Ulepszona metoda UPLC-UV do oznaczania ilościowego witaminy C w odmianach sałaty (Lactuca sativa L.) i dzikich krewnych roślin uprawnych (Lactuca spp.)

Inés Medina-Lozano; Juan  Ramón Bertolín; Raquel Zufiaurre; Aurora Díaz

doi:10.3791/61440

Method Article

Ulepszona metoda UPLC-UV do oznaczania ilościowego witaminy C w odmianach sałaty (Lactuca sativa L.) i dzikich krewnych roślin uprawnych (Lactuca spp.)

DOI:

10.3791/61440

⸱

June 30th, 2020

Inés Medina-Lozano^*¹^,⁴ , Juan Ramón Bertolín^*²^,⁴ , Raquel Zufiaurre³ , Aurora Díaz¹^,⁴

¹Unidad de Hortofruticultura, Centro de Investigación y Tecnología Agroalimentaria de Aragón (CITA), ²Unidad de Producción y Sanidad Animal, Centro de Investigación y Tecnología Agroalimentaria de Aragón (CITA), ³Dpto Química Analítica, Escuela Politécnica Superior (Universidad de Zaragoza), ⁴Instituto Agroalimentario de Aragón - IA2 (CITA-Universidad de Zaragoza)

^* These authors contributed equally

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiamy szybką i niezawodną metodę ilościowego oznaczania witaminy C w Lactuca spp. za pomocą UPLC-UV, potencjalnie przenoszącą się na inne rośliny. Kluczowymi etapami są przygotowanie próbki i ekstrakcja witaminy C w stabilnych warunkach, redukcja kwasu dehydroaskorbinowego do kwasu askorbinowego oraz optymalizacja procedury chromatograficznej.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Witaminy, zwłaszcza witamina C, są ważnymi mikroelementami występującymi w owocach i warzywach. Witamina C jest również głównym czynnikiem przyczyniającym się do ich zdolności przeciwutleniającej. Sałata jest jednym z najpopularniejszych warzyw wśród konsumentów na całym świecie. Kluczowy jest dokładny protokół pomiaru zawartości witaminy C w sałacie i innych pokrewnych gatunkach. Opisano tutaj metodę wykorzystującą technikę ultra-wysokosprawnej chromatografii cieczowej w ultrafiolecie (UPLC-UV), w której zoptymalizowano warunki przygotowania próbki, ekstrakcji witaminowej i chromatografii.

Próbki zostały pobrane, aby reprezentować całą roślinę, zamrożone w temperaturze -80 °C i liofilizowane, aby zapobiec niepożądanemu utlenianiu i ułatwić manipulowanie nimi. Ekstrakcja witaminy C odbywała się w środowisku kwaśnym, co również przyczyniło się do jej stabilności. Ponieważ witamina C może występować w dwóch różnych wymiennych formach, kwasie askorbinowym (AA) i kwasie dehydroaskorbinowym (DHAA), oba związki powinny być mierzone w celu dokładnej oceny ilościowej. DHAA określono ilościowo pośrednio po jego redukcji do AA, ponieważ AA wykazuje wyższą absorpcję niż DHAA w zakresie UV widma. Z tego samego ekstraktu przeprowadzono dwa pomiary, jeden przed i jeden po tej reakcji redukcji. W pierwszym przypadku określaliśmy ilościowo zawartość AA, a w drugim określaliśmy ilościowo sumę AA i DHAA (TAA: całkowity kwas askorbinowy) w postaci AA. Następnie ilość DHAA uzyskano pośrednio poprzez odjęcie AA pochodzącego z pierwszego pomiaru od TAA. Zostały one określone za pomocą UPLC-UV, przy użyciu komercyjnego wzorca AA do zbudowania krzywej kalibracyjnej i optymalizacji procedury chromatograficznej, aby uzyskać piki AA, które zostały całkowicie rozwiązane w krótkim czasie. Protokół ten można łatwo ekstrapolować na dowolny inny materiał roślinny z niewielkimi lub żadnymi zmianami. Jego dokładność ujawniła statystycznie istotne różnice, których inaczej nie można by dostrzec. Inne mocne strony i ograniczenia zostały omówione bardziej szczegółowo w manuskrypcie.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sałata uprawna (Lactuca sativa L.) jest jednym z najczęściej produkowanych i spożywanych warzyw liściastych na świecie, z łączną produkcją około 27,3 miliona ton w 2018 roku¹. Sałata jest postrzegana przez konsumentów jako zdrowa. Właściwości odżywcze przypisuje się głównie źródłu związków przeciwutleniających w uprawie, takich jak m.in. witamina C, polifenole i witamina^E2. Witamina C jest niezbędnym mikroelementem dla ludzi, w przeciwieństwie do wielu innych kręgowców, ponieważ nie jesteśmy w stanie jej wyprodukować z powodu mutacji obecnych w genie kodującym enzym ostatniego kroku w szlaku biosyntezy³. Jest niezbędny do prawidłowego metabolizmu komórkowego, a także odgrywa ważną rolę w odpowiedziach immunologicznych, głównie ze względu na swoją aktywność przeciwutleniającą³^,⁴.

Całkowita witamina C składa się z kwasu askorbinowego (AA) i kwasu dehydroaskorbinowego (DHAA). AA jest najbardziej biologicznie aktywną formą witaminy, ale DHAA (produkt jej utleniania) również wykazuje aktywność biologiczną i może być łatwo przekształcony w AA w organizmie człowieka⁵. Dlatego określenie ilościowe obu form jest ważne dla określenia całkowitej zawartości witaminy C w każdej uprawie ogrodniczej, w tym sałaty.

