Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wizualizacja oddziaływania białek naprawy DNA za pomocą immunofluorescencji

10.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61447

⸱

26 czerwca 2020

 , 
1Department of Biochemistry and Structural Biology, University of Texas Health Science Center at San Antonio, 2Mays Cancer Center at UT Health San Antonio MD Anderson Cancer Center

W tym artykule

Podsumowanie

Po uszkodzeniu DNA, ludzkie komórki aktywują niezbędne szlaki naprawcze, aby przywrócić integralność swojego genomu. W tym miejscu opisujemy metodę immunofluorescencji pośredniej jako sposób na wykrycie białek naprawy DNA, analizę ich przestrzennej i czasowej rekrutacji oraz pomoc w badaniu interakcji białko-białko w miejscach uszkodzenia DNA.

Streszczenie

Komórki ssaków są stale narażone na działanie substancji chemicznych, promieniowania i naturalnie występujących produktów ubocznych przemiany materii, które tworzą specyficzne rodzaje uszkodzeń DNA. Czynniki genotoksyczne mogą uszkadzać szkielet DNA, łamać go lub modyfikować charakter chemiczny poszczególnych zasad. Po uszkodzeniu DNA aktywowane są szlaki odpowiedzi na uszkodzenie DNA (DDR) i rekrutowane są białka zaangażowane w naprawę. Na wyczuwanie rodzaju uszkodzenia i aktywowanie odpowiedniej reakcji naprawczej zaangażowanych jest wiele czynników. Brak prawidłowej aktywacji i rekrutacji czynników DDR może prowadzić do niestabilności genomu, która leży u podstaw wielu patologii u ludzi, w tym raka. Badania białek DDR mogą dostarczyć informacji na temat genotoksycznej odpowiedzi na leki i komórkowych mechanizmów oporności na leki.

Istnieją dwa główne sposoby wizualizacji białek in vivo: bezpośrednia obserwacja, poprzez oznaczanie interesującego białka białkiem fluorescencyjnym i śledzenie go za pomocą obrazowania na żywo, lub pośrednia immunofluorescencja na ustalonych próbkach. Podczas gdy wizualizacja białek znakowanych fluorescencyjnie umożliwia precyzyjne monitorowanie w czasie, bezpośrednie znakowanie na końcu N lub C może zakłócać lokalizację lub funkcję białka. Preferowana jest obserwacja białek w ich niezmodyfikowanej, endogennej wersji. Kiedy białka naprawy DNA są rekrutowane do uszkodzenia DNA, ich stężenie wzrasta lokalnie i tworzą grupy lub "ogniska", które można uwidocznić za pomocą pośredniej immunofluorescencji przy użyciu specyficznych przeciwciał.

Chociaż wykrycie ognisk białkowych nie dostarcza ostatecznego dowodu na bezpośrednią interakcję, kolokalizacja białek w komórkach wskazuje, że przegrupowują się one do miejsca uszkodzenia i mogą informować o sekwencji zdarzeń wymaganych do tworzenia kompleksu. Dokładna analiza nakładania się przestrzennego ognisk w komórkach wykazujących ekspresję dzikich lub zmutowanych wersji białka może dostarczyć cennych wskazówek na temat domen funkcjonalnych ważnych dla funkcji naprawy DNA. Wreszcie, kolokalizacja białek wskazuje na możliwe bezpośrednie interakcje, które można zweryfikować przez koimmunoprecypitację w komórkach lub bezpośrednie ściąganie przy użyciu oczyszczonych białek.

Wprowadzenie

Komórki ludzkie są nieustannie narażone na działanie różnych czynników uszkadzających DNA o różnym pochodzeniu. Źródła egzogenne obejmują głównie ekspozycję na promieniowanie, substancje chemiczne (w tym leki chemoterapeutyczne i niektóre antybiotyki) oraz wirusy, natomiast głównymi źródłami endogennymi są błędy w replikacji DNA oraz stres oksydacyjny. Bezpośrednie skutki ekspozycji genotoksycznej mogą obejmować zarówno modyfikację pojedynczej zasady, jak i potencjalnie letalne pęknięcia dwuniciowe DNA (DSB), w zależności od rodzaju stresu i dawki ekspozycji. Ostatecznie nieusunięte lub błędnie naprawione uszkodzenia DNA mogą prowadzić do akumulacji mutacji, przetasowań genomicznych, niestabilności genomu, a w konsekwencji do kancerogenezy1. Komórki ssaków wykształciły złożone szlaki rozpoznawania specyficznych rodzajów uszkodzeń DNA2,3 i ich terminowej naprawy, zsynchronizowanej z przebiegiem cyklu komórkowego.

