Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Analiza metabolizmu ludzkich komórek NK

6.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61466

⸱

22 czerwca 2020

 ,  , 
1Cardiovascular Branch, National Heart, Lung and Blood Institute, National Institutes of Health, 2Departamento de Biología Molecular, Centro de Biología Molecular Severo Ochoa, Consejo Superior de Investigaciones Científicas-Universidad Autónoma de Madrid (CSIC-UAM), 3Lymphoid Malignancies Branch, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health

W tym artykule

Podsumowanie

W tym artykule opisujemy metodę pomiaru glikolizy i oddychania mitochondrialnego w pierwotnych ludzkich komórkach NK (Natural Killer) wyizolowanych z krwi obwodowej, w spoczynku lub po aktywacji wywołanej przez IL15. Opisany protokół można łatwo rozszerzyć na pierwotne ludzkie komórki NK aktywowane przez inne cytokiny lub rozpuszczalne bodźce.

Streszczenie

Komórki NK (Natural Killer) pośredniczą głównie w wrodzonych przeciwnowotworowych i przeciwwirusowych odpowiedziach immunologicznych oraz reagują na różne cytokiny i inne bodźce, aby promować przetrwanie, proliferację komórek, produkcję cytokin, takich jak interferon gamma (IFNγ) i/lub programy cytotoksyczności. Aktywacja komórek NK poprzez stymulację cytokin wymaga znacznego przemodelowania szlaków metabolicznych w celu zaspokojenia ich wymagań bioenergetycznych i biosyntetycznych. Istnieje wiele dowodów sugerujących, że upośledzony metabolizm komórek NK jest związany z wieloma chorobami przewlekłymi, w tym otyłością i rakiem, co podkreśla kliniczne znaczenie dostępności metody określania metabolizmu komórek NK. W tym miejscu opisujemy zastosowanie analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego, platformy, która umożliwia pomiary glikolizy i zużycia tlenu w mitochondriach w czasie rzeczywistym, jako narzędzia do monitorowania zmian w metabolizmie energetycznym ludzkich komórek NK. Opisana tu metoda pozwala również na monitorowanie zmian metabolicznych po stymulacji komórek NK cytokinami takimi jak IL-15, układ, który jest obecnie badany w szerokim zakresie badań klinicznych.

Wprowadzenie

Komórki NK (Natural Killer) to wrodzone limfocyty, które pośredniczą w odpowiedziach przeciwnowotworowych i przeciwwirusowych. Komórki NK stanowią 5-15% wszystkich limfocytów w ludzkiej krwi obwodowej i można je również znaleźć w śledzionie, wątrobie, szpiku kostnym i węzłach chłonnych. Komórki NK nie wykazują ekspresji polimorficznych receptorów klonotypowych, takich jak receptory komórek T (TCR) lub receptory komórek B (BCR). W przeciwieństwie do tego, aktywacja ich funkcji cytolitycznych jest wywoływana przez zaangażowanie receptorów, które rozpoznają niezmienne ligandy na powierzchni komórki docelowej1,2.

Ludzkie komórki NK w stanie spoczynku, wyizolowane z krwi obwodowej, mogą przetrwać przez kilka dni w pożywce hodowlanej uzupełnionej ludzką surowicą. Aktywacja komórek NK przez cytokiny, takie jak IL-15 lub IL-2, napędza komórki do proliferacji i zwiększenia ich zdolności zabijania, między innymi3,4,5. Kilka badań wykazało bezpośrednią korelację między aktywacją komórek NK a zmianami w ich aktywności metabolicznej6. Te przemiany metaboliczne mają na celu zaspokojenie szczególnych potrzeb komórek w zakresie energii i biosyntezy.

