Artykuł metodologiczny

Grafenowa obudowa chemicznie utrwalonych komórek ssaków do mikroskopii elektronowej w fazie ciekłej

7.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61458

⸱

21 września 2020

 ,  , 
1INM-Leibniz Institute for New Materials, 2Department of Physics, Saarland University

W tym artykule

Podsumowanie

Prezentowany jest tutaj protokół oznaczania białek błonowych w komórkach ssaków i pokrywania próbki grafenem do skanowania w fazie ciekłej transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Za pomocą tego protokołu można również badać stabilność próbek w stosunku do uszkodzeń spowodowanych promieniowaniem.

Streszczenie

Opisano protokół badania receptora ludzkiego naskórkowego czynnika wzrostu 2 (HER2) w nienaruszonej błonie plazmatycznej komórek raka piersi za pomocą skaningowej transmisyjnej mikroskopii elektronowej (STEM). Komórki ssaczego raka piersi z linii SKBR3 hodowano na mikroczipach krzemowych z okienkami z azotku krzemu (SiN). Komórki unieruchomiono chemicznie, a białka HER2 znakowano nanocząstkami kropek kwantowych (QD), stosując dwuetapowy protokół wiązania biotyny i streptawidyny. Komórki zostały pokryte wielowarstwowym grafenem w celu utrzymania stanu uwodnienia i ochrony przed uszkodzeniem wiązki elektronów podczas STEM. W celu zbadania stabilności próbek pod wpływem promieniowania wiązką elektronów przeprowadzono eksperyment z serią dawek. Porównano próbki pokryte grafenem i niepowlekane. Uszkodzenia wywołane wiązką, w postaci jasnych artefaktów, pojawiły się w przypadku niektórych próbek niepowlekanych przy zwiększonej dawce elektronów D, podczas gdy na próbkach powlekanych nie pojawiły się żadne artefakty.

Wprowadzenie

Analiza funkcji białka błonowego jest niezbędna do badań biologicznych komórek i do opracowywania leków. Klasa ważnych eksperymentów obejmuje badanie pozycji białek błonowych w komórkach. Informacje te można wykorzystać do wyciągnięcia wniosków na temat składania białek w kompleksach białkowych i ich specyficznych lokalizacji w błonie komórkowej, która poprzez dynamiczne składanie i demontaż napędza szeroką gamę funkcji komórkowych. Do badania funkcji białek w komórkach wykorzystuje się między innymi mikroskopię świetlną (LM) i mikroskopię elektronową (EM). LM umożliwia analizę całych komórek w cieczy; Jednak rozdzielczość jest ograniczona do 200-300 nm dla konwencjonalnej i do 20 nm dla mikroskopii fluorescencyjnej w super rozdzielczości w warunkach praktycznych1,2. EM zapewnia około 1 A rozdzielczości3, ale konwencjonalne przygotowanie próbki wymaga odwodnienia, barwienia metalu w celu zwiększenia kontrastu obrazu i zatopienia w substancji montażowej, takiej jak żywica, do transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM)4. Aby zachować próbki biologiczne w bardziej natywnym środowisku, można zastosować techniki cryo-EM5,6. Próbki są szybko zamrażane w amorficznym lodzie i, w razie potrzeby, dzielone na sekcje. Inną opcją jest szczelinowanie zamrażające EM7.

EM techniki badania białek błonowych w nienaruszonych komórkach w ich naturalnym, płynnym stanie pojawiły się w ciągu ostatniej dekady8,9,10,11. Rozdzielczość przestrzenną 2 nm osiągnięto na białkach błonowych znakowanych kropkami kwantowymi (QD) w całych komórkach wyhodowanych na błonie SiN i otoczonych warstwą grafenu9.

Tutaj opisane są szczegóły protokołu znakowania białek i powlekania grafenem9,12. Celem tego protokołu jest analiza przestrzennego rozkładu HER2 w błonie całych, utrwalonych komórek, przy jednoczesnym zachowaniu komórek w stanie uwodnionym. Powłoka grafenem zapobiega wysychaniu komórek w próżni, a także zmniejsza uszkodzenia spowodowane promieniowaniem13. Metoda ta dostarcza informacji o znakowanych białkach błonowych w nienaruszonej błonie plazmatycznej, ale metoda ta nie jest przydatna do badania ultrastruktury komórkowej, jak to zwykle ma miejsce w przypadku EM.

Grafen jest najcieńszym znanym nanomateriałem i składa się z pojedynczego atomu węgla o grubości kryształu ułożonego w siatkę o strukturze plastra miodu14. Posiada unikalne właściwości, w tym wysoką elastyczność i wytrzymałość mechaniczną. Ostatnie badania wykazały, że grafen wolny od wad jest nieprzepuszczalny dla gazów i cieczy, ale defekty umożliwiają przenikanie wodoru15. Wyciek ten można zmniejszyć, stosując wielowarstwowy grafen, jaki jest tutaj stosowany. Grafen dwuwarstwowy okazał się ostatnio przydatny jako wsparcie dla próbek krio-EM, poprawiając jednorodność cienkiej warstwy lodu w porównaniu z tlenkiem grafenu, gdzie mogą powstawać tylko niejednorodne warstwy16. Wykazano również, że grafen zmniejsza uszkodzenia wiązki próbek biologicznych podczas mikroskopii elektronowej w fazie ciekłej13,17. Jako przykładowy eksperyment, HER2 wyrażany w linii komórkowej raka piersi SKBR3 ssaków został oznaczony QDs18, a jego rozkład przestrzenny zarejestrowany za pomocą STEM. Komórki zostały umieszczone na mikrochipie Si z przezroczystą elektronowo membraną SiN19. Mikroczipy zostały wybrane jako wsparcie, ponieważ są solidne, kompatybilne z LM i EM, a cała procedura etykietowania może być wykonana bezpośrednio na microchip19. Po przyłączeniu komórki, HER2 został oznaczony dwuetapowym protokołem etykietowania20. Po pierwsze, do HER2 przyłączono biotynylowany związek mimetyczny przeciwciała anty-HER221. Komórki zostały następnie chemicznie utrwalone, aby zapobiec grupowaniu receptorów wywołanym przez znacznik i zwiększyć stabilność ultrastruktury komórkowej. Odstępy QD pokryte streptawidyną powiązano następnie z kompleksem mimetycznym przeciwciał HER2. Jasny sygnał fluorescencyjny i gęste elektronowo jądro QD pozwoliły na korelacyjną mikroskopię fluorescencyjną i elektronową (CLEM)20. CLEM jest szczególnie przydatny, ponieważ regiony komórkowe będące przedmiotem zainteresowania do analizy STEM można wybrać z przeglądowych obrazów mikroskopii fluorescencyjnej, podkreślając lokalizację HER2 na komórkach. Komórki analizowano za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej w celu zidentyfikowania regionów komórkowych o wysokim poziomie HER2. Następnie arkusz grafenu o grubości 3-5 warstw został przeniesiony na komórki w celu powlekania9,22. Następnie próbka została zamontowana w uchwycie na próbki EM. Dane STEM uzyskano za pomocą pierścieniowego detektora ciemnego pola (ADF), dostarczając informacji o przestrzennym rozkładzie HER2 na powierzchni komórki w stosunku do lokalizacji na powierzchni komórki, ale nie podając żadnych informacji na temat ultrastruktury komórki. Aby określić stabilność próbki pod wpływem promieniowania wiązką elektronów, próbki badano przy rosnącej dawce (D) w serii obrazów. Zbadano różnicę między próbkami pokrytymi grafenem a próbkami niepowlekanymi. Oceniono kilka rodzajów uszkodzeń spowodowanych promieniowaniem.

Opisany tutaj protokół wykorzystuje linię komórkową raka piersi SKBR3 z nadekspresją HER2 jako model do kierowania na HER223. Protokół obejmuje przygotowanie dla porównania jednej próbki pokrytej grafenem i jednej podobnej próbki, ale bez powłoki grafenowej. Eksperyment jest przygotowywany w dwóch egzemplarzach, ponieważ okno SiN może się zepsuć raz na jakiś czas, a w większości przypadków w celu uzyskania duplikatu eksperymentalnego. Ogólna wydajność metody jest wysoka, co oznacza, że mikroczipy z komórkami pokrytymi grafenem są zwykle uzyskiwane z wyjątkowym błędem, mimo że nie całe okno SiN może być pokryte grafenem we wszystkich przypadkach. Duplikaty nie są opisane w protokole.

Protokół znakowania (kroki 1-5) jest porównywalny do protokołu znakowania receptora naskórkowego czynnika wzrostu w komórkach fibroblastów COS7 opublikowanego wcześniej24; szczegóły w tym artykule dotyczą obchodzenia się z mikroczipami i korzystania z płytek studzienkowych. Poniższy protokół jest zoptymalizowany pod kątem oznaczania HER2, powłoki grafenowej9 i badania tolerancji próbki na promieniowanie.

