Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wymuszona aktywacja wzmacniających RNA in situ za pomocą systemu mediatorów synergicznej aktywacji dCas9

2.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61460

⸱

5 czerwca 2020

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, McGovern Medical School, University of Texas Health Science Center, 2Graduate School of Biomedical Sciences, University of Texas MD Anderson Cancer Center and UTHealth

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Enhancer RNA (eRNA) to niekodujące RNA wytwarzane z aktywnych wzmacniaczy. Optymalnym podejściem do badania funkcji eRNA jest manipulowanie ich poziomami w natywnych regionach chromatyny. W tym miejscu przedstawiamy solidny system do badań eRNA, wykorzystujący aktywatory transkrypcji połączone z CRISPR-dCas9 w celu indukowania ekspresji interesujących nas eRNA.

Streszczenie

Wzmacniacze są kluczowymi elementami genomu rozproszonymi w genomie ssaków i dyktują specyficzne tkankowo programy ekspresji genów. Coraz więcej dowodów wskazuje na to, że wzmacniacze nie tylko dostarczają motywów wiążących DNA dla czynników transkrypcyjnych (TF), ale także generują niekodujące RNA, które są określane jako eRNA. Badania wykazały, że transkrypty eRNA mogą odgrywać znaczącą rolę w regulacji genów zarówno w fizjologii, jak i chorobie. Powszechnie stosowane metody badania funkcji eRNA są ograniczone do podejść "utraty funkcji" poprzez knockdown eRNA lub chemiczne hamowanie transkrypcji wzmacniacza. Nie ma solidnej metody przeprowadzania badań "wzmocnienia funkcji" eRNA w celu naśladowania określonych stanów chorobowych, takich jak rak u ludzi, w których eRNA są często nadmiernie eksprymowane. W tym miejscu przedstawiamy metodę precyzyjnej i solidnej aktywacji eRNA w celu funkcjonalnego zbadania ich ról poprzez zastosowanie systemu Synergistic Activation Mediators (SAM) za pośrednictwem dCas9. Przedstawiamy cały przebieg procesu aktywacji eRNA, od wyboru eRNA, projektowania gRNA, aż po walidację aktywacji eRNA za pomocą RT-qPCR. Metoda ta reprezentuje unikalne podejście do badania roli konkretnego eRNA w regulacji genów i rozwoju choroby. Ponadto system ten może być wykorzystany do bezstronnych badań przesiewowych CRISPR w celu identyfikacji celów eRNA napędzających fenotyp w kontekście określonej choroby.

Wprowadzenie

Ludzki genom zawiera konstelację elementów regulatorowych1,2,3. Wśród nich wzmacniacze okazują się być jedną z najbardziej krytycznych kategorii4,5,6. Wzmacniacze odgrywają istotną rolę w regulacji rozwoju i są odpowiedzialne za generowanie przestrzenno-czasowych programów ekspresji genów w celu określenia tożsamości komórki5,6,7. Konwencjonalnie wzmacniacze są uważane tylko za elementy DNA, które dostarczają motywów wiążących dla czynników transkrypcyjnych (TF), które następnie kontrolują ekspresję genów docelowych6,8. Jednak seria badań wykazała, że wiele aktywnych wzmacniaczy transkrybuje również niekodujące wzmacniające RNA (tj. eRNA)4,9,10.

Stwierdzono, że poziom transkrypcji eRNA koreluje z aktywnością wzmacniacza4,10. Aktywne wzmacniacze wytwarzają więcej transkryptów eRNA i wykazują wyższe poziomy markerów epigenomu związanych z aktywną transkrypcją, takich jak H3K27ac i H3K4me19,11,12. Niektóre badania wykazały, że transkrypty eRNA mogą odgrywać ważną rolę w aktywacji transkrypcji docelowych genów10,12. Stwierdzono, że duża liczba eRNA jest rozregulowana w nowotworach u ludzi13,14,15,16, z których wiele wykazywało wysoką specyficzność typu raka i znaczenie kliniczne. Odkrycia te stwarzają możliwości, że wyjaśnienie eRNA, które mogą napędzać/promować nowotworzenie może stanowić nowe cele dla interwencji terapeutycznej13,15.

Obecne metody badania funkcji eRNA są prawie wyłącznie oparte na strategiach knockdown, które wykorzystywały RNA o małej interferencji (siRNA), krótkie RNA spinki do włosów (shRNA) lub oligonukleotydy antysensowne (ASO, z których najczęściej używane w badaniach są zablokowane kwasy nukleinowe (LNA))10,12,17. Jednak choroby ludzkie, takie jak rak, w przeważającej mierze wykazują nadekspresję eRNA w porównaniu z sąsiednimi normalnymi tkankami15, co wymaga narzędzi do "nadekspresji" eRNA, aby naśladować ich wzorce ekspresji istotne dla choroby do badań funkcjonalnych. Aby to osiągnąć, ektopowy system nadekspresji oparty na plazmidzie nie jest optymalny, ponieważ dokładne miejsca rozpoczęcia i zakończenia transkrypcji eRNA pozostają w dużej mierze niejasne. Ponadto system ekspresji plazmidu może zmieniać lokalizację eRNA, powodując potencjalne artefakty ich funkcji18. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół, który ułatwia funkcjonalną charakterystykę eRNA poprzez egzekwowanie ich "nadekspresji" w natywnym genomowym locus ich produkcji (tj. in situ), który opiera się na systemie synergicznych mediatorów aktywacji CRISPR/dCas9 (SAM).

