Artykuł metodologiczny

Różnicowanie i charakterystyka neuronalnych progenitorów i neuronów z embrionalnych komórek macierzystych myszy

DOI:

10.3791/61446

⸱

15 maja 2020

 ,  ,  , 
1Departments of Biochemistry and Molecular Biology, Penn State College of Medicine, Penn State Hershey Cancer Institute

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy procedurę różnicowania in vitro embrionalnych komórek macierzystych myszy w komórki neuronalne za pomocą metody wiszącej kropli. Ponadto przeprowadzamy kompleksową analizę fenotypową za pomocą RT-qPCR, immunofluorescencji, sekwencjonowania RNA i cytometrii przepływowej.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy krok po kroku procedurę hodowli i różnicowania embrionalnych komórek macierzystych myszy w linie neuronalne, po której następuje seria testów mających na celu scharakteryzowanie zróżnicowanych komórek. Mysie embrionalne komórki macierzyste E14 zostały wykorzystane do utworzenia ciał embrionalnych metodą wiszącej kropli, a następnie indukowane do różnicowania się w nerwowe komórki progenitorowe przez kwas retinowy, a ostatecznie różnicowane w neurony. Ilościowe eksperymenty z reakcją łańcuchową polimerazy z odwrotną transkrypcją (RT-qPCR) i immunofluorescencją wykazały, że neuronalne komórki progenitorowe i neurony wykazują odpowiednie markery (nestynę dla neuronów progenitorowych i neurofilament dla neuronów) odpowiednio w 8 i 12 dniu po różnicowaniu. Eksperymenty cytometrii przepływowej na linii E14 z ekspresją reportera GFP sterowanego przez promotor Sox1 wykazały, że około 60% komórek w dniu 8 jest GFP dodatnich, co wskazuje na pomyślne różnicowanie nerwowych komórek progenitorowych na tym etapie. Na koniec wykorzystano analizę sekwencyjną RNA do profilowania globalnych zmian transkryptomicznych. Metody te są przydatne do analizy udziału określonych genów i szlaków w regulacji przejścia tożsamości komórkowej podczas różnicowania neuronów.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Od czasu ich pierwszego wywodzenia się z wewnętrznej masy komórkowej rozwijających się blastocyst myszy1,2, embrionalne komórki macierzyste myszy (mESC) były wykorzystywane jako potężne narzędzia do badania samoodnawiania i różnicowania komórek macierzystych3. Co więcej, badanie różnicowania mESC prowadzi do ogromnego zrozumienia mechanizmów molekularnych, które mogą poprawić skuteczność i bezpieczeństwo terapii opartej na komórkach macierzystych w leczeniu chorób takich jak zaburzenia neurodegeneracyjne4. W porównaniu z modelami zwierzęcymi, ten system in vitro ma wiele zalet, w tym prostotę w praktyce i ocenie, niskie koszty utrzymania linii komórkowych w przeciwieństwie do zwierząt oraz względną łatwość manipulacji genetycznych. Jednak na wydajność i jakość zróżnicowanych typów komórek często wpływają różne linie mESC, a także metody różnicowania5,6. Ponadto tradycyjne testy oceniające efektywność różnicowania opierają się na jakościowym badaniu wybranych genów markerowych, którym brakuje odporności, a zatem nie są w stanie uchwycić globalnych zmian w ekspresji genów.

Tutaj zamierzamy użyć zestawu testów do systematycznej oceny różnicowania neuronów. Wykorzystując zarówno tradycyjne analizy in vitro na wybranych markerach, jak i sekwencję RNA, tworzymy platformę do pomiaru efektywności różnicowania, a także zmian transkryptomicznych zachodzących w tym procesie. Opierając się na wcześniej ustalonym protokole7, wygenerowaliśmy ciała embrionoidalne (EB) za pomocą techniki wiszącej kropli, a następnie indukcji przy użyciu suprafizjologicznej ilości kwasu retinowego (RA) w celu wygenerowania nerwowych komórek progenitorowych (NPC), które następnie zostały zróżnicowane do neuronów za pomocą pożywki do indukcji neuronalnej. Aby zbadać skuteczność różnicowania, oprócz tradycyjnych testów RT-qPCR i immunofluorescencji (IF), przeprowadziliśmy sekwencję RNA i cytometrię przepływową. Analizy te zapewniają kompleksowy pomiar progresji różnicowania specyficznego dla danego etapu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Kultura mESC