Tlenowe komórki i organizmy pozyskują energię poprzez szereg reakcji chemicznych, które obejmują katabolizm i utlenianie węglowodanów, tłuszczów i białek. Poprzez połączenie glikolizy, cyklu kwasu trikarboksylowego (TCA) i fosforylacji oksydacyjnej, komórki eukariotyczne zaspokajają większość swojego zapotrzebowania na ATP i uzyskują produkty pośrednie wymagane jako elementy budulcowe makrocząsteczek niezbędnych do wzrostu i proliferacji komórek. Proces glikolizy (Rysunek 1A) rozpoczyna się od wejścia glukozy do komórki. W cytozolu glukoza jest fosforylowana i przekształcana w pirogronian (z produkcją netto 2 cząsteczek ATP na cząsteczkę glukozy), który może zostać zredukowany do mleczanu lub przetransportowany do mitochondriów w celu przekształcenia w acetylo-CoA i wejścia w cykl TCA. Cykl TCA kontynuuje cykl napędzany większą liczbą cząsteczek acetylo-CoA i wytwarza CO2 (który ostatecznie dyfunduje na zewnątrz komórki i reagując zH2Ow pożywce, wytworzy kwas węglowy, który doprowadzi do zakwaszenia pożywki) i NADH, cząsteczkę odpowiedzialną za oddawanie elektronów do łańcucha transportu elektronów (ETC). Elektrony przemieszczają się przez różne kompleksy białkowe i są ostatecznie akceptowane przez tlen. Kompleksy te (I, III i IV) pompują również H+ z macierzy mitochondrialnej do przestrzeni międzybłonowej. W wyniku wygenerowanego gradientu elektrochemicznego, H+ ponownie wejdzie do matrycy przez kompleks V (syntazę ATP), inwestując zgromadzoną energię potencjalną w wytwarzanie ATP.

Zarówno glikoliza, jak i oddychanie mitochondrialne mogą być blokowane w różnych punktach za pomocą inhibitorów. Poznanie i zastosowanie tych inhibitorów było podstawą do opracowania testu strumienia zewnątrzkomórkowego. Mierząc dwa proste parametry w czasie rzeczywistym, takie jak pH i tlen, analizator strumienia zewnątrzkomórkowego wnioskuje o szybkości glikolizy i oddychania mitochondrialnego na 96-dołkowej płytce. Test stresu glikolizy przeprowadza się w podłożu podstawowym bez glukozy (Rysunek 1B)7. Pierwsze pomiary stopnia zakwaszenia zewnątrzkomórkowego (ECAR) wskazują na zakwaszenie niezależne od glikolizy. Jest to określane jako zakwaszenie nieglikolityczne i koreluje z CO2 wytwarzanym przez TCA, który, jak wyjaśniono wcześniej, łączy się z H2O w pożywce, tworząc H+ (ECAR sprzężony z TCA). Pierwszym wstrzyknięciem jest glukoza w celu wywołania wykorzystania glukozy i zwiększenia glikolizy. Drugie wstrzyknięcie łączy ze sobą zarówno rotenon, inhibitor kompleksu I, jak i antymycynę A, inhibitor kompleksu III, w celu zablokowania ETC. Komórki reagują na ten dramatyczny spadek produkcji mitochondrialnego ATP poprzez aktywację glikolizy w celu utrzymania komórkowego poziomu ATP, a to reprezentuje ilość glikolizy, która nie jest wykorzystywana przez komórkę w stanie podstawowym, ale może być potencjalnie rekrutowana w odpowiedzi na wzrost zapotrzebowania na ATP (glikoliza kompensacyjna). Trzecim wstrzyknięciem jest analog glukozy 2-deoksyglukoza (DG), który konkuruje z glukozą jako substrat dla enzymu heksokinazy. Produkt tej fosforylacji, 2-deoksyglukozo-6-fosforan nie może zostać przekształcony w pirogronian, dlatego glikoliza jest blokowana, co obniża ECAR do minimum. ECAR mierzony w tym momencie obejmuje inne źródła zakwaszenia zewnątrzkomórkowego, które nie są przypisywane glikolizie lub aktywności oddechowej, a także wszelką glikolizę resztkową, która nie jest w pełni hamowana przez 2-DG (po zakwaszeniu 2-DG).