Promieniowanie jonizujące (IR) uszkadza podwójną helisę DNA i tworzy pęknięcia obu nici (DSBs), które są jedną z najgroźniejszych form uszkodzeń DNA. Kompleks MRN (MRE1, RAD50, NBS1) pełni funkcję sensora końców DNA i aktywuje kinazę białkową ATM (ataxia telangiectasia mutated)4,5. Po wstępnej aktywacji ATM przez końce DNA, ATM inicjuje kaskadę zdarzeń DDR w miejscu pęknięcia, rozpoczynając od kluczowego etapu, jakim jest fosforylacja wariantu histony H2AX6. Fosforylacja H2AX w pozostałości S139 aktywuje go do postaci γH2AX, obejmując obszary o wielkości do megabaz wokół uszkodzenia DNA6,7,8,9. Zdarzenie to zwiększa dostępność DNA, co prowadzi do rekrutacji i akumulacji innych białek naprawczych DNA7. Ponieważ γH2AX jest obficie i specyficznie indukowany w otoczeniu pęknięć DSB, można go łatwo zwizualizować przy użyciu specyficznych przeciwciał, dlatego jest on powszechnie stosowany jako marker zastępczy dla DSB w badaniach nad naprawą DNA. Po zasygnalizowaniu pęknięcia komórki aktywują swoje szlaki naprawy DNA i przetwarzają uszkodzenia DNA. Białko MDC1 (mediator of DNA damage checkpoint protein 1) bezpośrednio wiąże γH2AX10, oddziałuje z ATM1, a także z NBS112,13. Przyczynia się ono do zwiększenia stężenia kompleksu MRN w miejscu DSB i inicjuje pozytywną pętlę sprzężenia zwrotnego ATM. γH2AX jest szybko usuwany po naprawie pęknięcia, co w konsekwencji pozwala na monitorowanie eliminacji DSB. Dzięki zastosowaniu mikroskopii spadek poziomu γH2AX w czasie stanowi pośredni pomiar pozostałych pęknięć oraz wydajności naprawy DNA.

Komórki eukariotyczne mogą naprawiać pęknięcia dwuniciowe (DSB) za pomocą kilku szlaków, z których dwa główne to niehomologiczne łączenie końców (NHEJ) oraz rekombinacja homologiczna (HR) (Rysunek 1). NHEJ w zasadzie liguje końce dwuniciowe DNA bez wykorzystania rozległej homologii i działa przez cały cykl komórkowy14,15. HR dominuje podczas faz S i G2 i jest w innym czasie tłumiona, ponieważ do naprawy wymaga ona chromatydy siostrzanej jako matrycy homologicznej14,16. Wybór szlaku między NHEJ a HR zależy nie tylko od fizycznej bliskości chromatydy siostrzanej, ale także od stopnia resekcji końców DNA17, która hamuje proces NHEJ.

Naprawa DSB zależna od homologii rozpoczyna się od nukleolitycznej degradacji nici 5’ od końców pęknięcia w celu wytworzenia jednoniciowych końców DNA (ssDNA) 3’, proces ten nazywa się resekcją 5’-3’. Kompleks MRN inicjuje resekcję końców DNA, a dalsza resekcja przebiega przy udziale BLM/EXO1 (białka zespołu Blooma/egzonukleazy 1) lub BLM/DNA2 (ATP-zależnej helikazy/nukleazy replikacji DNA)18,19,20,21,2. Resekcja końców DNA jest wspomagana przez CtIP (białko oddziałujące z CtBP) poprzez jego bezpośrednią interakcję z kompleksem MRN23 oraz rekrutację białka BRCA1 (białka podatności na raka piersi typu 1)24,25. Białko RPA (białko replikacyjne A) szybko wiąże się z odsłoniętym ssDNA, a następnie zostaje zastąpione przez rekombinazę RAD51, tworząc filament nukleoproteinowy, który katalizuje wyszukiwanie homologii i inwazję nici26,27,28.

Rozpoczęcie resekcji jest krytycznym krokiem w wyborze ścieżki naprawy. Po zainicjowaniu resekcji końce DNA stają się słabymi substratami dla wiązania przez heterodimer Ku70/Ku80 (składnik ścieżki NHEJ), a komórki zostają skierowane na drogę HR17,29,30. Heterodimer Ku70/Ku80 wiąże się z końcami DSB, rekrutując DNA-PKcs oraz białko wiążące p53 1 (53BP1)29,30. 53BP1 działa jako bariera dla resekcji w fazie G1, blokując tym samym HR przy jednoczesnym promowaniu NHEJ31,32, jednak jest ono usuwane w sposób zależny od BRCA1 w fazie S, co w konsekwencji umożliwia przeprowadzenie resekcji33,34. Zatem 53BP1 i BRCA1 pełnią przeciwstawne role w naprawie DSB, gdzie 53BP1 jest facylitatorem NHEJ, podczas gdy BRCA1 umożliwia naprawę pęknięć poprzez HR.

W warunkach laboratoryjnych powstawanie DSB można indukowanie za pomocą promieniowania jonizującego (IR). Choć w niniejszym przykładzie wykorzystano wysoką dawkę 4 Gy, dawki 1 Gy i 2 Gy również powodują powstanie znacznej liczby DSB, co jest odpowiednie do analizy tworzenia się ognisk przez białka występujące w dużym stężeniu. Należy zauważyć, że rodzaj i dawka zastosowanego promieniowania mogą prowadzić do różnych uszkodzeń DNA i komórek: o ile IR indukuje DSB, może ono również powodować pęknięcia pojedynczej nici lub modyfikacje zasad (patrz35,36 w celu uzyskania informacji na temat liniowego przekazu energii (LET) promieniowania i rodzaju uszkodzeń DNA). Aby określić kinetykę tworzenia się ognisk indukowanych promieniowaniem jonizującym (IRIF) oraz ich znikanie, co wskazuje na naprawę uszkodzeń i odwrócenie aktywacji DDR8,9,37,38, proces tworzenia ognisk można monitorować w różnych punktach czasowych po napromieniowaniu. Czas aktywacji i znikania wszystkich głównych białek odpowiedzi na uszkodzenia DNA jest znany39, a wiele z nich jest badanych jako markery zastępcze dla kluczowych zdarzeń. Na przykład pRPA, wykazujące wysokie powinowactwo do ssDNA, jest wykorzystywane jako marker zastępczy dla resekcji pęknięć; białka MRN (MRE1, RAD50, NBS1) oraz egzonukleazy mogą być również używane do oceny wydajności resekcji. Podczas gdy białka RAD51, BRCA1, BRCA2 (białko podatności na raka piersi typu 2) oraz PALB2 (partner i lokalizator BRCA2) mogą być monitorowane w celu oceny wydajności HR, obecność białek Ku lub 53BP1 służy jako markery NHEJ (Rysunek 1).

Ponieważ białka aparatu naprawy DNA rekrutują się nawzajem do miejsca pęknięcia i łączą w superkompleksy, oddziaływania DNA-białko oraz białko-białko można wnioskować, śledząc ich indywidualną lokalizację w czasie i analizując ko-lokalizację białek, wizualizowaną jako nakładające się sygnały w komórce40,41,42. W liniach komórkowych wprowadzenie mutacji punktowych lub delecji w specyficznych genach naprawy DNA – albo poprzez edycję genomu, albo poprzez nadekspresję mutantów opartych na plazmidach – pozwala na badanie konkretnych reszt aminokwasowych i ich możliwej roli w rozpoznawaniu uszkodzeń DNA (np. ko-lokalizacja z γH2AX) lub w montażu kompleksu (ko-lokalizacja z innym białkiem lub kilkoma białkami), a także ich wpływu na naprawę DNA. W niniejszej pracy wykorzystujemy pośrednią immunofluorescencję jako metodę badania tworzenia i usuwania pęknięć DSB poprzez śledzenie ognisk γH2AX w czasie. Przedstawiamy również przykład analizy tworzenia ognisk i ko-lokalizacji dla kluczowego białka w naprawie DSB: p53 Binding Protein 1 (53BP1)32. Jak wspomniano wcześniej, 53BP1 jest uważane za centralne dla wyboru ścieżki naprawy DNA. Śledzenie akumulacji 53BP1 i jego ko-lokalizacji z γH2AX dostarcza cennych informacji o fazie cyklu komórkowego, akumulacji uszkodzeń DNA oraz ścieżce wykorzystanej do naprawy DSB. Celem pośredniej immunolokalizacji jest ocena efektywności naprawy uszkodzeń DNA w liniach komórkowych po naświetlaniu IR, jak w niniejszym badaniu, lub po ekspozycji komórek na różne stresy, od sieciowania DNA po blokadę widełek replikacyjnych (lista czynników uszkadzających DNA znajduje się w Tabeli 1).

Schemat naprawy DNA przedstawiający procesy HR i NHEJ; etapy resekcji, ligacji i rekombinacji.
Rysunek 1: Szlaki naprawy pęknięć obu nici DNA (DSB).
Naprawa DSB przebiega dwiema głównymi drogami: rekombinacją homologiczną (HR, po lewej) oraz niespokrewnionym łączeniem końców (NHEJ, po prawej). Po wystąpieniu pęknięcia aktywowane są białka służące do znakowania miejsca pęknięcia (γH2AX), biorące udział w resekcji końców (MRN), pokrywające resekowane ssDNA (pRPA), promujące rekombinację (BRCA1, PALB2, BRCA2, RAD51) lub ograniczające resekcję i promujące NHEJ (53BP1). W naprawie uszkodzeń uczestniczą również inne białka, jednak wymienione powyżej są rutynowo monitorowane za pomocą pośredniej immunofluorescencji. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Agent uszkadzający DNAMechanizm działaniaZalecana dawka
promienie γ/promienie XPromieniowanie
Powstawanie pęknięć dwuniciowych z niektórymi niekontrolowanymi efektami komórkowymi		1-4 Gy
36jony ArPromieniowanie
Powstawanie pęknięć dwuniciowych		270 keV/μm
cząstki αPromieniowanie
Powstawanie pęknięć dwuniciowych		116 keV/μm
BleomycynaInhibitor syntezy DNA0.4-2 μg/mL
KamptotecynaInhibitor topoizomerazy I10-200 nM
CysplatynaAgent alkilujący
(indukujący wiązania krzyżowe wewnątrz nici)		0.25-2 μM
DoksorubicynaAgent interkalujący
Inhibitor topoizomerazy II		10-20 nM
EtopozydInhibitor topoizomerazy II10 μM
HydroksymocznikInhibitor syntezy DNA
(poprzez reduktazę rybonukleotydową)		10-20 μM
MetylometanosulfonianAgent alkilujący0.25-2 mM
Mitomycyna CAgent alkilujący0.25-2 μM
Światło ultrafioletowe (UV)Powstawanie dimerów tymydyny
(generujące zniekształcenie łańcucha DNA)		50-10 mJ/cm2

Tabela 1: Agenty genotoksyczne. Przykłady czynników uszkadzających DNA, ich mechanizm działania oraz indukowane uszkodzenia w oparciu o sugerowane stężenie robocze.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Hodowla komórek HeLa

  1. Przedwstępnie potraktować okrągłe szkiełka nakrywki 1 M HCl w temperaturze 50 °C przez 16-18 godzin. Przepłukać ddH2O i przechowywać w 10% EtOH.
  2. Przygotować pożywkę do hodowli komórkowej: dodać 10% (v/v) FBS do pożywki DMEM.
  3. Hodować 4,0 x 104 komórek/dołek w sterylnej płytce 12-dołkowej z okrągłym szkiełkiem nakrywką o średnicy 18 mm w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w inkubatorze z nawilżaniem. Hodować komórki do osiągnięcia 80% konfluencji (około 24 godziny).

2. Naświetlanie komórek promieniowaniem (IR)

  1. Aby indukować powstawanie pęknięć dwuniciowych, poddaj komórki promieniowaniu γ o dawce 4 Gy (kontrola: brak napromieniowania, t=0). W urządzeniu Gamma Cell -40 odpowiada to 4,54 min przy dawce 0,815 Gy na minutę.
  2. Inkubuj komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w inkubatorze z nawilżeniem przez odpowiedni czas (wybrane punkty czasowe: t=1, 2, 4, 16 h).

3. Ekstrakcja jądrowa i fiksacja komórek

  1. Przygotować roztwory stokowe: 0,2 M PIPES (pH 6,8), 5 M NaCl, 2 M sacharozy, 1 M MgCl2, 0,1 M EGTA (pH 8,0).
  2. Przygotować bufor do ekstrakcji jąder (NEB): rozpuścić 10 mM PIPES (pH 6,8), 10 mM NaCl, 30 mM sacharozy, 3 mM MgCl2, 1 mM EGTA (pH 8,0) oraz 0,5% (v/v) Triton X-100 w ddH2O. Mieszać do całkowitego rozpuszczenia.
  3. Przygotować 4% (v/v) paraformaldehyd (PFA): rozpuścić 10 mL 16% wodnego roztworu PFA w 30 mL PBS. Mieszać do całkowitego rozpuszczenia.
  4. W odpowiednich punktach czasowych (t=0, 1, 2, 4, 16 h) wypłukać komórki dwukrotnie 1 mL PBS. Całkowicie usunąć PBS.
  5. Do każdego dołka dodać 20 μL NEB w celu ekstrakcji jąder komórkowych (cytoplazma ulega degradacji, pozostaje tylko jądro) (Rysunek 2). Inkubować przez 2 minuty w temperaturze pokojowej, a następnie całkowicie usunąć.
    UWAGA: Nie przekraczać 2 minut.

Porównanie morfologii komórek: wpływ ekstrakcji jąder, obraz mikroskopowy, analiza struktury komórkowej.
Rysunek 2: Ekstrakcja jąder komórkowych.
Reprezentatywne obrazy komórek przed (lewo) i po (prawo) ekstrakcji jąder. Po ekstrakcji (prawo) cytoplazma powinna ulec strawieniu, natomiast struktura jądra powinna pozostać nienaruszona. (A) powiększenie 20x; pasek skali = 20 μm oraz (B) powiększenie 40x; pasek skali = 10 μm. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

  1. Przemyć komórki 1 mL PBS. Całkowicie usunąć PBS. Ostrożnie dodać PBS; na tym etapie komórki są bardzo delikatne.
  2. Do każdej studni dodać 20 μL 4% (v/v) PFA w celu utrwalenia komórek. Inkubować przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Całkowicie usunąć PFA.
  3. Dodać 1 mL PBS.
    UWAGA: Komórki można przechowywać w PBS w temperaturze 4 °C.

4. Barwienie immunofluorescencyjne

  1. Przygotować roztwór blokujący: rozpuścić 5% BSA (w/v) w PBS i dodać 0,3% (v/v) Triton X-10. Mieszać do całkowitego rozpuszczenia.
  2. Przygotować bufor do rozcieńczeń: rozpuścić 1% BSA (w/v) w PBS i dodać 0,3% (v/v) Triton X-10. Mieszać do całkowitego rozpuszczenia.
  3. W celu blokowania dodać 20 μL roztworu blokującego do każdej studzienki. Inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej lub przez 16-18 godzin w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Jeśli używane będą przeciwciała kozie, do roztworu blokującego należy dodać 5% surowicy koziej.
  4. Rozcieńczyć przeciwciało pierwszorzędowe w buforze do rozcieńczeń (1:500; lista przeciwciał znajduje się w Tabeli 2) i wymieszać za pomocą vorteksa.
    UWAGA: Jeśli używane jest przeciwciało kozie, do buforu do rozcieńczeń należy dodać 1% surowicy koziej.
  5. W komorze inkubacyjnej/wilgotnościowej przykleić kawałek parafilmu. Nanieść 10 μL przeciwciała pierwszorzędowego (w jednej kropli). Dopasować krawędź szkiełka nakrywki do kropli i powoli opuścić na parafilm, aby ciecz rozprzestrzeniła się po całej powierzchni (jeśli to możliwe, unikać pęcherzyków powietrza). Inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
  6. Przemyć szkiełka nakrywki trzy razy w PBS przez 1 minutę.
  7. Rozcieńczyć przeciwciało drugorzędowe w buforze do rozcieńczeń (stężenie końcowe: 2 μg/mL) i wymieszać za pomocą vorteksa.
  8. Nanieść 10 μL przeciwciała drugorzędowego zgodnie z procedurą opisaną dla przeciwciał pierwszorzędowych. Inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Chronić przed światłem.
PrzeciwciałoFirmaLiteraturaProszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.
53BP1Sygnalizacja komórkowa4937Królik
anty-IgG mysie H&L (Alexa Fluor 647)Abcamab150103Osioł
Przeciwciało przeciwko fosfo-histonie H2A.X (Ser139), klon JBW301Millipore05-636Mysz
przeciwciała anty-królicze IgG H&L (Alexa Fluor 48)Abcamab150081Koza

Tabela 2: Wykorzystane przeciwciała. Lista przeciwciał użytych w niniejszym badaniu.

  1. Przemyj szkiełka podstawowe trzy razy w PBS przez 1 minutę.
  2. Przemyj szkiełka podstawowe w H2O przez 1 minutę.
  3. Przebarw DNA za pomocą DAPI: nanieś 10 μL 30 nM DAPI (zgodnie z opisem dla przeciwciał), inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej, a następnie zamontuj na szkiełku przedmiotowym przy użyciu medium montażowego na bazie glicerolu. Alternatywnie, nanieś na szkiełko jedną kroplę (10 μL) komercyjnego medium montażowego z DAPI zapobiegającego blaknięciu, a następnie nałóż szkiełko podstawowe. Delikatnie dociśnij szkiełko podstawowe i usuń nadmiar cieczy wokół niego za pomocą ręcznika papierowego.
  4. Uszczelnij szkiełka podstawowe przezroczystym lakierem do paznokci i pozostaw do wyschnięcia na 20 minut.
  5. Przechowuj szkiełka w temperaturze 4 °C.

5. Akwizycja obrazu

  1. Nanieś kroplę olejku immersyjnego na obiektyw 60x. Użyj DAPI, aby zlokalizować jądra komórkowe przez okular mikroskopu.
    1. W celu akwizycji obrazów XYZ otwórz oprogramowanie akwizycyjne i wybierz następujące parametry: Typ skanera: Galvano; Tryb skanera: Roundtrip; Rozmiar obrazu: 512×512; Tryb PMT: VBF; Średnia PMT: klatka (4 razy); Skanowanie sekwencyjne PMT: linia.
    2. Wybierz barwniki i detektory:
      Kanał (CH1), Barwnik (DAPI), Detektor (SD1)
      Kanał (CH2), Barwnik (Alexa Fluor 48), Detektor (HSD3)
      Kanał (CH3), Barwnik (Alexa Fluor 647), Detektor (HSD4)
    3. W sekcji „Z” zaznacz opcję ON.
  2. Dostosuj obraz na żywo. Naciśnij przycisk Live w oknie Live.
    1. Ustaw ostrość oraz natężenie lasera (%), czułość (HV), wzmocnienie (gain) i offset w oknie narzędziowym „PMT”.
      1. Dostosuj natężenie lasera (%): w celu regulacji jasności i zapobiegania fotobieleniu. Wyższe natężenie lasera daje silniejszy sygnał, ale powoduje fotobielenie preparatu.
      2. Dostosuj czułość (HV): poziom szumów. Im wyższe HV, tym silniejszy sygnał, jednak zbyt wysoka wartość spowoduje pojawienie się szumów na obrazie.
        UWAGA: Zawsze utrzymuj stałe napięcie.
      3. Dostosuj offset: poziom tła.
    2. Dla stosów Z wybierz Start/End (15 przekrojów).
  3. Rozpocznij akwizycję.
    1. Wybierz folder do zapisu obrazów. Naciśnij przycisk LSM Start, aby rozpocząć akwizycję obrazu. Naciśnij przycisk Series Done, aby zakończyć proces akwizycji.

6. Analiza danych

  1. W celu analizy obrazów należy otworzyć oprogramowanie analityczne.
    1. W oknie narzędzia Batch należy wybrać obrazy do analizy oraz folder wyjściowy.
    2. W oknie narzędzia Analysis należy wybrać opcję Projection (wyświetli ona projekcję maksymalnej intensywności z 15 warstw).
    3. W sekcji Input/Output setting należy wybrać utworzoną partię.
    4. Należy nacisnąć Process, aby przetworzyć obrazy.
    5. Wyeksportować obrazy do plików w formacie .tiff.
  2. W celu ilościowego oznaczenia ognisk jądrowych należy otworzyć program CellProfiler.
    1. Otworzyć potok analizy ilościowej ognisk γH2AX i 53BP1 (patrz Supplemental information).
    2. Przedstawić dane na wykresach przy użyciu oprogramowania do tworzenia tabel.
  3. W celu analizy kolokalizacji należy otworzyć program CellProfiler.
    1. Otworzyć potok Colocalization (patrz Supplemental information). Zostanie utworzony plik arkusza kalkulacyjnego i zapisany w wybranym folderze. Same wykresy nie będą jednak zapisywane automatycznie. Zaleca się wykonanie zrzutów ekranu okien w celu zachowania dokumentacji wyników.
    2. Przedstawić dane na wykresach przy użyciu oprogramowania do tworzenia tabel.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W drugim dniu, czyli 24 h po wysianiu komórek na szkiełka nakrywki, komórki przechodzą jeden podział i osiągają 80% konfluencji. Specyficzne wyciszenia (knock-down) lub mutacje w białkach naprawy DNA mogą wydłużyć czas podwojenia lub zwiększyć wrażliwość komórek na działanie genotoksyczne, dlatego gęstość wysiewu oraz dawki traktowania powinny zostać odpowiednio dostosowane. Aby określić optymalne warunki pracy, przebieg odpowiedzi na uszkodzenia DNA w czasie można ustalić za pomocą Western blottingu białka γH2AX, a wraż...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Analiza czasu i skuteczności naprawy uszkodzeń DNA za pomocą mikroskopii okazała się niezbędna do zrozumienia, jak działa maszyneria naprawy DNA w normalnych komórkach i w patologiach ludzkich, takich jak rak.

Opracowanie specyficznych przeciwciał, które umożliwiają wykrywanie aktywowanych białek w ich ufosforylowanej wersji (takich jak γH2AX, pRPA, pRAD50 i inne 10,23,39,43) odegrało kluczową rolę w lepszym zrozumieniu czasu naprawy DNA i jego synchronizacji z cyklem komórkowym.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca została wsparta grantem z San Antonio Area Foundation. Mays Cancer Center jest wspierane przez NCI Cancer Center Support core grant P30 CA054174. Chcielibyśmy podziękować Stephenowi Hollowayowi za pomoc w pozyskiwaniu odczynników oraz laboratorium Sung za udostępnienie przestrzeni i możliwości mikroskopowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
16% (v/v) wodny roztwór paraformaldehydu (PFA)Mikroskopia elektronowa Sciences15710Jakość mikroskopowa PFA zapewnia najlepsze obrazy. Jeśli używasz "domowego PFA", przefiltruj przed użyciem.
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)Sigma-AldrichA3059Zalecana jest frakcja szoku cieplnego, aby uniknąć opadów/tła.
Szkiełko nakrywkowe #1, okrągłe 18 mm (szkiełka nakrywkowe)SzkiełkaNeuvitroNC0308920należy przed użyciem wyczyścić i wysterylizować HCl lub etanolem.
DMEM, Wysoka Glukoza [(+) 4,5 g/L D-Glukoza, (+) L-Glutamina, (-) Pirogronian Sodu]Gibco11965118Dostosuj podłoża uprawowe do potrzeb użytej linii komórkowej.
DPBS, bez wapnia, bez magnezuGibco14190144PBS do hodowli tkankowych.
Kwas bis(beta-aminoetylowy)-glikolu etylenowego-bis(beta;-aminoetylowego)-N,N,N′,N′-tetraoctowego (EGTA)Research Products InternationalE57060Bufor do ekstrakcji jądrowej.
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Life Technologies104370028Jakość FBS można ocenić, testując tworzenie ognisk gH2AX. Jeśli w partii obecne są śladowe ilości genotoksycznej endotoksyny, gH2AX będzie dodatni przy braku stresu.
Chlorek magnezu (MgCl2)Research Products InternationalM24000Bufor do ekstrakcji jądrowej.
Piperazyna-N,N′-bis (kwas 2-etanosulfonowy) (PIPES)Research Products InternationalP40150Bufor do ekstrakcji jądrowej.
SlowFade Diamond Antifade Mountant z DAPIInvitrogenS36973300 nM DAPI z VECTASHIELD Antifade Mounting Medium.
Chlorek sodu (NaCl)Research Products InternationalS23020Bufor do ekstrakcji jądrowej.
SacharozaResearch Products InternationalS24060Bufor do ekstrakcji jądrowej.
szkiełek mikroskopowych Superfrost PlusFisherbrand1255015Polysine Slides.
Płytki wielodołkowe poddane działaniu TC, rozmiar 12 dołkówCostar3513Wysiew na szkiełkach nakrywkowych odbywa się na płytce 12-dołkowej.
Triton X-100AmericanBioAB02025Bufor do ekstrakcji jądrowej.
TrypLE Express Enzyme (1X), bez Phenol RedGibco12604021Trypsin-EDTA.
Trypsin-EDTA (0,5%), No Phenol RedGibco15400054TrypLE.
nakrywkowe Zamiast tego można użyć Zamiast tego można użyć Zamiast tego można użyć Zamiast tego można stosować

Bibliografia

  1. Prakash, R., Zhang, Y., Feng, W., Jasin, M. Homologous recombination and human health: the roles of BRCA1, BRCA2, and associated proteins. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (4), 016600(2015).
  2. Jalan, M., Olsen, K. S., Powell, S. N. Emerging Roles of RAD52 in Genome Maintenance. Cancers (Basel). 11 (7), (2019).
  3. Oh, J., Symington, L. S. Role of the Mre11 Complex in Preserving Genome Integrity. Genes (Basel). 9 (12), (2018).
  4. Uziel, T., et al. Requirement of the MRN complex for ATM activation by DNA damage. The EMBO Journal. 22 (20), 5612-5621 (2003).
  5. Lee, J. H., Paull, T. T. ATM activation by DNA double-strand breaks through the Mre11-Rad50-Nbs1 complex. Science. 308 (5721), 551-554 (2005).
  6. Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139. Journal of Biological Chemistry. 273, 5858-5868 (1998).
  7. Kinner, A., Wu, W., Staudt, C., Iliakis, G. γ-H2AX in recognition and signaling of DNA double-strand breaks in the context of chromatin. Nucleic Acids Research. 36 (17), 5678-5694 (2008).
  8. Martin, O. A., Pilch, D. R., Redon, C., Bonner, W. M. Histone H2AX in DNA damage repair. Cancer Biology & Therapy. 2 (3), 233-235 (2003).
  9. Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo. Journal of Cell Biology. 146 (5), 905-916 (1999).
  10. Stucki, M., et al. MDC1 directly binds phosphorylated histone H2AX to regulate cellular responses to DNA double-strand breaks. Cell. 123 (7), 1213-1226 (2005).
  11. Lou, Z., et al. MDC1 maintains genomic stability by participating in the amplification of ATM-dependent DNA damage signals. Molecular Cell. 21 (2), 187-200 (2006).
  12. Chapman, J. R., Jackson, S. P. Phospho-dependent interaction between NBS1 and MDC1 mediate chromatin retention of the MRN complex at sites of DNA damage. EMBO Reports. 9 (8), 795-801 (2008).
  13. Melander, F., et al. Phosphorylation of SDT repeats in the MDC1 N terminus triggers retention of NBS1 at the DNA damage-modified chromatin. Journal of Cell Biology. 181 (2), 213-226 (2008).
  14. Branzei, D., Foiani, M. Regulation of DNA repair throughout the cell cycle. Nature Review. Molecular Cell Biology. 9 (4), 297-308 (2008).
  15. Chiruvella, K. K., Liang, Z., Wilson, T. E. Repair of double-strand breaks by end joining. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (5), 012757(2013).
  16. Mehta, A., Haber, J. E. Sources of DNA double-strand breaks and models of recombinational DNA repair. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 6 (9), 016428(2014).
  17. Symington, L. S., Gautier, J. Double-strand break end resection and repair pathway choice. Annual Review of Genetics. 45, 247-271 (2011).
  18. Huertas, P. DNA resection in eukaryotes: deciding how to fix the break. Nature Structural & Molecular Biology. 17 (1), 11-16 (2010).
  19. Nimonkar, A. V., et al. BLM-DNA2-RPA-MRN and EXO1-BLM-RPA-MRN constitute two DNA end resection machineries for human DNA break repair. Genes & Development. 25 (4), 350-362 (2011).
  20. Garcia, V., Phelps, S. E. L., Gray, S., Neale, M. J. Bidirectional resection of DNA double-strand breaks by Mre11 and Exo1. Nature. 479 (7372), 241-244 (2011).
  21. Sturzenegger, A., et al. DNA2 cooperates with the WRN and BLM RecQ helicases to mediate long-range DNA end resection in human cells. Journal of Biological Chemistry. 289 (39), 27314-27326 (2014).
  22. Daley, J. M., Niu, H., Miller, A. S., Sung, P. Biochemical mechanism of DSB end resection and its regulation. DNA Repair. 32, 66-74 (2015).
  23. Sartori, A. A., et al. Human CtIP promotes DNA end resection. Nature. 450 (7169), 509-514 (2007).
  24. Chen, L., Nievera, C. J., Lee, A. Y. L., Wu, X. Cell cycle-dependent complex formation of BRCA1-CtIP-MRN is important for DNA double-strand break repair. Journal of Biological Chemistry. 283, 7713-7720 (2008).
  25. Yun, M. H., Hiom, K. CtIP-BRCA1 modulates the choice of DNA double-strand break repair pathway throughout the cell cycle. Nature. 459 (7245), 460-463 (2009).
  26. Sung, P., Klein, H. Mechanism of homologous recombination: mediators and helicases take on regulatory functions. Nature Review. Molecular Cell Biology. 7, 739-750 (2006).
  27. San Filippo, J., Sung, P., Klein, H. Mechanisms of eukaryotic homologous recombination. Annual Review of Biochemistry. 77, 229-257 (2008).
  28. Jasin, M., Rothstein, R. Repair of strand breaks by homologous recombination. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (11), 012740(2013).
  29. Dynan, W. S., Yoo, S. Interaction of Ku protein and DNA-dependent protein kinase catalytic subunit with nucleic acids. Nucleic Acids Research. 26 (7), 1551-1559 (1998).
  30. Lieber, M. R. The mechanism of double-strand DNA break repair by the nonhomologous DNA end-joining pathway. Annual Review of Biochemistry. 79, 181-211 (2010).
  31. Cejka, P. DNA end resection: nucleases team up with the right partners to initiate homologous recombination. Journal of Biological Chemistry. 290 (38), 22931-22938 (2015).
  32. Mirman, Z., de Lange, T. 53BP1: a DSB escort. Genes & Development. 34, 7-23 (2020).
  33. Cao, L., et al. A selective requirement for 53BP1 in the biological response to genomic instability induces by BRCA1 deficiency. Molecular Cell. 35 (4), 534-541 (2009).
  34. Zimmermann, M., de Lange, T. 53BP1: Pro choice in DNA repair. Trends in Cell Biology. 24 (2), 108-117 (2014).
  35. Mavragani, I. V., Nikitaki, Z., Kalospyros, S. A., Georgakilas, A. G. Ionizing Radiation and Complex DNA Damage: From Prediction to Detection Challenges and Biological Significance. Cancers (Basel). 11 (11), (2019).
  36. Nikitaki, Z., et al. Measurement of complex DNA damage induction and repair in human cellular systems after exposure to ionizing radiations of varying linear energy transfer (LET). Free Radical Research. 50, sup1 64-78 (2016).
  37. Redon, C., et al. Histone H2A variants H2AX and H2AZ. Current Opinion in Genetics & Development. 12 (2), 162-169 (2002).
  38. Fernandez-Capetillo, O., Lee, A., Nussenzweig, M., Nussenzweig, A. H2AX: the histone guardian of the genome. DNA Repair. 3 (8-9), 959-967 (2004).
  39. Paull, T. T., et al. A critical role for histone H2AX in recruitment of repair factors to nuclear foci after DNA damage. Current Biology. 10 (15), 886-895 (2000).
  40. Sy, S. M. H., Huen, M. S. Y., Chen, J. PALB2 is an integral component of the BRCA complex required for homologous recombination repair. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (17), 7155-7160 (2009).
  41. Buisson, R., Masson, J. Y. PALB2 self-interaction controls homologous recombination. Nucleic Acids Research. 40 (20), 10312-10323 (2012).
  42. Belotserkovskaya, R., et al. PALB2 chromatin recruitment restores homologous recombination in BRCA1-deficient cells depleted of 53BP1. Nature Communications. 11 (1), 819(2020).
  43. Betts, J. A., et al. Long noncoding RNAs CUPID1 and CUPID2 mediate breast cancer risk at 11q13 by modulating the response to DNA damage. American Journal of Human Genetics. 101 (2), 255-266 (2017).
  44. Dray, E., et al. Molecular basis for enhancement of the meiotic DMC1 recombinase by RAD51 associated protein 1 (RAD51AP1). Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (9), 3560-3565 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Technika immunofluorescencjiwykrywanie ognisk bia kowychanaliza kolokalizacjiogniska gamma H2AXhodowla kom rek HeLanapromieniowanie gammabarwienie przeciwcia amiobrazowanie mikroskopowekwantyfikacja j drowa
Wizualizacja oddziaływania białek naprawy DNA za pomocą immunofluorescencji
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.