Artykuł metodologiczny

Ulepszona metoda UPLC-UV do oznaczania ilościowego witaminy C w odmianach sałaty (Lactuca sativa L.) i dzikich krewnych roślin uprawnych (Lactuca spp.)

15.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61440

⸱

30 czerwca 2020

 ,  ,  , 
1Unidad de Hortofruticultura, Centro de Investigación y Tecnología Agroalimentaria de Aragón (CITA), 2Unidad de Producción y Sanidad Animal, Centro de Investigación y Tecnología Agroalimentaria de Aragón (CITA), 3Dpto Química Analítica, Escuela Politécnica Superior (Universidad de Zaragoza), 4Instituto Agroalimentario de Aragón - IA2 (CITA-Universidad de Zaragoza)

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiamy szybką i niezawodną metodę ilościowego oznaczania witaminy C w Lactuca spp. za pomocą UPLC-UV, potencjalnie przenoszącą się na inne rośliny. Kluczowymi etapami są przygotowanie próbki i ekstrakcja witaminy C w stabilnych warunkach, redukcja kwasu dehydroaskorbinowego do kwasu askorbinowego oraz optymalizacja procedury chromatograficznej.

Streszczenie

Witaminy, zwłaszcza witamina C, są ważnymi mikroelementami występującymi w owocach i warzywach. Witamina C jest również głównym czynnikiem przyczyniającym się do ich zdolności przeciwutleniającej. Sałata jest jednym z najpopularniejszych warzyw wśród konsumentów na całym świecie. Kluczowy jest dokładny protokół pomiaru zawartości witaminy C w sałacie i innych pokrewnych gatunkach. Opisano tutaj metodę wykorzystującą technikę ultra-wysokosprawnej chromatografii cieczowej w ultrafiolecie (UPLC-UV), w której zoptymalizowano warunki przygotowania próbki, ekstrakcji witaminowej i chromatografii.

Próbki zostały pobrane, aby reprezentować całą roślinę, zamrożone w temperaturze -80 °C i liofilizowane, aby zapobiec niepożądanemu utlenianiu i ułatwić manipulowanie nimi. Ekstrakcja witaminy C odbywała się w środowisku kwaśnym, co również przyczyniło się do jej stabilności. Ponieważ witamina C może występować w dwóch różnych wymiennych formach, kwasie askorbinowym (AA) i kwasie dehydroaskorbinowym (DHAA), oba związki powinny być mierzone w celu dokładnej oceny ilościowej. DHAA określono ilościowo pośrednio po jego redukcji do AA, ponieważ AA wykazuje wyższą absorpcję niż DHAA w zakresie UV widma. Z tego samego ekstraktu przeprowadzono dwa pomiary, jeden przed i jeden po tej reakcji redukcji. W pierwszym przypadku określaliśmy ilościowo zawartość AA, a w drugim określaliśmy ilościowo sumę AA i DHAA (TAA: całkowity kwas askorbinowy) w postaci AA. Następnie ilość DHAA uzyskano pośrednio poprzez odjęcie AA pochodzącego z pierwszego pomiaru od TAA. Zostały one określone za pomocą UPLC-UV, przy użyciu komercyjnego wzorca AA do zbudowania krzywej kalibracyjnej i optymalizacji procedury chromatograficznej, aby uzyskać piki AA, które zostały całkowicie rozwiązane w krótkim czasie. Protokół ten można łatwo ekstrapolować na dowolny inny materiał roślinny z niewielkimi lub żadnymi zmianami. Jego dokładność ujawniła statystycznie istotne różnice, których inaczej nie można by dostrzec. Inne mocne strony i ograniczenia zostały omówione bardziej szczegółowo w manuskrypcie.

Wprowadzenie

Sałata uprawna (Lactuca sativa L.) jest jednym z najczęściej produkowanych i spożywanych warzyw liściastych na świecie, z łączną produkcją około 27,3 miliona ton w 2018 roku1. Sałata jest postrzegana przez konsumentów jako zdrowa. Właściwości odżywcze przypisuje się głównie źródłu związków przeciwutleniających w uprawie, takich jak m.in. witamina C, polifenole i witaminaE2. Witamina C jest niezbędnym mikroelementem dla ludzi, w przeciwieństwie do wielu innych kręgowców, ponieważ nie jesteśmy w stanie jej wyprodukować z powodu mutacji obecnych w genie kodującym enzym ostatniego kroku w szlaku biosyntezy3. Jest niezbędny do prawidłowego metabolizmu komórkowego, a także odgrywa ważną rolę w odpowiedziach immunologicznych, głównie ze względu na swoją aktywność przeciwutleniającą3,4.

Całkowita witamina C składa się z kwasu askorbinowego (AA) i kwasu dehydroaskorbinowego (DHAA). AA jest najbardziej biologicznie aktywną formą witaminy, ale DHAA (produkt jej utleniania) również wykazuje aktywność biologiczną i może być łatwo przekształcony w AA w organizmie człowieka5. Dlatego określenie ilościowe obu form jest ważne dla określenia całkowitej zawartości witaminy C w każdej uprawie ogrodniczej, w tym sałaty.

Do pomiaru witaminy C w warzywach zastosowano szeroką gamę podejść opartych na różnych technikach analitycznych, takich jak metody enzymatyczne, spektrofotometryczne i miareczkowe6,7,8. Chociaż te metody są proste, nie są chemicznie specyficzne dla AA9. W związku z tym preferowane są metody chromatograficzne, zwłaszcza technika wysokosprawnej chromatografii cieczowej w ultrafiolecie (HPLC-UV), ze względu na ich wyższą dokładność10. HPLC-UV został wykorzystany do określenia witaminy C w wielu różnych uprawach, takich jak brokuły, szpinak i sałata11,12,13. Jednak jednoczesna kwantyfikacja AA i DHAA jest skomplikowana ze względu na niską absorpcję DHAA w zakresie UV widma. Alternatywnie, DHAA można oznaczyć pośrednio za pomocą środka redukującego, który przekształca DHAA w AA, mierząc całkowity kwas askorbinowy (TAA), a następnie obliczając różnicę między TAA i AA. Ze względu na konieczność reakcji redukcji, w niektórych badaniach tylko AA zostało określone ilościowo14, co w rzeczywistości może oznaczać niedoszacowanie aktywności witaminy C. Ta dodatkowa reakcja redukcji jest również potrzebna do pośredniego oznaczenia DHAA, nawet jeśli stosuje się ostatni postęp w technikach chromatografii cieczowej, ultra-wysokosprawną chromatografię cieczową (UPLC). Ten etap korzysta również z zalet, które UPLC wykazuje w porównaniu z HPLC: wyższa wydajność i rozdzielczość, zwiększona czułość, krótszy czas analizy i niższe zużycie rozpuszczalnika15. W związku z tym technika UPLC-UV została wykorzystana do ilościowego określenia witaminy C w różnych uprawach16.

