzez wirowanie w gradionym gradieniu gęstości, cytometrię przepływową i kulki magnetyczne, protokół jest szybkim, prostym, solidnym i opłacalnym sposobem hodowli pierwotnego ludzkiego mikrogleju^17,18,19,20. Możliwość wykorzystania chirurgicznie usuniętej żywej dorosłej tkanki mózgowej zamiast utrwalonych tkanek mózgowych ze zwłok dowodzi dodatkowej zalety tej metody w przeciwieństwie do istniejących procedur^18,21.

Protokół

Wszystkie tkanki zostały pobrane po uzyskaniu zgody etycznej od komisji etycznych instytutu Indyjskiego Instytutu Technologii Jodhpur i All India Institute of Medical Sciences (AIIMS) Jodhpur.

1.Pozyskiwanie i przetwarzanie tkanek (Dzień 0)

1. Zbierz tkankę do probówki o pojemności 50 ml zawierającej 10 ml lodowatego sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (aCSF) (2 mM CaCl₂∙2H₂O, 10 mM glukozy, 3 mM KCl, 26 mM NaHCO₃, 2,5 mM NaH₂PO₄, 1 mM MgCl₂∙6H₂O, 202 mM sacharozy)²⁰. Upewnij się, że probówka jest trzymana na lodzie, jeśli tkanka musi zostać przeniesiona w inne miejsce.
   UWAGA: Przygotuj płyn CSF w autoklawowanej wodzie destylowanej. Przefiltruj go za pomocą filtra strzykawkowego 0,22 μm w okapie laminarnym. Można go przechowywać przez 1 miesiąc w temperaturze 4 °C.
2. Ostrożnie przetrzyj probówkę zbiorczą 70% alkoholem i przenieś do aseptycznej komory przepływu laminarnego powietrza.
3. Ostrożnie wyrzucić aCSF i zważyć tkankę w stanie aseptycznym. Masa tkanki jest niezbędna do obliczenia objętości trypsyny-EDTA potrzebnej do kolejnych etapów.
4. Przechowywać chusteczkę w świeżym, ciepłym płynie CSF w temperaturze 37 °C przez 5 minut. Ten krok ma kluczowe znaczenie, aby uniknąć śmierci komórki.
5. Wyrzucić płyn CSF i raz przemyć tkankę 1x PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami) w temperaturze 37 °C. Upewnij się, że cała krew została zmyta za pomocą wielokrotnych płukań PBS (w razie potrzeby).
6. Inkubować tkankę w ciepłym PBS, w temperaturze 37 °C, przez 5 minut.
7. Ostrożnie wyrzucić PBS i przenieść tkankę na wysterylizowaną szalkę Petriego. PBS można usunąć za pomocą pipety. Zapobiegnie to utracie tkanki.
8. Tkankę pokroić w kostkę na małe (co najmniej 1 mm³) kawałki za pomocą sterylnego skalpela. Drobno pokrojona w kostkę tkanka zapewnia większą powierzchnię tkanki do dysocjacji tkanek przez trypsynę-EDTA, zapewniając wyższą wydajność.
9. Przenieś pokrojoną w kostkę tkankę do probówki o pojemności 50 ml zawierającej 10 ml/g tkanki 0,25% trypsyny-EDTA i wymieszaj, pipetując przez pipetę serologiczną o pojemności 10 ml. Dodaj 2 ml trypsyny/EDTA do szalki Petriego i dokładnie umyj płytkę za pomocą pipety. Dodaj tę trypsynę z powrotem do probówki sokoła. Minimalizuje to utratę tkanek i komórek podczas krojenia w kostkę.
10. Inkubować probówkę na wytrząsarce przez 30 minut w temperaturze 37 °C przy 250 obr./min. Ten krok zwiększa dysocjację komórek od tkanki.
11. Pod koniec inkubacji dodać 10 ml pożywki neutralizującej (50% DMEM/50% F12 z glutaminą, 1% penicyliny-streptomycyny, 10% FBS) w celu zneutralizowania trypsyny. Wymieszać pipetą serologiczną o pojemności 10 ml. Ilość dodanego podłoża neutralizującego powinna być równa ilości użytej trypsyny.
12. Odwirować probówkę o masie 2 000 x g w temperaturze 4 °C przez 10 minut.
13. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 ml pożywki hodowlanej (50% DMEM/50% F12 z glutaminą, 1% penicyliną-streptomycyną, 20% supernatantem L929, 10% FBS).
    UWAGA: Komórki L929 są hodowane w DMEM (DMEM z glutaminą, 1% penicyliną-streptomycyną, 10% FBS). W przypadku hodowli komórkowej należy postępować zgodnie z zalecaną przez ATCC metodą hodowli. Supernatant musi być pobrany z kolby hodowlanej, która zawiera co najmniej 75% zlewania się. Może być zbierany luzem i przechowywany w temperaturze -80 °C, aby zapobiec degradacji czynników wzrostu. Zaleca się dodawanie supernatantu L929 oddzielnie do kolb, zamiast dodawania do pożywki podstawowej.
14. Umieść komórki w kolbie T-25, odpowiedniej dla komórek przylegających, i dodaj 4 ml dodatkowej pożywki hodowlanej. Inkubować kolbę w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ . Ostrożnie wstrząsnąć kolbą, aby równomiernie rozproszyć tkankę. Unikać przykładania pożywki do szyjki kolby podczas potrząsania, ponieważ może to zwiększyć ryzyko zanieczyszczenia.