System SAM został początkowo opracowany do aktywacji genów kodujących i długich międzygenowych niekodujących RNA (lincRNA) związanych z opornością na inhibitory BRAF w komórkach czerniaka19. W przeciwieństwie do innych technologii aktywacji CRISPR (CRISPRa), system SAM składa się z kombinacji aktywatorów transkrypcji, które zapewniają solidną aktywację transkrypcyjną regionów docelowych. Do tych aktywatorów należą: enzymatycznie martwy Cas9 (dCas9) połączony z VP64 (tj. dCas9-VP64); przewodnik RNA zawierający dwa aptamery MS2 RNA i białko aktywatora fuzji MS2-p65-HSF1. Obecność aptamerów MS2 w gRNA może rekrutować białko fuzyjne MS2-p65-HSF1 w pobliże miejsc wiązania dCas9 / gRNA. Wśród nich VP64 jest zmodyfikowanym tetramerem domeny aktywatora transkrypcji opryszczki pospolitej VP16, który, jak wykazano, silnie aktywuje transkrypcję genów poprzez rekrutację ogólnych czynników transkrypcyjnych20,21,22. Białko fuzyjne MS2-p65-HSF1 składa się z trzech części. Pierwsza część, MS2-N55K, jest zmutowaną formą białka wiążącego MS2, która ma silniejsze powinowactwo23; pozostałe dwie części tego białka fuzyjnego to domena transaktywacyjna p65 i czynnik szoku cieplnego 1 (HSF1), z których obie są czynnikami transkrypcyjnymi, które posiadają silne domeny transaktywacyjne i mogą indukować solidne programy transkrypcyjne24,25. W związku z tym system SAM zasadniczo stworzył wysoce silny kompleks aktywatora do aktywacji transkrypcji wyznaczonych genów kodujących i lincRNAs19.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Cały przebieg pracy tego protokołu jest pokazany w Rysunek 1.

1. Wybór wzmacniającego RNA (eRNA)

  1. Zidentyfikuj przypuszczalny obszar zainteresowania wzmacniacza, używając pików wiązania danych sekwencjonowania immunoprecypitacji chromatyny (ChIP-Seq), tj. modyfikacji histonów (np. H3K4me1 i H3K27ac) lub koaktywatorów transkrypcji (np. p300).
  2. Zidentyfikuj interesujące nas eRNA, przecinając pik ChIP-Seq z sygnałami sekwencyjnymi RNA (np. z całkowitego sekwencjonowania RNA lub z powstającego sekwencjonowania RNA, takiego jak globalne sekwencjonowanie run-on (GRO-Seq).
    UWAGA: Region wybrany do projektowania gRNA powinien być zwykle ograniczony do regionu "rdzenia wzmacniającego", w którym TF lub koaktywatory (np. p300) wykazały wyraźne piki sekwencyjne ChIP (Figura 2A). dCas9 i jego koaktywatory fuzyjne zostaną zrekrutowane przez gRNA do tego regionu, aby naśladować natywne wiązanie koaktywatorów (Figura 2A). Jeśli dostępne są określone zestawy danych, takie jak Cap Analysis of Gene Expression (CAGE)4 lub GRO-cap26, można je wykorzystać do precyzyjnego określenia "rdzenia wzmacniającego", regionu między dwoma miejscami rozpoczęcia transkrypcji eRNA transkrybowanych w przeciwnych kierunkach4,10,26.

2. Projekt gRNA

  1. Użyj popularnych narzędzi do projektowania gRNA CRISPR, takich jak CRISPOR27, aby wybrać gRNA o niskim potencjale celowania (http://crispor.tefor.net/).
    UWAGA: Inne narzędzia, takie jak Benchling28 lub CHOPCHOP29 mogą być również używane jako dodatkowe opcje do projektowania gRNA.
  2. Wklej sekwencję DNA rdzenia wzmacniacza do kolumny Krok 1 na stronie internetowej CORSTOR, a następnie kliknij przycisk rozwijany, aby wybrać odpowiedni genom (np. ludzki) w kolumnie Krok 2. Kliknij przycisk rozwijany, aby ustawić sekwencję Protospacer Adjacent Motif (PAM) jako "NGG" w kolumnie Krok 3, a następnie kliknij przycisk "Prześlij", aby wygenerować sekwencje prowadzące o długości 20 pz.
  3. Wybierz prowadnice o najwyższych wynikach swoistości w narzędziu CRISPOR, tj. o niskim potencjale poza celem, a następnie dodaj "CACCG" odpowiednio na końcu 5' i "C" na końcu 3'.
    UWAGA: Wybierz przewodniki z najwyższymi wynikami szczegółowości (preferowane jest >85 w CRISPOR).
  4. Zamów oligonukleotydy dla każdego zmysłu i sekwencji antysensownej ze źródeł komercyjnych.
    UWAGA: Dodatkowe instrukcje dotyczące projektowania gRNA CRISPR/Cas9 można znaleźć w innych badaniach30,31. Zwisy w kroku 2.2 sprawią, że gRNA będzie kompatybilne ze szkieletem gRNA SAM (Addgene #61427), który wykorzystuje enzym restrykcyjny BsmBI.