Do pomiaru witaminy C w warzywach zastosowano szeroką gamę podejść opartych na różnych technikach analitycznych, takich jak metody enzymatyczne, spektrofotometryczne i miareczkowe⁶^,7^,⁸. Chociaż te metody są proste, nie są chemicznie specyficzne dla AA⁹. W związku z tym preferowane są metody chromatograficzne, zwłaszcza technika wysokosprawnej chromatografii cieczowej w ultrafiolecie (HPLC-UV), ze względu na ich wyższą dokładność¹⁰. HPLC-UV został wykorzystany do określenia witaminy C w wielu różnych uprawach, takich jak brokuły, szpinak i sałata¹¹^,¹²^,¹³. Jednak jednoczesna kwantyfikacja AA i DHAA jest skomplikowana ze względu na niską absorpcję DHAA w zakresie UV widma. Alternatywnie, DHAA można oznaczyć pośrednio za pomocą środka redukującego, który przekształca DHAA w AA, mierząc całkowity kwas askorbinowy (TAA), a następnie obliczając różnicę między TAA i AA. Ze względu na konieczność reakcji redukcji, w niektórych badaniach tylko AA zostało określone ilościowo¹⁴, co w rzeczywistości może oznaczać niedoszacowanie aktywności witaminy C. Ta dodatkowa reakcja redukcji jest również potrzebna do pośredniego oznaczenia DHAA, nawet jeśli stosuje się ostatni postęp w technikach chromatografii cieczowej, ultra-wysokosprawną chromatografię cieczową (UPLC). Ten etap korzysta również z zalet, które UPLC wykazuje w porównaniu z HPLC: wyższa wydajność i rozdzielczość, zwiększona czułość, krótszy czas analizy i niższe zużycie rozpuszczalnika¹⁵. W związku z tym technika UPLC-UV została wykorzystana do ilościowego określenia witaminy C w różnych uprawach¹⁶.

Ponadto, AA jest bardzo labilną cząsteczką; dlatego ważne jest opracowanie protokołu, który zapobiega jej degradacji podczas przechowywania sałaty i analizy witaminy C⁹. W tym kontekście, poniższy protokół oferuje szybką i lepszą ocenę ilościową zawartości witaminy C w sałacie za pomocą UPLC-UV, a także wydajną procedurę ekstrakcji. W niniejszym badaniu uwzględniono nie tylko elitarne odmiany, ale także tradycyjne rasy lokalne i niektórych dzikich krewnych ze względu na ich potencjalne zainteresowanie hodowlą roślin, w szczególności poprawą wartości odżywczej sałaty.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie materiału roślinnego

W probówkach polipropylenowych o pojemności 50 ml należy pobrać próbki z co najmniej dwóch liści na roślinę, jednego zewnętrznego (starszego) i jednego wewnętrznego (młodszego), aby dokładniej odwzorować całą roślinę. Zebrać co najmniej trzy kontrpróby biologiczne dla każdej próbki.
Natychmiast zamrozić je za pomocą ciekłego azotu i przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu użycia. Upewnij się, że ciekły azot nie dostanie się do rurek; W przeciwnym razie mogą eksplodować po usunięciu z powodu rozszerzania się gazu podczas parowania.
UWAGA: Rękawice i osłona twarzy są wymagane ze względu na potencjalne zagrożenia związane z używaniem ciekłego azotu.
Zdjąć nakrętki z probówek i umieścić je na tackach w komorze liofilizatora liofilizatora (Tabela Materiałów) zaprogramowanych w następujący sposób: -25 °C przez 72 h, -10 °C przez 10 h, 0 °C przez 10 h i 20 °C przez co najmniej 4 h. Podczas procesu liofilizacji utrzymywać stałą temperaturę skraplacza i próżnię na poziomie -80,2 °C i 112 mTorr, odpowiednio.
Gdy materiał jest całkowicie suchy (od 4 do 7 dni, w zależności od rośliny i stopnia zagęszczenia w rurze), należy przechowywać w temperaturze 4 °C, -20 °C lub -80 °C odpowiednio przez krótkie (dni do tygodni), średnie (miesiące) lub długie (lata) przechowywanie. Zaleca się włączenie worków zawierających kulki żelu krzemionkowego do probówek zawierających próbki.
Umieść liofilizowane próbki w probówkach polipropylenowych o pojemności 20 ml wraz z kulkami ze stali nierdzewnej o średnicy 10 mm i zmiel je za pomocą wielorurowego wirownika, wykorzystując intensywność i czas potrzebny do uzyskania drobnego pyłu.
UWAGA: Podczas całego procesu należy chronić próbki przed wystawieniem na bezpośrednie działanie światła.