  1. Pokryj 10-centymetrową płytkę poddaną kulturze tkankowej 0,1% żelatyny i pozostaw żelatynę do zastygnięcia na co najmniej 15–30 minut przed jej odessaniem.
  2. Napromieniowane γ nasiona mysich fibroblastów embrionalnych (MEF) na dzień przed hodowlą mESC we wstępnie podgrzanej pożywce mESC (zmodyfikowana pożywka Eagle (DMEM) firmy Dulbecco z 15% płodową surowicą bydlęcą (FBS), aminokwasami endogennymi, β-merkaptoetanolem, L-glutaminą, penicyliną/streptomycyną, pirogronianem sodu, LIF, PD0325901 (PD) i Chir99021 (CH)).
  3. Pozwól, aby napromieniowane γ MEF-y osiadły i przyczepiły się do powierzchni płytki przed hodowlą komórek E14.
  4. Rozmrozić ESC E14 w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C i szybko przenieść komórki do stożkowej rurki o średnicy 15 cm z ciepłym podłożem mESC. Osadzać komórki w masie 200 x g przez 3 minuty i usunąć supernatant.
  5. Zawiesić komórki w 10 ml pożywki mESC i ułożyć komórki na płytce hodowlanej zawierającej wcześniej napromieniowane γ MEF-y. Inkubować kulturę komórkową w inkubatorze o temperaturze 37 °C w temperaturze 5% CO2 .
  6. W celu pasażowania kultur należy odessać pożywkę i umyć płytkę sterylnym 1x PBS. Dodać tyle 0,05% trypsyny, aby pokryć powierzchnię płytki i inkubować w temperaturze 37 °C przez 3 minuty.
  7. Zneutralizuj trypsynę za pomocą pożywki mESC i pipety, aby wytworzyć zawiesinę jednokomórkową. Odwirować komórki o stężeniu 200 x g przez 3 minuty i usunąć supernatant.
  8. Policz komórki za pomocą hemocytometru lub licznika komórek i zasiej około 5,0 x 105 komórek na 10 cm płytce hodowlanej.
  9. Zawiesić komórki w 10 ml pożywki mESC, umieścić komórki na pokrytej żelatyną płytce do hodowli tkankowej i inkubować kultury zgodnie z wcześniejszym opisem.
    UWAGA: Zaleca się pasażowanie mESC co 2 dni, aby zapobiec różnicowaniu się komórek w ich koloniach. Czerwień fenolowa w pożywce działa wyłącznie jako wskaźnik pH i w zależności od gęstości komórkowej może zmienić kolor na żółtawy (bardziej kwaśny) wcześniej niż 2 dni. W związku z tym może być konieczna codzienna zmiana podłoża. Napromieniowane γ MEF-y w końcu wymrą po kilku przejściach.