Protokół

1. Czyszczenie mikroczipów oraz powlekanie poli-L-lizyną (PLL) i białkiem podobnym do fibronektyny (FLP)

  1. Umieścić dwa mikroczipy z membraną SiN (2,0 x 2,6 mm) w 50 mL acetonu. Mikroczipy należy obchodzić się ostrożnie, stroną płaską do góry. Aby uniknąć uszkodzenia krawędzi, należy używać pęsety z płaskimi końcami. Podczas manipulacji pęsetą należy unikać dotykania górnej powierzchni mikroczipów, aby zapobiec pęknięciu okna SiN.
    UWAGA: Można również stosować pęsety powlekane politetrafluoroetylenem lub z końcówkami węglowymi, aby zapobiec uszkodzeniu mikroczipów.
  2. Myć czipy przez 2 min, ostrożnie wstrząsając zlewką i pilnując, aby mikroczipy się nie odwróciły.
  3. Przenieść mikroczipy do 50 mL etanolu i myć przez 2 min, ostrożnie wstrząsając zlewką. Przenoszenie musi odbyć się szybko, aby nadmiar acetonu nie wyschł na powierzchni.
  4. Myć mikroczipy w 50 mL wody przez 10 min.
  5. Zanurzyć mikroczipy w świeżo przygotowanej zlewce zawierającej 20 mL etanolu.
  6. Położyć mikroczipy na chusteczce do czystych pomieszczeń (cleanroom tissue) w celu osuszenia.
  7. Oczyścić mikroczipy plazmą przy użyciu 1,5 sccm O2 i 35 sccm Ar przy ciśnieniu 70 mTorr i mocy częstotliwości radiowej (RF) 50 W przez 5 min.
  8. Umieścić mikroczipy w komorze z laminarnym przepływem powietrza do sterylnej pracy z komórkami.
  9. Przygotować roztwór 0,01% PLL w wodzie. Przygotować roztwór 15 µg/mL FLP w soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS).
  10. Przygotować płytkę 24-dołkową w komorze z laminarnym przepływem powietrza i wypełnić poszczególne dołki 1 mL roztworów w następującej kolejności: dołek 1 – PLL; dołek 2 – woda; dołek 3 – woda; dołek 4 – FLP; dołek 5 – PBS oraz dołek 6 – PBS.
    UWAGA: Kroki mycia należy przeprowadzać poprzez zanurzanie mikroczipa w odpowiednim dołku płytki 24- lub 96-dołkowej na kilka sekund za pomocą pęsety. Kroki inkubacji należy przeprowadzać, inkubując mikroczipy w dołku 24- lub 96-dołkowym w wskazanym roztworze przez określony czas i w określonej temperaturze. Mikroczipy należy przenieść do kolejnego dołka w ciągu kilku sekund.
  11. Inkubować mikroczipy w roztworze PLL przez 5 min. Następnie dwukrotnie przemyć mikroczipy w wodzie.
  12. Inkubować mikroczipy w FLP przez 5 min. Następnie dwukrotnie przemyć mikroczipy w PBS.
  13. Przenieść oba mikroczipy do dołków (jeden mikroczip do każdego dołka) nowej płytki 96-dołkowej, uprzednio wypełnionej 50 µL pożywki bezsurowiczej do wysiewu komórek.
  14. Inkubować mikroczipy w temperaturze 37 °C i przy 5% CO2 do czasu przygotowania zawiesiny komórkowej.

2. Wysiewanie komórek na mikroczipy z membrany SiN

  1. Przygotuj wszystkie materiały i sprzęt w komorze z laminarnym przepływem powietrza, aby zapewnić sterylne warunki pracy.
  2. Jednokrotnie przemyj linię komórkową raka piersi SKBR3 w kolbie do hodowli komórkowej przy użyciu pożywki wzrostowej. Jako pożywkę wzrostową zastosuj zmodyfikowaną pożywkę Eagle’a Dulbecco (DMEM) zawierającą 10% płodowej surowicy bydlęcej (FCS) oraz 1% nieessentialnych aminokwasów (NEAAs).
  3. Inkubować komórki z 1 ml roztworu do odrywania komórek, aż do momentu ich odłączenia się od kolby.
  4. Do odseparowanych komórek w kolbie dodać 5 ml pożywki wzrostowej. Zawiesinę przenieść do probówki do wirowania.
  5. Pipeta 20 µL zawiesiny komórkowej do hemocytometru w celu oznaczenia stężenia komórek. Należy zastosować poniższy wzór.
    Wzór na stężenie komórek, równanie do obliczania gęstości komórek w policzonych kwadratach, zastosowanie edukacyjne..
  6. Przygotuj zawiesinę rozproszonych komórek o stężeniu 2,5 x 105 komórek/ml. Obliczyć wymaganą ilość przygotowanej zawiesiny komórkowej według wzoru:
    Wzór na stężenie komórek, 2,5×10^5 komórek/ml, stosowany w obliczeniach objętości do analiz laboratoryjnych.
    i dopełnić pożywkę wzrostową do pożądanego poziomu.
  7. Dodaj 100 µL zawiesiny komórkowej do dwóch dołków płytki 96-dołkowej zawierających mikroczipy powlekane PLL i FLP, z membraną SiN skierowaną do góry i 50 µL pożywki bezsurowiczej w taki sposób, aby każda studnia zawierała 25 0 komórek.
  8. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C oraz 5% CO22 przez 5 min, aby komórki przywarły do mikrochipu.
    UWAGA: Na tym etapie komórki mogą odczepić się od mikrochipu, ponieważ nie zdążyły się jeszcze przytwierdzić.
  9. Sprawdź gęstość komórek na mikroczipie za pomocą mikroskopu odwróconego. Upewnij się, że komórki pokrywają okienko, zachowując wystarczającą przestrzeń do rozplaszczenia się i przylegania (patrz Rysunek 1A).
    UWAGA: W razie potrzeby na tym etapie można dodać więcej komórek.
  10. Przenieść mikroczipy do nowych dołków zawierających 200 µL pożywki wzrostowej i inkubować w 37 °C oraz 5% CO22 przez noc.
  11. Następnego dnia po południu przenieś oba mikroचipy do pożywki bezsurowiczej (pożywki do głodzenia surowiczego), jeśli komórki spłaszczyły się i przyległy, osiągając w ocenie wizualnej konfluencję (tj. ułamek powierzchni okna pokryty komórkami) na poziomie około 2/3 (patrz Rysunek 1B). W razie potrzeby zmienić podłoże na wolne od surowicy, aby wprowadzić komórki w określony stan początkowy, niezbędny do porównania wyników między różnymi eksperymentami.25.
  12. Inkubować w temperaturze 37 °C oraz 5% CO22 przez noc.
    UWAGA: Należy pamiętać, że w przypadku innych linii komórkowych liczba komórek może się różnić w zależności od tempa wzrostu i morfologii komórek.

3. znakowanie HER2 i fiksacja

  1. Przygotować roztwory zgodnie z opisem w Tabeli uzupełniającej 1.
    1. Pracować pod laminarną komorą przepływową, aby zapewnić sterylność pracy. Użyć płytki 96-dołkowej, nazwanej płytką do znakowania I, i napełnić 6 dołków na jeden mikrochip 20 µL roztworów płytki do znakowania I: PBS/BSA, PBS/BSA/GS, mimetyk przeciwciała, PBS/BSA, PBS/BSA, PBS/BSA. Na każdy mikrochip przeznaczyć jeden rząd płytki (jedna litera na rząd, np. od A1 do A6). Podgrzać płytkę do znakowania do 37 °C.
    2. Pod wyciągiem przygotować płytkę 24-dołkową, nazwaną płytką do fiksacji, i napełnić 8 dołków na mikrochip 50 µL roztworów płytki do fiksacji: CB, FA, CB, PBS, PBS, PBS, PBS/glicyna, PBS/BSA.
      OSTRZEŻENIE: CB jest silnie toksyczny przy wdychaniu lub spożyciu oraz stwarza zagrożenie dla środowiska wodnego. Pracować pod wyciągiem z odpowiednią ochroną i utylizować CB zgodnie z kartą charakterystyki substancji (SDS). FA jest żrący i szkodliwy dla skóry oraz zdrowia. Pracować pod wyciągiem i zapoznać się z SDS w celu uzyskania informacji na temat obchodzenia się z substancją i jej utylizacji.
    3. Przygotować płytkę 96-dołkową, nazwaną płytką do znakowania II, i napełnić 4 dołki na mikrochip 20 µL roztworów płytki do znakowania II: QDs, PBS/BSA, PBS/BSA, PBS/BSA.
      UWAGA: W tym przypadku zastosowano płytkę 24-dołkową, aby lepiej widzieć mikrochipy w dołkach. Aby zużyć mniej mimetyku przeciwciał (krok 3.2) i QDs (krok 3.4), w tych krokach można użyć płytek 96-dołkowych.
  2. Znakować białko HER2 w komórkach.
    1. Po przygotowaniu płytek rozpocząć znakowanie, umieszczając mikrochipy w dołkach pierwszego rzędu płytki do znakowania I.
    2. Przemyć mikrochipy PBS/BSA w płytce 96-dołkowej oznaczonej jako płytka do znakowania I.
    3. Zablokować miejsca niespecyficzne, aby zapobiec niespecyficznemu wiązaniu mimetyku przeciwciała, inkubując z PBS/BSA/GS przez 5 min w temperaturze 37 °C i 5% CO2.
    4. Inkubować z 20 nM mimetykiem przeciwciała przez 10 min w temperaturze 37 °C i 5% CO2.
    5. Przemyć mikrochip trzy razy w PBS/BSA.
  3. Utrwalić komórki.
    1. Przenieść mikrochipy do 24-dołkowej płytki do fiksacji pod wyciągiem.
      UWAGA: Od tego momentu nie jest wymagana sterylna praca.
    2. Przemyć raz CB przez kilka sekund.
    3. Utrwalić komórki 3% FA przez 10 min.
    4. Przemyć raz CB i trzy razy PBS.
    5. Zablokować wolne grupy aldehydowe FA, inkubując z PBS-glicyną przez 2 min.
    6. Przemyć mikrochipy raz PBS-BSA.
  4. Przyłączyć QDs.
    1. Przenieść mikrochipy do 96-dołkowej płytki do znakowania II.
    2. Inkubować z 20 nM QDs przez 12 min.
    3. Przemyć mikrochipy dwukrotnie PBS/BSA.
    4. Przechowywać mikrochipy w dołku zawierającym PBS/BSA.