Test stresu mitochondrialnego jest wykonywany w pożywce z glukozą (Rysunek 1C)8. Pierwsze pomiary wskaźnika zużycia tlenu (OCR) odpowiadają podstawowej linii oddychania mitochondrialnego (oddychanie podstawowe). Pierwszym wstrzyknięciem jest oligomycyna, która hamuje powrót protonów przez syntazę ATP (kompleks V), blokując syntezę ATP, a tym samym gwałtownie hiperpolaryzując błonę mitochondrialną, co zapobiega dalszemu pompowaniu protonów przez kompleksy oddechowe i prowadzi do spadku OCR. Porównanie oddychania podstawowego z wartością wynikającą z dodania oligomycyny reprezentuje oddychanie sprzężone z ATP. Pozostała niewrażliwa na oligomycynę szybkość zużycia tlenu nazywana jest wyciekiem protonów, który reprezentuje przepływ protonów przez dwuwarstwę lipidową lub białka w wewnętrznej błonie mitochondrialnej, takie jak translokaza nukleotydu adeninowego9. Drugie wstrzyknięcie to rozprzęgacz 2,4-dinitrofenolu (DNP), jonoforu, który indukuje masowe wejście H+ do macierzy mitochondrialnej, co prowadzi do depolaryzacji błony mitochondrialnej i zakłócenia syntezy mitochondrialnego ATP. Komórki reagują na rozproszenie siły napędowej protonów, zwiększając szybkość transportu elektronów i zużycia tlenu do maksymalnych poziomów w daremnej próbie odzyskania potencjału błonowego (maksymalnej wydolności oddechowej). Różnica między maksymalną wydolnością oddechową a oddychaniem podstawowym polega na wolnej pojemności oddechowej komórki, która reprezentuje ilość oddechu, która nie jest wykorzystywana przez komórkę do generowania ATP w stanie podstawowym, ale może być potencjalnie rekrutowana w odpowiedzi na wzrost zapotrzebowania na ATP lub w warunkach stresu8. Trzecie wstrzyknięcie to połączenie rotenonu i antymycyny A. To wstrzyknięcie całkowicie zatrzymuje ETC, a OCR spada do najniższego poziomu, a pozostałe zużycie tlenu jest niemitochondrialne (spowodowane przez oksydazy NADPH itp.).

Zmiany w szlakach metabolicznych mogą jakoś przewidzieć funkcjonowanie komórek NK, ponieważ zasugerowano, że ciągła aktywacja komórek NK za pomocą cytokin in vitro może prowadzić do wyczerpania komórek NK poprzez badanie różnych szlaków metabolicznych10,11. Korelacja między stanem metabolicznym a funkcją komórek NK jest bardzo istotna z punktu widzenia immunoterapii nowotworów. W tej dziedzinie przetestowano aktywację komórek NK za pomocą infuzji IL-15, samodzielnie lub w połączeniu z monoklonalnymi przeciwciałami terapeutycznymi w celu poprawy zabijania komórek nowotworowych12,13,14. Wiedza na temat statusu metabolicznego komórek NK w odpowiedzi na te strategie leczenia dostarczyłaby cennego predyktora statusu aktywacji komórek NK i funkcji zabijania.

Opisano badanie szlaków metabolicznych w innych komórkach szpikowych i limfoidalnych, takich jak monocyty, limfocyty T i B15 i opublikowano zoptymalizowane metody16. W tym protokole zapewniamy metodę, która łączy zarówno protokół izolacji NK, który daje dużą liczbę czystych i żywotnych komórek NK, jak i zoptymalizowany protokół pomiaru aktywności metabolicznej za pomocą analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego. Tutaj pokazujemy, że jest to ważna metoda badania zmian metabolicznych w spoczynkowych i aktywowanych przez IL-15 ludzkich komórkach NK. W przypadku testu strumienia zewnątrzkomórkowego parametry takie jak liczba komórek i stężenia leków zostały przetestowane i zoptymalizowane. W porównaniu z innymi metodami respirometrycznymi, analizator strumienia zewnątrzkomórkowego jest w pełni zautomatyzowany i zdolny do testowania w czasie rzeczywistym, przy bardzo małej liczbie komórek, do 92 próbek jednocześnie, a tym samym umożliwia badania przesiewowe o wysokiej przepustowości (z wieloma próbkami i powtórzeniami) w stosunkowo szybki sposób17.

