Wizualizacja oddziaływania białek naprawy DNA za pomocą immunofluorescencji

Ludzkie komórki są stale narażone na działanie różnych czynników uszkadzających DNA różnego pochodzenia. Źródła egzogenne składają się głównie z narażenia na promieniowanie, chemikalia (w tym chemioterapeutyki i niektóre antybiotyki) oraz wirusy, podczas gdy główne źródła endogenne obejmują błędy w replikacji DNA i stres oksydacyjny. Bezpośrednie skutki narażenia genotoksycznego mogą wahać się od zmodyfikowanej zasady do potencjalnie śmiertelnego pęknięcia podwójnej nici DNA (DSB), w zależności od stresu i dawki ekspozycji. Ostatecznie, nienaprawione lub nieprawidłowo naprawione uszkodzenia DNA mogą prowadzić do akumulacji mutacji, rearanżacji genomu, niestabilności genomu i ostatecznie prowadzić do kancerogenezy¹. Komórki ssaków wyewoluowały złożone szlaki rozpoznawania określonych typów uszkodzeń DNA^2,3 i naprawiać je w odpowiednim czasie, zsynchronizowane z postępem cyklu komórkowego.

Promieniowanie jonizujące (IR) uszkadza podwójną helisę DNA i tworzy pęknięcia dwuniciowe (DSB), jedną z najbardziej szkodliwych form uszkodzenia DNA. Kompleks MRN (MRE11, RAD50, NBS1) działa jako czujnik końcówek DNA i aktywuje kinazę białkową ataksję teleangiektazję zmutowaną (ATM)^4,5. Po początkowej aktywacji ATM przez końcówki DNA, ATM uruchamia kaskadę zdarzeń DDR w miejscu pęknięcia, rozpoczynając kluczowym zdarzeniem, fosforylacją wariantu histonu H2AX⁶. Fosforylacja H2AX na reszcie S139 aktywuje ją do γH2AX, obejmując regiony aż do megazasad wokół uszkodzenia DNA^6,7,8,9. To zdarzenie zwiększa dostępność DNA, prowadząc do rekrutacji i akumulacji innych białek naprawy DNA⁷. Ponieważ γH2AX jest obficie i specyficznie indukowany w otaczających DSB, można go łatwo uwidocznić za pomocą specyficznych przeciwciał i jest powszechnie stosowany jako marker zastępczy dla DSB w polu naprawy DNA. Po zasygnalizowaniu przerwania komórki aktywują swoje szlaki naprawy DNA i przetwarzają uszkodzenia DNA. Białko MDC1 (mediator białka punktu kontrolnego uszkodzenia DNA 1) bezpośrednio wiąże γH2AX¹⁰, oddziałuje z ATM^11, a także z NBS1^12,13. Przyczynia się do zwiększenia stężenia kompleksu MRN w DSB i zainicjowania dodatniego sprzężenia zwrotnego ATM. γH2AX jest szybko usuwany po naprawieniu pęknięcia, co pozwala na monitorowanie odstępu DSB. Po mikroskopii, spadek γH2AX w czasie zapewnia pośredni pomiar pęknięć resztkowych i skuteczności naprawy DNA.

Komórki eukariotyczne mogą naprawiać DSB na kilka sposobów, z których dwa główne to niehomologiczne łączenie końcówek (NHEJ) i rekombinacja homologiczna (HR) (Rysunek 1). NHEJ zasadniczo liguje dwuniciowe końce DNA bez użycia rozszerzonej homologii i działa przez cały cykl komórkowy^14,15. HR staje się dominujący podczas faz S i G2 i jest tłumiony w inny sposób, ponieważ wymaga siostrzanej chromatydy jako homologicznego szablonu do naprawy^14,16. Wybór ścieżki między NHEJ i HR zależy nie tylko od fizycznej bliskości chromatydy siostrzanej, ale także od zakresu resekcji końca DNA¹⁷, która hamuje NHEJ.