4. Mikroskopia świetlna utrwalonych komórek

  1. Przygotuj szalkę z szklanym dnem o średnicy 3,5 cm z 2 mL roztworu PBS/BSA.
  2. Pobierz pierwszy mikrochip, umieść go odwróconym do góry dnem (komórkami skierowanymi w dół) w szalce z szklanym dnem, a następnie umieść szalkę w mikroskopie fluorescencyjnym. Powoli zanurz mikrochip w cieczy, aby zapobiec uszkodzeniu komórek.
  3. Wykonaj obrazy w kontraście interferencyjnym (DIC) oraz obrazy fluorescencyjne każdego mikrochipu, używając obiektywu 40x i odpowiedniego kanału fluorescencji.
    UWAGA: W tym przypadku do detekcji QD65 stosowana jest długość fali wzbudzenia 540-580 nm oraz długość fali emisji 607-683 nm.
  4. Powtórz procedurę dla drugiego mikrochipu.

5. Postfiksacja

  1. Wszystkie etapy należy przeprowadzać pod wyciągiem (dygestorium).
  2. Napełnić 6 studzienek na mikrochip w płytce 96-dołkowej 20 µL odpowiednich roztworów po utrwalaniu:
    CB, GA, CB, PBS, PBS, PBS.
    OSTRZEŻENIE: GA jest niebezpieczny dla środowiska wodnego, szkodliwy dla skóry, układu oddechowego i oczu. Pracować pod wyciągiem i zapoznać się z kartą charakterystyki (SDS) w celu uzyskania informacji o obchodzeniu się z substancją i jej utylizacji.
  3. Umieścić oba mikrochipy w odpowiednich studzienkach komórkami skierowanymi do góry.
  4. Przepłukać raz roztworem CB.
  5. Utrwalić komórki w 2% GA przez 10 min.
  6. Przepłukać raz roztworem CB.
  7. Przepłukać trzy razy roztworem PBS/BSA.
    UWAGA: Pierwszy etap utrwalania za pomocą FA stabilizuje strukturę biologiczną, jednak nadal może dochodzić do ograniczonej dyfuzji białek błonowych, co może prowadzić do agregacji indukowanej przez znaczniki ze względu na obecność wielu cząsteczek streptawidyny na jeden QD. NależyTherefore maksymalnie skrócić czas trwania etapów eksperymentalnych od utrwalania FA do GA, aby zminimalizować dyfuzję białek w błonie.
  8. Przechowywać w PBS/BSA, aby zapobiec szokom osmotycznym, oraz w 0,02% azotku sodu (NaN3) w celu zapobiegania wzrostowi bakterii w temperaturze 4 °C do czasu powlekania grafenem w nowej płytce. Uszczelnić płytkę folią parafinową, aby zapobiec wysychaniu. Mikrochipy i komórki są stabilne do 2 tygodni przy przechowywaniu w 4 ˚C.
    OSTRZEŻENIE: NaN3 jest niebezpieczny dla środowiska wodnego i silnie toksyczny w przypadku połknięcia, kontaktu ze skórą lub wziewania. Pracować pod wyciągiem i zapoznać się z kartą charakterystyki (SDS) w celu uzyskania informacji o obchodzeniu się z substancją i jej utylizacji.

6. Oczyszczanie i przenoszenie grafenu na kryształy soli

  1. Oddziel grafen z polimetakrylanem metylu (PMMA) z polimerowego podłoża (Rysunek 2A).
    1. Nanieś pipetą kilka kropel wody na polimer wokół PMMA-grafenu.
      UWAGA: Należy upewnić się, że PMMA-grafen łatwo oddziela się od wspierającego polimeru, unosząc się na powierzchni wody.
    2. Zanurz polimer z PMMA-grafenem w wodzie pod kątem 30-45°, aby uwolnić PMMA-grafen.
      UWAGA: Polimer powinien być jedynie lekko zwilżony. Nanieśienie zbyt dużej ilości wody na polimer może spowodować uniesienie i ewentualne zagięcie PMMA-grafenu.
  2. Usuń zanieczyszczenia na bazie miedzi za pomocą roztworu nadsiarczanu sodu (Rysunek 2B).
    UWAGA: Komercyjny grafen hodowany na folii miedzianej często zawiera submikrometryczne pozostałości miedzi, które można usunąć za pomocą roztworu trawiącego miedź2.
    1. Przygotuj 50 mL 0,42 M roztworu nadsiarczanu sodu w wodzie.
    2. Przenieś PMMA-grafen do roztworu nadsiarczanu sodu stroną grafenu w dół, używając standardowego szkiełka przedmiotowego. PMMA-grafen będzie unosić się na powierzchni roztworu.
    3. Pozostaw PMMA-grafen w roztworze nadsiarczanu sodu na noc.
    4. Wyjmij PMMA-grafen z roztworu nadsiarczanu sodu i umieść go na czystej wodzie za pomocą szkiełka przedmiotowego. Pozostaw go na powierzchni wody na pół godziny.
    5. Powtórz poprzedni krok łącznie trzy razy, aby usunąć wszystkie pozostałości nadsiarczanu sodu z PMMA-grafenu.
  3. Przenieś PMMA-grafen na kryształ chlorku sodu (NaCl).
    1. Przygotuj nasycony roztwór NaCl w wodzie w czalce Petriego.
    2. Przenieś PMMA-grafen na powierzchnię roztworu NaCl stroną grafenu w dół, używając szkiełka przedmiotowego.
    3. Chwyć kryształ NaCl pęsetą i podnieś unoszący się PMMA-grafen.
      UWAGA: Rozmiar kryształu NaCl powinien być nieco większy niż rozmiar PMMA-grafenu, aby uniknąć zagięcia wystającego grafenu na krawędzi soli lub kontaktu grafenu z pęsetą. W tych eksperymentach do podniesienia i późniejszego podparcia arkusza grafenowego o wymiarach 10 mm x 10 mm wykorzystano kryształ NaCl o wymiarach 12 mm x 12 mm x 0,5 mm.
    4. Trzymaj pionowo zestaw PMMA-grafen na soli przez 2 min, aby nadmiar wody mógł odpłynąć.
    5. Pozostaw zestaw PMMA-grafen na soli do wyschnięcia w temperaturze pokojowej przez 30 min, a następnie wypal w piekarniku w temperaturze 10 °C przez 20 min, aby całkowicie usunąć wodę.
  4. Usuń PMMA poprzez płukanie acetonem (Rysunek 2C).
    1. Podgrzej aceton w szklanej czalce Petriego do temperatury ~50 °C na płycie grzewczej w dygestorium. Uważnie monitoruj temperaturę, aby uniknąć zapłonu.
    2. Zanurz zestaw PMMA-grafen na soli w czalce Petriego wypełnionej acetonem i pozostaw na 30 min w celu rozpuszczenia PMMA.
    3. Powtórz poprzedni krok łącznie trzy razy, używając każdego razem nowego, czystego acetonu.
    4. Pozostaw zestaw grafen na soli do całkowitego wyschnięcia na powietrzu przed wykorzystaniem go do przygotowania próbki.

7. Powlekanie grafenem

UWAGA: Procedura powlekania grafenem została przedstawiona schematycznie na Rysunku 3A.