Ponadto, AA jest bardzo labilną cząsteczką; dlatego ważne jest opracowanie protokołu, który zapobiega jej degradacji podczas przechowywania sałaty i analizy witaminy C9. W tym kontekście, poniższy protokół oferuje szybką i lepszą ocenę ilościową zawartości witaminy C w sałacie za pomocą UPLC-UV, a także wydajną procedurę ekstrakcji. W niniejszym badaniu uwzględniono nie tylko elitarne odmiany, ale także tradycyjne rasy lokalne i niektórych dzikich krewnych ze względu na ich potencjalne zainteresowanie hodowlą roślin, w szczególności poprawą wartości odżywczej sałaty.

Protokół

1. Przygotowanie materiału roślinnego

  1. Pobierz próbki z co najmniej dwóch liści z każdej rośliny do probówek polipropylenowych o pojemności 50 mL, wybierając liść zewnętrzny (starszy) oraz wewnętrzny (młodszy), aby dokładniej reprezentować całą roślinę. Dla każdej próbki zgromadź co najmniej trzy replikaty biologiczne.
  2. Natychmiast zamroź je w ciekłym azocie i przechowuj w temperaturze -80 °C do momentu użycia. Upewnij się, że ciekły azot nie dostanie się do wnętrza probówek; w przeciwnym razie mogłyby one eksplodować podczas wyjmowania z powodu rozprężania gazu podczas odparowania.
    OSTROŻNIE: Ze względu na potencjalne zagrożenia związane z użyciem ciekłego azotu wymagane jest stosowanie rękawic i osłony twarzy.
  3. Zdejmij zakrętki z probówek i umieść je na tackach w komorze liofilizatora (Tabela materiałów) zaprogramowanego w następujący sposób: -25 °C przez 72 h, -10 °C przez 10 h, 0 °C przez 10 h oraz 20 °C przez co najmniej 4 h. Podczas procesu liofilizacji utrzymuj stałą temperaturę kondensatora i próżnię, odpowiednio na poziomie -80,2 °C i 112 mTorr.
  4. Gdy materiał będzie całkowicie wysuszony (po upływie od 4 do 7 dni, w zależności od rodzaju rośliny i stopnia zagęszczenia w probówce), przechowuj go w temperaturze 4 °C, -20 °C lub -80 °C odpowiednio dla krótkiego (dni do tygodni), średniego (miesiące) lub długiego (lata) okresu przechowywania. Zaleca się umieszczenie w probówkach z próbkami woreczków z żelem krzemionkowym.
  5. Umieść liofilizowane próbki w probówkach polipropylenowych o pojemności 20 mL wraz ze stalowymi kulkami o średnicy 10 mm i rozdrobnij je za pomocą wortexera wieloprobówkowego, stosując taką intensywność i czas, jakie są niezbędne do uzyskania drobnego proszku.
    UWAGA: Przez cały czas trwania procesu chronić próbki przed bezpośrednim działaniem światła.