2.Hodowla komórkowa (Dzień 2)

1. Zebrać pożywkę z kolby hodowlanej T-25 przygotowanej w dniu 0 do trzech probówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml, zbierając równą objętość pożywki w każdej probówce. Umyć kolbę raz 1 x PBS. Delikatnie wstrząsnąć kolbą, aby usunąć wszelkie resztki pozostałych fragmentów tkanki. Unikać mocnego potrząsania kolbą, ponieważ wszelkie resztki nie wpłyną niekorzystnie na kulturę. Dodać 5 ml świeżej pożywki hodowlanej do kolby.
2. Odwirować zebrane pożywki przy 1,466 x g (4000 obr./min) w temperaturze 4 °C przez 4 minuty.
3. Odrzucić sklarowany osad z każdej probówki i dodać 1 ml pożywki hodowlanej do jednej z probówek. Dokładnie wymieszać pipetą. Szeregowo dodawaj zmieszane podłoże z komórkami do innych probówek. Dokładnie wymieszaj pipetą i połącz komórki w jednej probówce.
4. Umieść komórki w osobnej kolbie T-25, odpowiedniej dla komórek przylegających. Dodać 4 ml pożywki i inkubować kolbę w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ .

3.Hodowla komórkowa (Dzień 4)

1. Wyrzucić pożywkę z obu kolb i dodać do niej świeże 5 ml pożywki hodowlanej.
2. Inkubować kolbę w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ przez 2 dni.

4. Hodowla komórkowa (Dzień 6)

1. Komórki będą gotowe do dalszych eksperymentów.

Wyniki

Stosując powyższy protokół (Rysunek 1), udało nam się wyizolować pierwotne ludzkie mikrogleje z żywych, chirurgicznie usuniętych tkanek mózgu. Hodowane komórki barwiono lektyną Ricinus communis agglutinin-1 (RCA-1) w celu identyfikacji mikrogleju (kolor zielony) oraz białkiem kwaśnym włókienstwa gliałowego (GFAP) w celu identyfikacji astrocytów (kolor czerwony) (Rysunek 2), zgodnie z wcześniejszymi opisami

Dyskusja

Mikroglej zapewnia homeostazę w normalnym mózgu i odgrywa kluczową rolę w patofizjologii różnych chorób neurologicznych⁴. Mikroglej ma kluczowe znaczenie dla rozwoju neurologicznego i tworzenia synaps². Badania nad mikroglejem okazały się kluczowe w zrozumieniu rozwoju i progresji różnych chorób neurologicznych⁴. Mikroglej gryzoni jest najczęściej wybieranym modelem w pierwotnych badaniach mikrogleju, mimo że mikroglej gryzoni różni się od pierwotneg...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Roztwór antybiotykowo-przeciwgrzybiczy	Himedia	A002
Chlorek wapnia	Sigma	223506
Wirówka (4 ° C)	Sigma	146532
Probówki wirówkowe	Abdos	P10203
Inkubator CO2	Nowy Brunswik	Galaxy 170 S
D-Glucose	Himedia	GRM077
Pożywka DMEM z glutaminą	Himedia	AL007S
Płodowa surowica bydlęca	Himedia	RM9955
Tubka flakonowa (50 ml)	Thermo Fsiher Scientific	50CD1058
Fluoresceina Ricinus communis aglutynina-1	Vector	FL-1081
Mikroskop fluorescencyjny	Leica	DM2000LED
Fluoroshield z przeciwciałem DAPI	Sigma	F6057
GFAP	GA5	3670S
	Nowy Brunszwik Scientific	Innova 42
L929 linia komórkowa	ATCC	NCTC klon 929 [komórka L, L-929, pochodna szczepu L] (ATCC  CCL-1)
Laminarny przepływ powietrza	Thermo Fsiher Scientific	1386
Chlorek magnezu	Himedia	MB040
Fosforan monosodowy	Merck	567545
Mieszanka składników odżywczych F-12 Szynka Średnia	Himedia	Al106S
szalka Petriego	Duran Group	237554805
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem	Himedia	ML023
Chlorek	potasuHimedia	MB043
Pipeta serologiczna	Sprzęt laboratoryjny	LW-SP1010
Wodorowęglan sodu	Himedia	MB045
Sacharoza		Himedia MB025
Filtr strzykawkowy (0,2μ, średnica 25 mm)	Kolby do hodowli tkankowych Axiva	SFPV25R
T-25 odpowiednie do przylegających hodowli komórkowych.	Himedia	TCG4-20X10NO
Trypsyna-EDTA (0.25%)	Gibco	Numer katalogowy: 25200-056

Wytrząsarka do inkubatora