  1. Przemyj jeden mikrochip przygotowany z utrwalonymi komórkami i znakowanym HER2 czystą wodą, aby usunąć wszelkie pozostałości soli z buforu. Umieść mikrochip na papierze filtracyjnym. Komórki są widoczne jako ciemne plamki (Rysunek 3B).
  2. Wytnij żyletką wielowarstwowy grafen z kryształu NaCl w kawałek pasujący do okna SiN mikrochipu.
  3. Przygotuj zlewkę z czystą wodą i oddziel grafen od kryształu NaCl, przechylając kryształ pod kątem około 45° względem powierzchni wody i dotykając jej. Grafen wypłynie na powierzchnię wody (Rysunek 3C).
  4. Zabierz grafen z powierzchni wody za pomocą metalowej pętli. Grafen będzie unosił się wewnątrz kropli pod pętlą (Rysunek 3D).
  5. Dotknij górnej powierzchni mikrochipu dolną częścią pętli. Mikrochip przyklei się do metalowej pętli. Grafen będzie widoczny na wierzchu mikrochipu (Rysunek 3E).
  6. Pod stereomikroskopem użyj papieru filtracyjnego, aby usunąć pozostałą wodę z mikrochipu, tak aby grafen pokrył wszystkie komórki w oknie SiN.
    UWAGA: Grafen będzie przesuwał się podczas odsączania. Upewnij się, że grafen pozostaje na górnej części okna, dotykając mikrochipu jedynie krawędzią papieru filtracyjnego.
  7. Za pomocą pęsety zdejmij mikrochip z metalowej pętli i połóż go na papierze filtracyjnym. Grafen jest widoczny jako fioletowy połysk na mikrochipie (Rysunek 3F).
  8. Przenieś mikrochip z papieru do podzielonej czarnej płytki Petri.
  9. Wprowadź pipetą kroplę wody do jednego z wolnych przedziałów i zamknij pokrywkę, aby zapewnić atmosferę nasyconą wodą.
  10. Zapieczętuj podzieloną płytkę folią parafinową i w razie potrzeby przechowuj w lodówce w temperaturze 4 °C do dalszych pomiarów.

8. Komórki macierzyste

  1. Skalibruj STEM przy energii wiązki 20 kV, używając próbki do wyrównania/testowej, aby uzyskać rozmiar sondy wynoszący co najmniej 0,2 nm poprzez regulację soczewek kondensacyjnych i prądu sondy I = 180 pA (informacje o prądzie sondy dla różnych ustawień mikroskopu są dostarczane przez producenta z dokładnością do 5%) oraz półkąt zbieżności wiązki wynoszący 13,2 mrad poprzez wstawienie przysłony. Ustaw zakres półkąta otwarcia detektora ADF STEM (wewnętrzny i zewnętrzny) na 68–280 mrad, regulując ustawienia soczewki projektora. Ustaw rozmiar obrazu STEM na 2048 x 2048 pikseli oraz czas ekspozycji piksela t = 6 µs.
  2. Umieść mikrochip z komórkami powleczymi grafenem w standardowym uchwycie do próbek TEM w taki sposób, aby komórki były skierowane górą.
  3. Wprowadź uchwyt do mikroskopu elektronowego.
  4. Nabyć obraz z ogólnym przeglądem przy powiększeniu (M) = 80x (Rysunek 4) przy użyciu ustawień określonych w kroku 8.1.
  5. Zidentyfikuj obszar zainteresowania na komórce.
  6. Obrazuj kropki kwantowe (QD) przy użyciu detektora ADF przy M = 80 0x przy rozmiarze piksela d = 1,3 nm (Rysunek 4) przy użyciu ustawień opisanych w kroku 8.1.
  7. Należy uzyskać obraz obszaru po ekspozycji przy mniejszym powiększeniu (tutaj, M = 50 0x) w celu ukazania odsłoniętego obszaru (Rysunek 4).
  8. Oblicz dawkę elektronów
    Równanie do obliczania przewodnictwa elektrycznego; mierzone jako D = lt / e * d²; koncepcja fizyczna.
    gdzie e jest ładunkiem elementarnym. Przy ustawieniach podanych powyżej,
    Równanie równowagi statycznej dla gęstości elektronowej, wzór przedstawiający obliczenia dla D=39 e/Ų.
    oraz błąd wynoszący 5%.
  9. Należy pozyskać 20 obrazów dla serii dawek przy tych samych ustawieniach, ale z t = 60 µs co skutkuje skumulowaną dawką wynoszącą
    Równanie stanu równowagi statycznej, obliczanie współczynnika dyfuzji D przy użyciu wzoru z czynnikiem wykładniczym..
  10. Aby potwierdzić obecność grafenu, przełącz mikroskop w tryb TEM przy M = 1 20x, wybierz obszar w pobliżu komórki i przełącz urządzenie w tryb dyfrakcyjny. Zarejestruj wzór dyfrakcyjny przy czasie ekspozycji 0,5 s, rozdzielczości 2048 x 2048 x 3 piksele i przysłonie wybranego obszaru o wartości 50 µm (Rysunek 4).
  11. Po zakończeniu sesji należy wyjąć próbkę z mikroskopu, umieścić mikrochip z powrotem w naczyniu z przedziałami, szczelnie zamknąć naczynie folią parafinową i przechowywać w lodówce w temperaturze 4 °C jeśli jest to wymagane do dalszych pomiarów.
  12. Wybierz drugi mikrochip, przygotowany w ten sam sposób co pierwszy, lecz bez powłoki grafenowej.
  13. Powtórz kroki 8.2–8.1, ale tym razem dla tej próbki. W celu porównania zarejestruj dyfraktogram przy zastosowaniu tych samych ustawień, co powyżej (Rysunek 4).

9. Analiza

UWAGA: W celu automatycznego wykrywania pozycji QD na obrazie STEM, analiza wykorzystuje wtyczkę do programu ImageJ (NIH) opracowaną lokalnie, zgodnie z opisem w innym opracowaniu20. Wtyczka jest dostępna na zapytanie.

  1. Oprogramowanie automatycznie wykonuje następujące kroki w celu wykrycia cząstek na obrazie STEM:
    1. Zastosuj filtr Gaussa w celu redukcji szumu pikselowego.
    2. Zastosuj filtr pasmowy szybkiej transformaty Fouriera (FFT), aby wyodrębnić wyłącznie nanocząstki.
    3. Wyznacz próg w celu binaryzacji obrazu.
    4. Do detekcji cząstek należy przyjąć średnicę cząstki wynoszącą 10 nm z tolerancją równą 2.
    5. Wykryj pozycje cząstek.
  2. Zmierzyć odległość od środka do środka dla dziesięciu par kropek kwantowych (QD) w każdej serii. W każdej serii zmierzono 10 odległości o różnych wartościach.
  3. Oblicz względną zmianę odległości między cząstkami, porównując każdą odległość z odległością w pierwszym obrazie, stosując wzór:
    Schemat formuły zmiany względnej służący do obliczania procentowej różnicy w odległościach między obrazami..

Wyniki

Rysunek 1A przedstawia komórki wysiane w taki sposób, aby okno było pokryte, ale z zachowaniem wystarczającej przestrzeni pozwalającej im na rozpłaszczenie się i przywiernięcie, co prowadzi do uzyskania konfluencji na poziomie około 2/3B&R (Rycina 1B). W przypadku wysiania zbyt wielu komórek na mikroczipie (Rycina 1C), brakuje wystarczającej przestrzeni, aby wszystkie komórki mogły przytwierdzić się do mikrochipu. Rycina 1D przedstawia ten sam mikrochip po 24 h. Więcej niż połowa komórek nie spłaszczyło się. Z drugiej strony, jeśli wysiano zbyt mało komórek (Rysunek 1E), w oknie z SiN po 24 h powstanie duża pusta przestrzeń, co widać na Rysunek 1F. Rysunek 1G przedstawia obraz DIC komórek w Rysunek 1A i Rycina 1B. Rycina 1H przedstawia odpowiadający obraz fluorescencyjny z nadanym żółtym kolorem, co wskazuje na pomyślne znakowanie HER2.

Reprezentatywne dane STEM przedstawiono w Rysunek 4Zbadano komórki SKBR3 pokryte grafenem (lewa kolumna) oraz niepokryte (prawa kolumna). Rycina 4A,B pokaż M = obrazy komórek w widoku ogólnym przy powiększeniu 80x. Obszary przedstawione jako wstawki zostały zobrazowane przy M = 80 0x podczas serii dawek, patrz Rycina 4C,DKropki kwantowe (QD) są tutaj widoczne jako jasne punkty. Rysunek 4E i Rycina 4F wyświetl M = obrazy powiększone 50 0x, uzyskane w miejscach odpowiadających prostokątom w Rysunek 4C,D. Oba obrazy zarejestrowano po pobraniu serii dawek z D = (7,8 ± 0,4) x 103 e-/Å2Seria dawek została zarejestrowana przy powiększeniu M = 80 00x. Obszary naświetlone można zidentyfikować jako prostokąty; prostokąt był wyraźnie widoczny w przypadku próbki niepowlekanej (Rycina 4F).

Aby potwierdzić obecność grafenu, zarejestrowano obrazy dyfrakcyjne obszarów pozbawionych komórek, ale z grafenem lub bez niego na oknie z SiN. Sześciokątna struktura grafenu została zaobserwowana na obrazie dyfrakcyjnym próbki pokrytej grafenem (Rycyna 4G), natomiast nie wystąpiła w próbce niepokrytej (Rycyna 4H). Obraz dyfrakcyjny monokrystalicznego grafenu wykazuje symetrię sześciokrotną ze względu na wysoce uporządkowaną strukturę sześciokątną grafenu. Zatem stwierdzenie struktury sześciokątnej wskazuje na obecność grafenu na próbkach.