Naprawa DSB zależna od homologii rozpoczyna się od nukleolitycznej degradacji nici 5' od końca pęknięcia w celu wytworzenia 3' jednoniciowych ogonów DNA (ssDNA), proces określany jako resekcja 5'-3'. Kompleks MRN inicjuje resekcję końca DNA, a dalsza resekcja jest przetwarzana w połączeniu z BLM/EXO1 (białko zespołu Blooma/egzonukleaza 1) lub BLM/DNA2 (helikaza/nukleaza zależna od replikacji DNA ATP)^{18,19,20,21,22}. Resekcja końca DNA jest wzmocniona przez CtIP (białko oddziałujące z CtBP) poprzez jego bezpośrednią interakcję z kompleksem MRN²³ i rekrutację BRCA1 (białko podatności na raka piersi typu 1)^24,25. Białko replikacyjne A (RPA) natychmiast wiąże się z odsłoniętym ssDNA, a następnie jest wypierane przez białko rekombinazy RAD51, tworząc filament nukleoproteinowy, który katalizuje poszukiwanie homologiczne i inwazję nici^26,27,28.

Rozpoczęcie resekcji jest kluczowym krokiem dla wyboru ścieżki naprawy. Po rozpoczęciu resekcji końce DNA stają się słabymi substratami do wiązania przez heterodimer Ku70/Ku80 (składnik szlaku NHEJ), a komórki są angażowane do HR^17,29,30. Heterodimer Ku70/Ku80 wiąże się z końcami DSB, rekrutując DNA-PKcs i białko wiążące p53 1 (53BP1)^29,30. 53BP1 działa jako bariera dla resekcji w G1, blokując w ten sposób HR, jednocześnie promując NHEJ^31,32, ale jest usuwany w sposób zależny od BRCA1 w fazie S, co w konsekwencji pozwala na resekcję^33,34. W związku z tym 53BP1 i BRCA1 odgrywają przeciwstawne role w naprawie DSB, przy czym 53BP1 jest czynnikiem ułatwiającym NHEJ, podczas gdy BRCA1 działa umożliwiając naprawę przerw przez HR.

W laboratorium powstawanie DSB może być indukowane przez promieniowanie jonizujące (IR). Podczas gdy ten przykład wykorzystuje wysoką dawkę 4 Gy, 1 Gy i 2 Gy tworzą również znaczną ilość DSB, odpowiednich do analizy tworzenia ognisk przez obfite białka. Ważne jest, aby pamiętać, że rodzaj i dawka zastosowanego promieniowania może prowadzić do różnych zmian w DNA i komórce: podczas gdy IR indukuje DSB, może również powodować pęknięcia pojedynczej nici lub modyfikację zasady (patrz^35,36 dla odniesienia do liniowego transferu energii napromieniowania (LET) i rodzaju uszkodzenia DNA). Aby określić kinetykę powstawania ognisk wywołanych promieniowaniem jonizującym (IRIF) i ich klirens, które wskazują na naprawę uszkodzenia i odwrócenie aktywowanego DDR^8,9,37,38, można monitorować powstawanie ognisk w różnych punktach czasowych po promieniowaniu jonizującym. Czas aktywacji i usuwania wszystkich głównych białek uszkodzeń DNA jest znany³⁹, a wiele z nich jest badanych jako zastępcze markery kluczowych zdarzeń. Na przykład pRPA, który ma wysokie powinowactwo do ssDNA, jest stosowany jako substytut resekcji przerwania, białka MRN (MRE11, RAD50, NBS1) i egzonukleazy mogą być również stosowane do oceny skuteczności resekcji. Podczas gdy RAD51, BRCA1, BRCA2 (białko podatności na raka piersi typu 2) i PALB2 (partner i lokalizator BRCA2) mogą być monitorowane w celu oceny wydajności HR, obecność białek Ku lub 53BP1 jest używana jako markery NHEJ (Figura 1).