2. Przygotowanie odczynników i roztworów

  1. Przygotuj roztwór do ekstrakcji rozpuszczalnikowej: 8% kwasu octowego (v/v), 1% MPA (kwasu metafosforowego) (w/v), 1 mM EDTA (kwasu etylenodiaminotetraoctowego).
    1. Oblicz całkowitą objętość rozpuszczalnika potrzebną do przetworzenia całego zestawu próbek, przyjmując, że do każdej z nich zostanie dodane 5 mL. Aby przygotować 1 L roztworu, dodaj do kolby: 30 g MPA, 0,372 g EDTA dehydratu, 80 mL kwasu octowego oraz 500 mL wody ultraczystej (odpowiednio skaluj objętości i ilości). Zamknij wylot kolby folią plastikową.
    2. Po rozpuszczeniu przy użyciu mieszadła magnetycznego, użyj kolby miarowej, aby precyzyjnie odmierzyć 1 L, dodając niezbędną ilość wody ultraczystej.
  2. Przygotuj bufor do reakcji redukcji (0,5 M Tris (2-amino-2-(hydroksymetylo)-1,3-propanodiol) pH 9,0) oraz roztwór redukujący (40 mM DTT (1,4-ditiotreitol) w 0,5 M Tris pH 9,0).
    1. Oblicz całkowitą objętość roztworu redukującego potrzebną do przetworzenia całego zestawu próbek, przyjmując, że do każdej z nich zostanie dodane 200 µL. Aby przygotować 100 mL buforu, dodaj do zlewki: 6,055 g Trisu i 90 mL wody ultraczystej (odpowiednio skaluj objętości i ilości). Zamknij wylot zlewki folią plastikową.
    2. Po rozpuszczeniu przy użyciu mieszadła magnetycznego, dostosuj pH roztworu do 9,0 poprzez dodanie 2 M HCl i użyj kolby miarowej, aby precyzyjnie odmierzyć 100 mL, dodając niezbędną ilość wody ultraczystej.
    3. Aby przygotować 100 mL roztworu redukującego, dodaj do zlewki: 0,629 g DTT (czystość: 98%) i 90 mL wcześniej przygotowanego buforu (0,5 M Tris pH 9,0) (punkty 2.2.1 do 2.2.2). Odpowiednio skaluj objętości i ilości. Zamknij wylot zlewki folią plastikową.
    4. Po rozpuszczeniu przy użyciu mieszadła magnetycznego, użyj kolby miarowej, aby precyzyjnie odmierzyć 100 mL, dodając niezbędną objętość buforu 0,5 M Tris pH 9,0.
      UWAGA: Roztwór redukujący jest bardzo niestabilny. Dlatego zdecydowanie zaleca się stosowanie świeżo przygotowanego roztworu.
  3. Kwas siarkowy (0,4 M H2SO4)
    1. Oblicz całkowitą objętość 0,4 M kwasu siarkowego potrzebną do przetworzenia całego zestawu próbek, przyjmując, że do każdej z nich zostanie dodane 200 µL. Aby przygotować 100 mL roztworu, dodaj do zlewki: 80 mL wody ultraczystej, a następnie 2,22 mL H2SO4 (czystość: 96%, gęstość: 1,84 g mL-1). Użyj kolby miarowej, aby precyzyjnie odmierzyć 100 mL, dodając niezbędną ilość wody ultraczystej.
      OSTRZEŻENIE: Kwas siarkowy jest silnie żrący, dlatego należy go obsługiwać przy użyciu środków ochrony osobistej i pod wyciągiem. Ponadto kwas należy dodawać do wody ultraczystej, a nie wodę do kwasu, aby zredukować wydzielanie oparów i uniknąć wypadków.
  4. Kwas solny (2 M HCl).
    1. Aby przygotować 100 mL 2 M kwasu solnego, dodaj do zlewki: 80 mL wody ultraczystej, a następnie 6,13 mL HCl (czystość: 37%, gęstość: 1,19 g mL-1). Zamknij wylot zlewki folią plastikową. Użyj kolby miarowej, aby precyzyjnie odmierzyć 100 mL, dodając niezbędną ilość wody ultraczystej. Odpowiednio skaluj objętości.
      OSTRZEŻENIE: Kwas solny jest silnie żrący, dlatego należy go obsługiwać przy użyciu środków ochrony osobistej i pod wyciągiem. Ponadto kwas należy dodawać do wody ultraczystej, a nie wodę do kwasu, aby zredukować wydzielanie oparów i uniknąć wypadków.
  5. Standard AA (roztwór zapasowy i rozcieńczenia)
    1. Odważ dokładnie 10 mg standardu AA (czystość: 99%) przy użyciu wagi precyzyjnej i dodaj 90 mL fazy ruchomej (woda ultraczysta pH 2,0 z kwasem mrawkowym).
    2. Po rozpuszczeniu przy użyciu mieszadła magnetycznego, użyj kolby miarowej, aby precyzyjnie odmierzyć 100 mL, dodając niezbędną objętość wody ultraczystej pH 2,0 z kwasem mrawkowym.
      UWAGA: Chronić ten roztwór zapasowy przed ekspozycją na światło.
    3. Przygotuj pięć rozcieńczeń z roztworu zapasowego standardu AA w celu uzyskania krzywej kalibracyjnej zgodnie z instrukcjami w Tabeli 1 i przejdź do kroku 5.2.
Standard[AA] (µg mL-1)Roztwór AA (100 µg mL-1) (µL)Faza ruchoma (µL)a
10.55995
22.525975
3550950
410100900
525250750
aWoda ultrapure pH 2.0 zakwaszona kwasem mrówkowym.

Tabela 1: Protokół przygotowania pięciu wzorców AA (kwasu askorbinowego). Podano objętości substancji rozpuszczonej i rozpuszczalnika niezbędne do przygotowania każdej z różnych stężeń wzorców.

3. Ekstrakcja AA i DHAA

UWAGA: Podczas etapów ekstrakcji zaleca się pracę w warunkach niskiego natężenia światła.

  1. Do polipropylenowej probówki wirówkowej o pojemności 15 mL dodać 50 mg liofilizowanej, zmielonej próbki oraz 5 mL rozpuszczalnika do ekstrakcji (krok 2.1).
  2. Wymieszać zawiesinę za pomocą vortexa przez 5 s, a następnie na wytrząsarce orbitalnej przez 10 min przy 2000 rpm.
  3. Umieścić probówkę w kąpieli ultradźwiękowej na 10 min w temperaturze pokojowej przy włączonych ultradźwiękach.
  4. Wirować przy 4,000 x g przez 10 min w temperaturze 4 °C.
  5. Ostrożnie zebrać nadsącz, przefiltrować go przez filtr z celulozy regenerowanej o rozmiarze porów 0.22 µm i przechowywać w bursztynowej fiolce o pojemności 5 mL. Jest to Ekstrakt 1, który zawiera AA oraz DHAA.
    UWAGA: Protokół można w tym miejscu przerwać, zamrażając ekstrakty w temperaturze -80 °C i chroniąc je przed światłem, ponieważ AA i DHAA są bardzo niestabilne i łatwo ulegają degradacji pod wpływem światła, wysokich temperatur lub w atmosferze utleniającej (Supplemental File 1).

4. Redukcja DHAA do AA w celu ekstrakcji TAA

  1. Przenieś 200 µL Ekstraktu 1 do 2 mL bursztynowej fiolki do chromatografii cieczowej i dodaj 200 µL roztworu redukującego (krok 2.2). Zamknij fiolkę korkiem PTFE-silikonowym z otworem wstępnym i wymieszaj za pomocą wortexa przez 5 s.
  2. Pozostaw roztwór na 30 min w temperaturze pokojowej, chroniąc go przed światłem.
  3. Dodaj 200 µL 0,4 M H2SO4, aby zatrzymać reakcję i ustabilizować AA w kwaśnym pH. Otrzymany roztwór to Ekstrakt 2, który zawiera wyłącznie AA i stanowi w rzeczywistości TAA.