3. Klonowanie gRNA do konstruktu lentiwirusowego

  1. Do wyżarzania oligonukleotydów zmieszać 1 μl każdego sparowanego oligonukleotydu w 100 μM, 1 μl 10x buforu ligacyjnego T4, 0,5 μl ligazy DNA T4 (400 000 jednostek/mL) i 6,5 μLH2O, aby osiągnąć całkowitą objętość 10 μL. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 min, następnie 95 °C przez 5 minut i zmniejszać do 25 °C przy 5 °C/min. Rozcieńczyć do 100 μl przy użyciuH2O.
  2. Trawić szkielet gRNA, mieszając 2 μl 10x buforu enzymu restrykcyjnego (RE), 300 ng plazmidu szkieletowego lenti_gRNA(MS2)_zeo (Addgene #61427) w 1 μl, 1 μl enzymu BsmBI i 16 μlH2O, aby osiągnąć całkowitą objętość 20 μL. Inkubować w temperaturze 55 °C przez 15 minut.
  3. Wymieszaj składniki ligacji z 20 μl produktu wytrawiania, dodając 2,5 μl 10x buforu ligacyjnego T4, 1 μl rozcieńczonego produktu wyżarzania i 1,5 μl ligazy DNA T4 (400 000 jednostek/ml) do systemu 25 μl. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
  4. Przekształć 2 μl mieszanki ligacyjnej z kroku 3.3 w komórki E. coli kompetentne Stbl3. Umieścić je na płytce z ampicyliną LB-agar i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.
  5. Wybierz i zaszczep pojedynczą kolonię bakterii i wyekstrahuj plazmid. Wyślij go do sekwencjonowania Sangera, aby potwierdzić, że sekwencja gRNA jest prawidłowo wstawiona.
    UWAGA: Sekwencje starterów i gRNA są dostępne w tabeli uzupełniającej 1. Zaleca się stosowanie tutaj chemicznie kompetentnych komórek E. coli Stbl3, ponieważ mają one wyższą wydajność plazmidowego DNA i wyższą stabilność plazmidu podczas generowania plazmidów podatnych na niestabilność lentiwirusa32.

4. test wydajności gRNA

UWAGA: Chociaż może to nie być konieczne dla każdego gRNA, zaleca się, aby badacze zbadali jakość gRNA poprzez wykonanie testu Surveyor (tj. testu niedopasowania cięcia) w celu wykrycia indeli lub mutacji, które mogą być efektywnie generowane tylko przez dobrej jakości gRNAs33,34. Inne metody, takie jak śledzenie indeli przez dekompozycję (TIDE), mogą być również używane do określania wydajności gRNA30,35. Nukleaza geodezyjna należy do rodziny endonukleaz specyficznych dla niedopasowania, które mogą przecinać dwuniciowe DNA z niedopasowaniami (Rysunek 3A). Jakość gRNA może być ujawniona przez skuteczność wytwarzania mniejszych gatunków DNA. W praktyce na skuteczność cięcia geodetą może mieć również wpływ wydajność transfekcji gRNA i Cas9.

  1. Transfekcyjna gRNA wraz z plazmidem pSpCas9(BB)-2A-Puro (Addgene #62988), który ulega ekspresji białka Cas9 do komórek 293T za pomocą odczynnika do transfekcji na bazie lipidów. Użyj 1,2 μg / ml na każdy plazmid na studzienkę w płytce 6-dołkowej. Kontynuuj hodowlę komórek przez 3 dni po transfekcji. Zbierz i wyekstrahuj genomowe DNA zgodnie z protokołem producenta36.
  2. Użyj reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR), aby amplifikować docelowy region wzmacniający z genomowego DNA. Należy stosować warunki PCR przedstawione w tabeli uzupełniającej 2. Użyj starterów w Tabeli Uzupełniającej 1 dla przykładowego wzmacniacza, NET1e. Denaturyzacja produktów PCR przez inkubację w temperaturze 95 °C przez 10 minut i ponowna hybrydyzacja poprzez obniżenie temperatury z 95 °C do 25 °C z prędkością -0,3 °C/s, aby umożliwić jednoniciowemu DNA (ssDNA) z indelami lub mutacjami indukowanymi przez gRNA i bez nich, wyżarzanie się ze sobą.
  3. Strawić zhybrydyzowane DNA za pomocą nukleazy Surveyor (Rysunek 3A) zgodnie z protokołem producenta37. Wymieszać 400 ng zhybrydyzowanego DNA z kroku 4.2, 1 μl nukleazy Surveyor, 1 μl wzmacniacza Surveyor i 5 μl 0,15 M MgCl2 w systemie 50 μL. Inkubować w temperaturze 42 °C przez 60 minut. Przeanalizuj DNA na żelu agarozowym. Użyj kontroli negatywnej, takiej jak komórki z Cas9, ale bez celowania w gRNA, w teście i elektroforezie żelowej (Rysunek 3B).