Ponieważ białka maszynerii naprawy DNA rekrutują się nawzajem do przerwy i łączą w super-kompleksy, interakcje DNA-białko i białko-białko można wywnioskować, śledząc ich indywidualną lokalizację w czasie i analizując kolokalizację białek, co jest widoczne przez nakładające się sygnały w komórce^40,41,42. W liniach komórkowych wprowadzenie mutacji punktowych lub delecji w określonych genach naprawy DNA, czy to poprzez edycję genomu, czy też przez nadekspresję mutantów opartych na plazmidach, pozwala na badanie specyficznych reszt i ich możliwej roli w rozpoznawaniu uszkodzeń DNA (np. kolokalizacja z γH2AX) lub złożonych składach (kolokalizacja z innym lub kilkoma białkami), a także ich wpływu na naprawę DNA. Tutaj używamy immunofluorescencji pośredniej jako środka do badania powstawania i rozdzielczości DSB, śledząc ogniska γH2AX w czasie. Przedstawiamy również jeden przykład analizy powstawania ognisk i kolokalizacji przez głównego gracza w naprawie DSB: p53 Binding Protein 1 (53BP1)³². Jak wspomniano wcześniej, 53BP1 jest uważany za kluczowy dla wyboru ścieżki naprawy DNA. Śledzenie akumulacji 53BP1 i jego kolokalizacji z γH2AX dostarcza cennych informacji na temat fazy cyklu komórkowego, akumulacji uszkodzeń DNA i szlaku wykorzystywanego do naprawy DSB. Celem immunolokalizacji pośredniej jest ocena skuteczności naprawy uszkodzeń DNA w liniach komórkowych, po IR, jak w tym badaniu, lub po ekspozycji na różne stresy w komórce, od sieciowania DNA do zablokowania widełek replikacyjnych (lista czynników uszkadzających DNA znajduje się w tabeli 1).

Ryc. 1: Szlaki naprawy pęknięć podwójnej nici DNA (DSB).
Naprawa DSB obejmuje dwie główne ścieżki: rekombinację homologiczną (HR, po lewej) i niehomologiczne łączenie końców (NHEJ, po prawej). Po przerwie białka są aktywowane, aby zaznaczyć przerwę (γH2AX), uczestniczyć w resekcji końcowej (MRN), pokryć wycięty ssDNA (pRPA), promować rekombinację (BRCA1, PALB2, BRCA2, RAD51) lub ograniczyć resekcję i promować NHEJ (53BP1). Inne białka uczestniczą w naprawie uszkodzeń, ale po wymienionych białkach rutynowo następuje immunofluorescencja pośrednia. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1: Czynniki genotoksyczne. Przykłady czynników uszkadzających DNA, ich mechanizm działania i indukowane uszkodzenia na podstawie sugerowanego stężenia roboczego.

1. Hodowla komórkowa HeLa

1. Okrągłe szkiełka nakrywkowe należy wstępnie traktować 1 M HCl w temperaturze 50 °C przez 16-18 godzin. Spłukać ddH₂O i przechowywać w 100% EtOH.
2. Przygotować pożywkę do hodowli komórkowych: dodać 10% (v/v) FBS do pożywki DMEM.
3. Hodować 4,0 x 10⁴ komórki/basenik na sterylnej 12-dołkowej płytce z okrągłym szkiełkiem nakrywkowym o średnicy 18 mm w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ w wilgotnym inkubatorze. Hoduj komórki do 80% konfluencji (około 24 godzin).

2. Leczenie komórek promieniowaniem (IR)

1. Aby wywołać powstawanie pęknięć dwuniciowych, należy wystawić komórki na działanie promieniowania 4 Gy γ (kontrola: brak napromieniowania, t = 0). W komórce gamma -40 odpowiada to 4,54 min, przy 0,815 Gy na minutę.
2. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ w nawilżanym inkubatorze przez odpowiedni czas (wybrane tutaj punkty czasowe t=1, 2, 4, 16 godzin).