5. Oznaczenie

  1. Przygotowanie UPLC-UV
    1. Przygotować roztwory robocze opisane w Tabeli 2, odpowiednio przefiltrować je przez filtry 0,22 µm, poddać sonikacji przez co najmniej 10 min i umieścić w systemie UPLC.
    2. Włączyć trzy moduły UPLC i poczekać na zakończenie wewnętrznego procesu kalibracji.
    3. Otworzyć oprogramowanie (np. Empower 3) i załadować program instrumentalny opisany w Tabeli 2: Empower 3 | Run Samples | Vitamin C method | UPLC_PDA | Use QuickStart.
    4. Po załadowaniu programu w oprogramowaniu przejść do konsoli zarządzania UPLC: Quaternary Solvent Manager | Kliknięcie prawym przyciskiem myszy | Launch Console.
    5. Przejść do przygotowania i stabilizacji instrumentu UPLC: System | Control | Startup.
      1. Przepłukać wszystkie linie UPLC przez co najmniej 5 min: Prime Solvents | QSM | Check A, B, C, D and Seal Wash | Duration of prime > 5 min.
      2. Przepłukać i oczyścić injektor: Prime Solvents | SM | Check Wash solvent (> 45 s) and Check Purge solvent (> 35 cycles).
      3. Równoważyć UPLC do warunków metody: Equilibrate to Method | QSM | Flow (0,3 mL min-1) | Solvent A (2%) | Solvent B (0%) | Solvent C (98%) | Solvent D (0%); Equilibrate to Method | SM | Sample (5 °C) | Column (30 °C) oraz Equilibrate to Method | Other | Check Lamp On | Press Start.
      4. Odczekać co najmniej 1 h (zaleca się dłuższy czas) do ustabilizowania się sprzętu. Stabilność można zweryfikować sprawdzając ciśnienie w kolumnie w Launch Console: System | Quaternary Solvent Manager | QSM System Pressure. Upewnić się, że nie występują żadne wyraźne trendy zmian ciśnienia (wzrosty lub spadki), a wartość delta jest mniejsza niż 10 psi.
    6. W ekranie QuickStart wypełnić macierz nazwami standardów i próbek do analizy.
  2. Oznaczanie AA w standardach
    1. Przenieść 1 mL każdego z pięciu wcześniej przygotowanych standardów AA (krok 2.5.3) do bursztynowych fiolek 2 mL do chromatografii cieczowej. Zamknąć fiolkę korkiem PTFE-silikonowym z otworem i wstrzyknąć 5 µL do instrumentu UPLC.
    2. Przeprowadzić chromatografię zgodnie z procedurą opisaną w Tabeli 2, zaczynając od najbardziej rozcieńczonego do najbardziej stężonego roztworu.
  3. Oznaczanie AA w próbkach
    1. Pipetować 200 µL Ekstraktu 1 do bursztynowej fiolki 2 mL do chromatografii cieczowej i dodać 800 µL wody ultrapure. Zamknąć fiolkę korkiem PTFE-silikonowym z otworem i wstrzyknąć 5 µL do instrumentu UPLC.
    2. Przeprowadzić chromatografię zgodnie z procedurą opisaną w Tabeli 2.
  4. Oznaczanie TAA w próbkach
    1. Dodać 400 µL wody ultrapure do Ekstraktu 2. Zamknąć fiolkę korkiem PTFE-silikonowym z otworem i wstrzyknąć 5 µL do instrumentu UPLC.
    2. Przeprowadzić chromatografię zgodnie z procedurą opisaną w Tabeli 2.
Komponenty i parametryOpis
InstrumentAcquity UPLC H-Class
DetektorDetektor PDA eλ λabs dla AA=245 nm
OprogramowanieEmpower 3
KolumnaAcquity UPLC HSS T3 (150 mm x 2,1 mm x 1.8 µm)
Kanał ACH3OH
Kanał B/PłukanieH2O:CH3OH (50:50 v:v)
Kanał CWoda ultra-czysta o pH 2,0 zakwaszona kwasem mrówkowyma
Kanał D/Płukanie uszczelkiWoda ultraczysta:acetonitryl (90:10 v:v)
Faza ruchoma0,3 ml/min-1 2% A + 98% C (tryb izokratyczny)
Temperatura kolumny30 °C
Temperatura autosamplera5 °C
Objętość iniekcji5 µL
czas retencji AA1,874 min
Czas trwania3 min
aNieokreślona objętość kwasu mrówkowego użyta do momentu regulacji pH

Tabela 2: Procedura chromatograficzna zoptymalizowana do oznaczania AA (kwasu askorbinowego) w ekstraktach z sałaty i jej dzikich krewnych. Opis zastosowanych komponentów, warunków i roztworów.

6. Oznaczanie ilościowe AA i DHAA

  1. Analiza statystyczna
    1. Wyznaczyć parametry analityczne metody chromatograficznej zgodnie z opisem Bertolín i wsp.18 (Tabela 3).
      UWAGA: Wartości parametrów przedstawione w Tabeli 3 będą wymagały zdefiniowania w konkretnych warunkach eksperymentalnych.
Parametry analityczne metodyWartości
Zakres liniowy (μg ml-1)0.5-25
Równanie liniowey=53 143,03x
R20.99998
Granica wykrywalności (mg AA g-1)-1 suchej masy)0.013
Granica oznaczalności (mg AA g-1)-1 suchej masy)0.045
Powtarzalność (CV, %)a1.75
Precyzja pośrednia (CV, %)a4.22
Odzysk (Rec, %)b95.6±2.4
aCV: współczynnik zmienności
bAnalizę odzysku przeprowadzono z wykorzystaniem 10 alikwotów zawierających po 50 mg tej samej próbki, z czego 5 wzbogacono 2 mg AA g-1 suchej masy oraz 5 próbek nieposiewanych. %Rec=([AA]próbka posiewana-[AA]próbka)/([AA]posiewana)x100.

Tabela 3: Zoptymalizowane parametry analityczne dla detekcji i oznaczania ilościowego AA (kwasu askorbinowego) i TAA (całkowitego kwasu askorbinowego). Zakres liniowy, równanie i współczynnik determinacji (R2) krzywej kalibracyjnej, a także granice detekcji i oznaczania AA (analogicznie dla TAA), a także powtarzalność, precyzja pośrednia i odzysk zostały wyznaczone przy objętości wtrysku próbki wynoszącej 5 μL.