2. Przygotowanie odczynnika i roztworu

Przygotować roztwór ekstrakcyjny rozpuszczalnika: 8% kwas octowy (v/v), 1% MPA (kwas metafosforowy) (w/v), 1 mM EDTA (kwas etylenodiaminotetraoctowy).
1. Obliczyć całkowitą objętość rozpuszczalnika potrzebną do przetworzenia całego zestawu próbek, biorąc pod uwagę, że do każdej z nich zostanie dodane 5 ml. Aby przygotować 1 l roztworu, dodać do kolby: 30 g MPA, 0,372 g odwodnionego EDTA, 80 ml kwasu octowego i 500 ml wody ultraczystej (odpowiednio skalować objętości i ilości). Uszczelnić otwór kolby folią z tworzywa sztucznego.
2. Po rozpuszczeniu za pomocą mieszadła magnetycznego użyj kolby miarowej, aby dokładnie odmierzyć 1 l, dodając niezbędną ultraczystą wodę.
Przygotować bufor reakcyjny redukujący (0,5 M Tris (2-amino-2-(hydroksymetylo)-1,3-propanodiol) pH 9,0) i roztwór redukujący (40 mM DTT (1,4-ditiotreitol) o 0,5 M Tris pH 9,0).
1. Obliczyć całkowitą objętość roztworu redukującego potrzebnego do przetworzenia całego zestawu próbek, biorąc pod uwagę, że do każdej z nich zostanie dodane 200 μl. Aby przygotować 100 ml buforu, dodać do zlewki: 6,055 g Tris i 90 ml ultraczystej wody (odpowiednio skalować objętości i ilości). Uszczelnij otwór zlewki folią z tworzywa sztucznego.
2. Po rozpuszczeniu za pomocą mieszadła magnetycznego dostosuj roztwór do pH 9,0, dodając 2 M HCl i użyj kolby miarowej, aby dokładnie odmierzyć 100 ml, dodając niezbędną ultraczystą wodę.
3. Aby przygotować 100 ml roztworu redukującego, dodać do zlewki: 0,629 g DTT (czystość: 98%) i 90 ml buforu (0,5 M Tris pH 9,0) wcześniej przygotowanego (2.2.1 do 2.2.2). Odpowiednio skaluj objętości i ilości. Uszczelnij otwór zlewki folią z tworzywa sztucznego.
4. Po rozpuszczeniu za pomocą mieszadła magnetycznego użyj kolby miarowej, aby dokładnie odmierzyć 100 ml, dodając niezbędną objętość buforu 0,5 M Tris pH 9,0,
  UWAGA: Roztwór redukujący jest bardzo niestabilny. Dlatego zdecydowanie zaleca się świeżo przygotowany roztwór.
Kwas siarkowy (0,4 M H₂_SO4)
1. Obliczyć całkowitą objętość 0,4 M kwasu siarkowego potrzebną do przetworzenia całego zestawu próbek, biorąc pod uwagę, że do każdej z nich zostanie dodane 200 μl. Aby przygotować 100 ml roztworu, dodać do zlewki: 80 ml ultraczystej wody, a następnie 2,22 ml H₂SO₄ (czystość: 96%, gęstość: 1,84 g ^mL-1). Użyj kolby miarowej, aby dokładnie odmierzyć 100 ml, dodając niezbędną ultraczystą wodę.
  UWAGA: Kwas siarkowy jest bardzo, dlatego należy się z nim obchodzić przy użyciu sprzętu ochronnego i pod maską. Ponadto kwas należy dodawać do wody ultraczystej, a nie wodę do kwasu, aby zmniejszyć opary i uniknąć wypadków.
Kwas solny (2 M HCl).
1. Aby przygotować 100 ml 2 M kwasu solnego, dodaj do zlewki: 80 ml ultraczystej wody, a następnie 6,13 ml HCl (czystość: 37%, gęstość: 1,19 g ^mL-1). Uszczelnij otwór zlewki folią z tworzywa sztucznego. Użyj kolby miarowej, aby dokładnie odmierzyć 100 ml, dodając niezbędną ultraczystą wodę. Odpowiednio skaluj woluminy.
  UWAGA: Kwas solny jest bardzo, dlatego należy się z nim obchodzić przy użyciu sprzętu ochronnego i pod maską. Ponadto kwas należy dodawać do wody ultraczystej, a nie wodę do kwasu, aby zmniejszyć opary i uniknąć wypadków.
Wzorzec AA (zapas i rozcieńczenia)
1. Odważyć dokładnie 10 mg wzorca AA (czystość: 99%) za pomocą wagi precyzyjnej i dodać 90 ml fazy ruchomej (woda ultraczysta o pH 2,0 z kwasem mrówkowym).
2. Po rozpuszczeniu za pomocą mieszadła magnetycznego użyj kolby miarowej, aby dokładnie odmierzyć 100 ml, dodając niezbędną objętość wody ultraczystej o pH 2,0 z kwasem mrówkowym.
  UWAGA: Chronić ten roztwór podstawowy przed wystawieniem na działanie światła.
3. Przygotować pięć rozcieńczeń z podstawowego roztworu wzorca AA w celu uzyskania krzywej kalibracyjnej zgodnie z instrukcjami w tabeli 1 i przejść do kroku 5.2.

szt. szt. Rozdział szt. szt. szt. szt. szt.

norma	[AA] (μg ^mL-1)	AA (100 μg ^mL-1) roztwór (μL)	Faza ^ruchoma (μl)a
1	0,5	5	995
cyfra arabska	Rozdział 2.5	25	975
3	5	50	950
4	10	100	900
5	25	Z kolei 250	750
^aUltraczysta woda o pH 2,0 zakwaszona kwasem mrówkowym.

Tabela 1: Protokół przygotowania pięciu wzorców AA (kwasu askorbinowego). Wskazane są objętości substancji rozpuszczonej i rozpuszczalnika do przygotowania każdego z różnych stężeń wzorców.

3. Ekstrakcja AA i DHAA

UWAGA: Zaleca się pracę w warunkach niskiego natężenia światła podczas etapów ekstrakcji.

Do probówki wirówkowej z polipropylenu o pojemności 15 ml dodać 50 mg liofilizowanej próbki mielonej i 5 ml rozpuszczalnika ekstrakcyjnego (krok 2.1).
Potrząsaj mieszaniną za pomocą wiru przez 5 s, a następnie wytrząsarki orbitalnej przez 10 minut przy 2000 obr./min.
Wprowadzić probówkę do kąpieli ultradźwiękowej na 10 minut w temperaturze pokojowej z aktywowanymi ultradźwiękami.
Wirować przy 4 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
Pobrać supernatant, przepuścić go przez filtr z regenerowanej celulozy 0,22 μm i przechowywać w bursztynowej fiolce o pojemności 5 ml. Jest to ekstrakt 1, który zawiera AA i DHAA.
UWAGA: Protokół można w tym miejscu wstrzymać, zamrażając ekstrakty w temperaturze -80 °C i chroniąc je przed ekspozycją na światło, ponieważ AA i DHAA są bardzo niestabilne i łatwo ulegają degradacji w obecności światła, w wysokich temperaturach lub w atmosferze utleniającej (plik uzupełniający 1).

4. Redukcja DHAA do AA w celu ekstrakcji TAA

Przenieść 200 μl ekstraktu 1 do bursztynowej fiolki o pojemności 2 ml do chromatografii cieczowej i dodać 200 μl roztworu redukującego (krok 2.2). Zamknąć fiolkę korkiem z PTFE-silikonu z wstępnym otwarciem i wstrząsać nią wirem przez 5 sekund.
Pozostawić roztwór na 30 minut w temperaturze pokojowej i chronić przed światłem.
Dodać 200 μl 0,4 M H₂SO₄ w celu zatrzymania reakcji i ustabilizowania AA w kwaśnym pH. Otrzymanym roztworem jest Ekstrakt 2, który zawiera tylko AA i jest w rzeczywistości TAA.