2. Różnicowanie EB, NPC i neuronów

  1. Wykonaj wspomniany wcześniej protokół pasażowania hodowli i policz komórki (kroki 1.7–1.10).
  2. Metoda wiszącego upuszczania (dzień 0)
    1. W przypadku 10-centymetrowej płytki do hodowli komórkowej policz około 2,5 x 104 komórki, z których 5,0 x 102 komórki zostaną zawieszone w pożywce różnicującej o objętości 20 μl (DMEM z 15% FBS, aminokwasami endogennymi, β-merkaptoetanolem, L-glutaminą, penicyliną/streptomycyną i pirogronianem sodu). Około pięćdziesięciu kropelek o objętości 20 μl zawierających komórki można posiać na jednej płytce o średnicy 10 cm.
    2. Podzielić odpowiednią liczbę komórek, a następnie odwirować komórki przy 200 x g przez 3 minuty i usunąć supernatant.
    3. Ponownie zawiesić komórki w odpowiedniej objętości pożywki różnicującej dla gęstości komórek 5,0 x 102 komórek na 20 μl (np. 2,5 x 104 komórki w 1 ml pożywki różnicowej).
    4. Za pomocą mikropipety lub pipety powtarzalnej umieścić 20 μl kropelek zawiesiny komórek na wieczku płytki do hodowli tkankowej. Upewnij się, że kropelki nie znajdują się zbyt blisko siebie, aby zapobiec ich łączeniu się.
      UWAGA: Kropelki można umieszczać na płytce mocującej poddanej działaniu kultur tkankowych lub na płytce do zawieszania, ponieważ zostaną one umieszczone na pokrywie, a nie na samej płytce. Aby uzyskać bardziej wykonalne i sterylne podejście, umieść kropelki na płytki do hodowli tkankowej i przenieś je na płytkę do zawieszania, jak opisano poniżej.
    5. Napełnij talerz 5-10 ml 1x PBS i ostrożnie załóż pokrywkę z powrotem na talerz. Inkubować kulturę w inkubatorze w temperaturze 37 °C.
      UWAGA: PBS dodaje się do płytki hodowlanej, aby zapobiec wysychaniu kropel.
  3. W drugim dniu za pomocą mikropipety zebrać kropelki z pokrywki i umieścić je na 10-centymetrowej płytce zawiesinowej do hodowli komórkowych wypełnionej 10 ml pożywki różnicującej. Inkubować kulturę na wytrząsarce orbitalnej, wytrząsając się z małą prędkością w inkubatorze.
  4. W 4 dniu, aby zebrać EBs, zebrać komórki, odwirować przy 200 x g przez 3 minuty i usunąć supernatant.
    UWAGA: EB można również myć 1x PBS zgodnie z wymaganiami kolejnych eksperymentów.
  5. Aby kontynuować procedurę i indukować różnicowanie EB w nerwowe komórki progenitorowe (NPC), należy przygotować pożywkę różnicującą z 5 μM kwasem retinowym (RZS).