  1. Oblicz stężenie AA oraz TAA.
    1. Otwórz chromatogramy wzorców i próbek: QuickStart | Browse Project | Channels | „nazwa wzorca lub próbki” | PDA Ch1 245 nm@1.2 nm.
    2. Zintegruj odpowiedni pik (AA lub TAA) we wzorcach i próbkach, klikając w jego punkt początkowy (około 1,790 min) i przeciągając myszą do punktu końcowego (około 1,910 min).
    3. Wykreśl krzywą kalibracyjną, nanosząc wartości absorbancji wyznaczone chromatograficznie (krok 5.2.) w funkcji stężeń pięciu przygotowanych wcześniej wzorców AA (Tabela 1).
    4. Interpoluj wartości absorbancji próbek wyznaczone w krokach 5.3 i 5.4, aby uzyskać odpowiednio stężenie AA i TAA, korzystając z następującego wzoru:
      Równanie liniowe y=mx+n; formuła matematyczna; schemat edukacyjny; algebra; koncepcja nachylenia i punktu przecięcia.
      gdzie y to zintegrowana powierzchnia piku, x to stężenie AA lub TAA w ppm, a m i n to odpowiednio nachylenie i punkt przecięcia z osią y uzyskanej linii regresji.
    5. Do obliczenia stężenia DHAA zastosuj następujący wzór:
      Równanie do wyznaczenia stężenia DHAA, [DHAA](µg/mL)= [TAA] − [AA], analiza chemiczna.
      UWAGA: Aby uzyskać całkowite stężenia DHAA, AA i TAA w mg g-1 suchej masy, wartości uzyskane bezpośrednio poprzez interpolację na krzywej kalibracyjnej należy pomnożyć przez całkowitą objętość ekstraktu oraz zastosowany czynnik rozcieńczenia, a następnie podzielić przez masę próbki użytej do ekstrakcji.

Wyniki

Oznaczenie ilościowe witaminy C w matrycach Lactuca wymaga opracowania podejścia chromatograficznego, które zapewni wiarygodne wyniki. Rysunek 1A przedstawia chromatogram uzyskany za pomocą niezoptymalizowanego protokołu (Plik uzupełniający 2), w którym widoczny jest pik AA wraz z niezidentyfikowanym niewielkim „ramieniem”. Niemniej jednak, po usprawnieniu warunków ekstrakcji i chromatografii, uzyskano rozdzielony pik AA bez interferencji nieznanych związków (Rysunek 1B). Ponadto zastosowanie sprzętu UPLC-UV zamiast HPLC-UV pozwoliło na skrócenie czasu retencji (RT) dla AA: 1,874 min w zoptymalizowanych chromatogramach w stosunku do 2,980 min w niezoptymalizowanych (Rysunek 1), a także czasu analizy, który wyniósł odpowiednio 3 i 7 minut dla protokołów zoptymalizowanego i niezoptymalizowanego.

Chromatogram HPLC i wykres absorpcji UV kwasu askorbinowego, pokazujący pik w czasie retencji.
Rysunek 1: Chromatogramy AA w tej samej próbce sałaty (odmiana handlowa ‘Begoña’).(A) Chromatogram HPLC-UV uzyskany przy użyciu niezoptymalizowanego protokołu (warunki opisane w Pliku uzupełniającym 2). (B) Chromatogram UPLC-UV uzyskany przy użyciu zoptymalizowanego protokołu (warunki opisane w Tabeli 2). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Interferencje w pikach AA, takie jak te zaobserwowane na Rysunku 1A, konsekwentnie prowadziły do niedoszacowania zawartości witaminy C (AA, DHAA i TAA) (Rysunek 2) z powodu niewystarczającego rozdzielenia podczas procesu chromatograficznego, ponieważ nakładające się obszary pików były integrowane poprzez pionowy spadek w najgłębszym punkcie między nimi. Odchylenie to jest szczególnie zauważalne w przypadku dzikich krewnych roślin uprawnych, zwłaszcza w odniesieniu do zawartości DHAA i TAA (Rysunek 2).

Wykres skrzypcowy analizujący zawartość witaminy C w odmianach szpinaku; wpływ protokołu na poziomy DHAA, AA i TAA.
Rycina 2: Rozkład zawartości witaminy C.Podzielone wykresy skrzypcowe zawartości DHAA, AA i TAA (mg g-1 suchej masy) w komercyjnych i tradycyjnych odmianach sałaty oraz u niektórych krewniaków dzikich z zastosowaniem protokołów nieoptymalizowanych i optymalizowanych. Czarne linie wskazują wartości średnie. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Co więcej, zastosowanie nieoptymalizowanego protokołu uniemożliwiło nam wyciągnięcie jakichkolwiek użytecznych wniosków z wyników, ponieważ wykazały one, że wszystkie próbki, zarówno oba typy sałat, jak i krewniakie dzikie, posiadają podobną zawartość witaminy C. W przeciwieństwie do tego, zoptymalizowany protokół pozwolił nam wykryć statystycznie istotne różnice między nimi w zawartości DHAA i TAA (Tabela 4), przy czym najwyższą zawartość odnotowano u gatunków dzikich (Rycina 2).

NieoptymalizowanyZoptymalizowany
stosunek Fpwartość pstosunek Fpwartość p
DHAA0.4600.637ns5.6130.009**
AA0.0700.932ns1.0200.374ns
TAA0.0150.985ns4.4380.022*
ns, * i ** oznaczają brak istotności oraz istotność na poziomie p

Tabela 4: Zmienność zawartości witaminy C. Stosunki F (ilorazy dwóch wariancji: wariancji międzygrupowej i wariancji wewnątrzgrupowej) oraz wartości istotności z jednoczynnikowej analizy ANOVA z uwzględnieniem typu Lactuca (komercyjne odmiany sałaty, tradycyjne odmiany sałaty oraz dzikie krewniacy uprawne) dla zawartości DHAA, AA i TAA w protokołach nieoptymalizowanych i optymalizowanych.

Plik uzupełniający 1: Stabilność AA i TAA w temperaturze 5 °C przez 24 h. (A) Powierzchnie pików AA i TAA w ciągu 24 h. (B) Zawartość AA i TAA (mg g-1 suchej masy) w ciągu 24 h. Słupki reprezentują odchylenia standardowe dwóch powtórzeń technicznych (n=2) przechowywanych w autopróbniku w temperaturze 5 °C i chronionych przed światłem. Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 2: Główne różnice między zoptymalizowanym a nieoptymalizowanym protokołem ekstrakcji i oznaczania ilościowego TAA, AA i DHAA. W obu przypadkach wykorzystano te same próbki. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Witamina C jest bardzo ważnym składnikiem odżywczym, ale jest również związkiem bardzo labilnym, dlatego jej oznaczanie metodą UPLC-UV zależy od wielu czynników, takich jak przechowywanie i przygotowanie próbki, metoda ekstrakcji oraz warunki chromatograficzne. W związku z tym konieczne było opracowanie szybkiej i prostej procedury zapobiegającej utlenianiu AA (wykazującej potencjał przeciwutleniający) do DHAA (pozbawionej właściwości przeciwutleniających). Kluczowe było również unikanie wysokiego pH i temperatury, a także intensywnego światła i utleniającej atmosfery podczas obróbki próbek, aby zwiększyć stabilność związku.