3. Ekstrakcja jądrowa i utrwalanie komórek

1. Przygotować roztwory podstawowe: 0,2 M RURY (pH 6,8), 5 M NaCl, 2 M sacharozy, 1 M MgCl₂, 0,1 M EGTA (pH 8,0).
2. Przygotować jądrowy bufor ekstrakcyjny (NEB): rozpuścić 10 mM RUR (pH 6,8), 100 mM NaCl, 300 mM sacharozy, 3 mM MgCl₂, 1 mM EGTA (pH 8,0) i 0,5% (v/v) Triton X-100 w ddH₂O. Mieszać aż do całkowitego rozpuszczenia.
3. Przygotować 4% (v/v) paraformaldehyd (PFA): rozpuścić 10 ml 16% wodnego roztworu PFA w 30 ml PBS. Mieszaj, aż do całkowitego rozpuszczenia.
4. W odpowiednim momencie (t=0, 1, 2, 4, 16 h) przemyj komórki dwukrotnie 1 ml PBS. Całkowicie usuń PBS.
5. Dodaj 200 μl NEB do każdej studzienki w celu ekstrakcji jąder komórkowych (cytoplazma ulega degradacji, pozostaje tylko jądro) (Rysunek 2). Inkubować przez 2 minuty w temperaturze pokojowej i całkowicie usunąć.
   UWAGA: Nie przekraczaj 2 minut.

Rysunek 2: Ekstrakcja jądrowa.
Reprezentatywne obrazy komórek przed (po lewej) i po (prawej) ekstrakcji jądrowej. Cytoplazma powinna zostać strawiona, ale struktura jądrowa powinna pozostać nienaruszona po ekstrakcji (po prawej). (A) 20-krotne powiększenie; podziałka = 20 μm i (B) 40-krotne powiększenie; Podziałka = 10 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

6. Umyj komórki 1 ml PBS. Całkowicie usuń PBS. Ostrożnie dodawaj PBS, na tym etapie komórki są bardzo delikatne.
7. Dodaj 200 μl 4% (v/v) PFA do każdego dołka w celu utrwalenia komórek. Inkubować przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Całkowicie usunąć PFA.
8. Dodać 1 ml PBS.
   UWAGA: Komórki mogą być przechowywane w PBS w temperaturze 4 °C.

4. Barwienie immunofluorescencyjne

1. Przygotować roztwór blokujący: rozpuścić 5% BSA (w/v) w PBS i dodać 0,3% (v/v) Triton X-100. Mieszaj aż do całkowitego rozpuszczenia.
2. Przygotować bufor rozcieńczający: rozpuścić 1% BSA (w/v) w PBS i dodać 0,3% (v/v) Triton X-100. Mieszaj aż do całkowitego rozpuszczenia.
3. W celu zablokowania dodaj 200 μl roztworu blokującego do każdej studzienki. Inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej lub 16-18 godzin w temperaturze 4 °C.
   UWAGA: Jeśli zostanie użyte przeciwciało kozie, dodaj 5% surowicy koziej do roztworu blokującego.
4. Rozcieńczyć przeciwciało pierwszorzędowe w buforze rozcieńczającym (1:500; zob. tabela 2 w celu zapoznania się z wykazem przeciwciał) i wirować aż do dobrego wymieszania.
   UWAGA: Jeśli stosuje się przeciwciało kozie, dodać 1% surowicy koziej do buforu rozcieńczającego.
5. W pojemniku do nawilżania/inkubacji przyklej kawałek parafilmu. Dodać 10 μl przeciwciała pierwszorzędowego (w jednej kropli). Dopasuj jedną krawędź szkiełka nakrywkowego do kropli i powoli opuść na parafilm, aby płyn rozprowadził się po całym ciele (jeśli to możliwe, unikaj pęcherzyków). Inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
6. Umyj szkiełka nakrywkowe trzy razy w PBS przez 1 minutę.
7. Rozcieńczyć przeciwciało drugorzędowe w buforze rozcieńczającym (końcowe stężenie: 2 μg/ml) i wirować aż do dobrego wymieszania.
8. Zastosować 10 μl przeciwciał drugorzędowych zgodnie z opisem dla przeciwciał pierwszorzędowych. Inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
   UWAGA: Chronić przed światłem.