5. Generowanie lentiwirusów

  1. Dodaj psPAX2, pMD2.G i plazmid docelowy (np. lenti_dCas9-VP64_Blast, Addgene #61425; lub lenti_MS2-p65-HSF1_Hygro, Addgene #61426) w stosunku 3 μg : 1 μg : 4 μg w probówce polipropylenowej o pojemności 1,5 ml. Wymieszaj je z 500 μl Opti-MEM i inkubuj przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  2. W osobnej probówce umieścić 10 μl odczynnika do transfekcji na bazie lipidów w 500 μl Opti-MEM i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  3. Połączyć produkty z etapów 5.1 i 5.2 i inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
  4. Umieść komórki 293T na płytce dzień przed transfekcją i pozwól im osiągnąć zbieg ~30% w 10 cm naczyniu w momencie transfekcji. Dodaj 4 ml zwykłej pożywki (DMEM z 10% FBS), a następnie dodaj kompleks z kroku 5.3 kroplami do komórek. Dodaj DMEM z 10% FBS, aby uzyskać ostateczną objętość do 6 ml. Inkubować przez noc w inkubatorze komórkowym w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .
  5. Następnego dnia zmień pożywkę na 10 ml nowego DMEM z 10% FBS. Zebrać podłoże 24 godziny po zmianie podłoża. Użyć filtra strzykawkowego (np. 0,45 μm) do przefiltrowania pożywki zawierającej wirusa, a następnie przejść do kroku 6 lub przechowywać wirusa w temperaturze -80 °C.
    UWAGA: Operacje z użyciem lentiwirusa wymagają szafy bezpieczeństwa biologicznego na poziomie II. Należy zachować ostrożność, aby bezpiecznie obchodzić się z eksperymentami związanymi z wirusem; A jeśli jakikolwiek pojemnik ma bezpośredni kontakt z pożywką wirusową, należy go wybielać przez ponad 20 minut przed usunięciem jako zagrożenie biologiczne.

6. Hodowla komórkowa

  1. Utrzymywać komórki w inkubatorze do hodowli komórkowych CO2 w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .
  2. Hodowla komórek MCF7 i 293T w pożywce Modified Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco z 10% FBS.
  3. Hoduj komórki w 10-centymetrowych naczyniach i dziel je w stosunku 1:3 do 1:5, gdy się zlewają.

7. Zakażenie i selekcja komórek

  1. Wysiewaj komórki docelowe (np. MCF7) bezpośrednio w mieszaninie pożywki wirusowej zawierającej 0,5 ml lenti_dCas9-VP64_Blast (Addgene #61425) i 0,5 ml lenti_MS2-p65-HSF1_Hygro (Addgene #61426). Dodać 8 μg/ml bromku heksadimetryny, aby zwiększyć skuteczność infekcji. Użyj studzienki z niezainfekowanymi komórkami jako kontroli negatywnej do zbadania skuteczności selekcji antybiotyków.
    UWAGA: Ilość pożywki wirusowej jest zalecana w następujący sposób: 6 ml pożywki wirusowej na 10-centymetrowe naczynie, 1 ml na dołek na płytkę 6-dołkową i 0,5 ml na dołek na płytce 12-dołkowej.
  2. Po 24 godzinach od zakażenia dodaj do komórek świeżą pożywkę zawierającą blastycydynę (5 μg/ml dla komórek MCF7) i higromycynę (200 μg/ml dla komórek MCF7).
  3. Utrzymuj komórki w pożywce selekcyjnej antybiotyków, aż ujemne komórki kontrolne wymrą.
    UWAGA: Czas ustabilizowania się różnych linii komórkowych może się różnić. W przypadku MCF7 całkowite wymarcie niezainfekowanych komórek zajmuje zwykle 5-7 dni. Przed rozpoczęciem eksperymentów należy zbadać krzywą zabijania przy użyciu różnych stężeń antybiotyków dla nowej linii komórkowej. Dopuszczalne jest użycie mieszaniny komórek do kolejnych etapów, ale alternatywą jest wybranie kolonii jednokomórkowych, które są jednorodne pod względem ekspresji dwóch białek efektorowych. Otrzymana stabilna linia jest w tym artykule określana jako linia macierzysta efektora SAM (np. linia efektorowa SAM MCF7). Zaleca się, aby wspólna macierzysta linia komórkowa efektora SAM była używana do infekcji różnymi ukierunkowanymi lub niedocelowymi gRNA, zwłaszcza jeśli ich efekty będą porównywane.
  4. Użyj western blot, aby określić, czy komórki stabilnie wyrażają dwa białka efektorowe (przykład pokazano w Rysunek 4A). Użyj odwrotnej transkrypcji całkowitych RNA, a następnie ilościowego PCR (RT-qPCR) jako alternatywnej metody do zbadania poziomów ekspresji dwóch mRNA (dCas9-VP64 i MS2-p65-HSF1, Figura 4B).
    UWAGA: Startery do badania poziomów mRNA dwóch efektorów dCas9 są dostępne w tabeli uzupełniającej 1.
  5. Wygeneruj lentiwirusa z gRNA skonstruowanych w kroku 3.5 i zainfekuj stabilną linię komórkową SAM o podwójnej ekspresji dCas9-VP64 i MS2-p65-HSF1 indywidualnym lentiwirusem gRNA. Dodaj zeocynę (100 μg/ml dla komórek MCF7) do pożywki 24 godziny po transdukcji wirusa gRNA. Wygeneruj kontrolę negatywną, która wyraża niedocelowe gRNA (NT-gRNA) w rodzicielskiej linii komórkowej SAM.
    UWAGA: Upewnij się, że lek selekcyjny jest specyficzny dla konstruktu, który Cię interesuje.