Aby zminimalizować utlenianie AA, podjęto następujące środki. Przede wszystkim próbki zostały liofilizowane jako materiał wyjściowy dla obu protokołów, aby zapewnić dokładne ilościowe oznaczenie zawartości witaminy C i ułatwić manipulację próbkami. Opcję tę preferowano nad drobne mielenie, powszechnie spotykane w literaturze19, ponieważ pył rozmraża się bardzo szybko, przez co woda ponownie staje się dostępna. Podczas procedury ekstrakcji, w protokole zoptymalizowanym (Supplemental File 2) jako ekstrahent zastosowano większą objętość bardziej kwasowego roztworu (8% kwasu octowego i 1% MPA), który pełnił również rolę stabilizatora, zapobiegając degradacji AA. Roztwór ten zawierał również EDTA jako czynnik chelatujący w celu zwiększenia stabilizacji16, w przeciwieństwie do ekstrahentu w protokole nieoptymalizowanym (Supplemental File 2). Ponadto przetestowano, czy procedurę ekstrakcji można usprawnić, stosując dwie następujące po sobie ekstrakcje z 2,5 mL ekstrahentu zamiast jednej z 5 mL oraz w atmosferze N2 zamiast w standardowych warunkach atmosferycznych. Najlepsze wyniki uzyskano, stosując tylko jedną ekstrakcję w niemodyfikowanej atmosferze, co uprościło protokół poprzez wyeliminowanie zbędnych dodatkowych kroków (dane nie pokazane). W protokole wprowadzono również inne niewielkie zmiany w celu usprawnienia ekstrakcji (np. sonikację), uzyskania klarowniejszego ekstraktu (drobniejsza filtracja) i skrócenia czasu trwania protokołu (Supplemental File 2). W odniesieniu do warunków chromatograficznych, walidacja metody została przeprowadzona zgodnie z wcześniejszymi doniesieniami18, co zagwarantowało dobre parametry analityczne (Table 3). Ponadto, zastosowanie wody ultrapure z kwasem mrówkowym (pH 2.0) i metanolem (98:2 v:v) przy przepływie 0,3 mL min-1, zamiast 30 mM fosforanu potasu (pH 3.0) przy 1 mL min-1 jako fazy ruchomej (Supplemental File 2), doprowadziło do udoskonalenia metody. Najważniejszym usprawnieniem było prawdopodobnie zastosowanie systemu UPLC zamiast HPLC, co pozwoliło na większą kontrolę nad warunkami wpływającymi na wynik (takimi jak temperatura) i skutkowało rozdzieleniem pików AA bez interferencji ze strony nieznanych związków, w krótszym czasie i przy zużyciu mniejszej objętości ekstraktu (Supplemental File 2).

Niemniej jednak, metoda ta posiada dwa główne ograniczenia. Pierwszym z nich jest fakt, że DHAA nie można zmierzyć bezpośrednio przy użyciu detektora UV ze względu na niską absorpcyjność w zakresie UV widma. Ilościowe oznaczenie zawartości DHAA jest istotne, ponieważ wykazuje ona określoną aktywność biologiczną i jest łatwo przekształcana w AA w organizmie człowieka5. W tym celu niezbędna jest dodatkowa reakcja redukcji DHAA do AA, wraz z drugim przebiegiem chromatograficznym w celu pomiaru TAA, a następnie pośredniego wyznaczenia DHAA poprzez odjęcie zawartości AA od TAA (Rycina 3). W tym kontekście etap redukcji zoptymalizowano poprzez zastosowanie wyższego stężenia czynnika redukującego (DTT), wydłużenie czasu reakcji z 5 do 30 min oraz zatrzymanie reakcji kwasem siarkowym (Plik uzupełniający 2). Drugim ograniczeniem metody jest niska stabilność AA. Ponieważ AA zaczyna ulegać degradacji 4 h po ekstrakcji (Plik uzupełniający 1), konieczne jest jej ilościowe oznaczenie w tym przedziale czasowym. Zatem liczba próbek do ekstrakcji jest uwarunkowana procedurą chromatograficzną. Dlatego w niniejszym protokole proponujemy ich zamrożenie na tym etapie, choć w takim przypadku nie wszystkie mogłyby zostać umieszczone w autosamplerze UPLC w celu automatycznego pomiaru. Na szczęście zredukowany RT dla AA pozwolił nam uzyskać chromatogramy 3-minutowe, znacznie krótsze niż 7-minutowe chromatogramy uzyskiwane przy użyciu HPLC (Plik uzupełniający 2). W związku z tym zawartość witaminy C mogła zostać określona w dużej liczbie próbek w oknie czasowym 4 h.

Schemat pomiaru TAA; ekstrakcja AA, DHAA, wyniki UPLC-UV, analiza danych, analiza witamin.
Rysunek 3: Schemat ilościowego oznaczania witaminy C w sałacie i niektórych jej dzikich krewniakach.
Schemat zoptymalizowanego protokołu przedstawiający dwie ścieżki oznaczania: wyłącznie AA lub AA + DHAA (TAA). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Ponieważ witamina C jest niezbędnym składnikiem odżywczym dla ludzi i ze względu na jej istotne korzyści zdrowotne, stała się ona obiektem wielu badań. W związku z tym określano jej ilość w bardzo wielu uprawach, w tym w sałacie, która jest jednym z najczęściej spożywanych warzyw na świecie. Proste metody klasyczne były stopniowo zastępowane technikami chromatografii cieczowej, ponieważ są one bardziej specyficzne i dokładne10. Jednakże, ze względu na konieczność przeprowadzenia dodatkowej reakcji w celu ilościowego oznaczenia zarówno AA, jak i DHAA za pomocą HPLC, w niektórych badaniach nad sałatą mierzono tylko AA14 lub tylko TAA11 (bez oznaczania AA przed redukcją DHAA do AA). Co więcej, tylko niewielu autorów określiło ilość AA i DHAA, pomimo udziału obu cząsteczek w aktywności przeciwutleniającej witaminy C2. Niemniej jednak technika UPLC zyskała w ostatnim czasie na znaczeniu ze względu na wyższą wydajność podczas pomiaru witaminy C w kilku uprawach16. Porównując wyniki uzyskane w niniejszym badaniu przy zastosowaniu dwóch metodologii, UPLC i HPLC, potwierdzono te zalety: osiągnięto dobrze zdefiniowane piki AA dzięki wyższej czułości i w bardzo krótkim czasie, co wiąże się również z mniejszym zużyciem zasobów. Pomimo wydajności UPLC, tylko Chen i wsp.20 zastosowali tę technikę do pomiaru zawartości witaminy C w sałacie, co nadal prowadziło do niedoszacowania, ponieważ określono ilość tylko formy AA.