5. Determinacja

Przygotowanie UPLC-UV
1. Przygotować roztwory robocze opisane w Tabeli 2, odpowiednio przefiltrowane przez filtry 0,22 μm, sonikowane przez co najmniej 10 minut i umieścić je w systemie UPLC.
2. Włącz trzy moduły UPLC i poczekaj na zakończenie procesu kalibracji wewnętrznej.
3. Otwórz oprogramowanie (np. Empower 3) i załaduj program instrumentalny opisany w Tabeli 2: Empower 3 | Uruchamianie przykładów | Metoda witaminy C | UPLC_PDA | Korzystanie z przewodnika Szybki start.
4. Po załadowaniu oprogramowania odpowiednim programem uzyskaj dostęp do konsoli zarządzania UPLC: Czwartorzędowy menedżer rozpuszczalników | Kliknij prawym przyciskiem myszy | Uruchom konsolę.
5. Przejdź do przygotowania i stabilizacji instrumentu UPLC: System | Sterowanie | Uruchomienie.
  1. Oczyść wszystkie linie UPLC przez co najmniej 5 minut: Rozpuszczalniki Prime | Zarządzania jakością (QSM) | Sprawdź mycie A, B, C, D i uszczelki | Czas trwania > prime 5 min.
  2. Oczyść i wyczyść wtryskiwacz: Rozpuszczalniki główne | SM | Sprawdź rozpuszczalnik do mycia (> 45 s) i sprawdź rozpuszczalnik do czyszczenia (> 35 cyklach).
  3. Równowaga UPLC do warunków metody: Równowaga z metodą | Zarządzania jakością (QSM) | Przepływ (0,3 ml ^min-1) | Rozpuszczalnik A (2%) | Rozpuszczalnik B (0%) | Rozpuszczalnik C (98%) | Rozpuszczalnik D (0%); Równowaga z metodą | SM | Próbka (5 °C) | kolumny (30 °C) i równoważyć z metodą | Inne | Sprawdź, czy lampa jest włączona | Naciśnij przycisk Start.
  4. Odczekaj co najmniej 1 godzinę (zalecany jest jeszcze dłuższy czas), aż sprzęt się ustabilizuje. Stabilność można zweryfikować, sprawdzając ciśnienie w kolumnie w konsoli startowej: System | Kierownik ds. rozpuszczalników czwartorzędowych | Ciśnienie w układzie QSM. Upewnij się, że nie ma możliwych do zidentyfikowania trendów zmian ciśnienia (wzrostów lub spadków), a wartość delta jest mniejsza niż 10 psi.
6. Na ekranie Szybki start wypełnij matrycę nazwami wzorców i próbek, które mają być analizowane.
Oznaczenie AA w wzorcach
1. Przenieść 1 ml każdego z pięciu wcześniej przygotowanych wzorców AA (krok 2.5.3) do 2 ml bursztynowych fiolek do chromatografii cieczowej. Zamknąć fiolkę korkiem z PTFE-silikonu z wstępnym otwarciem i wstrzyknąć 5 μl do przyrządu UPLC.
2. Przeprowadzić chromatografię zgodnie z procedurą opisaną w tabeli 2, zaczynając od najbardziej rozcieńczonego do najbardziej skoncentrowanego.
Oznaczanie AA w próbkach
1. Odpipetować 200 μl ekstraktu 1 w bursztynowej fiolce o pojemności 2 ml do chromatografii cieczowej i dodać 800 μl ultraczystej wody. Zamknąć fiolkę korkiem z PTFE-silikonu z wstępnym otwarciem i wstrzyknąć 5 μl do przyrządu UPLC.
2. Przeprowadzić chromatografię zgodnie z procedurą opisaną w tabeli 2.
Oznaczanie TAA w próbkach
1. Dodaj 400 μl ultraczystej wody do ekstraktu 2. Zamknąć fiolkę korkiem z PTFE-silikonu z wstępnym otwarciem i wstrzyknąć 5 μl do przyrządu UPLC.
2. Przeprowadzić chromatografię zgodnie z procedurą opisaną w tabeli 2.

Komponenty i parametry	opis
instrument	Klasa H dla UPLC
detektor	PDA eλ Detektor λabs dla AA=245 nm
oprogramowanie	Wzmocnienie 3
kolumna	Uchwyt UPLC HSS T3 (150 mm x 2,1 mm x 1,8 μm)
Kanał A	CH₃OH
Kanał B/Wash	H₂O:CH₃OH (50:50 v:v)
Kanał C	Woda ultraczysta o pH 2,0 zakwaszona kwasem mrówkowym
Mycie kanału D/uszczelki	Ultraczysta woda:acetonitryl (90:10 v:v)
Faza ruchoma	0,3 ml ^min-1 2%A + 98%C (tryb izokratyczny)
Temperatura kolumny	30 °C
Temperatura automatycznego podajnika próbek	5 °C
Objętość wtrysku	5 μL
Czas przechowywania usługi AA	Czas trwania: 1,874 min
Czas trwania	Czas trwania: 3 min
^{a Nieokreślona}objętość kwasu mrówkowego używana do czasu dostosowania pH

Tabela 2: Procedura chromatograficzna zoptymalizowana do oznaczania AA (kwasu askorbinowego) w ekstraktach z sałaty i dzikich krewnych. Opis zastosowanych składników, warunków i rozwiązań.

6. Kwantyfikacja AA i DHAA

analiza statystyczna
1. Określić parametry analityczne metody chromatograficznej zgodnie z opisem Bertolína i wsp.¹⁸ (Tabela 3).
  UWAGA: Wartości parametrów przedstawionych w tabeli 3 będą musiały zostać określone w określonych warunkach doświadczalnych.

pkt. pkt.

Parametry analityczne metody	Wartości
Zakres liniowy (μg ^mL-1)	0,5-25
Równanie liniowe	y=53 143,03x
R²	0,99998
Granica wykrywalności (mg AA ^g-1 suchej masy)	0,013
Granica oznaczalności (mg AA ^g-1 suchej masy)	0,045
Powtarzalność (CV, %)^a	Pytanie 1,75
Precyzja pośrednia (CV, %)^a	Rozdział 4,22
Odzysk (Rec, %)^b	95,6±2,4
^aCV: współczynnik zmienności
^bTest odzysku przeprowadzono z 10 podwielokrotnościami zawierającymi 50 mg tej samej próbki, 5 wzbogaconymi 2 mg AA ^g-1 suchej masy i 5 niewzbogaconymi. %Rec=([AA]próbka wzbogacona-[AA]próbka)/([AA]wzbogacona)x100.