  6. Usuń starą pożywkę, granulując EB w ilości 100 x g przez 3 minuty lub pozwól EB osiąść przed zasysaniem starej pożywki. Dodać 10 ml pożywki różnicującej zawierającej 5 μM RA do płytki hodowlanej.
  7. W dniu 6 należy zastąpić co najmniej połowę pożywki świeżą pożywką zawierającą 5 μM RZS, przechylając płytkę i odpipetując pożywkę w sposób opisany powyżej.
    UWAGA: Zaleca się, aby co najmniej połowę pożywki zastąpić świeżą pożywką zawierającą RZS w dniach 5 i 7. Zwróć uwagę na wskaźnik czerwieni fenolowej; Jeśli zmieni kolor na żółtawy, najlepiej wymienić całe podłoże.
  8. W dniu 8 zbierz NPC, zbierając komórki, odwirowując przy 200 x g przez 3 minuty i usuwając supernatant.
    UWAGA: NPC można również myć za pomocą 1x PBS w zależności od potrzeb kolejnych eksperymentów. W razie potrzeby NPC można zamrozić i ponownie rozmrozić w celu późniejszej hodowli i analizy. Jeśli NPC mają być hodowane, akutaza może być również stosowana jako alternatywa dla trypsyny.
  9. Aby kontynuować procedurę i rozróżnić NPC w neurony, zbierz NPC w stożkowej probówce o pojemności 15 ml przez odwirowanie, zdysocjuj je trypsyną i inkubuj w temperaturze 37 °C przez 3 minuty. Odpipetuj NPC, aby upewnić się, że wszystkie agregaty NPC są zdysocjowane i zneutralizuj trypsynę z pożywką.
  10. Przefiltrować komórki za pomocą nylonowego sitka do komórek 40 μm i policzyć komórki przed posiewem o gęstości 1,5 x 105/cm2 w pożywce N2 (pożywka DMEM/F12 + 3 mg/ml glukozy + 3 mg/ml bogata w lipidy albumina surowicy bydlęcej (LBSA) + suplement 1:100 N2 + 10 ng/ml bFGF + 50 U/ml pióra/paciorkowca + 1 mM L-glutamina) na płytce poddanej działaniu kultur tkankowych do kolejnych eksperymentów PCR i western blot; lub na tkance komora hodowlana do eksperymentów immunofluorescencyjnych.
  11. W dniu 9 zastąp starą pożywkę świeżą pożywką N2.
  12. W dniu 10 zamień pożywkę N2 na pożywkę N2/B27 (50% DMEM/F12 i 50% neuronalnie podstawowe, 3 mg/ml LBA, 1:200 suplement N2, 1:100 suplement B27, 50 U/ml pióra/paciorkowca i 1 mM L-glutamina).
  13. W dniach 11–12 zbierz neurony w następujący sposób. Przemyć komórki 1x PBS, dodać trypsynę i inkubować kulturę w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez 3 minuty przed neutralizacją trypsyny pożywką i odwirować przy 200 x g przez 3 minuty.