Tabela 2: Użyte przeciwciała. Lista przeciwciał użytych w tym badaniu.

9. Umyj szkiełka nakrywkowe trzy razy w PBS przez 1 minutę.
10. Szkiełka nakrywkowe myć_H2Oprzez 1 minutę.
11. Barwienie przeciwdziałające DNA za pomocą DAPI: nałożyć 10 μl 300 nM DAPI (zgodnie z opisem dla przeciwciał), inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej, a następnie zamontować na szkiełku podstawowym za pomocą podłoża montażowego na bazie glicerolu. Alternatywnie, dodaj jedną kroplę (10 μl) komercyjnego podłoża montażowego zapobiegającego blaknięciu zawierającego DAPI na szkiełko podstawowe i nałóż szkiełko nakrywkowe. Delikatnie dociśnij szkiełko nakrywkowe i usuń nadmiar płynu wokół niego ręcznikiem papierowym.
12. Uszczelnij szkiełka nakrywkowe przezroczystym lakierem do paznokci i pozostaw do wyschnięcia na 20 minut.
13. Szkiełka należy przechowywać w temperaturze 4 °C.

5. Akwizycja obrazu

1. Umieść kroplę olejku immersyjnego na soczewce obiektywu 60x. Użyj DAPI, aby zlokalizować jądra przez okular.
   1. Aby uzyskać obraz XYZ, otwórz oprogramowanie do akwizycji i wybierz parametry: Typ skanera: Galvano; Tryb skanera: w obie strony; Rozmiar obrazu: 512×512; Tryb PMT: VBF; Średnia PMT: klatka (4 razy); Skanowanie sekwencyjne PMT: linia.
   2. Wybierz barwnik i detektory:
      Kanał (CH1), barwnik (DAPI), detektor (SD1)
      Kanał (CH2), Barwnik (Alexa Fluor 488), Detektor (HSD3)
      Kanał (CH3), Barwnik (Alexa Fluor 647), Detektor (HSD4)
   3. Wybierz ON w "Z".
2. Dostosuj obraz na żywo. Naciśnij przycisk Live (Na żywo) w oknie Live (Na żywo).
   1. Dostosuj ostrość i ustaw intensywność lasera (%), czułość (HV), wzmocnienie i przesunięcie w oknie narzędzi "PMT".
      1. Dostosuj intensywność lasera (%): dla jasności i wybielania. Im wyższa intensywność lasera, tym silniejszy sygnał, ale próbka będzie fotowybielać.
      2. Dostosuj czułość (HV): poziom hałasu. Im wyższa wartość HV, tym silniejszy sygnał, ale obraz będzie zaszumiony, jeśli będzie zbyt wysoki.
         UWAGA: Zawsze utrzymuj napięcie na stałym poziomie.
      3. Dostosuj przesunięcie: poziom tła.
   2. Wybierz opcję Początek/Koniec (15 plasterków) dla stosów Z.
3. Rozpocznij nabywanie.
   1. Wybierz folder, w którym chcesz zapisać obrazy. Naciśnij przycisk LSM Start, aby rozpocząć pobieranie obrazu. Naciśnij przycisk Seria Gotowe, aby zakończyć akwizycję obrazu.