Tabela 3: Zoptymalizowane parametry analityczne do wykrywania i oznaczania ilościowego AA (kwas askorbinowy) i TAA (całkowity kwas askorbinowy). Zakres liniowy, równanie i współczynnik determinacji krzywej kalibracyjnej (R²), a także granice wykrywalności i kwantyfikacji AA (takie same dla TAA) oraz powtarzalność, precyzja pośrednia i odzysk uzyskano przy objętości wtrysku próbki wynoszącej 5 μl.

Obliczyć stężenie AA i TAA.
1. Otwieranie chromatogramu wzorcowego i chromatogramu próbki: Szybki start | Przeglądaj projekt | Kanały | "nazwa wzorca lub próbki" | PDA Ch1 245 nm@1,2 nm.
2. Zintegruj odpowiedni pik (AA lub TAA) w wzorcach i próbkach, klikając na jego punkt początkowy (około 1,790 min) i przeciągając go myszą do punktu końcowego (około 1,910 min).
3. Zbudować krzywą kalibracyjną reprezentującą wartości absorbancji wyznaczone chromatograficznie (krok 5.2.) w stosunku do stężenia pięciu wzorców AA przygotowanych powyżej (Tabela 1).
4. Interpolować wartości absorbancji próbek oznaczone w krokach 5.3 i 5.4 i otrzymać odpowiednio stężenie AA i TAA według następującego wzoru:
  
  gdzie y jest zintegrowanym obszarem piku, x jest stężeniem AA lub TAA w ppm, a m i n są odpowiednio nachyleniem i punktem przecięcia z osią y uzyskanej linii regresji.
5. Do obliczenia stężenia DHAA należy zastosować następujący wzór:
  
  UWAGA: Aby uzyskać całkowite stężenia DHAA, AA i TAA w mg ^g-1 suchej masy, wartości uzyskane bezpośrednio interpolowane w krzywej kalibracyjnej należy pomnożyć przez całkowitą objętość ekstraktu i zastosowany współczynnik rozcieńczenia, a następnie podzielić przez masę próbki użytej do przeprowadzenia ekstrakcji.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kwantyfikacja witaminy C w matrycach Lactuca wymaga opracowania podejścia chromatograficznego, które może zapewnić wiarygodne wyniki. Rysunek 1A pokazuje chromatogram wynikający z niezoptymalizowanego protokołu (Plik uzupełniający 2), który przedstawia pik AA wraz z niezidentyfikowanym małym "ramieniem". Niemniej jednak, po poprawie warunków ekstrakcji i chromatografii, uzyskano rozdzielczy pik AA bez zakłóceń nieznanych związków (Rysunek 1B). Ponadto zastosowanie sprzętu UPLC-UV zamiast HPLC-UV pozwoliło nam skrócić czas retencji (RT) dla AA: 1,874 minuty w zoptymalizowanych chromatogramach w porównaniu z 2,980 minuty w chromatogramach niezoptymalizowanych (Rysunek 1), a także czasy trwania, odpowiednio 3 i 7 minut dla zoptymalizowanych i niezoptymalizowanych protokołów.

figure-results-1
Rysunek 1: Chromatogramy AA w tej samej próbce sałaty (odmiana handlowa 'Begoña'). (A) Chromatogram HPLC-UV wynikający z niezoptymalizowanego protokołu (warunki opisane w pliku uzupełniającym 2). (B) Chromatogram UPLC-UV otrzymany przy użyciu zoptymalizowanego protokołu (warunki opisane w Tabeli 2). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Zakłócenia w pikach AA, takie jak te obserwowane w Rysunek 1A, konsekwentnie powodowały niedoszacowanie zawartości witaminy C (AA, DHAA i TAA) (Rysunek 2) z powodu niewystarczającej separacji podczas procesu chromatograficznego, ponieważ nakładające się na siebie obszary pików były zintegrowane przez pionowy spadek w najgłębszym punkcie między nimi. To odchylenie jest szczególnie widoczne w przypadku dzikich krewnych roślin uprawnych, szczególnie w zawartości DHAA i TAA (Rysunek 2).

figure-results-2
Rysunek 2: Rozkład zawartości witaminy C. Podziel działki skrzypcowe o zawartości DHAA, AA i TAA (mg ^g-1 suchej masy) w komercyjnych i tradycyjnych odmianach sałaty oraz niektórych dzikich krewnych przy użyciu niezoptymalizowanych i zoptymalizowanych protokołów. Czarne linie pokazują wartości średnie. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Ponadto, użycie niezoptymalizowanego protokołu uniemożliwiło nam wyciągnięcie jakichkolwiek użytecznych wniosków z wyników, ponieważ pokazały one, że wszystkie próbki, zarówno sałaty, jak i dzikich krewnych, mają podobną zawartość witaminy C. Natomiast zoptymalizowany protokół pozwolił nam wykryć statystycznie istotne różnice między nimi pod względem zawartości DHAA i TAA (Tabela 4), z których najbogatsze to gatunki dzikie (Rysunek 2).

pkt. TGL pkt. jedn. T pkt. pkt.

	Niezoptymalizowany		Zoptymalizowany
	Współczynnik przenikania	Wartość p	Współczynnik przenikania	Wartość p
Wirus DHAA (wirus DHA	0,460	0,637^ns	5,613	0,009**
Aa	0,070	0,932^ns	1,020	0,374^ns
TAA (Międzynarodowa Agencja	0,015	0,985^ns	4,438	0,022*
^ns, * i ** oznaczają nieistotne i istotne odpowiednio przy p<0,05 i 0,01.

Tabela 4: Różnice w zawartości witaminy C. Współczynniki F (ilorazy dwóch wariancji, wariancji międzygrupowej i wariancji wewnątrzgrupowej) oraz wartości istotności z jednoczynnikowej ANOVA z uwzględnieniem rodzaju Lactuca (komercyjne odmiany sałaty, tradycyjne odmiany sałaty i krewni dzikich roślin uprawnych) dla zawartości DHAA, AA i TAA w niezoptymalizowanych i zoptymalizowanych protokołach.