3. Charakterystyka mESC i komórek zróżnicowanych

  1. Test fosfatazy alkalicznej (AP)
    1. Użyj zestawu do oceny aktywności fosfatazy alkalicznej (patrz tabela materiałów).
    2. Usuń pożywkę z płytki hodowlanej i umyj ESC 1x PBS.
    3. Dodać 1 ml roztworu fix (składającego się z formaldehydu i metanolu) dostarczonego z zestawem do płytki i inkubować w temperaturze pokojowej przez 2–5 min.
      UWAGA: Nadmierna inkubacja w roztworze naprawczym może zagrozić aktywności AP.
    4. Usunąć roztwór utrwalający, umyć ESC 1x PBS i pozostawić pewną ilość PBS na płytce.
      UWAGA: Utrzymuj ESC wilgotne w PBS, aby nie zagrozić aktywności AP.
    5. Przygotuj roztwór AP, mieszając roztwory substratów A, B i C w stosunku 1:1:1. Najpierw wymieszaj roztwory A i B i inkubuj mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 2 minuty przed dodaniem roztworu C.
    6. Usuń 1x PBS i dodaj przygotowany wcześniej roztwór AP.
    7. Inkubować ESC przez około 15 minut w ciemności, owijając płytkę hodowlaną folią aluminiową lub wykonując krok 3.5 w ciemnym pomieszczeniu.
    8. Monitoruj reakcję i usuń roztwór reakcyjny, gdy roztwór zmieni kolor na jasny, aby uniknąć niespecyficznego zabarwienia.
    9. Umyj ESC dwukrotnie za pomocą 1x PBS.
    10. Zapobiec wyschnięciu próbki, przykrywając ESC 1x PBS lub podłożem montażowym.
      UWAGA: Pojawi się czerwona lub fioletowa plama dla wyrażenia AP. Talerz można przechowywać w lodówce o temperaturze 4 °C.
  2. RT-qPCR (Protokół RT-qPCR)
    1. Zbieraj komórki na różnych etapach, wykonując kroki 1.6–1.7 i 2.4 odpowiednio dla ESC i EB oraz NPC.
    2. Wyizoluj RNA za pomocą RNA, DNA i roztworu do ekstrakcji białek (patrz tabela materiałów).
    3. Wygeneruj cDNA za pomocą zestawu do odwrotnej transkryptazy (patrz tabela materiałów) i postępuj zgodnie z instrukcją producenta.
  3. Utrwalanie i osadzanie
    1. Zbierz EB i NPC zgodnie z powyższym opisem (krok 2.6) i utrwal je 4% roztworem paraformaldehydu (PFA) w 1x PBS przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
    2. Usunąć PFA i przemyć próbkę 1x PBS przez 5 minut.
    3. Umieścić próbkę w seryjnym rozcieńczeniu 1x PBS, 10%-, 20%- i 30%--roztworów sacharozy w temperaturze 25\u201228 °C, gdzie próbkę przenosi się do następnego roztworu po 30 minutach inkubacji.
      UWAGA: Próbka może być przechowywana w 30% roztworze sacharozy w temperaturze 4 °C przed kontynuowaniem etapu zatapiania.
    4. Zwilż końcówkę pipety roztworem sacharozy przed umieszczeniem próbki (bez układania jej w stosy) na środku formy kriogenicznej i odpipetuj nadmiar płynu.
      UWAGA: Bibuła filtracyjna może być również użyta do usunięcia nadmiaru roztworu. Zwilżenie końcówki pipety roztworem sacharozy jest ważne, aby zapobiec przywieraniu EB i NPC do ścianek końcówki.
    5. Ostrożnie dodać roztwór o optymalnej temperaturze cięcia (OCT) do formy bez ponownego zawieszania próbek i usunąć nadmiar pęcherzyków za pomocą pipety.
    6. Umieść formę z próbką na mieszalniku laboratoryjnym na niskich obrotach, aby delikatnie mieszać próbkę przez 15 minut. Pomaga to osadzić EB i NPC na dnie, jeśli zostaną ponownie zawieszone w roztworze OCT.
    7. Szybko zamroź próbkę, umieszczając formę w ciekłym azocie lub na suchym lodzie.
      UWAGA: Próbki można przechowywać w zamrażarce o temperaturze -70 °C przed przejściem do następnego kroku.
  4. Kriosekcja
    1. Ustawić kriostat tak, aby ostygł do -20 do -18 °C przed przeniesieniem próbki do urządzenia.