8. Ekstrakcja RNA i ilościowy RT-PCR w celu zbadania poziomów eRNA

  1. Wyodrębnij całkowite RNA z linii komórkowych SAM wyrażających NT-gRNA lub celujących w gRNA za pomocą zestawu do ekstrakcji RNA38 lub innej metody opartej na chloroformie fenolowej. Użyj komórek o konfluencji ~80% w jednym dołku sześciodołkowej płytki do ekstrakcji RNA.
    UWAGA: Nie zaobserwowano znaczącej różnicy w naszej praktyce wykrywania eRNA, gdy RNA są ekstrahowane albo przez komercyjne kolumny wiążące, albo przez odczynniki chloroformu fenolowego.
  2. Stwórz komplementarne DNA (cDNA) z oczyszczonego RNA w reakcji odwrotnej transkrypcji z losowym heksamerem, zgodnie z protokołem producenta39. Warunki stosowania podane w tabeli uzupełniającej 2.
    UWAGA: Ponieważ większość eRNA nie jest poliadenylowana1,2,4,9,10, losowy heksamer jest rutynowo używany do generowania cDNA.
  3. Zaprojektuj startery do pomiaru docelowych eRNA RT-qPCR za pomocą renomowanego narzędzia do projektowania starterów (np. Primer 3). Zbadaj liniowość amplifikacji par starterów, badając, czy startery będą liniowo amplifikować seryjnie rozcieńczone cDNA i pokażą oczekiwane różnice w cyklu qPCR. Warunki stosowania podane w tabeli uzupełniającej 2.
    UWAGA: Startery do RT-qPCR powinny być ukierunkowane na wysoce transkrybowany region w powstającym sekwencie RNA, a test liniowości starterów powinien obejmować szeroki zakres rozcieńczeń cDNA, aby zapewnić, że wszystkie możliwe do napotkania poziomy eRNA są testowane. Przykład testu liniowości pokazano w Rysunek 5A.
  4. Wykonaj RT-qPCR i przeanalizuj poziomy ekspresji eRNA w komórkach kontrolnych (linia komórkowa SAM z NT-gRNA) oraz w linii komórkowej SAM z gRNA ukierunkowanymi na eRNA (np. NET1e gRNA#1) (np. Figura 6A). Startery dla RNA NET1e przedstawiono w tabeli uzupełniającej 1. Warunki stosowania podane w tabeli uzupełniającej 2.

9. dCas9 ChIP i qPCR

UWAGA: Ten krok jest opcjonalnym eksperymentem mającym na celu sprawdzenie wiązania kompleksu dCas9/SAM-gRNA z docelowym wzmacniaczem przez specyficzne gRNA. Chociaż zachęca się użytkowników do wykonania tego kroku, nie jest konieczne testowanie każdego pojedynczego gRNA. Zapoznaj się z przykładem pokazanym w Rysunek 5B. Patrz startery wymienione w Tabeli Uzupełniającej 1.

  1. Ogniwa sieciujące
    1. Usuń pożywkę z komórek i dodaj 1% formaldehydu rozpuszczonego w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS). Pozostaw na 10 minut.
    2. Dodaj 2,5 M glicyny w stosunku 1:20 objętości, aby ugasić sieciowanie i dwukrotnie przemyć komórki lodowatym PBS. Dodaj 700 μl lodowatego PBS i zeskrob komórki do probówki o pojemności 1,5 ml.
    3. Wirować przy 2 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Przejść do kroku 9.2 lub zamrozić błyskawicznie i przechowywać w temperaturze -80 °C.
  2. Poddając działaniu
    1. Wykonaj nowe LB1, LB2 i LB3. LB1: 50 mM Hepes-KOH (pH 7,5), 140 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10% glicerol, 0,5% NP-40, 0,25% Triton-X 100 i 1x inhibitor proteazy. LB2: 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,5 mM EGTA i 1x inhibitor proteazy. LB3: 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,5 mM EGTA, 0,1% Na-deoksycholan, 0,5% N-lauroilsarkozyna i 1x inhibitor proteazy. Uzupełnij 1x inhibitor proteazy świeżo do buforu przed eksperymentem.
    2. Dodać 1 ml buforu LB1 do granulek komórek, dobrze odpipetować, obracać w temperaturze 4 °C przez 10 minut i wirować w temperaturze 2 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odlać supernatant, dodać 1 ml buforu LB2, obracać w temperaturze 4 °C przez 10 minut i wirować w temperaturze 2 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odlać supernatant i usunąć nadmiar buforu LB2. Dodać 300 μl buforu LB3.
    3. Sonizacja i fragmentacja DNA chromatyny do średniej wielkości ~200-400 pz przy użyciu odpowiedniego systemu sonikatora. Po sonikacji dodać 30 μl 10% Triton-X 100 i dobrze wymieszać. Przetestuj prawidłowy czas sonikacji, jeśli używana jest nowa linia komórkowa.
    4. Odwirować przy 14 000 x g, aby usunąć osad. Przenieść supernatant do nowej probówki i dodać 630 μl LB3 i 70 μl 10% Triton X-100 do całkowitej objętości 1 ml. Dodać 2 μg przeciwciała Cas9 do supernatantu i obracać w temperaturze 4 °C przez noc.
  3. Wychwytywanie kompleksów immunologicznych i odwrotne sieciowanie
    1. Przygotować bufor RIPA (50 mM HEPES pH 7,6, 1 mM EDTA, 0,7% Na-deoksycholanu, 1% NP-40, 0,5 M LiCl) i bufor elucyjny (1% SDS i 0,1 M NaHCO3).
    2. Przemyć Białko G dynabeads 1% BSA w PBS 3 razy i raz buforem LB3.
    3. Dodać 30 μl granulek białkowych G do próbki i inkubować w temperaturze 4 °C przez 4 godziny.
    4. Przemyj granulki immunokompleksu w 500 μl buforu RIPA 6x. Nie pozwól, aby koraliki wyschły.
    5. Przemyć perełki immuno-kompleksu raz buforem TE; usunąć bufor.
    6. Dodać 200 μl buforu elucyjnego do immunokompleksu kulek i odwirować, a następnie umieścić go w podgrzewanym wytrząsarce o regulowanej temperaturze, ustawionej na 65 °C z wytrząsaniem 600 obr./min przez 6-16 godzin, aby odwrócić sieciowanie.
  4. Ekstrakcja DNA
    1. Wyjmij rurki z shakera, na krótko odkręć koraliki i połóż je na stojaku magnetycznym. Przenieść 200 μl supernatantu do świeżej probówki i dodać 200 μl buforu TE.
    2. Dodać 1 μl RNazy A (1 mg/ml) do probówki i inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
    3. Po 1 godzinie inkubacji dodać 2 μl proteinazy K (20 mg/ml) do próbki i inkubować ją w temperaturze 65 °C przez 2 godziny.
    4. Krótko odwirować i dodać 400 μl mieszaniny fenolu, chloroformu i alkoholu izoamylowego. Dobrze wymieszaj, a następnie wiruj przez 5 minut przy 10 000 x g.
    5. Przenieść 400 μl górnej warstwy do probówki o pojemności 1,7 ml zawierającej 16 μl 5 M NaCl i 1 μl glikogenu (20 μg/μl) i dobrze wymieszać.
    6. Dodać 800 μl 100% etanolu i pozostawić na noc w temperaturze -20 °C.
    7. Następnego ranka odwirować probówki w temperaturze 4 °C przy 14 000 x g przez 15 minut.
    8. Usunąć supernatant i przemyć osad 1 ml 70% etanolu. Wirować z prędkością 14 000 x g przez 10 minut.
    9. Usunąć etanol, suche na powietrzu granulki i ponownie zawiesić w 50 μL TE (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA).
  5. Wykonaj ChIP-qPCR, aby zbadać rekrutację kompleksu SAM do miejsca docelowego przez parę starterów wzmacniających rdzeń ukierunkowany. Użyj pary starterów skierowanej na nieistotny region jako kontroli negatywnej.

10. Test wzrostu komórek i inne testy funkcjonalne nadmiernej aktywacji eRNA

  1. Trypsynizuj linie komórkowe SAM wyrażające gRNA niedocelowe lub gRNA ukierunkowane na eRNA i umieść ~ 3,000 komórek na dołku na 96-dołkowej płytce.
  2. Zmierz wzrost komórek za pomocą obrazowania żywych komórek lub innych metod (np. zliczania komórek lub testu soli tetrazolowej-1 rozpuszczalnej w wodzie).
  3. Użyj połowy maksymalnego stężenia hamującego (IC50) do przetestowania odpowiedzi komórkowych na określone leki przeciwnowotworowe w komórkach z nadekspresją NET1e lub bez niej przez SAM15.
    UWAGA: Wyniki testów wzrostu komórek i testów wrażliwości na leki komórek raka piersi są prezentowane po nadekspresji eRNA transkrybowanego sąsiadującego z genem NET1, który był określany jako NET1e15. Inne testy można przeprowadzić na poziomie komórkowym lub organizmowym w zależności od potrzeb każdego konkretnego projektu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Rysunek 1 ilustruje ogólny przebieg pracy tego protokołu. Skupiliśmy się na reprezentatywnym eRNA, NET1e15, który ulega nadekspresji w raku piersi, w przypadku którego system SAM został wykorzystany do aktywacji i zbadania jego biologicznej roli w regulacji ekspresji genów, proliferacji komórek i odpowiedzi na leki przeciwnowotworowe. Dla tego wzmacniacza NET1 zaznaczono kilka pików p300 ChIP-Seq, otoczonych transkrybowanymi transkryptami eRNA (

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Na podstawie naszych danych wnioskujemy, że system SAM nadaje się do badania roli eRNA w regulacji fenotypów komórkowych, np. wzrostu komórek lub oporności na leki. Jednak staranne projektowanie gRNA jest wymagane do solidnej aktywacji eRNA z następujących powodów. Po pierwsze, miejsce rozpoczęcia transkrypcji (TSS) eRNA w każdej konkretnej linii/typie komórek pozostaje mniej wyraźnie oznaczone. Z tego powodu informacje epigenomiczne (np. ChIP-Seq H3K27ac, czynników transkrypcyjnych lub p300), aktywność transkrypcyjna pr...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i niekoniecznie reprezentują one oficjalne poglądy Instytutu Zapobiegania i Badań nad Rakiem w Teksasie.

Podziękowania

Ta praca jest wspierana przez granty dla W.L (Cancer Prevention and Research Institute of Texas, CPRIT RR160083 i RP180734; NCI K22CA204468; NIGMS R21GM132778; Nagroda University of Texas UT Stars Award; oraz fundacja Welch AU-2000-20190330) oraz stypendium podoktorskie dla J.L (UTHealth Innovation for Cancer Prevention Research Training Program Post-doctoral Fellowship, CPRIT RP160015). Uznajemy oryginalną publikataion15, z której niektóre z naszych obecnych figurek zostały zaadoptowane (z modyfikacjami), co jest zgodne z licencją Creative Commons (https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
BlasticidinGoldbioB-800-100
BsmBI enzym restrykcyjnyNew England BioLabs Inc.R0580S
Cas9 mAbAktywny motyw61757Partia: 10216001
Mieszanina roztworu deoksynukleotydu (dNTP)New England BioLabs Inc.N0447S
Dulbecco" s Modified Eagle MediumCorning10-013-CM
Dynabeads Białko GThermo Fisher Scientific65002
EDTAThermo Fisher ScientificBP118-500
EGTASigmaE3889
Surowica bydlęcapłodu GenDEPOTF0900-050
GlikogenThermo Fisher Scientific10814010
Hepes-KOHThermo Fisher ScientificBP310-100
Bromek heksadimetrynySigmaH9268
Higromycyna BGoldbioH-270-25
IGEPAL CA630SigmaD6750
Obrazowanie żywych komórek IncuCyteEssen BioScienceIncuCyte S3 System analizy
lenti_ dCAS-VP64_BlastAddgene61425
lenti_gRNA(MS2)_zeo szkieletAddgene61427
lenti_MS2-p65-HSF1_HygroAddgene61426
LiCLSigmaL9650
Lipofectamine 2000Thermo Fisher Scientific11668-500
NaClSigmaS3014
Na-DeoksycholanSigmaD6750
NaHCO3ThermoFisher ScientificBP328-500
N-lauroilosarkozynaSigma97-78-9
Opti-MEM Obniżona surowicaThermo Fisher Scientific31985070
Filtr strzykawkowy PESBASIX13-1001-07
Inhibitor proteazy Tabletka koktajlowaRoche Diagnostic11836145001
pSpCas9(BB)-2A-PuroAddgene62988
Q5 Polimeraza DNA o wysokiej wiernościNew England BioLabs Inc.M0491S
Q5 Bufor reakcyjnyNew England BioLabs Inc.B9027S
Quick-DNA MiniprepZYMO ResearchD3025
Quick-RNA MiniprepZYMO ResearchR1054
Bufor enzymów restrykcyjnychNew England BioLabs Inc.B7203S
System detekcji RT-qPCRThermo Fisher ScientificQuant Studio3
SDSThermo Fisher ScientificBP359-500
SonikatorQsonicaQ800R2
Sso Advanced Uniwersalny SYBR Green SupermixBio-Rad Laboratories1725274
Stbl3 kompetentna komórkaThermo Fisher ScientificC7373-03
Indeks górny IV odwrotna transkrypcjaThermo Fisher Scientific719000
Zestawy do wykrywania mutacjiSurveyor Zintegrowane technologie DNA706020
Ligaza DNA T4Nowa Anglia BioLabs Inc.M0202S
DNAT4 New England BioLabs Inc.B0202S
Bufor TEThermo Fisher Scientific46009CM
TermocyklerBio-Rad LaboratoriesT100
TermomikserSigma5384000020
ZeocinThermo Fisher Scientificant-zn-1p
żywych komórek Bufor reakcyjny ligazy

Bibliografia

  1. ENCODE Project Consortium. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
  2. Djebali, S., et al. Landscape of transcription in human cells. Nature. 489 (7414), 101-108 (2012).
  3. Kundaje, A., et al. Integrative analysis of 111 reference human epigenomes. Nature. 518 (7539), 317-330 (2015).
  4. Andersson, R., et al. An atlas of active enhancers across human cell types and tissues. Nature. 507 (7493), 455-461 (2014).
  5. Heinz, S., Romanoski, C. E., Benner, C., Glass, C. K. The selection and function of cell type-specific enhancers. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (3), 144-154 (2015).
  6. Ong, C. T., Corces, V. G. Enhancer function: new insights into the regulation of tissue-specific gene expression. Nature Reviews Genetics. 12 (4), 283-293 (2011).
  7. Hnisz, D., et al. Super-enhancers in the control of cell identity and disease. Cell. 155 (4), 934-947 (2013).
  8. Grossman, S. R., et al. Systematic dissection of genomic features determining transcription factor binding and enhancer function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (7), 1291-1300 (2017).
  9. Kim, T. K., et al. Widespread transcription at neuronal activity-regulated enhancers. Nature. 465 (7295), 182-187 (2010).
  10. Li, W., Notani, D., Rosenfeld, M. G. Enhancers as non-coding RNA transcription units: recent insights and future perspectives. Nature Reviews Genetics. 17 (4), 207-223 (2016).
  11. Creyghton, M. P., et al. Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21931-21936 (2010).
  12. Li, W., et al. Functional roles of enhancer RNAs for oestrogen-dependent transcriptional activation. Nature. 498 (7455), 516-520 (2013).
  13. Lee, J. H., Xiong, F., Li, W. Enhancer RNAs in cancer: regulation, mechanisms and therapeutic potential. RNA Biology. , 1-10 (2020).
  14. Sur, I., Taipale, J. The role of enhancers in cancer. Nature Reviews Cancer. 16 (8), 483-493 (2016).
  15. Zhang, Z., et al. Transcriptional landscape and clinical utility of enhancer RNAs for eRNA-targeted therapy in cancer. Nature Communications. 10 (1), 4562(2019).
  16. Chen, H., et al. A Pan-Cancer Analysis of Enhancer Expression in Nearly 9000 Patient Samples. Cell. 173 (2), 386-399 (2018).
  17. Kopp, F., Mendell, J. T. Functional Classification and Experimental Dissection of Long Noncoding RNAs. Cell. 172 (3), 393-407 (2018).
  18. Lubelsky, Y., Ulitsky, I. Sequences enriched in Alu repeats drive nuclear localization of long RNAs in human cells. Nature. 555 (7694), 107-111 (2018).
  19. Konermann, S., et al. Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex. Nature. 517 (7536), 583-588 (2015).
  20. Beerli, R. R., Segal, D. J., Dreier, B., Barbas, C. R. Toward controlling gene expression at will: specific regulation of the erbB-2/HER-2 promoter by using polydactyl zinc finger proteins constructed from modular building blocks. Proceedings of The National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (25), 14628-14633 (1995).
  21. Gilbert, L. A., et al. CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes. Cell. 154 (2), 442-451 (2013).
  22. Hirai, H., Tani, T., Kikyo, N. Structure and functions of powerful transactivators: VP16, MyoD and FoxA. International Journal of Developmental Biology. 54 (11-12), 1589-1596 (2010).
  23. Lim, F., Spingola, M., Peabody, D. S. Altering the RNA binding specificity of a translational repressor. Journal of Biological Chemistry. 269 (12), 9006-9010 (1994).
  24. Schmitz, M. L., Baeuerle, P. A. The p65 subunit is responsible for the strong transcription activating potential of NF-kappa B. EMBO Journal. 10 (12), 3805-3817 (1991).
  25. Vihervaara, A., Sistonen, L. HSF1 at a glance. Journal of Cell Science. 127, Pt 2 261-266 (2014).
  26. Core, L. J., et al. Analysis of nascent RNA identifies a unified architecture of initiation regions at mammalian promoters and enhancers. Nature Genetics. 46 (12), 1311-1320 (2014).
  27. Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biology. 17 (1), 148(2016).
  28. Benchling [Biology Software]. , Available from: https://benchling.com (2020).
  29. Labun, K., et al. CHOPCHOP v3: expanding the CRISPR web toolbox beyond genome editing. Nucleic Acids Research. 47, 171-174 (2019).
  30. Hanna, R. E., Doench, J. G. Design and analysis of CRISPR-Cas experiments. Nature Biotechnology. , (2020).
  31. Nageshwaran, S., et al. CRISPR Guide RNA Cloning for Mammalian Systems. Journal of Visualized Experiments. (140), e57998(2018).
  32. Al-Allaf, F. A., Tolmachov, O. E., Zambetti, L. P., Tchetchelnitski, V., Mehmet, H. Remarkable stability of an instability-prone lentiviral vector plasmid in Escherichia coli Stbl3. 3 Biotech. 3 (1), 61-70 (2013).
  33. Qiu, P., et al. Mutation detection using Surveyor nuclease. Biotechniques. 36 (4), 702-707 (2004).
  34. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  35. Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Research. 42 (22), 168(2014).
  36. Quick-DNA Miniprep Kit. ZYMO. , Available from: https://files.zymoresearch.com/protocols/_d3024_d3025_quick-dna_miniprep_kit.pdf (2020).
  37. SURVEYOR Mutation Detection Kit. IDT. , Available from: https://sfvideo.blob.core.windows.net/sitefinity/docs/default-source/user-guide-manual/surveyor-kit-for-gel-electrophoresis-user-guide.pdf?sfvrsn=a9123407_6 (2020).
  38. Quick-RNA Miniprep Kit. ZYMO. , Available from: https://files.zymoresearch.com/protocols/_r1054_r1055_quick_rna_miniprep_kit.pdf (2020).
  39. SuperScript IV Reverse Transcriptase Product Manual. Thermo Fisher Scientific. , Available from: https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/SSIV_Reverse_Transcriptase_UG.pdf (2020).
  40. Ounzain, S., et al. Functional importance of cardiac enhancer associated noncoding RNAs in heart development and disease. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 76, 55-70 (2014).
  41. McCleland, M. L., et al. CCAT1 is an enhancer-templated RNA that predicts BET sensitivity in colorectal cancer. Journal of Clinical Investigation. 126 (2), 639-652 (2016).
  42. Miao, Y., et al. Enhancer-associated long non-coding RNA LEENE regulates endothelial nitric oxide synthase and endothelial function. Nature Communications. 9 (1), 292(2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

System dCas9 SAMaktywacja eRNAprzesiewanie CRISPRwalidacja RT-qPCRprojektowanie gRNAwiązanie czynników transkrypcyjnychregulacja genówmodelowanie choróbbadania typu gain-of-function

Ten artykuł został opublikowany

Film wkrótce dostępny

Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.