Plik uzupełniający 1: Stabilność AA i TAA w temperaturze 5 °C przez 24 godziny. (A) obszary pików AA i TAA przez 24 godziny. (B) Zawartość AA i TAA (mg ^g-1 suchej masy) przez 24 godziny. Słupki reprezentują odchylenia standardowe dwóch kontrprób technicznych (n=2) przechowywanych w autosamplerze w temperaturze 5 °C i chronionych przed ekspozycją na światło. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 2: Główne różnice między zoptymalizowanym i niezoptymalizowanym protokołem ekstrakcji i kwantyfikacji TAA, AA i DHAA. Użyte próbki były takie same w obu przypadkach. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Witamina C jest bardzo ważnym składnikiem odżywczym, ale jest również bardzo labilnym związkiem, więc jej kwantyfikacja UPLC-UV zależy od wielu czynników, takich jak przechowywanie i przygotowanie próbki, metoda ekstrakcji i warunki chromatograficzne. Dlatego potrzebna była szybka i prosta procedura, aby zapobiec utlenianiu AA (o mocy przeciwutleniającej) do DHAA (bez właściwości przeciwutleniających). Kluczowe było również unikanie warunków wysokiego pH i temperatury, a także intensywnego światła i atmosfery utleniającej podczas obróbki próbki, aby zwiększyć stabilność związku.

Aby zminimalizować utlenianie AA, podjęto następujące środki. Przede wszystkim próbki zostały zliofilizowane jako materiał wyjściowy dla obu protokołów, aby zapewnić dokładne określenie ilościowe zawartości witaminy C i łatwo manipulować próbkami. Ta opcja była preferowana w stosunku do drobnego mielenia, powszechnie spotykanego w literaturze¹⁹, ponieważ pył bardzo szybko topnieje, więc woda staje się ponownie dostępna. Podczas procedury ekstrakcji większą objętość bardziej kwaśnego roztworu (8% kwasu octowego i 1% MPA) użyto jako ekstrahentu w zoptymalizowanym protokole (Plik uzupełniający 2), który działał również jako stabilizator, zapobiegając degradacji AA. Roztwór ten zawierał również EDTA jako czynnik chelatujący w celu zwiększenia stabilizacji¹⁶, w przeciwieństwie do ekstrahentu w niezoptymalizowanym protokole (plik uzupełniający 2). Ponadto sprawdziliśmy, czy procedurę ekstrakcji można ulepszyć, stosując dwie kolejne ekstrakcje z 2,5 ml ekstrahentu zamiast jednej z 5 ml i w atmosferze_N2 zamiast standardowych warunków atmosferycznych. Najlepsze wyniki osiągnięto przy użyciu tylko jednej ekstrakcji w niezmodyfikowanej atmosferze, co uprościło protokół poprzez wykonanie niepotrzebnych dodatkowych kroków (dane nie pokazane). Inne drobne zmiany zostały również wprowadzone w protokole w celu usprawnienia ekstrakcji (tj. sonikacji), uzyskania bardziej klarownego ekstraktu (dokładniejsza filtracja) i skrócenia czasu trwania protokołu (Plik uzupełniający 2). Jeśli chodzi o warunki chromatograficzne, walidację metody przeprowadzono zgodnie z raportem złożonym przed¹⁸ rokiem, co gwarantuje dobre parametry analityczne (tabela 3). Poza tym zastosowanie ultraczystej wody z kwasem mrówkowym (pH 2,0) i metanolem (98:2 v:v) o przepływie 0,3 ml ^min-1 , zamiast fosforanu monopotasowego 30 mM (pH 3,0) przy 1 ml ^min-1 jako fazy ruchomej (plik uzupełniający 2), zaowocowało ulepszoną metodą. Najważniejszym postępem było prawdopodobnie zastosowanie systemu UPLC zamiast HPLC, co pozwoliło nam na większą kontrolę warunków wpływających (takich jak temperatura) i spowodowało rozwiązanie pików AA bez zakłóceń przez nieznane związki, w krótszym czasie i przy mniejszym zużyciu ekstraktu (plik uzupełniający 2).

Niemniej jednak istnieją dwa główne ograniczenia tej metody. Pierwszą z nich jest to, że DHAA nie może być mierzony bezpośrednio za pomocą detektora UV ze względu na jego niską absorpcję w zakresie UV widma. Ważne jest, aby określić ilościowo zawartość DHAA, ponieważ wykazuje on pewną aktywność biologiczną i łatwo przekształca się w AA w organizmie człowieka⁵. W tym celu potrzebna jest dodatkowa reakcja mająca na celu redukcję DHAA do AA, wraz z drugim przebiegiem chromatograficznym w celu zmierzenia TAA, a następnie pośredniego oznaczenia DHAA poprzez odjęcie zawartości AA od TAA (ryc. 3). W tym sensie etap redukcji został zoptymalizowany poprzez zastosowanie wyższego stężenia środka redukującego (DTT), wydłużenie czasu reakcji z 5 do 30 minut i zatrzymanie reakcji kwasem siarkowym (Plik uzupełniający 2). Drugim ograniczeniem metody jest niska stabilność AA. Ponieważ AA zaczyna ulegać degradacji 4 godziny po ekstrakcji (plik uzupełniający 1), konieczne jest jego ilościowe określenie w tym przedziale czasu. Tak więc liczba próbek do ekstrakcji jest uwarunkowana procedurą chromatograficzną. Dlatego proponujemy zamrozić je na tym etapie tego protokołu, chociaż w takim przypadku nie wszystkie z nich można umieścić w autosamplerze UPLC w celu automatycznego pomiaru. Na szczęście obniżony RT dla AA pozwolił nam uzyskać chromatogramy 3 min, znacznie krótsze niż chromatogramy 7 min uzyskane przy użyciu HPLC (Supplemental File 2). W związku z tym zawartość witaminy C można było oznaczyć w dużej liczbie próbek w ciągu 4 godzin.