W celu zbadania wpływu naświetlania wiązką elektronów na próbkę, wykonano serię obrazów STEM z kumulującą się dawką elektronów. Reprezentatywne wyniki dla próbek niepowlekanych oraz powlekanych grafenem przedstawiono w Rysunek 5A-D i Rysunek 5E-Godpowiednio. Wszystkie dane pozyskano na krawędzi komórki, gdzie jest ona najcieńsza, a zatem obserwowana struktura znajduje się najbliżej membrany SiN. Ekspozycja próbek niepowlekanych doprowadziła do pojawienia się jasnych struktur na powierzchniach komórek przy D = (1,9 ± 0,1) x 103 e-/Å2 (Rycina 5B). Struktury te stawały się większe przy wyższych dawkach, dzięki czemu były wyraźnie widoczne na ostatnim obrazie w serii przy D = (7,8 ± 0,4) x 103 e-/Å2 (Rycina 5C,D). Plamki te nie pojawiły się na żadnej z próbek powleczonych grafenem (Rycina 5E-G).

Dodatkowe mikroczipy przygotowano i zbadano zgodnie z opisanym powyżej protokołem. Łącznie przebadano sześć próbek powlekanych i siedem niepowlekanych. Dwie z siedmiu próbek niepowlekanych wykazały te artefakty. W żadnej z próbek powlekanych nie zaobserwowano dodatkowych jasnych punktów.

Jako kolejny parametr uszkodzeń radiacyjnych zbadano odległości między kropkami kwantowymi (QD). W przypadku wystąpienia uszkodzeń strukturalnych należałoby oczekiwać zmian w odległościach między QD. Zmiany odległości mierzono dla różnych par QD przy kumulatywnej dawce D dla zakresu odległości między parami. Rysunek 5H pokazuje, że średnia względna zmiana odległości cząstek dla próbek niepowlekanych pozostała poniżej 1,3%, podczas gdy średnia względna odległość dla próbek powlekanych pozostała poniżej 0,8%. Można zatem wywnioskować, że powłoka grafenowa ustabilizowała próbkę, jednak próbki wysuszone bez powłoki grafenowej również wykazały znaczną stabilność.

Analiza morfologii komórek za pomocą mikroskopii; porównanie ośmiopanelowe, skala 50 μm, wyniki eksperymentalne.
Rysunek 1: Wysiew komórek na oknie z SiN krzemowego mikrochipa i znakowanie HER2. (A) Reprezentatywny obraz obszaru okna z SiN z komórkami SKBR3 5 minut po wysianiu na mikrochipie. (B) Te same komórki po 24 h rozprzestrzenione na tym samym oknie z SiN. (C) komórki SKBR3 na mikroczipie krzemowym (Si) 5 minut po wysianiu. (D) Te same komórki co w (C) po 24 h. Komórki nie rozpłaszczyły się prawidłowo z powodu zbyt wysokiej gęstości wysiewu komórek na chipach. (E) Komórki na mikroczipie 5 min po wysianiu. (FW okienku widoczne było tylko kilka komórek, ponieważ na mikroczipie wysiano zbyt małą liczbę komórek.G) Obraz DIC tych samych komórek SKBR3 po znakowaniu HER2 kropkami kwantowymi (QD). (H) Nałożony obraz DIC i odpowiadający mu obraz fluorescencyjny znakowanych komórek SKBR3 z HER2-QD65 (kolor sztuczny: żółty). Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat procesu przenoszenia grafenu; metoda PMMA; etapy z użyciem wody, trawia, kryształu soli i acetonu.
Rysunek 2: Czyszczenie i przenoszenie grafenu na kryształy NaCl. (A) PMMA-grafen na polimerze jest zanurzony w czystej wodzie w celu uwolnienia grafenu z PMMA. PMMA-grafen można przechwycić za pomocą szkiełka przedmiotowego. (BZanieczyszczenia miedzią usunięto poprzez trawienie roztworem nadsiarczanu sodu. W celu oczyszczenia grafenu przeniesiono go do zlewki zawierającej wodę dejonizowaną. Kroki te powtórzono 3 razy. Następnie PMMA-grafen przeniesiono do nasyconego roztworu NaCl w czystej wodzie. Do pobrania grafenu z roztworu soli wykorzystano kryształ NaCl.C) Próbkę PMMA-grafen na krysztale NaCl suszono przez 30 min w temperaturze pokojowej. PMMA usunięto poprzez inkubację bloku w acetonie przez 30 min. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat procesu przenoszenia grafenu: okno SiN, grafen pływający, powlekanie chipa, wyniki mikroskopowe.
Rysunek 3: Powłoka grafenowa komórek wysianych na mikrochipie krzemowym. (A) Procedura powlekania grafenem. Grafen znajdujący się na krysztale NaCl zostaje uwolniony na powierzchnię wody. Następnie fragment grafenu zostaje uchwycony za pomocą metalowej pętli i przeniesiony na mikrochip krzemowy (Si). (B) Mikrochip (2,0 x 2,6 mm) z oknem z SiN o wymiarach 40 x 160 μm bez grafenu. Komórki SKBR3 były widoczne jako ciemne punkty. (C) Grafen (czerwone koło) unoszący się na powierzchni zlewki wypełnionej wodą. (D) Grafen uchwycony metalową pętlą. (E) Mikroczip przytwierdzono do kropli wody w taki sposób, aby grafen znajdował się nad oknem z SiN. (F) Mikrochip po powłoce grafenowej. Grafen był widoczny jako fioletowy połysk. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Analiza mikrostruktury, obrazy z mikroskopii elektronowej ukazujące strukturę porowatą oraz obrazy dyfrakcyjne.
Rysunek 4: Obraz STEM komórek SKBR3 powleczonych grafenem i niepowleczonych na oknie z SiN. (A) obraz STEM próbki powlekanej grafenem, wykonany przy M = 800x. (B) obraz STEM próbki niepowlekanej uzyskany przy M = 800x. (C) M Obraz przy powiększeniu 80 0x zarejestrowany w pozycji oznaczonej niebieskim prostokątem w A. Żółte linie przedstawiają przykłady odległości zmierzonych w obrębie cząsteczki.D) M = obraz przy powiększeniu 80 0x zarejestrowany w miejscu zaznaczonym niebieskim prostokątem w B. Żółta linia przedstawia przykładowe odległości zmierzone w obrębie cząstek. (E) M = obraz tego samego obszaru co C przy powiększeniu 50 0x, poddany działaniu D = (7,8±0,4) x 103 e-/Å2. (F) M = obraz tego samego obszaru przy powiększeniu 50 0x D i poddano działaniu D = (7,8±0,4) x 103 e-/Å2Obszar odsłonięty był wyraźnie widoczny.G) Obraz dyfrakcyjny próbki powlekanej grafenem z obszaru bez komórek. Sześciokrotna symetria grafenu jest widoczna w postaci jasnych punktów. (H) Dyfraktogram próbki bez grafenu, niewykazujący sześciokrotnej symetrii jasnych plamek. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Analiza mikroskopowa grafenu; próbki A-G z dawką elektronów; wykres H przedstawia procentowe zmiany względne.
Rysunek 5: Artefakty pojawiające się na próbkach bez powłoki grafenowej. (A) Pierwsze obrazy obszarów na próbkach bez powłoki grafenowej wykonane przy M = 80 0x i poddano działaniu D = (0,39 ± 0,02) x 102 e-/Å2. (B) obrazy z pierwszymi artefaktami pojawiającymi się przy D = (1,94 ± 0,1) x 103 e-/Å2 (żółte strzałki). (C, D) Ostatni obraz z serii wykonany za pomocą D = (7,8 ± 0,4) x 103 e-/Å2Artefakty były widoczne jako jasne punkty.E-GPróbki powlekane grafenem bez powstających artefaktów.E) D = (0,39 ± 0,02) x 102 e-/Å2 (F) D = (1,94 ± 0,1) x 103 e-/Å2 (G) D = (7,8 ± 0,4) x 103 e-/Å2. (H) Względna zmiana odległości między cząsteczkami dla próbek powlekanych grafenem i niepowlekanych. Przeanalizowano dwie niepowlekane próbki wykazujące artefakty, z których jedna przedstawiona jest w (A-C), a ostatni obraz drugiej próbki w D, a także trzy próbki powlekane (jedną pokazano w E-G). W sumie w każdej próbce zbadano dziesięć par QD, których odległości mieściły się w zakresie od 250 nm do 3 µmZmiana względna odzwierciedla średnią ze wszystkich pomiarów w jednej grupie. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Tabela uzupełniająca 1: Składy roztworów i buforów. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Dyskusja

Aby lepiej zrozumieć funkcję białek, ważne jest uzyskanie informacji o lokalizacji białek w błonie komórkowej nienaruszonych komórek. Metody uzyskiwania tych informacji obejmują mikroskopię fluorescencyjną o wysokiej rozdzielczości 1,2. Chociaż mikroskopia superrozdzielcza rozwinęła się w ciągu ostatnich lat, jej rozdzielczość jest nadal ograniczona do około 20 nm dla praktycznych warunków eksperymentów komórkowych, podczas gdy typowe białka receptorowe mają rozmiary w zakresie 1-10 nm. Obrazowanie białek na poziomie pojedynczej komórki i pojedynczej cząsteczki z rozdzielczością wystarczającą do wizualizacji białek jest możliwe za pomocą EM. Jednak ze względu na sekcje, konwencjonalne metody EM zazwyczaj nie pozostawiają komórki nienaruszonej26, co prowadzi do utraty ważnych informacji o kontekście i przestrzennym rozmieszczeniu białek w błonie komórkowej. Opracowano metody dla całych komórek za pomocą cryo-TEM6, możliwe jest połączenie znakowania białek z cryo-EM27, wykazano również cryo-STEM28. Jednak przepływy pracy cryo-EM są zoptymalizowane pod kątem badania ultrastruktury komórkowej i struktury białek, a nie pod kątem analizy rozkładów przestrzennych białek błonowych. Suszenie w punkcie krytycznym jest inną metodą przygotowania całych komórek, ale próbki są poddawane kilku etapom suszenia, a technika ta jest bardzo czasochłonna29. Białka błonowe zostały również zbadane za pomocą pęknięcia zamrażalniczego7. W tej metodzie komórki są unieruchalane, zamrażane i pękane. Pęknięte części są replikowane przez warstwy węgla i platyny, a próbka biologiczna jest usuwana. Repliki można następnie analizować za pomocą EM30. Analiza całych komórek jest niemożliwa w przypadku frakcji zamrażającej, ponieważ informacje o rozmieszczeniu białek w błonie w kontekście całej komórki są tracone.

Przedstawiona tutaj metoda pozwala na badanie błony komórkowej bez konieczności cienkiego krojenia próbki 9,31. Komórki są utrzymywane w stanie nienaruszonym, dzięki czemu lokalizacja białek błonowych jest widoczna na obrazach fluorescencyjnych, które są skorelowane z obrazami EM. Badanie białek na poziomie pojedynczej komórki i pojedynczej cząsteczki w nienaruszonych komórkach w stanie uwodnionym okazało się możliwe przy rozdzielczości 2 nm przy użyciu STEM białek znakowanych QD przy użyciu tej metody obudowy grafenu9. Utrzymanie komórek w ich naturalnym stanie ma kluczowe znaczenie, ponieważ pozwala zachować przestrzenne rozmieszczenie białek błonowych, dzięki czemu możliwe są analizy na poziomie pojedynczej komórki i pojedynczej cząsteczki, co jest ważne dla zrozumienia funkcji białek i opracowania nowych leków do metod terapeutycznych.

Innym krytycznym aspektem obrazowania próbek biologicznych za pomocą EM jest uszkodzenie próbek spowodowane promieniowaniem przez wiązkę elektronów. Rozwiązania często obejmują maksymalne zmniejszenie dawki elektronów lub różne metody powlekania, takie jak zamknięcie próbki między cienkimi warstwami węgla32. Nasza metoda pokazuje, że powłoka grafenowa zmniejsza artefakty wywołane wiązką, które pojawiają się na powierzchni komórki w przypadku próbek niepowlekanych. Badanie chemicznie utrwalonych i pokrytych grafenem próbek biologicznych jest możliwe pod napromieniowaniem wiązką elektronów o energii wiązki 200 keV do D = (7,8±0,4) x 103 e-/Å2 bez uszkodzeń radiacyjnych, takich jak jasne punkty, pojawiające się na próbce. W porównaniu z innymi metodami EM, które obejmują skomplikowane przygotowanie próbki, na przykład barwienie, zatapianie, cięcie (krio)cięcie, pękanie itp., opisana tutaj metoda jest mniej czasochłonna. Znakowanie białek odbywa się w ciągu kilku godzin, a powłoka grafenowa wymaga tylko około 15 minut dla przeszkolonych badaczy. Przygotowanie próbki jest porównywalne z procedurami potrzebnymi do mikroskopii fluorescencyjnej.

Protokół można modyfikować w niektórych krokach. Grafen na mikrochipie można również wysuszyć na powietrzu, aby upewnić się, że grafen nie porusza się po osuszeniu bibułą filtracyjną. Jeśli grafen jest zanieczyszczony solą, można pozwolić mu unosić się na powierzchni wody przez około godzinę, aby rozpuścić sól, a tym samym zminimalizować zanieczyszczenie. Występujące na grafenie zanieczyszczenie miedzią lub PMMA można zmniejszyć, rozszerzając odpowiednie etapy trawienia w protokole. Opisano inne metody powlekania grafenem, w których na przykład grafen-PMMA był bezpośrednio osadzany na komórkach, a PMMA był usuwany przez mycie w acetonie, a następnie33. W naszej metodzie PMMA został usunięty przed powlekaniem, aby uniknąć ewentualnych uszkodzeń komórek spowodowanych dodatkowymi etapami płukania acetonem. NaCl został tutaj wybrany jako podłoże, ponieważ jest płaski, więc nie marszczy grafenu i rozpuszcza się w wodzie, uwalniając grafen9. Poza tym można go przyciąć do pożądanego rozmiaru, a na grafenie nie pozostają żadne pozostałości podłoża. Ale biorąc pod uwagę te kryteria, można również zastosować inne substraty, takie jak chlorek potasu.

Aby zmniejszyć ryzyko potencjalnego grupowania indukowanego przez znacznik, etap utrwalania GA można wdrożyć bezpośrednio po utrwaleniu FA, po którym wszystkie białka błonowe są unieruchomione. Pierwszy etap fiksacji FA już naprawia strukturę biologiczną, ale nadal może wystąpić zmniejszony poziom dyfuzji białek błonowych34, co może prowadzić do grupowania indukowanego znacznikiem z powodu obecności wielu streptawidyny na QD. Fiksacja za pomocą GA może prowadzić do sygnału autofluorescencji podczas LM, a zatem jest wykonywana po LM w opisanym protokole, ale może być zredukowana, jak opisano w innym miejscu34. Bufor kakodylanu jest dość toksyczny i można również stosować inne utrwalacze, ale tutaj stosuje się kakodylat, ponieważ jest powszechnie stosowanym buforem dla protokołów EM, unika wytrącania się, zapobiega rozwojowi bakterii i grzybów oraz jest kompatybilny z jonami wapnia, które są potrzebne do zachowania ultrastrukturalnej integralności błon lipidowych35. W razie potrzeby tetratlenek osmu może być użyty jako dodatkowe utrwalenie w celu stabilizacji lipidów. Pomogłoby to zwiększyć kontrast struktury komórki, ale także dodać kolejny metal do systemu i zmniejszyć kontrast uzyskany na QD.

Opisany tutaj protokół zawiera wiele kroków, które wymagają dobrego instruktażu. Przed obchodzeniem się z mikroczipami wymagane jest pewne szkolenie, aby uniknąć zarysowania powierzchni SiN mikroczipów i zapobiec ich pękaniu. Jak wspomniano wcześniej, zaleca się przygotowanie mikroczipów w dwóch egzemplarzach, ponieważ okienko SiN może się od czasu do czasu zepsuć. Uzyskanie wymaganej liczby komórek na mikroczipie również wymaga pewnego doświadczenia. Powlekanie ogniw grafenem wymaga pewnego treningu, ponieważ znalezienie odpowiedniego kąta nachylenia do unoszenia grafenu na wodzie może być trudne. Podczas wyłapywania grafenu z wody może być również trudno dostrzec cienki grafen. Gdy tylko grafen znajdzie się na mikrochipie, nadmiar wody należy zetrzeć bibułą filtracyjną. Należy to robić tylko za pomocą końcówki bibuły filtracyjnej, aby uniknąć usunięcia grafenu z mikroczipa.

Powłoka grafenowa zapobiegała pojawianiu się artefaktów na próbce. Ale dla D < 4 x 102 e-/Å2 również nie pojawiły się żadne artefakty dla próbki niepowlekanej, a artefakty pojawiły się tylko dla 2 próbek niepowlekanych. W związku z tym badania ogniw niepowlekanych również wydają się możliwe, choć lepiej byłoby użyć grafenu i uniknąć ryzyka powstawania artefaktów. Skład tych artefaktów może być analizowany w przyszłości, aby dać wskazówki, jak zapobiec ich powstawaniu. Jeśli chodzi o stabilność strukturalną ogniw, zaobserwowano jedynie niewielką poprawę powłoki grafenowej. Utrwalone komórki były najwyraźniej stabilizowane w badanych cienkich obszarach, gdzie ich struktura znajdowała się w bliskim sąsiedztwie błony SiN. To, czego jednak tutaj nie zbadaliśmy, to artefakty suszenia, o których wiadomo, że występują w próbkach komórkowych po wystawieniu na działanie próżni4. Wysuszenie komórek doprowadziłoby do obkurczenia się komórek, tak że w konsekwencji zmieniłyby się również odległości QD. Dla zastosowanej tu dawki elektronów odległość odstępów czasu dla próbek pokrytych grafenem i niepowlekanych pozostała stabilna. Potrzebne są dalsze badania, aby zbadać wpływ powłoki grafenowej na ogniwa EM.

Jednym z ograniczeń tej metody jest to, że konieczne jest chemiczne utrwalenie komórek; W związku z tym nie można przeprowadzać eksperymentów z żywymi komórkami. Ale w przypadku, gdy etykietowanie nie jest potrzebne i stosowane są komórki o wyższej stabilności strukturalnej, na przykład bakterie, nieutrwalone komórki można zamknąć w grafenie dla EM36 , choć z inną tolerancją dawki elektronów. Ponadto białka nie są bezpośrednio wykrywalne, więc do wizualizacji białek potrzebne są QD. Metoda ta byłaby korzystna w przypadku mniejszych etykiet. Kwestią dyskusyjną jest to, czy to dobrze, czy źle, że ultrastruktura nie jest wyraźnie widoczna. Nasza metoda jest podobna do mikroskopii fluorescencyjnej, w której widoczne są tylko wybrane białka37. Zwiększenie widoczności ultrastruktury dodałoby również znacznie więcej informacji do obrazu, a następnie w pewnym momencie uniemożliwiłoby wykrycie poszczególnych pozycji etykiety. Co więcej, opisana tutaj metoda dotyczy jednego gatunku białka i potrzebne są dodatki do protokołu, aby móc znakować wiele białek. Wreszcie, metoda działa, gdy dostępna jest mała cząsteczka specyficznie wiążąca o wysokim powinowactwie, taka jak przeciwciało mimetic21 lub nanobody38 . Powszechnie stosowane przeciwciała są znacznie większe i uniemożliwiałyby wykrycie stanu funkcjonalnego podjednostek białkowych w oligomery.

Nasza metoda jest przydatna do badania funkcji białek w całych komórkach za pomocą EM przy jednoczesnym utrzymywaniu komórek w stanie uwodnionym. Łatwo można zbadać szereg komórek. Można również badać inne typy komórek i białek. Jeśli znakowanie białek nie jest potrzebne, podzbiór protokołu można wykorzystać do powlekania grafenem szerokiej gamy próbek biologicznych. Zdolność do badania całych komórek jest istotna w badaniach komórkowych dla zrozumienia korelacji funkcji białek błonowych na poziomie molekularnym.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy D. B. Peckysowi za pomoc przy protokole hodowli komórkowej, F. Weinbergowi za przejrzenie manuskryptu, T. Trampertowi za pomoc przy eksperymentach i rysunkach, S. Smolce za pomoc przy rysunkach i E. Arzt za wsparcie za pośrednictwem INM. Badania są finansowane przez Else Kröner-Fresenius-Stiftung.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Aceton do HPLC (min. 99,8 %)Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Niemcy2626-1L
AL54 waga analitycznaMettler-Toledo GmbH, Giessen, Niemcy30029077
Frakcja albuminy V, bez biotyny, ≥ 98 %, dla biologii molekularnejCarl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Niemcy0163.2
Cząsteczka powinowactwa anty-HER2, biotyna sprzężona 20 &mikro; MAffibody, Solna, Szwecja10.0817.02.0001
analityczny o rozdzielczości atomowej JEM-ARM200FJEOL (Germany) GmbH, Freising, Niemcy
Kwas borowySigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, NiemcyB6768-500G
Kwas kakodylowy sól sodowa trójwodzian ≥ 98 %Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Niemcy5169.1
Kolby do hodowli komórkowych, PS, poddane obróbce, sterylne, Zakrętka filtra 50mlLabsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Niemcy7696781
Kolby do hodowli komórkowych, PS, poddane obróbce, sterylne, Zakrętka filtra 250mlLabsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Niemcy7696782
Płytki wielodołkowe do hodowli komórkowych, poddane obróbce, 24-dołkoweLabsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Niemcy7696792
Płytki wielodołkowe do hodowli komórkowych, poddane obróbce, 96-dołkoweLabsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Niemcy7696794
Kolby do hodowli komórkowych CELLSTAR poddane działaniu TC, 250 mlGreiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Niemcy658170
Płytki wielodołkowe do hodowli komórkowych CELLSTAR 96-dołkoweGreiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Niemcy655180
Probówki wirówkowe CELLSTAR 15 ml sterylneGreiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Niemcy188271
CELLview naczynie do hodowli komórkowych, PS, 35/10mm, szklane dno, 1 komoraGreiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Niemcy627861
Wirówka 5418Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Niemcy5401000010
Probówki wirówkowe 50 ml sterylneLabsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Niemcy7696705
Corning CellStripper nieenzymatyczny roztwór do dysocjacji komórekCorning, NY, USA25-056-CI
D(+)-sacharoza min. 99,7 %, sproszkowanaTh. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Niemcy9286.1
Jednorazowy hemocytometr C-Chip Neubauer ulepszonyCarl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, NiemcyPK36.1
EasypetEppendorf, Wesseling-Berzdorf, Niemcy
pipety Eppendorf Research plus zmienne, 0,1 - 2,5 i mikro; lEppendorf, Wesseling-Berzdorf, Niemcy3123000012
Eppendorf Research plus zmienna pipeta, 2 -20 i mikro; lEppendorf, Wesseling-Berzdorf, Niemcy3123000039
Eppendorf Research plus zmienna pipeta, 10 - 100 i mikro; lEppendorf, Wesseling-Berzdorf, Niemcy3123000047
Eppendorf Research plus zmienna pipety, 100 - 1000 i mikro; lEppendorf, Wesseling-Berzdorf, Niemcy3123000063
Absolut etanolu do HPLC (min. 99,9 %)Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Niemcy2222-1L
Białko modyfikowane podobne do fibronektyny*poly mer-plusTh. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, NiemcyF8141
Mikroskop fluorescencyjny Leica DMI6000Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Niemcy
Gibco Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), o wysokiej zawartości glukozy, suplement GlutaMAX, pirogronianFisherScientific, Hampton, NH, USA31966021
Gibco Płodowa surowica cielęca (FCS)FisherScientific, Hampton, NH, USA10099141numer partii: 1751893
Gibco Goat Serum, pochodzenie z Nowej ZelandiiFisherScientific, Hampton, NH, USA16210064numer partii: 1788320
Gibco Sól fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS), pH 7,4ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, Stany Zjednoczone10010015
Galaxy 48R Inkubator CO2Nowy Brunszwik, Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, NiemcyCO48310001
Gatan Model 950 Solarus— Myjka plazmowaGatan GmbH, Mü nchen, Niemcy
Roztwór aldehydu glutarowego klasy I, 25% w H2O, specjalnie oczyszczony do stosowania jako utrwalacz do mikroskopii elektronowejSigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, NiemcyG5882
Glicyna ≥ 98,5 % Ph.Eur., USP, BPCarl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, NiemcyT873.1
Odwrócony mikroskop laboratoryjny Leica DM IL LEDLeica Microsystems GmbH, Wetzlar, NiemcyDM IL LED
Płyta grzewczaHeidolph Instruments GmbH & CO. KG, Schwabach, NiemcyMR 3002
MEM endogenne aminokwasy (NEAA) 100x W/O L-GlutamineBiowest, Nuaillé, FrancjaX0557-100
Szkiełka mikroskopowe 76 mm x 26 mmDWK Life Sciences GmbH, Wertheim/Main
mikroprobówki (1,5 ml, 2 ml) niesterylneLabsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Niemcy1,5 ml: 7696751, 2 ml: 7696752
MSc-Advantage— Szafa bezpieczeństwa biologicznego klasy IIThermoFisher Scientific, Waltham, USA
Ocean Microchips SiN okno 400x150 i mikro; m, dystans 200 nmDENSsolutions, Delft, Holandia
Omnifix Jednorazowa strzykawka Luer Lock Solo (10 ml, 20 ml, 50 ml)B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Niemcy10 ml: C542.1 20 ml: T550.1zakupiony za pośrednictwem Carl Roth GmbH&Co. KG, Karlsruhe
OvenMemmert GmbH + Co. KG, Schwabach, NiemcyVO 200
ParafilmVWR, Darmstadt, Niemcy#291-0057
Paraformaldehyd 16 % roztwór, klasa EMMikroskopia elektronowa Sciences, Hatfield, PA, USA15710
Perfekt-Kescher z uchwytemPlano GmbH, Wetzlar, NiemcyT5112
Końcówki do pipet z barierą aerozolową w stojakach, niesterylneLabsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Niemcy2-200µ l: 7695892
Końcówki do pipet z barierą aerozolową w stojakach, sterylneLabsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Niemcy0,1-10 µ l: 7695880 2-100 i mikro; l: 7695883 100-1000 i mikro; l: 7695886 1250 &mikro; l XL: 7695887
Poli-L-lizyna 0,01 % roztwór mol. WT.70.000 - 150.000Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, NiemcyP4707
Qdot 655 Streptawidyna sprzężona 1 &mikro; MInvitrogen, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, Stany ZjednoczoneQ10121MP
Żyletka, Gem Uncoated 3 Fasci, Stalowy grzbiet, odtłuszczonyPersonna, AccuTec Blades, Verona, VA, USA94-0451
okrągła bibuła filtracyjna, bezpopiołowa, klasa 589/3 niebieska wstążka, średnica 150mmSchleicher & Schuell, Dassel, Niemcy300212
Rutynowy mikroskop stereoskopowy Leica M60Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, NiemcyM60
Pipety serologiczne ROTILABO, sterylne (1 ml, 2 ml, 10 ml)Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Niemcy1 ml: N231.1 2 ml: N236.1 10 ml: ET30.1
Pipety serologiczne, sterylne, (1 ml, 2 ml, 10ml)Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Niemcy1 ml: 7695550 2 ml: 7695551 10 ml: 7695553
Pipety serologiczne, sterylne, (5 ml, 25 ml, 50 ml)Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Niemcy5 mL: 7695552 25ml: 7695554 50ml: 7695555
Kąpiel wodna z wytrząsaniem SW22Julabo GmbH, Seelbach, Niemcy9550322
Chlorek soduCarl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, NiemcyHN00.1
Kryształy chlorku sodu, rozszczepione 12 mm x 12 mm x 0,5-1 mmInternational Crystal Laboratories, Garfield, NJ, USA9750
Dekahydrat tetraboranu sodu, odczynnik ACS, ≥ 99,5 %Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, NiemcyS9640-500G
Nadsiarczan soducarl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Niemcy4365.2
filtry strzykawkowe ROTILABO PES, sterylne 0,22 i mikro; mCarl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, NiemcyP668.1
Trivial Transfer Graphene 3-5 warstw, 1 cm x 1 cmmateriał ACS, Pasadena, CA, USATTG30011
Pęseta Dumoxel 03Manufactures D' Outils Dumont SA, Montignez, Szwajcaria0103-7-PO
Pęseta Inox 02Manufactures D' Outils Dumont SA, Montignez, Szwajcaria0102-7-PO
Pęseta, plastikowa wymienna końcówkaIdeal-tek SA, Balerna, Szwajcaria5SVR.SA
Woda ROTISOLV HPLC klasa gradientuCarl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, NiemcyA511.2
mikroskop 4430000018