6. Analiza danych

1. Aby przeprowadzić analizę obrazu, otwórz oprogramowanie do analizy.
   1. Naciśnij okno narzędzia Przetwarzanie wsadowe, wybierz obrazy do analizy i wybierz folder wyjściowy.
   2. Naciśnij okno narzędzia Analiza i wybierz Projekcja (wyświetli projekcję maksymalnej intensywności z 15 plasterków).
   3. W obszarze Ustawienie wejścia/wyjścia wybierz utworzoną partię.
   4. Naciśnij przycisk Proces, aby obrazy zostały przetworzone.
   5. Eksportuj obrazy jako pliki .tiff.
2. Aby określić ilościowo ogniska jądrowe, otwórz program CellProfiler.
   1. Otwórz potok kwantyfikacji ognisk γH2AX i 53BP1 (patrz Informacje uzupełniające).
   2. Wykres danych za pomocą oprogramowania do tworzenia tabel.
3. Aby przeprowadzić analizę kolokalizacji, otwórz program CellProfiler.
   1. Otwórz potok kolokalizacji (zobacz Informacje dodatkowe). Plik arkusza kalkulacyjnego zostanie utworzony i zapisany w preferowanej lokalizacji. Jednak same wykresy nie zostaną automatycznie zapisane. Zaleca się zrobienie migawki okien w celu zapisania wyników.
   2. Wykres danych za pomocą oprogramowania do tworzenia tabel.

W dniu 2, czyli 24 godziny po wysianiu komórek na szkiełkach nakrywkowych, komórki przeszły jeden podział i są w 80% zlewne. Specyficzne knock-down lub mutacje w białkach naprawczych DNA mogą wydłużyć czas podwojenia lub uwrażliwić komórki na leczenie genotoksyczne, a gęstość wysiewu oraz dawki leczenia powinny być odpowiednio dostosowane. Aby określić najlepsze warunki pracy, czas odpowiedzi na uszkodzenie DNA można ustalić za pomocą Western blot γH2AX w czasie, a wrażliwość na promieniowanie można określić za pomocą testu tworzenia kolonii.

Komórki nie poddane napromienianiu wykazują niewiele, jeśli w ogóle, ognisk γH2AX (Rysunek 3A). Jednak tworzenie się ognisk γH2AX może być wywołane w hodowanych komórkach przez różne stresy związane z warunkami wzrostu: komórki pozostawione zlewające się w zakwaszonych pożywkach, obecność genotoksycznej endotoksyny w FBS, stężenie tlenu używanego do hodowli, by wymienić tylko kilka.

Rysunek 3: Ogniska jądrowe bez naprężeń.
Przy braku zewnętrznego stresora obserwuje się bardzo niewiele, jeśli w ogóle, ognisk γH2AX (A). W przypadku braku niezbędnych białek naprawczych DNA, akumulację γH2AX można zaobserwować, ponieważ pęknięcia powstałe z powodu źródeł endogennych nie są naprawiane (B). Nagromadzenie nienaprawionych pęknięć może prowadzić do preapoptozy komórek, co jest oznaczone "stałym" barwieniem jąder γH2AX (C). Podziałka = 5 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Ponadto, w komórkach zubożonych na kluczowe białka uszkadzające DNA, takich jak zmutowane komórki BRCA1 lub BRCA2, pęknięcia DNA, które powstają w wyniku stresów endogennych, nie są naprawiane jak w komórkach typu dzikiego i kumulują się. W rezultacie, podwyższony poziom γH2AX można zaobserwować w komórkach z niedoborem HR, nawet w normalnych warunkach wzrostu (Rysunek 3B). Subpopulacja komórek może wykazywać "stałe" barwienie jądrowe za pomocą γH2AX (Rysunek 3C). Barwienie panjądrowe może wskazywać, że komórka jest przytłoczona uszkodzeniami nie do naprawienia i/lub jest preapoptoza. Takie komórki zwykle charakteryzują się powiększonymi jądrami i obecnością wakuoli cytoplazmatycznych. Dodatkowo, γH2AX może być wyzwalany przez stres replikacyjny w fazie S i zatrzymanych widełkach replikacyjnych lub przez zatrzymanie G2/M. W razie potrzeby fazy cyklu komórkowego można zidentyfikować poprzez barwienie zawartości DNA lub współbarwienie za pomocą określonych markerów. Podczas przeprowadzania analizy naprawy uszkodzeń DNA, pan-jądro może być oznaczane ilościowo niezależnie od zindywidualizowanych ognisk.