    2. Odłącz zamrożony blok OCT od formy i zabezpiecz go na uchwycie za pomocą niewielkiej ilości roztworu OCT umieszczonego na powierzchni uchwytu.
    3. Ustaw blok OCT tak, aby EB i NPC znajdowały się najbliżej ostrza, aby upewnić się, że próbka nie zostanie utracona podczas cięcia.
    4. Ostrożnie przeciąć 10 μm bloku i zwrócić szczególną uwagę na plasterki zawierające próbkę.
    5. Szybko umieść plasterek OCT zawierający próbkę na szkiełku podstawowym do zatapiania w tkankach i pozostaw plastry OCT do wyschnięcia na powietrzu przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
      UWAGA: Próbki można przechowywać w temperaturze -70 °C do późniejszego wykorzystania.
  5. Immunofluorescencja (IF)
    1. Zablokuj skrawki OCT lub komory hodowlane zawierające neurony w 10% normalnej surowicy osła / 0,1% Triton X-100 w 1x PBS przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
    2. Próbki inkubować w pierwotnym przeciwciałie rozcieńczonym w 5% normalnej surowicy osła/0,05% Triton X-100 w 1x PBS przez noc w temperaturze 4 °C.
    3. Próbki należy myć w 1x PBS/0,1% Triton X-100 trzykrotnie przez 5 minut przy każdym myciu.
    4. Próbki inkubować z przeciwciałem drugorzędowym rozcieńczonym w 5% normalnej surowicy osła/0,05% Triton X-100 w 1x PBS przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
    5. Próbki należy przemyć trzykrotnie w 1x PBS/0,1% Triton X-100 przez 5 minut przy każdym płukaniu, a następnie inkubować próbki w 1 μg/ml DAPI.
    6. Połączyć próbki szkiełkiem nakrywkowym i odrobiną podłoża montażowego i pozostawić do wyschnięcia.
    7. Obserwuj próbki pod mikroskopem fluorescencyjnym.
  6. Analiza sekwencyjna RNA
    1. Zebrać komórki na różnych etapach i przeprowadzić ekstrakcję RNA (patrz krok 3.2).
    2. Przygotuj biblioteki cDNA, przeprowadź głębokie sekwencjonowanie i analizę danych zgodnie z protokołem opisanym w Wang et al.8.
    3. Wykonaj analizę ontologii genów (GO) przy użyciu pakietu języka R clusterProfiler.
  7. Cytometria przepływowa
    1. Zbierz ESC, wykonując czynności opisane w punktach 1.6–1.7 i ponownie zawieś komórki w pożywce. Zbierz EB i NPC, wykonując krok 2.4 i ponownie zawieś komórki w podłożu.
    2. Przefiltruj zawiesinę komórek za pomocą nylonowego sitka komórkowego 40 μm do nowej stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
    3. Zmierz sygnał GFP próbek za pomocą cytometru przepływowego (wykonywanego przez główny ośrodek instytucji).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jako reprezentację naszej metody, przeprowadziliśmy eksperyment różnicowania EB, NPC i neuronów na komórkach E14. Komórki E14 hodowano na napromieniowanych γ MEF-ach (Rysunek 1A) do momentu rozcieńczenia populacji MEF napromieniowanej γ. Potwierdziliśmy pluripotencję komórek E14, wykonując barwienie fosfatazą alkaliczną (AP) (Figura 1B), a później RT-qPCR (patrz poniżej) dla markerów Nanog i Oct4. Napromieniowane γ komórki E14 wolne od MEF zostały następnie induko...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metoda różnicowania neuronalnego embrionalnych komórek macierzystych myszy jest znana od dziesięcioleci, a naukowcy nadal modyfikują poprzednie protokoły lub tworzą nowe do różnych celów 7,10,11. Wykorzystaliśmy serię testów do kompleksowej analizy wydajności i postępu etapów różnicowania mESC do neuronów, które mogą być wykorzystane w analizie różnicowania innych linii mysich lub ludzkich ESC. Co więcej, nasze podejścia okazały...