Bibliografia

  1. Hell, S. W. Far-field optical nanoscopy. Science. 316 (5828), 1153-1158 (2007).
  2. Sigal, Y. M., Zhou, R., Zhuang, X. Visualizing and discovering cellular structures with super-resolution microscopy. Science. 361 (6405), 880-887 (2018).
  3. Williams, D. B., Carter, C. B. The Transmission Electron Microscope. , Springer. (2009).
  4. Bozzola, J. J., Russell, L. D. Electron Microscopy Principles and Techniques for Biologists. , Jones and Barlett Publishers. (1999).
  5. Thompson, R. F., Walker, M., Siebert, C. A., Muench, S. P., Ranson, N. A. An introduction to sample preparation and imaging by cryo-electron microscopy for structural biology. Methods. 100, 3-15 (2016).
  6. Lucic, V., Leis, A., Baumeister, W. Cryo-electron tomography of cells: connecting structure and function. Histochemistry and Cell Biology. 130 (2), 185-196 (2008).
  7. Carson, J. L. Fundamental technical elements of freeze-fracture/freeze-etch in biological electron microscopy. Journal of Visualized Experiments. (91), e51694(2014).
  8. Nishiyama, H., et al. Atmospheric scanning electron microscope observes cells and tissues in open medium through silicon nitride film. Journal of Structural Biology. 169 (3), 438-449 (2010).
  9. Dahmke, I. N., et al. Graphene Liquid Enclosure for Single-Molecule Analysis of Membrane Proteins in Whole Cells Using Electron Microscopy. ACS Nano. 11 (11), 11108-11117 (2017).
  10. Maruyama, Y., Ebihara, T., Nishiyama, H., Suga, M., Sato, C. Immuno EM-OM correlative microscopy in solution by atmospheric scanning electron microscopy (ASEM). Journal of Structural Biology. 180 (2), 259-270 (2012).
  11. Kinoshita, T., et al. Immuno-electron microscopy of primary cell cultures from genetically modified animals in liquid by atmospheric scanning electron microscopy. Microscopy and Microanalysis. 20 (2), 469-483 (2014).
  12. Hauwiller, M. R., Ondry, J. C., Alivisatos, A. P. Using graphene liquid cell transmission electron microscopy to study in situ nanocrystal etching. Journal of Visualized Experiments. (135), e57665(2018).
  13. Cho, H., et al. The Use of Graphene and Its Derivatives for Liquid-Phase Transmission Electron Microscopy of Radiation-Sensitive Specimens. Nano Letters. 17 (1), 414-420 (2017).
  14. Meng, F., et al. Graphene-Based Fibers: A Review. Advanced Materials. 27 (35), 5113-5131 (2015).
  15. Sun, P. Z., et al. Limits on gas impermeability of graphene. Nature. 579 (7798), 229-232 (2020).
  16. Kato, R., et al. High-precision thickness control of ice layer on CVD grown bilayer graphene for cryo-TEM. Carbon. 160, 107-112 (2020).
  17. Keskin, S., de Jonge, N. Reduced Radiation Damage in Transmission Electron Microscopy of Proteins in Graphene Liquid Cells. Nano Letters. 18 (12), 7435-7440 (2018).
  18. Giepmans, B. N., Deerinck, T. J., Smarr, B. L., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. Correlated light and electron microscopic imaging of multiple endogenous proteins using Quantum dots. Nature Methods. 2, 743-749 (2005).
  19. Ring, E. A., Peckys, D. B., Dukes, M. J., Baudoin, J. P., de Jonge, N. Silicon nitride windows for electron microscopy of whole cells. Journal of Microscopy. 243 (3), 273-283 (2011).
  20. Peckys, D. B., Korf, U., de Jonge, N. Local variations of HER2 dimerization in breast cancer cells discovered by correlative fluorescence and liquid electron microscopy. Science Advances. 1 (6), 1500165(2015).
  21. Eigenbrot, C., Ultsch, M., Dubnovitsky, A., Abrahmsen, L., Hard, T. Structural basis for high-affinity HER2 receptor binding by an engineered protein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (34), 15039-15044 (2010).
  22. Textor, M., de Jonge, N. Strategies for Preparing Graphene Liquid Cells for Transmission Electron Microscopy. Nano Letters. 18, 3313-3321 (2018).
  23. Henjes, F., et al. Strong EGFR signaling in cell line models of ERBB2-amplified breast cancer attenuates response towards ERBB2-targeting drugs. Oncogenesis. 1, 16(2012).
  24. Peckys, D. B., de Jonge, N. Studying the Stoichiometry of Epidermal Growth Factor Receptor in Intact Cells using Correlative Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (103), e53186(2015).
  25. Pirkmajer, S., Chibalin, A. V. Serum starvation: caveat emptor. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 301 (2), 272-279 (2011).
  26. Kohl, H., Reimer, L. Transmission electron microscopy: physics of image formation. , Springer. (2008).
  27. Yi, H., et al. Native immunogold labeling of cell surface proteins and viral glycoproteins for cryo-electron microscopy and cryo-electron tomography applications. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 63 (10), 780-792 (2015).
  28. Wolf, S. G., Houben, L., Elbaum, M. Cryo-scanning transmission electron tomography of vitrified cells. Nature Methods. 11 (4), 423-428 (2014).
  29. Dukes, M. J., Ramachandra, R., Baudoin, J. P., Jerome, W. G., de Jonge, N. Three-dimensional locations of gold-labeled proteins in a whole mount eukaryotic cell obtained with 3 nm precision using aberration-corrected scanning transmission electron microscopy. Journal of Structural Biology. 174, 552-562 (2011).
  30. Meier, C., Beckmann, A. Freeze fracture: new avenues for the ultrastructural analysis of cells in vitro. Histochemistry and Cell Biology. 149 (1), 3-13 (2018).
  31. Peckys, D. B., de Jonge, N. Liquid scanning transmission electron microscopy: imaging protein complexes in their native environment in whole eukaryotic cells. Microscopy and Microanalysis. 20 (2), 346-365 (2014).
  32. Egerton, R. F. Control of radiation damage in the TEM. Ultramicroscopy. 127, 100-108 (2013).
  33. Wojcik, M., Hauser, M., Li, W., Moon, S., Xu, K. Graphene-enabled electron microscopy and correlated super-resolution microscopy of wet cells. Nature Communications. 6, 7384(2015).
  34. Huebinger, J., Spindler, J., Holl, K. J., Koos, B. Quantification of protein mobility and associated reshuffling of cytoplasm during chemical fixation. Scientific Reports. 8 (1), 17756(2018).
  35. Glauert, A. M., Lewis, P. R. Biological specimen preparation for transmission electron microscopy. , Princeton University Press. (2014).
  36. Koo, K., Dae, K. S., Hahn, Y. K., Yuk, J. M. Live Cell Electron Microscopy Using Graphene Veils. Nano Letters. 20 (6), 4708-4713 (2020).
  37. Pawley, J. B. Handbook of biological confocal microscopy, 2 edn. , Springer. (1995).
  38. Chung, I., et al. Spatial control of EGF receptor activation by reversible dimerization on living cells. Nature. 464 (7289), 783-787 (2010).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Skaningowa mikroskopia elektronowa w transmisjiznakowanie HER2nanocz stki kropek kwantowychutrwalanie chemiczneokienka z azotku krzemuochrona przed uszkodzeniem wi zkeksperyment z seri dawekobrazowanie STEM
Grafenowa obudowa chemicznie utrwalonych komórek ssaków do mikroskopii elektronowej w fazie ciekłej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.