Podsumowując, niniejsza praca stanowi pierwszą udaną próbę oznaczenia całkowitej zawartości witaminy C nie tylko w różnych odmianach sałaty, ale także w niektórych z jej dzikich krewniaków. Ilościowe oznaczenie witaminy C jest również niezbędne do wyboru odmian sałaty o wyższej aktywności antyoksydacyjnej w ramach programów hodowlanych. W związku z tym, stwierdzona w niniejszej pracy zwiększona całkowita zawartość witaminy C w dzikich krewniakach sałaty oraz zwiększona zawartość AA zgłoszona w poprzednich badaniach14, jak i innych związków antyoksydacyjnych21, poszerza grupę odpowiednich kandydatów do poprawy wartości odżywczej sałat.

Podsumowując, mimo pewnych ograniczeń wynikających z natury witaminy C, takich jak jej stopniowa degradacja kilka godzin po ekstrakcji czy konieczność przeprowadzenia reakcji redukcji ze względu na niską absorbancję UV DHAA, metoda ta stanowi mniej pracochłonny i szybszy sposób pomiaru zawartości witaminy C. Ponadto jest ona bardzo stabilna i wykazuje wysoką czułość oraz rozdzielczość. Co więcej, można ją łatwo przenieść nie tylko na inne materiały roślinne przy niewielkich zmianach lub bez nich, ale także na produkty przetworzone stanowiące źródło witaminy C w diecie człowieka, co otwiera szeroki zakres przyszłych zastosowań w rozwijającej się dziedzinie weryfikacji jakości żywności.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy Bankowi Plazmy Zarodkowej Warzyw w Saragossie (BGHZ-CITA, Hiszpania) oraz Centrum Zasobów Genetycznych (CNG, Wageningen, Holandia) za dostarczenie nasion potrzebnych do tej pracy. Dziękujemy J. A. Aranjuelo, A. Castellanosowi i "laboratorio de valoración nutritiva" z CITA za wsparcie techniczne, a także D. L. Goodchildowi za recenzję języka angielskiego. Prace te zostały sfinansowane w ramach projektów RTA2017-00093-00-00 z Narodowego Instytutu Badań i Technologii Rolnictwa i Żywności (INIA) oraz LMP164_18 z rządu Aragonii; oraz w ramach Programu Operacyjnego FEDER Aragonia 2014-2020 i Europejskiego Funduszu Społecznego Unii Europejskiej [Grupos Consolidados A12-17R: "Grupo de investigación en fruticultura: caracterización, adaptación y mejora genéica" i A14-17R: "Sistemas agroganaderos alimentarios sostenibles" (SAGAS)]. Projekt I. M.L. otrzymał wsparcie w postaci umowy przeddoktorskiej na szkolenie lekarzy wydanej przez hiszpańskie Ministerstwo Nauki, Innowacji i Uniwersytetów (MCIU) oraz Hiszpańską Państwową Agencję Badawczą (AEI).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1,4-ditiotreitol (DTT) ≥ 98% (Ellman′ Roche10197777001
10 mm Φ kulka ze stali nierdzewnejEuro Aznar Supplies S.L.
15 ml probówka polipropylenowa do wirówkiDeltalab429946
2 ml HPLC bursztynowa fiolkaAgilent5190-9063
2 ml strzykawka z igłąDeltalabJS2
20 ml probówki polipropylenoweDeltalab202840
2-amino-2-(hydroksymetylo)-1,3-propanodiol (TRIS) ≥ 99,9% (miareczkowanie)Roche10708976001
50 ml probówka polipropylenowaDeltalab429951
Kwas octowy (CH3COOH) ≥ 99% czystości lodowcowej, ReagentPlusSigma-AldrichA6283
Acetonitryl, klasa HPLC o super gradiencie (99,9 +% CH3CN-0,2 i mikro; m przefiltrowany)Chem-labCL00.0189
Kolumna Acquity UPLC HSS T3 (150 mm x 2,1 mm x 1,8 µ m)Wody186003540
Zlewka 1 l, 200 mlDeltalab191725, 191722
Fosforan dipotasowy (KH2PO4)Panreac766384Tylko w niezoptymalizowanym protokole (Plik uzupełniający 2)
Kwas etylenodiaminotetraoctowy Sól disodowa (EDTA x 2H2O) Test 99-101%, odczynnik ACSPanreac131669
Fisherbrand Analog MultiTube VortexerThermo Fisher Scientific15549004
Kwas mrówkowy 98-100% do HPLC Liofilizator Liofilizator LiChropurSupelco5438040100
VirTis genesis 25ELVirTisna
Heidolph Multi Reax mikserHeidolphna
Heidolph Reax mikser górnyHeidolphna
Hewlett Packard HPLC 1050 wyposażony w eλ DetektorHewlett PackardnaTylko w niezoptymalizowanym protokole (Plik uzupełniający 2)
Kwas solny (HCl) czystość 37%, odczynnik ACSSigma-Aldrich320331
Kwas L-askorbinowy ≥ 99%, odczynnik ACSSigma-Aldrich255564
Kwas metafosforowy (MPA) Odczynnik ACS, chipsy, 33,5-36,5%Sigma-Aldrich239275
Metanol ≥ 99,9% (klasa supergradientu HPLC)ChemLabCL00.0189.2500
Mikropipety 10-1000 μ LSocorexna
Nucleosil 120 C18 Kolumna Tracer (250 mm x 4 mm x 5 & mikro; m)Merck (Sigma-Aldrich)54919Tylko w niezoptymalizowanym protokole (plik uzupełniający 2)
Nasadka PTFE-silikonowa z otworemwstępnym Agilent5190-9067
Wirówka z chłodzeniem Gyrozen 1248RGyrozenna
Filtry z regenerowanej celulozy 0,22 i mikro; m (13 mm)Agilent1015190-5108
Filtry z regenerowanej celulozy 0,45-&mikro; m (13 mm)LabboxSFCA-145-100Tylko w niezoptymalizowanym protokole (Plik uzupełniający 2)
Spektrofotometr Heλ iOS i wersja beta;Thermo Scientific Corporationna
Kwas siarkowy (H2SO4) czystość 95,0-98,0%, odczynnik ACSSigma-Aldrich258105
Woda ultraczystaWasserLabna
Ultrasons H-DSelectana
Kolby miarowe 1 L, 100 mlDeltaLab191489, 191486
Waters Acquity UPLC H-Class wyposażony w PDA eλ DetektorWodyna
20112100