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie ma sprzecznych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca została wsparta grantem z NIH (1R35GM133496-01) dla Z. Gao. Chcielibyśmy podziękować dr Ryanowi Hobbsowi za pomoc w sekcji. Dziękujemy głównym obiektom Penn State College of Medicine, w tym Naukom o Genomie i Bioinformatyce, Zaawansowanemu Obrazowaniu Mikroskopii Świetlnej i Cytometrii Przepływowej. Dziękujemy również dr Yuka Imamura za pomoc w analizie sekwencyjnej RNA.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,05% Trypsyna + 0,53 mM EDTA 1XCorning25-052-CV
0,1% ŻelatynaSigmaG1890-100GPrzygotowana w wodzie dejonizowanej
16% ParaformaldehydThermo Scientific28908Rozcieńczony w 1X PBS
40-μ m sitko komórkoweFalcon352340
AlbumaxThermo Fisher Scientific11020021
AlexaFluor 488 kozie przeciwciało anty-mysie IgG (H+L)InvitrogenA11001rozcieńczono w stosunku 1:500 dla zestawu do
barwienia fosfatazy alkalicznej IF IIStemgent00-0055
AzuraQuant Green Fast qPCR Mix LoRoxAzura GenomicsAZ-2105
Suplement B27Thermo Fisher Scientific17504044
BD FACSCantoBD657338
bFGFSigma11123149001
BioAnalyzer Zestaw DNA o wysokiej czułościAgilent5067-4626
Chir99021 CaymanChemicals13122
ChloroformC298-500Fisher Chemiczny
DAPIInvitrogenR37606
DMEMCorning10-017-CM
DMEM/F12 mediumThermo Fisher Scientific11320033
EB buforQiagen19086
Etanol111000200PharmcoRozcieńczony w wodzie dejonizowanej
Surowica bydlęcapłodu Atlanta BiologicalsS10250
Fisherbrand Superfrost Plus Szkiełka mikroskopoweFisher Scientific12-550-15
HiSeq 2500 System sekwencjonowaniaIlluminaSY-401-2501
IzopropanolBDH1133-4LGBDH VWR AnalitycznyRozcieńczony w wodzie dejonizowanej
L-glutaminaThermo Fisher Scientific25030024
LIFN/AN/AZebrane z MEF supernatant
m18srRNA starteryIDTDNAN/A5'-GCAATTATTCCCCATGAACG-3'
5'-GGCCTCACTAACCATCCAA-3'MEM
Aminokwasy endogenneCorning25-025-Cl
startery mNanogIDTDNAN/A5'-AGGCTTTGGAGACAGTGAGGTG-3'
5'-TGGGTAAGGGTTCAAGCACT-3'
Startery mNesIDTDNAN/A5'-AGTGCCCAGTTCTAGTGGTGTCC-3'
5'-CCTCTAAAATAGAGTGGTGAGGGGGG-3'mNeuroD1
starteryIDTDNAN/A5'-CGAGTCATGAGTGCCCAGCTTA-3'
5'-CCGGGAATAGTGAAACTGACGTG-3'mOct4
starteryIDTDNAN/A5'-AGATCACTCACATCGCCAATCA-3'
5'- Startery CGCCGGTTACAGAACCATACTC-3'mPax6
IDTDNAN/A5'-CTTGGGAAATCCGAGACAGA-3'
5'-CTAGCCAGGTTGCGAAGAAC-3'N2
SuplementThermo Fisher Scientific17502048
Nestin pierwszorzędowePrzeciwciało MilliporeMAB5326rozcieńczono w stosunku 1:200 dla IF
Neural BasalThermo Fisher Scientific
Przeciwciało pierwszorzędowe neurofilamentuDSHB2H3
NEXTflex Illumina Zestaw do przygotowania biblioteki szybkiego kierunkowego sekwencjonowania RNABioO ScientificNOVA-5138-07
PD0325901Cayman Chemicals13034
Penicylina/streptomycynaCorning30-002-Cl
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS)N/AN/APrzygotowany w wodzie dejonizowanej
- Chlorek potasuP217-500GVWR-
Fosforan potasu jednozasadowy bezwodny0781-500GVWR-
Chlorek soduBP358-10Fisher Bioreagents
- Fosforan sodu, dwuzasadowy, siedmiowodnySX0715-1Milipore
Losowy podkład heksamerowyThermo ScientificSO142
Kwas retinowySigmaR2625Przygotowany w DMSO
Pirogronian soduCorning25-000-Cl
SacharozaSigma84097Rozcieńczony w 1X PBS
SuperScript III Odwrotna transkryptazaInvitrogen18064022
Tissue-Tek Związek OCTSakura4583
Odczynnik izolacyjny TriPureSigma-Aldrich11667165001
TruSeq RapidIllumina20020616
β-merkaptoetanolFisher BioReagentsBP176-100
21103049

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kaufman, M. H., Evans, M. J. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature. 292, 154-156 (1981).
  2. Martin, G. R. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 78, 7634-7638 (1981).
  3. Czechanski, A., et al. Derivation and characterization of mouse embryonic stem cells from permissive and nonpermissive strains. Nature Protocols. 9 (3), 559-574 (2014).
  4. Sugaya, K., Vaidya, M. Stem Cell Therapies for Neurodegenerative Diseases. Exosomes, Stem Cells and MicroRNA: Aging, Cancer and Age Related Disorders. , 61-84 (2018).
  5. Dang, S. M., Kyba, M., Perlingeiro, R., Daley, G. Q., Zandstra, P. W. Efficiency of embryoid body formation and hematopoietic development from embryonic stem cells in different culture systems. Biotechnology and Bioengineering. 78 (4), 442-453 (2002).
  6. McKee, C., Chaudhry, G. R. Advances and challenges in stem cell culture. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 159, 62-77 (2017).
  7. Bibel, M., et al. Differentiation of mouse embryonic stem cells into a defined neuronal lineage. Nature Neuroscience. 7 (9), 1003-1009 (2004).
  8. Wang, Q., et al. WDR68 is essential for the transcriptional activation of the PRC1-AUTS2 complex and neuronal differentiation of mouse embryonic stem cells. Stem Cell Research. 33, 206-214 (2018).
  9. Ying, Q. L., Stavridis, M., Griffiths, D., Li, M., Smith, A. Conversion of embryonic stem cells into neuroectodermal precursors in adherent monoculture. Nature Biotechnology. 21 (2), 183-186 (2003).
  10. Visan, A., et al. Neural differentiation of mouse embryonic stem cells as a tool to assess developmental neurotoxicity in vitro. NeuroToxicology. 33 (5), 1135-1146 (2012).
  11. Fraichard, A., et al. In vitro differentiation of embryonic stem cells into glial cells and functional neurons. Journal of Cell Science. 108 (10), 3181-3188 (1995).
  12. Stavridis, M. P., Smith, A. G. Neural differentiation of mouse embryonic stem cells. Biochemical So. 31, 45-49 (2003).
  13. Park, Y. -G., et al. Effects of Feeder Cell Types on Culture of Mouse Embryonic Stem Cell In vitro. Development & Reproduction. 19 (3), 119-126 (2015).
  14. Lee, J. H., Lee, E. J., Lee, C. H., Park, J. H., Han, J. Y., Lim, J. M. Requirement of leukemia inhibitory factor for establishing and maintaining embryonic stem cells in mice. Fertility and Sterility. 92 (3), 1133-1140 (2009).
  15. Onishi, K., Zandstra, P. W. LIF signaling in stem cells and development. Development (Cambridge). 142 (13), 2230-2236 (2015).
  16. Smith, A. G., et al. Inhibition of pluripotential embryonic stem cell differentiation by purified polypeptides. Nature. 336, 688-690 (1988).
  17. Williams, R. L., et al. Myeloid leukemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells. Nature. 336, 684-687 (1988).
  18. Ghimire, S., et al. Comparative analysis of naive, primed and ground state pluripotency in mouse embryonic stem cells originating from the same genetic background. Scientific Reports. 8 (1), 1-11 (2018).
  19. Kurosawa, H., Imamura, T., Koike, M., Sasaki, K., Amano, Y. A Simple Method for Forming Embryoid Body from Mouse Embryonic Stem Cells. Journal of Bioscience and Bioengineering. 96 (4), 409-411 (2003).
  20. Wang, X., Yang, P. In vitro differentiation of mouse embryonic stem (mES) cells using the hanging drop method. Journal of Visualized Experiments. (17), 2-3 (2008).
  21. Soprano, D. R., Teets, B. W., Soprano, K. J. Role of Retinoic Acid in the Differentiation of Embryonal Carcinoma and Embryonic Stem Cells. Vitamins and Hormones. 75 (06), 69-95 (2007).
  22. Venere, M., Han, Y. G., Bell, R., Song, J. S., Alvarez-Buylla, A., Blelloch, R. Sox1 marks an activated neural stem/progenitor cell in the hippocampus. Development (Cambridge). 139 (21), 3938-3949 (2012).
  23. Chen, Y., et al. NS21: Re-defined and modified supplement B27 for neuronal cultures. Journal of Neuroscience Methods. 171 (2), 239-247 (2008).
  24. Bahmad, H. F., et al. The Akt/mTOR pathway in cancer stem/progenitor cells is a potential therapeutic target for glioblastoma and neuroblastoma. Oncotarget. 9 (71), 33549-33561 (2018).
  25. Bastiaens, A. J., et al. Advancing a MEMS-Based 3D Cell Culture System for in vitro Neuro-Electrophysiological Recordings. Frontiers in Mechanical Engineering. 4, 1-10 (2018).
  26. Antill-O'Brien, N., Bourke, J., O'Connell, C. D. Layer-by-layer: The case for 3D bioprinting neurons to create patient-specific epilepsy models. Materials. 12 (19), (2019).
  27. Duval, K., et al. Modeling physiological events in 2D vs. 3D cell culture. Physiology. 32 (4), 266-277 (2017).
  28. Joshi, P., Lee, M. Y. High content imaging (HCI) on miniaturized three-dimensional (3D) cell cultures. Biosensors. 5 (4), 768-790 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

neuronalne kom rki progenitorowemetoda wisz cej kroplir nicowanie kwasem retinowymtworzenie cia embrionoidalnychanaliza RT qPCRbarwienie immunofluorescencyjneanaliza cytometrii przep ywowejsekwencjonowanie RNAreporter Sox1 GFP

Powiązane artykuły