figure-discussion-1
Rycina 3: Przebieg oznaczania ilościowego witaminy C w sałacie i niektórych dzikich krewnych.
Schemat ideowy zoptymalizowanego protokołu przedstawiający dwie gałęzie do oznaczania tylko AA lub AA + DHAA (TAA). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Ponieważ witamina C jest niezbędnym składnikiem odżywczym dla ludzi i ze względu na swoje ważne korzyści zdrowotne, stała się przedmiotem wielu badań. W związku z tym został określony ilościowo w wielu różnych uprawach, w tym w sałacie, jednym z najczęściej spożywanych warzyw na świecie. Proste metody klasyczne zostały stopniowo zastąpione technikami chromatografii cieczowej, ponieważ są one bardziej specyficzne i dokładne¹⁰. Jednak ze względu na potrzebę dodatkowej reakcji w celu ilościowego określenia zarówno AA, jak i DHAA za pomocą HPLC, w niektórych badaniach na sałacie mierzono tylko AA¹⁴ lub tylko TAA¹¹ (bez ilościowego określania AA przed redukcją DHAA do AA). Co więcej, tylko kilku autorów określiło ilościowo AA i DHAA, pomimo udziału obu cząsteczek w aktywności przeciwutleniającej witaminy C². Niemniej jednak technika UPLC stała się w ostatnim czasie ważniejsza ze względu na jej wyższą wydajność przy pomiarze witaminy C w kilku uprawach¹⁶. Porównując wyniki uzyskane w tym badaniu z dwiema metodologiami, UPLC i HPLC, te zalety zostały potwierdzone: dobrze zdefiniowane piki AA dzięki wyższej czułości i w bardzo krótkim czasie zostały osiągnięte, co oznacza również mniejsze zużycie zasobów. Pomimo skuteczności UPLC, tylko Chen i ^wsp.20 zastosowali tę technikę do pomiaru zawartości witaminy C w sałacie, co nadal prowadziło do niedoszacowania, ponieważ określono ilościowo tylko formę AA.

Podsumowując, praca ta stanowi pierwszą udaną próbę określenia całkowitej zawartości witaminy C nie tylko w różnych odmianach sałaty, ale także u niektórych ich dzikich krewnych. Kwantyfikacja witaminy C jest również niezbędna do selekcji sałat o wyższej aktywności przeciwutleniającej w ramach programów hodowlanych. W tym sensie zwiększona całkowita zawartość witaminy C w dzikich krewnych sałaty występujących tutaj i zwiększona zawartość AA odnotowana w poprzednich badaniach¹⁴, a także inne związki przeciwutleniające²¹, poszerza odpowiednich kandydatów do poprawy wartości odżywczej sałaty.

Podsumowując, nawet przy pewnych ograniczeniach związanych z naturą witaminy C, takich jak jej stopniowa degradacja kilka godzin po ekstrakcji lub potrzeba reakcji redukcji ze względu na niską absorpcję DHAA UV, oferuje ona mniej pracochłonną i mniej czasochłonną metodę pomiaru zawartości witaminy C. Dodatkowo jest również bardzo wytrzymały i wykazuje wysoką czułość i moc rozdzielczości. Co więcej, można ją łatwo przenieść nie tylko na inne materiały roślinne z niewielkimi zmianami lub bez zmian, ale także na produkty przetworzone, które dostarczają ludziom witaminę C w diecie, co daje początek szerokiemu zakresowi przyszłych zastosowań w powstającej dziedzinie testowania niezawodnej jakości żywności.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Bankowi Plazmy Zarodkowej Warzyw w Saragossie (BGHZ-CITA, Hiszpania) oraz Centrum Zasobów Genetycznych (CNG, Wageningen, Holandia) za dostarczenie nasion potrzebnych do tej pracy. Dziękujemy J. A. Aranjuelo, A. Castellanosowi i "laboratorio de valoración nutritiva" z CITA za wsparcie techniczne, a także D. L. Goodchildowi za recenzję języka angielskiego. Prace te zostały sfinansowane w ramach projektów RTA2017-00093-00-00 z Narodowego Instytutu Badań i Technologii Rolnictwa i Żywności (INIA) oraz LMP164_18 z rządu Aragonii; oraz w ramach Programu Operacyjnego FEDER Aragonia 2014-2020 i Europejskiego Funduszu Społecznego Unii Europejskiej [Grupos Consolidados A12-17R: "Grupo de investigación en fruticultura: caracterización, adaptación y mejora genéica" i A14-17R: "Sistemas agroganaderos alimentarios sostenibles" (SAGAS)]. Projekt I. M.L. otrzymał wsparcie w postaci umowy przeddoktorskiej na szkolenie lekarzy wydanej przez hiszpańskie Ministerstwo Nauki, Innowacji i Uniwersytetów (MCIU) oraz Hiszpańską Państwową Agencję Badawczą (AEI).

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number	Comments
1,4-ditiotreitol (DTT) ≥ 98% (Ellman′	Roche	10197777001
10 mm Φ kulka ze stali nierdzewnej	Euro Aznar Supplies S.L.
15 ml probówka polipropylenowa do wirówki	Deltalab	429946
2 ml HPLC bursztynowa fiolka	Agilent	5190-9063
2 ml strzykawka z igłą	Deltalab	JS2
20 ml probówki polipropylenowe	Deltalab	202840
2-amino-2-(hydroksymetylo)-1,3-propanodiol (TRIS) ≥ 99,9% (miareczkowanie)	Roche	10708976001
50 ml probówka polipropylenowa	Deltalab	429951
Kwas octowy (CH₃COOH) ≥ 99% czystości lodowcowej, ReagentPlus	Sigma-Aldrich	A6283
Acetonitryl, klasa HPLC o super gradiencie (99,9 +% CH3CN-0,2 i mikro; m przefiltrowany)	Chem-lab	CL00.0189
Kolumna Acquity UPLC HSS T3 (150 mm x 2,1 mm x 1,8 µ m)	Wody	186003540
Zlewka 1 l, 200 ml	Deltalab	191725, 191722
Fosforan dipotasowy (KH₂PO₄)	Panreac	766384	Tylko w niezoptymalizowanym protokole (Plik uzupełniający 2)
Kwas etylenodiaminotetraoctowy Sól disodowa (EDTA x 2H2O) Test 99-101%, odczynnik ACS	Panreac	131669
Fisherbrand Analog MultiTube Vortexer	Thermo Fisher Scientific	15549004
Kwas mrówkowy 98-100% do HPLC Liofilizator Liofilizator LiChropur	Supelco	5438040100
VirTis genesis 25EL	VirTis	na
Heidolph Multi Reax mikser	Heidolph	na
Heidolph Reax mikser górny	Heidolph	na
Hewlett Packard HPLC 1050 wyposażony w eλ Detektor	Hewlett Packard	na	Tylko w niezoptymalizowanym protokole (Plik uzupełniający 2)
Kwas solny (HCl) czystość 37%, odczynnik ACS	Sigma-Aldrich	320331
Kwas L-askorbinowy ≥ 99%, odczynnik ACS	Sigma-Aldrich	255564
Kwas metafosforowy (MPA) Odczynnik ACS, chipsy, 33,5-36,5%	Sigma-Aldrich	239275
Metanol ≥ 99,9% (klasa supergradientu HPLC)	ChemLab	CL00.0189.2500
Mikropipety 10-1000 μ L	Socorex	na
Nucleosil 120 C18 Kolumna Tracer (250 mm x 4 mm x 5 & mikro; m)	Merck (Sigma-Aldrich)	54919	Tylko w niezoptymalizowanym protokole (plik uzupełniający 2)
Nasadka PTFE-silikonowa z otworem	wstępnym Agilent	5190-9067
Wirówka z chłodzeniem Gyrozen 1248R	Gyrozen	na
Filtry z regenerowanej celulozy 0,22 i mikro; m (13 mm)	Agilent	1015190-5108
Filtry z regenerowanej celulozy 0,45-&mikro; m (13 mm)	Labbox	SFCA-145-100	Tylko w niezoptymalizowanym protokole (Plik uzupełniający 2)
Spektrofotometr Heλ iOS i wersja beta;	Thermo Scientific Corporation	na
Kwas siarkowy (H₂SO₄) czystość 95,0-98,0%, odczynnik ACS	Sigma-Aldrich	258105
Woda ultraczysta	WasserLab	na
Ultrasons H-D	Selecta	na
Kolby miarowe 1 L, 100 ml	DeltaLab	191489, 191486
Waters Acquity UPLC H-Class wyposażony w PDA eλ Detektor	Wody	na