Bibliografia

  1. FAOSTAT. Statistics of the Food and Agriculture Organization of the United Nations. FAOSTAT. , Available from: http://www.fao.org/faostat/en/#data/QC (2018).
  2. Llorach, R., Martínez-Sánchez, A., Tomás-Barberán, F. A., Gil, M. I., Ferreres, F. Characterisation of polyphenols and antioxidant properties of five lettuce varieties and escarole. Food Chemistry. 108 (3), 1028-1038 (2008).
  3. Carr, A. C., Frei, B. Toward a new recommended dietary allowance for vitamin C based on antioxidant and health effects in humans. American Journal of Clinical Nutrition. 69 (6), 1086-1107 (1999).
  4. Carr, A. C., Vissers, M. C. M. Synthetic or food-derived vitamin C-Are they equally bioavailable. Nutrients. 5 (11), 4284-4304 (2013).
  5. Lee, S. K., Kader, A. A. Preharvest and postharvest factors influencing vitamin C content of horticultural crops. Postharvest Biology and Technology. 20 (3), 207-220 (2000).
  6. Shekhovtsova, T. N., Muginova, S. V., Luchinina, J. A., Galimova, A. Z. Enzymatic methods in food analysis: determination of ascorbic acid. Analytica Chimica Acta. 573-574, 125-132 (2006).
  7. Zhan, L., et al. Light exposure during storage preserving soluble sugar and L-ascorbic acid content of minimally processed romaine lettuce (Lactuca sativa L.var. longifolia). Food Chemistry. 136 (1), 273-278 (2013).
  8. Malejane, D. N., Tinyani, P., Soundy, P., Sultanbawa, Y., Sivakumar, D. Deficit irrigation improves phenolic content and antioxidant activity in leafy lettuce varieties. Food Science and Nutrition. 6 (2), 334-341 (2017).
  9. Tarrago-Trani, M. T., Phillips, K. M., Cotty, M. Matrix-specific method validation for quantitative analysis of vitamin C in diverse foods. Journal of Food Composition and Analysis. 26 (1-2), 12-25 (2012).
  10. Klimczak, I., Gliszczyńska-Świgło, A. Comparison of UPLC and HPLC methods for determination of vitamin C. Food Chemistry. 175, 100-105 (2015).
  11. Złotek, U., Świeca, M., Jakubczyk, A. Effect of abiotic elicitation on main health-promoting compounds, antioxidant activity and commercial quality of butter lettuce (Lactuca sativa L.). Food Chemistry. 148, 253-260 (2014).
  12. Koh, E., Charoenprasert, S., Mitchell, A. E. Effect of organic and conventional cropping systems on ascorbic acid, vitamin C, flavonoids, nitrate, and oxalate in 27 varieties of spinach (Spinacia oleracea L). Journal of Agricultural and Food Chemistry. 60 (12), 3144-3150 (2012).
  13. Kałuzewicz, A., et al. The influence of short-term storage on the content of flavonoids and vitamin C in Broccoli. European Journal of Horticultural Science. 77 (3), 137-143 (2012).
  14. van Treuren, R., van Eekelen, H. D. L. M., Wehrens, R., de Vos, R. C. H. Metabolite variation in the lettuce gene pool: towards healthier crop varieties and food. Metabolomics. 14 (11), 1-14 (2018).
  15. Swartz, M. E. UPLC: An introduction and review. Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies. 28 (7), 1253-1263 (2005).
  16. Spínola, V., Mendes, B., Câmara, J. S., Castilho, P. C. An improved and fast UHPLC-PDA methodology for determination of L-ascorbic and dehydroascorbic acids in fruits and vegetables. Evaluation of degradation rate during storage. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 403 (4), 1049-1058 (2012).
  17. Ball, G. F. M. Water-soluble vitamin assays in human nutrition. , Springer. Boston, MA. (1994).
  18. Bertolín, J. R., et al. Simultaneous determination of carotenoids, tocopherols, retinol and cholesterol in ovine lyophilised samples of milk, meat, and liver and in unprocessed/raw samples of fat. Food Chemistry. 257, 182-188 (2018).
  19. Spínola, V., Llorent-Martínez, E. J., Castilho, P. C. Determination of vitamin C in foods: Current state of method validation. Journal of Chromatography A. 1369, 2-17 (2014).
  20. Chen, Y., et al. radiation is beneficial for yield and quality of indoor cultivated lettuce. Frontiers in Plant Science. 10, 1-10 (2019).
  21. Damerum, A., et al. Elucidating the genetic basis of antioxidant status in lettuce (Lactuca sativa). Horticulture Research. 2 (15055), 1-13 (2015).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Oznaczanie ilości witaminy Ckwas askorbinowykwas dehydroaskorbinowyprzygotowanie próbekanaliza chromatograficznakrzywa kalibracyjnaoptymalizacja ekstrakcjicałkowita zawartość kwasu askorbinowego
Ulepszona metoda UPLC-UV do oznaczania ilościowego witaminy C w odmianach sałaty (Lactuca sativa L.) i dzikich krewnych roślin uprawnych (Lactuca spp.)
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.