Po napromieniowaniu, jądra wykazują dużą liczbę pęknięć podwójnej nici, do których γH2AX lokalizuje się niezwykle szybko (Rysunek 4). W optymalnych warunkach obserwuje się niewiele, jeśli w ogóle, ognisk γH2AX przy braku napromieniowania. Po napromieniowaniu gwałtownie wzrasta tworzenie ognisk γH2AX. Jeśli pęknięcia są przetwarzane i naprawiane, liczba ognisk na jądra zmniejsza się, a także liczba komórek dodatnich dla ognisk. Intensywność i liczba ognisk różni się w zależności od użytej linii komórkowej i dostarczonej dawki promieniowania. W niskopasażowych komórkach HeLa, hodowanych w surowicy wolnej od endotoksyn, rutynowo zaobserwowaliśmy gwałtowny wzrost ognisk po 30 minutach i 1 godzinie od napromieniania, który osiąga szczyt między 1 a 2 godzinami, a następnie stopniowo zmniejsza się do 16 godzin. Z tego powodu przedstawiono tutaj reprezentatywne punkty czasowe po 0, 1, 2, 4 i 16 godzinach od napromieniowania. Zachowanie sygnalizacji przerwania, naprawy i przeżycia na napromieniowanie może się znacznie różnić między liniami komórkowymi, a także po wyczerpaniu lub mutacji genów. Z tego powodu najodpowiedniejsze punkty czasowe będą zależne od eksperymentu i komórki. W eksperymencie po 16 godzinach γH2AX ogniska resztkowe osiągnęły ten sam poziom podstawowy, co komórki nienapromieniowane. Monitorowanie ognisk resztkowych w celu uwzględnienia późniejszych punktów czasowych jest sugerowane w przypadku pracy z wolno dzielącymi się liniami komórkowymi.

Rysunek 4: Ogniska jądrowe i kwantyfikacja po naprężeniu (przebieg w czasie).
Powstawanie ognisk γH2AX przy t=0 (brak napromieniowania) oraz we wskazanych punktach czasowych po napromieniowaniu (4 Gy, t=1, 2, 4, 16 h). (A) Pokazane są reprezentatywne obrazy. DAPI wskazuje jądra. Podziałka = 5 μm. (B) Ogniska jądrowe γH2AX po ekspozycji na promieniowanie γ oceniano za pomocą automatycznej kwantyfikacji (CellProfiler) w ≥ 100 jądrach dla każdego punktu czasowego. W zależności od postawionego pytania biologicznego i rodzaju pozyskanych danych, dostępne są różne opcje prezentacji danych surowych, aby ułatwić porównanie i krytyczne zrozumienie. (i) Wykres chmur pokazuje średnią ± SD. Symbol (*) oznacza istotność statystyczną w stosunku do kontroli, przy użyciu dwustronnego testu t-Studenta: *** p ≤ 0,0001, (ii) krzywa indukcji pokazuje średnią ± SEM, (iii) więcej niż 10 ognisk na jądro. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Odwrotnie, w komórkach z niedoborem funkcji naprawy uszkodzeń DNA, ogniska γH2AX gromadzą się przy braku napromieniowania (t=0 h) i naprawa może być opóźniona lub nieobecna nawet w długich punktach czasowych (t=16 h, t=24 h) po napromieniowaniu. Bezpośrednie porównanie między komórkami typu dzikiego i zmutowanego może dostarczyć cennych informacji na temat funkcji naprawy DNA zmutowanego genu i wskazać rodzaj naprawy. Podczas gdy usterka NHEJ może zmusić do naprawy przerwy przez HR w fazie S, DSB, które zostały wycięte i muszą zostać naprawione przez HR, nie zostaną naprawione przez NHEJ. Z tego powodu akumulacja uszkodzeń po fazie S może wskazywać na niedobór HR, a wysoki poziom γH2AX po podziale wskazuje na defekty NHEJ.