20112100

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

FAOSTAT. Statistics of the Food and Agriculture Organization of the United Nations. FAOSTAT. , Available from: http://www.fao.org/faostat/en/#data/QC (2018).
Llorach, R., Martínez-Sánchez, A., Tomás-Barberán, F. A., Gil, M. I., Ferreres, F. Characterisation of polyphenols and antioxidant properties of five lettuce varieties and escarole. Food Chemistry. 108 (3), 1028-1038 (2008).
Carr, A. C., Frei, B. Toward a new recommended dietary allowance for vitamin C based on antioxidant and health effects in humans. American Journal of Clinical Nutrition. 69 (6), 1086-1107 (1999).
Carr, A. C., Vissers, M. C. M. Synthetic or food-derived vitamin C-Are they equally bioavailable. Nutrients. 5 (11), 4284-4304 (2013).
Lee, S. K., Kader, A. A. Preharvest and postharvest factors influencing vitamin C content of horticultural crops. Postharvest Biology and Technology. 20 (3), 207-220 (2000).
Shekhovtsova, T. N., Muginova, S. V., Luchinina, J. A., Galimova, A. Z. Enzymatic methods in food analysis: determination of ascorbic acid. Analytica Chimica Acta. 573-574, 125-132 (2006).
Zhan, L., et al. Light exposure during storage preserving soluble sugar and L-ascorbic acid content of minimally processed romaine lettuce (Lactuca sativa L.var. longifolia). Food Chemistry. 136 (1), 273-278 (2013).
Malejane, D. N., Tinyani, P., Soundy, P., Sultanbawa, Y., Sivakumar, D. Deficit irrigation improves phenolic content and antioxidant activity in leafy lettuce varieties. Food Science and Nutrition. 6 (2), 334-341 (2017).
Tarrago-Trani, M. T., Phillips, K. M., Cotty, M. Matrix-specific method validation for quantitative analysis of vitamin C in diverse foods. Journal of Food Composition and Analysis. 26 (1-2), 12-25 (2012).
Klimczak, I., Gliszczyńska-Świgło, A. Comparison of UPLC and HPLC methods for determination of vitamin C. Food Chemistry. 175, 100-105 (2015).
Złotek, U., Świeca, M., Jakubczyk, A. Effect of abiotic elicitation on main health-promoting compounds, antioxidant activity and commercial quality of butter lettuce (Lactuca sativa L.). Food Chemistry. 148, 253-260 (2014).
Koh, E., Charoenprasert, S., Mitchell, A. E. Effect of organic and conventional cropping systems on ascorbic acid, vitamin C, flavonoids, nitrate, and oxalate in 27 varieties of spinach (Spinacia oleracea L). Journal of Agricultural and Food Chemistry. 60 (12), 3144-3150 (2012).
Kałuzewicz, A., et al. The influence of short-term storage on the content of flavonoids and vitamin C in Broccoli. European Journal of Horticultural Science. 77 (3), 137-143 (2012).
van Treuren, R., van Eekelen, H. D. L. M., Wehrens, R., de Vos, R. C. H. Metabolite variation in the lettuce gene pool: towards healthier crop varieties and food. Metabolomics. 14 (11), 1-14 (2018).
Swartz, M. E. UPLC: An introduction and review. Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies. 28 (7), 1253-1263 (2005).
Spínola, V., Mendes, B., Câmara, J. S., Castilho, P. C. An improved and fast UHPLC-PDA methodology for determination of L-ascorbic and dehydroascorbic acids in fruits and vegetables. Evaluation of degradation rate during storage. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 403 (4), 1049-1058 (2012).
Ball, G. F. M. Water-soluble vitamin assays in human nutrition. , Springer. Boston, MA. (1994).
Bertolín, J. R., et al. Simultaneous determination of carotenoids, tocopherols, retinol and cholesterol in ovine lyophilised samples of milk, meat, and liver and in unprocessed/raw samples of fat. Food Chemistry. 257, 182-188 (2018).
Spínola, V., Llorent-Martínez, E. J., Castilho, P. C. Determination of vitamin C in foods: Current state of method validation. Journal of Chromatography A. 1369, 2-17 (2014).
Chen, Y., et al. radiation is beneficial for yield and quality of indoor cultivated lettuce. Frontiers in Plant Science. 10, 1-10 (2019).
Damerum, A., et al. Elucidating the genetic basis of antioxidant status in lettuce (Lactuca sativa). Horticulture Research. 2 (15055), 1-13 (2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Ulepszona metoda UPLC-UV do oznaczania ilościowego witaminy C w odmianach sałaty (Lactuca sativa L.) i dzikich krewnych roślin uprawnych (Lactuca spp.)

In This Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

References

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles