Udar mózgu jest globalnym problemem, z minimalnymi możliwościami leczenia i brakiem obecnie klinicznej terapii regenerującej utraconą tkankę mózgową. W tym miejscu opisujemy metody tworzenia precyzyjnego udaru fotozakrzepowego w korze ruchowej gryzoni, a następnie wstrzykiwania biomateriałów hydrożelowych w celu zbadania ich wpływu na regenerację tkanek po udarze.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Wstrzyknięcie hydrożelowych rusztowań biomateriałowych do mózgu po udarze mózgu
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Udar mózgu jest główną przyczyną niepełnosprawności i piątą najczęstszą przyczyną zgonów w Stanach Zjednoczonych. Około 87% wszystkich udarów to udary niedokrwienne i definiuje się je jako nagłe zablokowanie naczynia dostarczającego krew do mózgu. W ciągu kilku minut od zablokowania komórki zaczynają obumierać, co powoduje nieodwracalne uszkodzenie tkanek. Obecne terapie terapeutyczne koncentrują się na usuwaniu skrzepów lub lizie, aby umożliwić reperfuzję i zapobiec poważniejszym uszkodzeniom mózgu. Chociaż przejściowa plastyczność mózgu może z czasem uratować część uszkodzonej tkanki, znaczna część pacjentów pozostaje z deficytami neurologicznymi, które nigdy nie zostaną rozwiązane. Brakuje opcji terapeutycznych w leczeniu deficytów neurologicznych spowodowanych udarem mózgu, co podkreśla potrzebę opracowania nowych strategii leczenia tej rosnącej populacji pacjentów. Biomateriały do wstrzykiwań są obecnie projektowane w celu zwiększenia plastyczności mózgu i poprawy naprawy endogennej poprzez dostarczanie substancji czynnych lub komórek macierzystych. Jedną z metod testowania tych podejść jest wykorzystanie modelu udaru gryzoni, wstrzyknięcie biomateriału do rdzenia udaru i ocena naprawy. Znajomość dokładnej lokalizacji rdzenia udarowego jest niezbędna do dokładnego leczenia po udarze, dlatego preferowany jest model udaru, który zapewnia przewidywalną lokalizację udaru, aby uniknąć konieczności obrazowania przed wstrzyknięciem. Poniższy protokół omówi, jak wywołać udar fotozakrzepowy, jak wstrzyknąć hydrożel w kontrolowany i precyzyjny sposób oraz jak usunąć i kriosekcję mózgu, zachowując nienaruszony biomateriał. Ponadto podkreślimy, w jaki sposób te same materiały hydrożelowe mogą być wykorzystywane do jednoczesnego dostarczania komórek macierzystych. Protokół ten można uogólnić na stosowanie innych biomateriałów do wstrzykiwania do rdzenia udaru.
Wprowadzenie
Udar mózgu jest główną przyczyną niepełnosprawności i piątą najczęstszą przyczyną zgonów w Stanach Zjednoczonych1. Około 87% wszystkich udarów to udary niedokrwienne, podczas gdy większość z pozostałych 13% to udary krwotoczne2. Udar niedokrwienny definiuje się jako zablokowanie przepływu krwi w tętnicy do otaczającej tkanki. Ta okluzja powoduje niedobór tlenu i późniejszą martwicę, która często prowadzi do trwałej niepełnosprawności u pacjentów, którzy przeżyli. Chociaż nastąpił spadek śmiertelności z powodu udaru mózgu3, oczekuje się, że do 2030 r. jego częstość występowania wzrośnie do 3,4 miliona osób4. Ten wzrost liczby niepełnosprawnych osób, które przeżyły, i wynikające z tego obciążenie ekonomiczne doprowadziły do nacisku na badania nad udarem, które koncentrują się na mechanizmach naprawy neuronów. Po udarze następuje okres zapalny, który prowadzi do powstania blizny, która zapobiega rozszerzaniu się martwiczego obszaru. Obszar otaczający rdzeń martwiczy jest określany jako "okołozawałowy" i istnieją mocne dowody na to, że plastyczność w tym regionie, która obejmuje zwiększoną angiogenezę, neurogenezę i kiełkowanie aksonów, jest bezpośrednio związana z obserwowanym powrotem do zdrowia w modelach zwierzęcych i ludziach5. Ponieważ nie ma modeli in vitro, które mogłyby prawidłowo odtworzyć złożone interakcje po udarze, modele zwierzęce są niezbędne w badaniach nad udarem.
Istnieje kilka modeli in vivo, które mogą być użyte do wywołania udaru niedokrwiennego. Jednym z najczęstszych modeli stosowanych u myszy jest okluzja tętnicy środkowej mózgu lub MCAo, poprzez dystalną lub proksymalną (za pośrednictwem włókna wewnątrztętniczego) okluzji. Model proksymalny, znany również jako włókno MCAo (fMCAo), zazwyczaj powoduje duże udary niedokrwienne, które obejmują od 5% do 50% półkuli mózgowej, w zależności od liczby czynników6. W tych modelach szew lub włókno jest przesuwane z tętnicy szyjnej wewnętrznej do podstawy tętnicy środkowej mózgu (MCA) i utrzymywane na miejscu przez określony czas. Ta metoda okluzji, która może być tymczasowa lub trwała, powoduje zawał, który jest wyśrodkowany w prążkowiu i może, ale nie musi, obejmować nałożenie kory mózgowej6. Uzyskana wielkość skoku jest bardzo zmienna, a techniki obrazowania, takie jak doppler laserowy, są wymagane, aby potwierdzić skuteczność zabiegu u każdej myszy. Okluzja filamentu wewnątrztętniczego lub wewnątrzświetlnego, która trwa dłużej niż 30 minut, powoduje pociągnięcia na większym końcu zakresu rozmiarów. Niektórzy badacze skupili się na krótszych czasach okluzji włókien, które wymagają znacznego skupienia eksperymentalnego i walidacji laboratoryjnej7. Modele MCAo włókien u myszy przebiegają podobne etapy śmierci komórki, progresji niedokrwiennej i tworzenia obszaru okołozawałowego, jak obserwowano w przypadkach udaru u ludzi; Jednak większe udary bardziej przypominają stan chorobowy złośliwych zawałów mózgu, które są mniej powszechne, mniej uleczalne u ludzi6. Tymczasem dystalna niedrożność MCA wymaga bardziej skomplikowanej operacji i kraniektomii. W tym modelu dystalna część MCA, która biegnie wzdłuż powierzchni mózgu, jest bezpośrednio zasłonięta opaską szwową lub kauteryzacją. W niektórych odmianach tej techniki tętnice szyjne są jednostronnie lub przejściowo obustronnie niedrożne. Zaletą dystalnego MCAo jest to, że wytwarza on udar oparty na korze mózgowej, który jest mniej zmienny pod względem wielkości niż model żarnika. Jednak model dystalny powoduje gorsze wyniki behawioralne z powodu przecięcia tętnicy szyjnej zewnętrznej (ECA), co jest również problemem w przypadku fMCAo6.
Alternatywnym modelem udaru, który jest znany z tego, że jest mniej inwazyjny, jest model fotozakrzepowy (PT). Model PT skutkuje dobrze zdefiniowaną lokalizacją niedokrwienia i jest związany z wysokim wskaźnikiem przeżycia8. Technika ta opiera się na światłoczułym barwniku wstrzykiwanym dootrzewnowo, który pozwala na wewnątrznaczyniowe fotoutlenianie po prostu poprzez naświetlanie pożądanej tkanki światłem lub laserem9. Po wzbudzeniu powstają rodniki tlenowe, które powodują uszkodzenie śródbłonka, co aktywuje agregację płytek krwi i tworzenie skrzepów w napromieniowanym obszarze8,9. Ścisła kontrola nad rozmiarem i lokalizacją skoku, a także wysoka odtwarzalność modelu PT sprawiają, że idealnie nadaje się on do badania biomateriałów. Chociaż precyzja jest możliwa dzięki laserowi i współrzędnym stereotaktycznym, istnieją pewne wady, które mogą sprawić, że model ten będzie mniej idealny do niewielu badań. W przeciwieństwie do modelu fMCAo, model skoku PT nie może być ponownie sperfuzowany. W związku z tym materiały do badania środków neuroprotekcyjnych specyficznych dla uszkodzeń po reperfuzji lub mechanizmów po reperfuzji nie byłyby tutaj przydatne8. Dodatkowo, ze względu na urazy mikronaczyniowe modelu PT, obserwuje się stosunkowo mały półcień niedokrwienny. Zamiast tego występuje miejscowy obrzęk naczyniopochodny, który jest nietypowy dla udaru u człowieka, co sprawia, że model ten jest niepożądany w przedklinicznych badaniach leków skoncentrowanych na obszarze okołozawałowym6,8.
Ogólnym celem strategii biomateriałów w udarze mózgu jest albo dostarczenie czynników bioaktywnych, albo działanie jako zastępcza macierz zewnątrzkomórkowa dla wzrostu tkanki mózgowej. Jedną ze strategii, którą będziemy badać przy użyciu naszych metod, jest dostarczanie hydrożelu bezpośrednio do rdzenia udaru, w przeciwieństwie do tkanki okołozawałowej, gdzie dostarczanych jest wiele obecnych terapii komórkowych10. Uzasadnieniem tego podejścia jest to, że dostarczenie do martwiczej tkanki znajdującej się w rdzeniu pozwoli uniknąć zakłócenia otaczającej zdrowej lub regenerującej się tkanki. Zakładamy, że dyfuzja wszelkich substancji czynnych zawartych w biomateriale będzie w stanie dotrzeć do okołozawałowego z rdzenia, zwłaszcza, że okazuje się, że dostarczanie biomateriałów hydrożelowych zmniejsza grubość blizny glejowej11. Jest to ważne, ponieważ wykazano, że obszar okołozawałowy wykazuje neuroplastyczność po udarze, co czyni go atrakcyjnym celem. Co więcej, dostarczenie macierzy zastępczej do rdzenia udaru może być obciążone czynnikami angiogenicznymi12 lub neurogenic13, które kierują tworzeniem nowej tkanki, a także komórkami do dostarczania14. Dostarczanie komórek jest znacznie ulepszone dzięki zastosowaniu matrycy, ponieważ chroni ona komórki przed silnymi siłami iniekcji i lokalnym środowiskiem obecnym podczas porodu, a także zachęca do różnicowania i wszczepiania15.
Te wstrzykiwalne biomateriały terapeutyczne mają kliniczne znaczenie w zastosowaniach związanych z udarem, ponieważ obecnie nie ma terapii medycznych, które stymulowałyby regenerację neuronów po udarze. Podstawowe obwody neuronalne zaangażowane w powrót do zdrowia leżą w tkance mózgowej, która sąsiaduje z rdzeniem udarowym16, podczas gdy sam rdzeń udaru jest pozbawiony żywotnej tkanki nerwowej. Przewidujemy, że dostarczenie biomateriału do rdzenia martwiczego udaru ma potencjał do stymulowania sąsiedniej tkanki do procesów regeneracyjnych poprzez szereg wcześniej wymienionych mechanizmów, w tym uwalnianie czynników wzrostu w magazynie13, stymulację wzrostu tkanek i promowanie powrotu do rozwoju tkanki mózgowej11,12, zmiana odpowiedzi immunologicznej17oraz dostarczanie leków pochodzących z komórek macierzystych14,18. Jednak, aby skutecznie zbadać możliwości tych zastosowań, potrzebna jest spójna i powtarzalna metoda wywoływania udaru mózgu i wstrzykiwania biomateriałów. Model skoku PT wykorzystuje techniki, które zapewniają precyzyjną kontrolę nad orientacją i położeniem pociągnięcia. Laser przymocowany do urządzenia stereotaktycznego kieruje orientacją, a pompy podłączone do urządzeń stereotaktycznych kontrolują szybkość wtryskiwania materiału bez potrzeby dodatkowych form obrazowania. Dlatego zdecydowaliśmy się opisać metody wykonywania udaru PT w korze ruchowej myszy oraz wstrzykiwania biomateriałów do rdzenia udaru. W tym przypadku używamy hydrożeli z mikroporowatymi cząstkami wyżarzonymi (MAP) jako biomateriału do wstrzykiwań bez dodatku komórek lub czynników wzrostu. Ponadto wyjaśniamy, jak skutecznie odzyskać mózg z nienaruszonym biomateriałem i omawiamy testy immunochemiczne stosowane do analizy wyniku udaru z wstrzyknięciem biomateriałów i bez niego.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z IUCAC na Uniwersytecie Duke'a i Uniwersytecie Kalifornijskim w Los Angeles. W tym badaniu wykorzystano 8 do 12-tygodniowych samców myszy C57Bl/6J. Zwierzęta trzymano w kontrolowanej temperaturze (22 ± 2 °C), z 12-godzinnym cyklem światło-ciemność i dostępem do granulowanego pokarmu i wody ad libitum. Protokoły analgezji i sedacji są opisane jako zatwierdzone przez ICUCAC, ale mogą różnić się od protokołów stosowanych w innych laboratoriach.
Zwierzęta mogą zostać przedwcześnie poddane eutanazji, jeśli doświadczają nadmiernego niepokoju, wokalizacji (wskazującej na niekontrolowany ból), samookaleczenia, zmniejszonej lub upośledzonej mobilności, fizycznych objawów infekcji skórnej, utraty apetytu i/lub utraty wagi większej niż 10%-15% w wyniku operacji przetrwania. Nie ma przewidywanych skutków ubocznych po wstrzyknięciu żelu, ponieważ składa się on z naturalnie występującego polimeru w mózgu. Zwierzęta powinny być monitorowane codziennie, w tym w weekendy i święta, i ważone co drugi dzień. Badania z naszego laboratorium i innych nie wykazały żadnych deficytów w pielęgnacji, utraty masy ciała ani oznak / objawów odstawienia lub przewlekłego stresu u myszy po tych małych udarach korowych lub podkorowych. Jeśli zwierzęta wykazują jakiekolwiek oznaki miejscowego zakażenia raną głowy, powinny zostać poddane eutanazji. Zwierzęta powinny być również monitorowane pod kątem złej pielęgnacji, stanu ran i dowodów na walki między zwierzętami (rany pleców). Jeśli istnieją dowody na walkę lub rozejście się rany, zwierzęta należy najpierw leczyć po skontaktowaniu się z weterynarzami. Często wiąże się to z podawaniem antybiotyków w wodzie i/lub miejscowym stosowaniem antybiotyków. Jeśli te środki nie przyniosą uzdrowienia, zwierzęta powinny zostać poddane eutanazji.
1. Przygotowanie materiałów i instrumentów
- Przygotuj barwnik fotozakrzepowy przed zabiegiem. Odważyć 15 mg Rose Bengal do probówki mikrowirówkowej o pojemności 2 ml.
UWAGA: Róża bengalska może powodować poważne uszkodzenie/podrażnienie oczu.- Rozpuść Rose Bengal w 1,5 ml sterylnego, przefiltrowanego 1x PBS, aby uzyskać stężenie robocze 10 mg / ml.
- Obracaj probówkę, aż nie będą widoczne żadne grudki, wskazując, że barwnik całkowicie się rozpuścił, a następnie przykryj folią do dalszego użycia.
UWAGA: Wymagana ilość barwnika będzie zależeć od liczby myszy. Barwnik wstrzykuje się dootrzewnowo IP w stężeniu 10 μl/g, np. 200 μl na 20 g myszy.
- Włącz poduszkę grzewczą, aby utrzymać temperaturę ciała myszy podczas znieczulenia (37 °C).
- Przygotuj autoklawowane nożyczki, kleszcze, bawełnę, maść do oczu weterynarza, klej chirurgiczny lub materiał do szycia, niebieski lub marker chirurgiczny oraz sterylne chusteczki nasączone alkoholem i jodem beta. Przygotuj wiertło do kości ze sterylizowanymi głowicami wierteł.
- Włącz sterylizację kulek do 160 °C, aby umożliwić sterylizację narzędzi między operacjami na myszach. Odłóż na bok stożkową probówkę o pojemności 50 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej lub 1x PBS roztwór do późniejszego wykorzystania w celu utrzymania nawodnionego obszaru operacyjnego.
- Przymocuj laser do urządzenia stereotaktycznego. Nosząc laserowe okulary ochronne, zmierz moc lasera (mW).
UWAGA: Używaj laserowych okularów ochronnych zawsze, gdy laser jest włączony podczas zabiegu.- Dostosuj prąd na konsoli laserowej, postępując zgodnie z instrukcjami produkcji lasera, aż moc wyjściowa lasera wskaże 10 mW, i ustaw prąd jako wstępnie ustawiony na konsoli ekranu głównego. Następnie ponownie wyreguluj prąd, aby ustawić kolejne ustawienie wstępne, w którym moc wyjściowa lasera wynosi 40 mW. Teraz wyłącz laser do czasu dalszego użycia.
UWAGA: 10 mW zostanie użyte do orientacji lasera przed użyciem.
- Dostosuj prąd na konsoli laserowej, postępując zgodnie z instrukcjami produkcji lasera, aż moc wyjściowa lasera wskaże 10 mW, i ustaw prąd jako wstępnie ustawiony na konsoli ekranu głównego. Następnie ponownie wyreguluj prąd, aby ustawić kolejne ustawienie wstępne, w którym moc wyjściowa lasera wynosi 40 mW. Teraz wyłącz laser do czasu dalszego użycia.
- Przygotuj czystą klatkę dla myszy po operacji. Następnie umieść mysz w komorze indukcyjnej o stężeniu izofluranu 4%, aby znieczulić ją, aż spontaniczny ruch ustanie, a jej oddech zacznie się zmniejszać.
- Po zaśnięciu zważ mysz, aby określić, ile barwnika Rose Bengal należy wstrzyknąć. Następnie przenieś i zabezpiecz mysz do urządzenia stereotaktycznego za pomocą konserwacyjnego stężenia izofluranu 1,5%.
UWAGA: Zwiększenie stężenia izofluranu może rozszerzyć naczynia krwionośne i zapobiec wystarczającej okluzji lub udarom o stałej wielkości między myszami. - Nałóż maść do oczu weterynarza na oba oczy.
UWAGA: Obserwuj oddech i temperaturę przez cały czas trwania zabiegu i od czasu do czasu ściskaj palce u stóp, aby upewnić się, że mysz nic nie czuje.
2. Model udaru fotozakrzepowego9
- Zgol sierść z głowy myszy i aseptycznie przygotuj obszar za pomocą chusteczki nasączonej alkoholem, a następnie chusteczki z beta-jodem. Powtórz trzy razy.
UWAGA: Jeśli to konieczne, użyj dodatkowej chusteczki nasączonej alkoholem na końcu, aby usunąć cały jod beta, ponieważ powoduje on podrażnienie skóry, co prowadzi myszy do swędzenia czaszki po operacji. - Za pomocą małych nożyczek chirurgicznych wykonaj boczne nacięcie między uszami do oczu, około 1-2 cm. Zrób to, ciągnąc skórę w górę za pomocą kleszczy, aby stworzyć namiot, tnąc raz w dół, a następnie wkładając nożyczki do otworu i tworząc ciągłe nacięcie w linii środkowej.
- Oddziel skórę i lekko dociśnij kleszczemi kości ciemieniowe, aby zlokalizować bregmę. Oznacz bregmę kropką za pomocą markera chirurgicznego.
UWAGA: Ruch fragmentu kości uwydatnia przednią granicę kości ciemieniowych. Bregma jest centralnym punktem, w którym spotykają się fragmenty kości czołowej i ciemieniowej (Ryc. 1A). - Zakładając laserowe okulary ochronne, przesuń laser nad czaszką myszy, mocując urządzenie stereotaktyczne pod kątem 90°. Wybierz ustawienie wstępne 10 mW i włącz laser.
- Wyreguluj osie x i y lasera, aż znajdzie się bezpośrednio nad bregmą. Zresetuj x i y na konsoli wyświetlacza cyfrowego, a następnie przesuń laser o 1.8 mm w lewo od bregmy. Teraz przyłóż laser jak najbliżej czaszki, nie pozwalając mu dotknąć czaszki.
- Przesuń laser na 2.2 mm na lewo od bregmy, aby upewnić się, że może poruszać się bez żadnych przeszkód. Wyłącz laser.
- Wstrzyknąć odpowiednią ilość barwnika Rose Bengal dootrzewnowo (IP) za pomocą jednorazowej igły 29 G. Natychmiast uruchom minutnik na 7 minut, aby umożliwić systemową cyrkulację barwnika. Wybierz ustawienie wstępne na 40 mW bez włączania lasera.
UWAGA: Po zapoznaniu się z procedurą, barwnik można wstrzyknąć przed aseptycznym przygotowaniem myszy i zakończyć przed upływem 7 minut, aby zaoszczędzić czas. - Włącz laser (40 mW), gdy wyłączy się 7-minutowy timer, nosząc laserowe okulary ochronne i ustaw 10-minutowy timer.
- Po 10 minutach przesuń laser na 2,2 mm na lewo od bregmy, nie wyłączając go, i ustaw kolejny 10-minutowy timer.
- Gdy drugi 10-minutowy timer wyłączy się, zmień laser z powrotem na 10 mW i przesuń laser na 2.0 mm na lewo od bregmy. Zaznacz to miejsce markerem chirurgicznym. Następnie wyłącz laser.
- Podnieś laser i odblokuj go pod kątem 90°, aby można go było odsunąć od myszy. W tym momencie nałóż sterylną sól fizjologiczną lub PBS z bawełną, jeśli obszar operacyjny jest suchy.
- Wywierć małe serie w miejscu 2,0 mm prostopadłym do powierzchni czaszki.
UWAGA: Uważaj, aby wiercić powoli, aby nie wiercić zbyt głęboko i nie uderzać w mózg. Po przejściu wiertła przez czaszkę nastąpi niewielki spadek/zmiana oporu, a wiercenie może spowodować krwawienie.- Użyj bawełny, aby wchłonąć nadmiar krwi. Typowe jest to, że po wierceniu widać trochę krwi z naciętych tętnic w czaszce – nadmiar krwi oznacza, że wiertło trafiło w mózg. Jeśli tak się stanie, zapisz identyfikator myszy i przejdź dalej.
- Umieść małą chusteczkę obok myszy. Za pomocą kleszczy przyciągnij skórę do siebie, aby przygotować się do klejenia.
UWAGA: Zamiast tego można tutaj wykonać szycie. Szycie zazwyczaj wymaga tylko 3 szwów.- Za pomocą kleszczy chwyć obie strony skóry i pociągnij je do siebie i do góry. Zetrzyj wszelkie duże krople kleju chirurgicznego na końcu końcówki chusteczki przed nałożeniem na mysz.
- Klej chirurgiczny nakładać oszczędnie i przytrzymywać skórę kleszczami przez 10 sekund. Kontynuuj, aż nie będzie widocznych otworów.
UWAGA: Klej szybko wychodzi – nie ściskaj butelki. Unikaj przyklejania skóry do czaszki lub dostania się kleju do oka.
- Po sklejeniu lub zszyciu umieść mysz w nowej klatce, aby doszła do siebie po znieczuleniu. Zwierzę potrzebuje 5-10 minut, aby dojść do siebie i pomaga odpocząć połowę klatki na poduszce grzewczej.
3. Operacja pozorowanego skoku
- Wykonaj wszystkie procedury identycznie jak operację opisaną powyżej w sekcji 2, z wyjątkiem wstrzyknięcia 1x PBS lub soli fizjologicznej zamiast barwnika Rose Bengal .
4. Wstrzykiwanie hydrożelu lub innych biomateriałów
- Wykonaj iniekcję biomateriałów w czasie zdefiniowanym przez użytkownika. W tym eksperymencie zastrzyki wykonywano między 5 a 7 dniem po udarze. Wstrzykuje się 2 - 6 μl hydrożelu (zdefiniowanego przez użytkownika).
- Włącz poduszkę grzewczą, aby utrzymać temperaturę ciała myszy podczas znieczulenia (37 °C).
- Przygotuj autoklawizowane nożyczki, kleszcze, bawełnę, maść do oczu weterynarza, klej chirurgiczny lub materiał do szycia oraz sterylne chusteczki nasączone alkoholem i jodem beta. Przygotuj wiertło do kości za pomocą sterylnych końcówek wiertarskich i szklanych strzykawek Hamilton o pojemności 25 μl z metalowymi igłami 30 G.
- Włącz sterylizację kulek do 160 °C, aby umożliwić sterylizację narzędzi między myszami.
- Podłącz pompy wtryskowe do urządzenia stereotaktycznego. Ustaw natężenie przepływu na 1 μl/min i ustaw objętość na 4 μl.
- Przygotuj czystą klatkę dla myszy po operacji.
- Umieść mysz w komorze indukcyjnej o stężeniu izofluranu 4%, aby znieczulić ją, aż spontaniczny ruch ustanie, a jej oddech zacznie się zmniejszać, a tempo oddychania będzie powolne.
- Po zaśnięciu przenieś i zabezpiecz mysz do urządzenia stereotaktycznego o stężeniu konserwacyjnym izofluranu 1,5%.
- Nałóż maść do oczu weterynarza na oba oczy.
- Ogol futro, które mogło odrosnąć na głowie myszy, i aseptycznie przygotuj obszar za pomocą chusteczki nasączonej alkoholem, a następnie chusteczki z jodem beta. Powtórz trzy razy.
UWAGA: Jeśli to konieczne, użyj dodatkowej chusteczki nasączonej alkoholem na końcu, aby usunąć cały jod beta, ponieważ powoduje on podrażnienie skóry i prowadzi myszy do swędzenia czaszki po operacji.
- Używając małych nożyczek i/lub kleszczy, ponownie otwórz skórę nad mózgiem. Użyj bawełny ze sterylną solą fizjologiczną lub PBS, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia z czaszki. Widoczne będzie biało-żółte kółko (obrys, Rysunek 1B) i otwór na zadziory od wiertła. Jeśli martwa tkanka nie jest widoczna, prawdopodobnie nie doszło do udaru. Jeśli otwór zadziorów nie jest wyśrodkowany nad pociągnięciem, nawiercić ponownie, aby go wyśrodkować.
- Ustawić pompę wtryskową nad myszą i zablokować pod kątem 90°. Oczyścić strzykawkę sterylnym roztworem soli fizjologicznej lub roztworem PBS przed ponownym załadowaniem materiału.
- Po oczyszczeniu zdemontować szklaną strzykawkę tak, aby nie było igły. Ponownie naładować strzykawkę za pomocą pipety wyporowej o pojemności 25 μl z 10 μl hydrożelu (lub innego biomateriału, w tym przypadku z komórkami lub bez).
- Za pomocą tłoka strzykawki wepchnąć żel do końca przedniej części strzykawki. Następnie ponownie złożyć strzykawkę i kontynuować przeciskanie, aż żel zacznie widocznie wydzielać się z igły.
- Umieścić strzykawkę na pompie. Może być konieczne wyregulowanie tylnej części pompy, aby strzykawka pasowała. W tym celu należy ustawić natężenie przepływu na 30 μl/min, wybrać opcję Wycofanie lub Wstrzyknięcie w zależności od kierunku, w którym ma się poruszać, a następnie nacisnąć przycisk Start. Naciśnij Stop, gdy tył pompy znajdzie się we właściwym miejscu.
- Przykręcić tylną część pompy, tak aby strzykawka była dobrze zamocowana. Jeśli wcześniej dokonano regulacji, upewnij się, że natężenie przepływu jest ustawione z powrotem na 1 μl/min i jest ustawione na wstrzykiwanie.
- Przesuń pompę w kierunku x i y, aby zorientować ją nad otworem. Przesunąć pompę w dół w kierunku z, aż igła strzykawki dotknie górnej części otworu.
- Zresetuj literę Z na konsoli wyświetlacza cyfrowego. Następnie przesunąć strzykawkę w dół w kierunku z 0,750 mm. Jeśli strzykawka wygina się lub występuje opór, oznacza to, że czaszka albo się zagoiła, albo nie została całkowicie przewiercona i musi zostać ponownie nawiercona.
- Naciśnij Start na konsoli pompy, aby wstrzyknąć 4 - 6 μl hydrożelu z szybkością 1 μl/min.
- Ustaw 5-minutowy timer, gdy pompa przestanie wstrzykiwać, aby żel mógł rozpocząć sieciowanie.
- Po 5 minutach powoli pociągnąć strzykawkę do góry, obracając końcówkę z nob. Obserwuj, czy jakiś materiał nie został przypadkowo wyciągnięty lub nie wycieka z otworu. Odblokuj pompkę i odsuń ją od myszy, gdy igła znajdzie się wystarczająco daleko od czaszki.
- Za pomocą kleszczy, kleju chirurgicznego lub szwów zamknij skórę nad głową. Umieść mysz w czystej klatce i obserwuj jej regenerację. Mysz powinna potrzebować około 5 – 10 minut, aby dojść do siebie po znieczuleniu.
5. Perfuzja i pobieranie próbek
- Znieczulij mysz za pomocą izofluranu.
- Unieruchom zwierzę w pozycji leżącej na plecach i otwórz jamę brzuszną za pomocą środkowego cięcia. Opcjonalnie zaciśnij zstępującą aortę brzuszną, aby użyć mniej utrwalacza i PBS.
- Rozetnij przeponę i przesuń boki klatki piersiowej w górę, aby otworzyć jamę klatki piersiowej. Wprowadzić kaniulę perfuzyjną do lewej komory i wyciąć otwór w prawym przedsionku. Zacznij powoli perfuzjować za pomocą 10-20 ml PBS lub do momentu, gdy płyn stanie się półklarowny.
- Po oczyszczeniu zmień na 4% PFA na kolejne 10 – 20 ml. Odpięcie ramion pozwala im kurczyć się w miarę zaparzania PFA. Gdy przestaną się ruszać, odczekaj kolejne 30 sekund.
- Odetnij głowę zwierzęciu i odciągnij skórę, aby odsłonić czaszkę. Za pomocą, cienkich kleszczy ostrożnie usuń kawałki czaszki, aby odsłonić mózg. Należy zachować szczególną ostrożność podczas wyjmowania czaszki powyżej miejsca udaru. Można tu użyć małych nożyczek chirurgicznych, które pomogą wyciąć czaszkę. Największym wyzwaniem jest to, że żel przykleja się do czaszki i wydostaje się z mózgu podczas usuwania czaszki.
- Po odłączeniu mózgu umieść go w 10 – 15 ml 4% PFA na noc (nie dłużej niż 24 godziny).
- Następnego dnia przenieś mózgi z PFA do 30% sacharozy. Mózg jest gotowy do kriosekcji, gdy opadnie na dno (około 2 – 3 dni). W tym momencie można go również pozostawić do przechowywania.
6. Kriosekcja i barwienie
- Wyjmij mózg z sacharozy i umieść na szkiełku podstawowym . Odetnij niewielką część tylnej części mózgu żyletką, aby utworzyć płaską część, którą można zamontować na uchwycie.
- Umieść porcję związku o optymalnej temperaturze cięcia (OCT) na uchwycie, a następnie umieść mózg, płaską stroną do dołu, na uchwycie w OCT. Umieść tę próbkę na suchym lodzie do zamrożenia lub w kriosacie na bloku zamrażającym.
UWAGA: OCT można dodać, aby w pełni objąć mózg, aby zapobiec oddzielaniu się materiału od mózgu podczas sekcji.
- Umieść porcję związku o optymalnej temperaturze cięcia (OCT) na uchwycie, a następnie umieść mózg, płaską stroną do dołu, na uchwycie w OCT. Umieść tę próbkę na suchym lodzie do zamrożenia lub w kriosacie na bloku zamrażającym.
- Mózgi należy ciąć szeregowo na kriostacie w temperaturze -20 °C i odcinkach o grubości 30 μm na 10 szkiełkach pokrytych żelatyną. Zachowaj ostrożność podczas cięcia, uważając, aby nie zgubić hydrożelu. Jeśli ta część jest trudna, umieść trochę OCT na górze mózgu nad żelem (Rysunek 3). Przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu dalszego użycia.
- Wyjmij szkiełka z temperatury -80 °C i umieść je na tacy do barwienia, aby mogły wyschnąć. Szkiełka, które nie zostały zamrożone, a jedynie podzielone na sekcje, można również natychmiast poplamić.
- Za pomocą hydrofobowego pisaka narysuj okrąg wokół wycinków mózgu na szkiełku. Po wyschnięciu nawodnij plastry mózgu 1x przefiltrowanym PBS i umieść na shakerze w temperaturze pokojowej na 15 minut. Zajmuje to około 1 ml buforu na szkiełko z 9 – 12 sekcjami mózgu.
- Umyj szkiełka 1x przefiltrowanym PBS przez 5 minut w temperaturze pokojowej, powtórz trzy razy.
- Blokuj zjeżdżalnie przez 30 minut do godziny z 10% surowicą osła w 0,01% PBS-Triton X w temperaturze pokojowej na tancerce brzucha. Zajmuje to około 200 μl na szkiełko.
- Inkubować przeciwciało pierwotne w 10% surowicy osła z 0,01% PBS-Triton X przez noc w temperaturze 4°C na shakerze. Najpierw przetestuj przeciwciała pierwszorzędowe, aby określić prawidłowe stężenia. Tutaj użyto GFAP (1:400), Iba1 (1:250), Glut1 (1:500) (Rysunek 4).
- Umyj szkiełka 1x przefiltrowanym PBS następnego dnia przez 5 minut w temperaturze pokojowej, powtórz trzy razy.
- Inkubować z przeciwciałami drugorzędowymi w 10% surowicy osła w 0,01% PBS-Triton X i DAPI przez 2 godziny na wytrząsarce laboratoryjnej w temperaturze pokojowej. Dla wszystkich wtórnych i DAPI zastosowano 1:1,000.
- Myć szkiełka przez 5 minut 1x przefiltrowanym PBS.
- Pozostaw sekcje do wyschnięcia w temperaturze pokojowej w ciemności. Może to potrwać od 20 minut do 4 godzin; Umieszczenie szkiełek w eksykatorze może przyspieszyć ten proces.
- Odwodnienie ślizga się w rosnących stężeniach alkoholu (1 minuta na roztwór) 50%, 70%, 95%, 100% i 100%.
- Odtłuszczanie w pierwszej kąpieli ksylenu przez 1 min, a następnie w drugiej kąpieli ksylenu przez 5 min.
- Szybko wyjmij szkiełka pojedynczo i dodaj podłoże montażowe, podczas gdy sekcje mózgu są mokre ksylenem. Szybko dodaj szklane szkiełko nakrywkowe na wierzch. Należy użyć szkiełka nakrywkowego o odpowiedniej długości i grubości potrzebnej odpowiednio dla szkiełka podstawowego i mikroskopu używanego do obrazowania.
- Pozbądź się wszelkich pęcherzyków pod szkiełkiem nakrywkowym, delikatnie naciskając końcówką pipety ruchem na zewnątrz od środka szkiełka. Pozostaw DPX do wyschnięcia na 4 godziny do nocy w ciemności w temperaturze pokojowej.
- Użyj żyletki, aby zeskrobać zaschnięte medium montażowe, które wylało się na szkiełka. Przetrzyj szkiełka środkiem do czyszczenia soczewek. Preparaty można teraz obrazować za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.
UWAGA: Najlepiej przechowywać szkiełko w ciemności lub w temperaturze 4 °C do czasu zakończenia obrazowania.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Celem niniejszej metody było zademonstrowanie sposobu wstrzykiwania biomateriałów do mózgu po udarze. W celu kontrolowanego wyznaczenia rozmiaru i lokalizacji obszaru udarowego wykorzystano fototrombastyczny model z użyciem różu bengalskiego oraz lasera o długości fali 520 nm. Pięć dni po udarze obszar zawału można było zwizualizować podczas operacji (Rycina 1B) oraz na preparatach barwionych TTC oraz IHC obrazowanych mikroskopowo (Rycina 2). Zwiększenie średnic...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W tym miejscu demonstrujemy łatwy do odtworzenia, minimalnie inwazyjny, trwały model udaru i opisujemy, jak wstrzyknąć biomateriał do zawału pięć dni po udarze. Zastosowanie barwnika fotozakrzepowego Rose Bengal oraz lasera kolimacyjnego o długości fali 520 nm połączonego z urządzeniem stereotaktycznym daje nam możliwość ustawienia skoku w korze ruchowej myszy ze zwiększoną precyzją. Pięć dni po udarze lokalizacja zawału jest widoczna gołym okiem w centrum napromieniowania, 2,0 mm przyśrodkowo-bocznie do bregmy. Hydrożel...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy deklarują, że TS jest założycielem spółki Tempo Therapeutics, która dąży do komercjalizacji hydrożeli MAP.
Podziękowania
Chcielibyśmy podziękować Narodowym Instytutom Zdrowia oraz Narodowemu Instytutowi Zaburzeń Neurologicznych i Udaru za finansowanie (R01NS079691).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 10% normalna surowica kozia | VWR | 100504-028 | Do blokowania buforu |
| 2-warstwowa podkładka nasączona nasączkowa, sterylna, średnia | Medline | MDS090735 | |
| 25uL Strzykawka Hamilton 702RN, bez igły | Fishcer Scientific | 14824663 | Strzykawki używane do wstrzykiwania biomateriałów |
| 25uL Pipeta wyporowa | Gilson | M-25 | |
| 2x ekspander wiązki, 400-650nm | Thorlabs | GBE02-A | Ekspander wiązki laserowej |
| Regulowana platforma sceniczna | Kopf Instruments | 901 | |
| Transporter antyglukozy Przeciwciało GLUT1, królik | Abcam | ab113435 | |
| Przeciwciało anty-Iba1, koza | abcam | ab5076 | |
| BD Vacutainer Safety-Lok Zestawy do pobierania krwi. 25G, 12" | Medsupply 367294 | Do perfuzje | |
| BKF12- Matowa folia aluminiowa | Thorlabs | BKF12 | Do pokrycia wszystkiego, co odbija światło podczas korzystania z lasera. |
| Mini nożyczki do tęczówki kostnej - 3-1 / 2 " | Instrumenty chirurgiczne Sklar | 64-2035 | |
| C57BL/6 Myszy | Jackson Laboratory | 000664 | 8-12 tygodni |
| Montaż klatki Rob | Thorlabs | ER3-P4 | 3" Długi, średnica 6mm, 4 sztuki - do mocowania lasera do sterotax |
| Frezy ze stali węglowej o średnicy 0,5 mm | Fine Science Tools | 19007-05 | Do tworzenia otworów na zadziory |
| Siarczan potasu chromu(III) dwunastowodny | VWR | EM1.01036.0250 | |
| Kompaktowy sterownik do laserów pigtailowych | Waciki bawełniane Thorlabs | CLD1010LP | |
| VWR | 89031-288 | ||
| CP 25 | Gilson | F148012 | |
| Donkey anty-kozie IgG H& L (488) | abcam | ab150129 | |
| Osioł Anty-królik IgG H& L (647) | abcam | ab150075 | |
| Osioł Anty-szczurzy IgG H& L (555) | abcam | ab150154 | |
| EMS DPX Uchwyt | montażowy Elecron Microscopy Sciences | 13512 | Rozwiązanie montażowe do szkiełek |
| EMS Żelatyna w proszku Typ A 300 Bloom | Mikroskopia elektronowa Sciences | 16564 | Do szkiełek żelatynowych |
| EMS Paraformaldehyd, granulowany | VWR | 100504-162 | Do wytwarzania 45 PFA |
| ESD Zestaw do nawalania | Elmstat | WSKK5324SB | Konieczność ustawienia laserowej |
| płyty ściennej stołu światłowodowego, niegwintowanej | Thorlabs | HCA3 | Potrzeba podłączenia lasera do wału |
| Kopf FiberPort | Thorlabs | PAF-X-5-A | FC/APC& APC, f=4.6mm, 350-700nm, średnica 0.75mm |
| Nożyczki drobne - proste/ostre-/10cm | Fine Science Tools | 14028-10 | |
| Przeciwciało GFAP, szczur | Thermo Fisher Scientific | 13-0300 | |
| Płyta grzewcza | Kopf Instruments | HP-4M | |
| ImmEdge Hydrofobowy długopis barierowy | Vector Laboratories | H-4000 | Do barwienia szkiełek |
| IMPAC 6-Zintegrowane Centrum Anestezjologii dla Wielu Pacjentów | VetEquip | 901808 | |
| Podkładki do przygotowania jodu | Medx Supple | MED MDS093917H | |
| Kleszcze do biżuterii #5 | Chemikalia GFS | 46085 | |
| Laserowe okulary ochronne | Thorlabs | LG10B | Bursztynowe soczewki, 35% światła widzialnego (dostępne są również wersje goglami) |
| M27-1084 Potężna dioda LED Podwójna gęsia | szyja United Scope | LED-11C | |
| Medical USP Grade Oxygen | Airgas | OX USP250 | |
| Kleszcze opatrunkowe Miltex Adson, klasa preparcyjna | Intefra Miltex | V96-118 | |
| Mini przewód/akumulatorowy trymer dla małych zwierząt | Harvard aparatus | 72-6110 | |
| Mini-pompa o zmiennym przepływie | Thomas Scientific | 70730-064 | Pompa do perfuzji |
| Mózg myszy Matryce, plastry koronalne, 1mm | Kent Scientific | RBMA-200c | do plastrów TTC |
| Mysz Znieczulenie gazowe Uchwyt głowicy | Kopf Instruments | 923-B | |
| Skrzynka kontrolna Nanojet | Chemyx | 10050 | |
| Nagłówk pompy Nanojet | Chemxy | 10051 | Podłącz do urządzenia stereotaktycznego do wstrzykiwania biomateriału |
| Igła RN 30G PT STY 3, 0,5 cala | Fishcer Scientific | ||
| Listwy uszne bez pękania 60º | Kopf Instruments | 922 | |
| PBS Bufor pH 7,4 | VWR | 97062 338 | |
| Laser pigtaled 520 nm, 100mW, 5G Pin | Thorlabs | LP520-MF100 | |
| Szkiełka szklane o dodatnim | ładunku Hareta | AHS90-WH | |
| Miernik mocy | Thorlabs | PM100D | Służy do pomiaru mocy lasera |
| mW Puralube Vet Maść | Dr. Foster Smith | 9N-76855 | |
| Sonda doodbytnicza Mysz | kopf Instrumenty | Ret-3-ISO | |
| Rose Bengal Dye 95% | Sigma-Aldrich | 330000-5G | |
| Wał zmodyfikowany 8-32 otwór gwintowany o głębokości 1/2 " | Kopf Instruments | 1770-02 | Do podłączenia lasera do urządzenia sterotaktycznego |
| Smukły czujnik mocy fotodiody | Thorlabs | S130VC | Używany z energią miernik |
| SM1-Threaed 30 mm Płyta klatkowa o grubości 0,35 cala 2 Uchwyt zabezpieczający | CP02 | Do podłączenia ekspandera laserowego | |
| Sol-M U-100 Strzykawka insulinowa z oznaczeniami 1/2 jednostki 0,5 ml | VWR | 10002-726 | Do wstrzykiwania róży bengalskiej |
| System barwienia szkiełek StainTray | Simport Scientific | M920-2 | Do barwienia szkiełek |
| Urządzenie sterotaksyjne | Kopf Instruments | 940 | Instrument stereotaktyczny dla małych zwierząt |
| Studenckie kleszcze Adson -1x2 zęby | Fine Science Tools | 91127-12 | |
| Kleszcze studenckie - proste/szerokie Narzędzia | do nauki o drobnych | 91113-10 | |
| Regulator temperatury | Kopf Instruments | TCAT-2LV | |
| Związek Tissue-Tek OCT | VWR | 25608-930 | |
| Triton X-100 | VWR | 97063-864 | |
| Zacisk górnego wspornika | Kopf Instruments | 1770-c | Do podłączenia lasera do urządzenia sterotaktycznego |
| Vetbond Tissue Adhessive 3mL | Santa Cruz Biotechnology | sc-361931 | |
| Vogue Professional Moja manicurzystka | Bargin Source | 6400 | do zadziorów |
| Sterylizatory koralikowe | VWR VWR | 75999-328 | |
| Tissue Tek OCT związek | Sakura | 4583 | Do zatapiania tkanek |
Bibliografia
- National Center for Health Statistics. Health, United States, 2015: With Special Feature on Racial and Ethnic Health Disparities. , U.S. Department of Health and Human Services. Hyattsville, MD. No. 2016-123 (2016).
- Benjamin, E. J., et al. Heart disease and stroke statistics-2017 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 135 (10), 229(2017).
- Rosamond, W., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2007 update: a report from the American Heart Association Statistics Committee and Stroke Statistics Subcommittee. Circulation. 115 (5), 69(2017).
- Ovbiagele, B., et al. Forecasting the future of stroke in the united states: A policy statement from the American heart association and American stroke association. Stroke. 44 (8), 2361-2375 (2013).
- Carmichael, S. T. Themes and strategies for studying the biology of stroke recovery in the poststroke epoch. Stroke. 39 (4), (2008).
- Carmichael, S. T. Rodent models of focal stroke: size, mechanism, and purpose. NeuroRx: the journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutics. 2 (3), (2005).
- Qin, L., et al. An adaptive role for BDNF Val66Met polymorphism in motor recovery in chronic stroke. Journal of Neuroscience. 34 (7), 2493-2502 (2014).
- Fluri, F., Schuhmann, M. K., Kleinshnitz, C. Animal models of ischemic stroke and their application in clinical research. Drug Design, Development and Therapy. 9, 3445-3454 (2015).
- Talley Watts, L., Zheng, W., Garling, R. J., Frohlich, V. C., Lechleiter, J. D. Rose Bengal Photothrombosis by Confocal Optical Imaging In Vivo: A Model of Single Vessel Stroke. Journal of Visualized Experiments. (100), e52794(2015).
- Tuladhar, A., Payne, S. L., Scoichet, M. S. Harnessing the potential of biomaterials for brain repair after stroke. Frontiers. 5, 14(2018).
- Nih, L. R., Sideris, E., Carmicahel, S. T., Segura, T. Injection of microporous annealing particle (MAP) hydrogels in the stoke cavity reduces gliosis and inflammation and promotes NPC migration to the lesion. Advance Materials. 29 (32), (2017).
- Nih, L. R., Gojgini, S., Carmichael, S. T., Segura, T. Duel-function injectable angiogenic biomaterial for the repair of brain tissue following stroke. Nature Materials. 17, 642-651 (2018).
- Cook, D. J., et al. Hydrogel-delivered brain-derived neurotrophic factor promotes tissue repair and recovery after stroke. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 37, 1030-1045 (2017).
- Lam, J., Lowry, W. E., Carmichael, S. T., Segura, T. Delivery of iPS-NPCs to the stroke cavity within a hyaluronic acid matrix promotes the differentiation of transplanted cells. Advance Functional Materials. 24, 7053-7062 (2015).
- Nih, L. R., et al. Engineered HA hydrogel for stem cell transplantation in the brain: Biocompatibility data using a design of experiment approach. Data in Brief. 10, 202-209 (2016).
- Carmichael, S. T. The 3 Rs of Stroke Biology: Radial, Relayed, and Regenerative. Neurotherapeutics. 13, 348-359 (2016).
- Caicco, M. J., Cooke, M. J., Wang, Y., Tuladhar, A., Morshead, C. M., Shoichet, M. S. A hydrogel composite system for sustained epi-cortical delivery of Cyclosporin A to the brain for treatment of stroke. Journal of Controlled Release. 166 (3), 197-202 (2013).
- Moshayedi, P., et al. Systematic optimization of an engineered hydrogel allows for selective control of human neural stem cell survival and differentiation after transplantation in the stroke brain. Biomaterials. 105, 145-155 (2016).
- Lu, H., et al. Hemodynamic effects of intraoperative anesthetics administration in photothrombotic stroke model: a study using laser speckle imaging. BMC Neuroscience. 18 (10), (2017).
- Wiersma, A. M., Winship, I. R. Induction of Photothrombotic Stroke in the Sensorimotor Cortex of Rats and Preparation of Tissue for Analysis of Stroke Volume and Topographical Cortical Localization of Ischemic Infarct. Bio-protocol. 8 (10), (2018).
- Liang, H., et al. Region-specific and activity-dependent regulation of SVZ neurogenesis and recovery after stroke. PNAS. 116 (27), 13621-13630 (2019).
- Payne, S. L., Anandakumaran, P. N., Varga, B. V., Morshead, C. M., Nagy, A., Shoichet, M. S. In vitro maturation of human iPSC-derived neuroepithelial cells influences transplant survival in the stroke-injured rat brain. Tissue Engineering Part A. 24, 351-360 (2018).
- Lee, I. H., et al. Delayed epidural transplantation of human induced pluripotent stem cell-derived neural progenitors enhances functional recovery after stroke. Science Reports. 7, 1943(2017).
- Somaa, F. A., et al. Peptide-based scaffolds support human cortical progenitor graft integration to reduce atrophy and promote functional repair in a model of stroke. Cell Reports. 20, 1964-1977 (2017).
- Griffin, D. R., Weaver, W. M., Scumpia, P., Di Carlo, D., Segura, T. Accelerated wound healing by injectable microporous gel scaffolds assembled from annealed building blocks. Nature Materials. 14 (7), 737-744 (2016).
- Sideris, E. Y., Aaron, C. J., Carmichael, S. T., Segura, T. Hyaluronic acid particle hydrogels decrease cerebral atrophy and promote pro-reparative astrocyte/axonal infiltration in the core after ischemic stroke. bioRxiv. , (2019).
- Yu, H., et al. Combinated Transplantation of Neural Stem Cells and Collagen Type I Promote Functional Recovery After Cerebral Ischemia in Rats. The Anatomical Record. 293 (5), 911-917 (2010).
- Jin, K., et al. Transplantation of Human Neural Precursor Cells in Matrigel Scaffolding Improves Outcome from Focal Cerebral Ischemia after Delayed Postischemic Treatment in Rats. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 30 (3), 534-544 (2009).
- Gelderblom, M., et al. Temporal and spatial dynamics of cerebral immune cell accumulation in stroke. Stroke. 40 (5), 1849-1857 (2009).
- Wei, L., Erinjeri, J. P., Rovainen, C. M., Woolsey, T. A. Collateral growth and angiogenesis around cortical stroke. Stroke. 32 (9), 2179-2184 (2001).
- Zhang, R., et al. Activated Neural Stem Cells Contribute to Stroke-Induced Neurogenesis and Neuroblast Migration toward the Infarct Boundary in Adult Rats. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 24 (4), 441-448 (2004).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