Gdy kilka białek jest badanych w tych samych komórkach, kolokalizacja może być badana poprzez multipleksowanie pierwotnych przeciwciał wyhodowanych u różnych gatunków zwierząt i ujawnianie ich za pomocą drugorzędowych przeciwciał znakowanych odrębnymi fluoroforami (Rysunek 5). Kolokalizacja wskazuje, czy białka (i) są rekrutowane do pęknięcia, (ii) są rekrutowane w odpowiednim czasie, (iii) łączą się w kompleksy naprawcze DNA. Powszechnie akceptowaną metodą jakościową jest przedstawianie wyników jako prostej nakładki różnych kanałów (tj. zielonego i czerwonego). Superpozycja koloru zielonego i czerwonego spowoduje powstanie żółtych hotspotów, w których dwa interesujące białka są obecne w tych samych pikselach (Rysunek 5A). Metoda ta ma jednak ograniczenia, ponieważ zależy od względnej intensywności sygnału zebranego w obu kanałach, a oba fluorochromy mogą mieć różnice w sile sygnału. W związku z tym metody nakładania pomagają w generowaniu wizualnego oszacowania zdarzeń kolokalizacji, ale nie są odpowiednie do celów ilościowych. Ilościową analizę kolokalizacji można przeprowadzić za pomocą podejścia obiektowego (Rysunek 5B (i-iii) lub podejścia statystycznego, które przeprowadza analizy oparte na współczynniku korelacji intensywności (ICCB) (Rysunek 5B (iv)). Dostępnych jest kilka narzędzi do analizy kolokalizacji, w tym JACoP (Just Another Co-localization Plugin; https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/jacop.html) i potok "Kolokalizacja" (CellProfiler) wykorzystany tutaj, który może być używany jako narzędzie ICCB, w celu oceny związku między intensywnością fluorescencji. Odbywa się to głównie poprzez obliczenie współczynnika korelacji (współczynnika Pearsona), który mierzy siłę liniowej zależności między dwiema zmiennymi. Kolokalizacja fluorescencji może być przedstawiona graficznie na wykresach punktowych, gdzie intensywność jednego fluorochromu (zielony) jest wykreślany w stosunku do intensywności drugiego fluorochromu (czerwonego) dla każdego piksela. Pełna kolokalizacja powoduje, że punkty skupiają się wokół linii prostej, której nachylenie odzwierciedla stosunek fluorescencji dwóch kolorów. Wręcz przeciwnie, brak kolokalizacji skutkuje rozkładem punktów na dwie oddzielne grupy (rozmieszczone wzdłuż osi), z których każda wykazuje różne poziomy sygnału jednego koloru z niewielkim lub żadnym sygnałem z drugiego koloru. Wartość współczynnika Pearsona waha się od 1 do -1, gdzie 1 oznacza pełną dodatnią korelację, -1 oznacza ujemną korelację, a zero oznacza brak korelacji. Alternatywnie można zastosować metodę Pclc. Metoda ta została zastosowana w różnych promieniowaniach (zobacz36, aby uzyskać szczegółowe informacje i ogólnie dostępną metodę).

Rysunek 5: Analiza kolokalizacji.
Stosując kilka przeciwciał wyhodowanych przeciwko różnym gatunkom (w tym przypadku anty-mysi γH2AX (czerwony) i anty-króliczy 53BP1 (zielony)), można zbadać kilka białek. (A) Pokazane są reprezentatywne obrazy. DAPI wskazuje jądra. Kolokalizacja jest wizualizowana przez nakładanie się kolorów i obszarów (tutaj czerwony + zielony = żółty). Podziałka liniowa = 5 μm. (B) Ogniska indywidualne i kolokalizujące mogą być indywidualnie określane ilościowo za pomocą jednego z kilku programów (tutaj, CellProfiler, patrz inne opcje w tekście głównym) i kreślone. (i-iii) Podejście obiektowe stosowane do określenia kolokalizacji (iv) Wyniki korelacji uzyskane dla kolokalizacji, przy użyciu podejścia opartego na pikselach (analiza ICCB). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Informacje uzupełniające. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.