Ta metoda może być używana przez badaczy zainteresowanych oceną funkcji komórek NK poprzez badanie metabolizmu komórek NK. Może być również stosowany do komórek aktywowanych przez inne cytokiny, przeciwciała lub bodźce rozpuszczalne.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z zasadami etycznymi badań medycznych Deklaracji Helsinek. Próbki krwi obwodowej od dawców uzyskano z Wydziału Medycyny Transfuzjologicznej NIH zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez IRB 99-CC-0168, za pisemną świadomą zgodą pacjenta.

1. Przygotowanie odczynnika

  1. Odczynniki do izolacji komórek NK
    UWAGI: Przygotuj te odczynniki w kapturze do hodowli komórkowych.
    1. Przygotować bufor separacyjny NK: Uzupełnij PBS (pH 7,4) 1 mM EDTA i 2% płodową surowicą cielęcą (FCS), która została wcześniej inaktywowana termicznie (w temperaturze 56 °C przez 30 min).
    2. Przygotuj pożywkę hodowlaną NK: Uzupełnij zmodyfikowaną pożywkę Dulbecco firmy Iscove (IMDM) 10% surowicą ludzką (HS). Sterylny filtr i przechowywać w temperaturze 2-8 °C. Podgrzać pożywkę do 37 °C przed dodaniem do komórek.
    3. Zawiesić ludzką IL-15 w PBS w stężeniu 200 μg/ml.
  2. Odczynniki do oznaczania strumienia zewnątrzkomórkowego
    1. Przygotuj pożywkę do oznaczania: W przypadku pożywki do mitochondrialnych testów wysiłkowych dodaj 1 mM pirogronianu sodu, 2 mM L-glutaminy i 10 mM glukozy do podłoża podstawowego; w przypadku pożywki do testu wysiłkowego glikolizy dodać 2 mM L-glutaminy do pożywki podstawowej.
      UWAGA: Stężenia glukozy, pirogronianu i glutaminy są podane zgodnie z zaleceniami producenta analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego. Jednak skład pożywki może być zmieniany przez badaczy, aby idealnie pasował do składu pożywki hodowlanej, jeśli jest to pożądane.
    2. Za pomocą pH-metru laboratoryjnego należy ustawić pH obu pożywek do 7,4 za pomocą 0,1 N NaOH, sterylnie przefiltrować przez pory o wielkości 0,2 μM i przechowywać w temperaturze 2-8 °C. Ogrzewać podłoże do 37 °C, sprawdzić pH i w razie potrzeby ponownie dostosować do 7,4.
      UWAGA: W atmosferze analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego znajduje się tylko CO2 z otoczenia, stosowanie pożywek bez wodorowęglanu ma kluczowe znaczenie.
    3. Przygotować roztwory podstawowe dla odczynników: oligomycyna (inhibitor syntazy ATP), 10 mM roztwór podstawowy w DMSO; 2,4-dinitrofenol (DNP, rozprzęgacz), 1 M roztwór podstawowy w DMSO; antymycyna A (inhibitor kompleksu III), 10 mM roztwór podstawowy w DMSO; rotenon (inhibitor kompleksu I), 10 mM roztwór podstawowy w DMSO. Przygotować 30 μl porcji wszystkich odczynników i przechowywać w temperaturze -20 °C.
      UWAGA: Niniejsze wytyczne przeznaczone są dla odczynników zakupionych indywidualnie i przygotowanych przez badacza. Jeśli odczynniki są kupowane od producenta analizatora, postępuj zgodnie z jego wytycznymi dotyczącymi przygotowania odczynników.

2. Izolacja komórek NK z krwi obwodowej

  1. Preparat komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) z krwi ludzkiej
    UWAGA: Wykonaj te czynności w kapturze do hodowli komórkowych. Odkazić wszystkie pozostałości i materiały mające kontakt z krwią za pomocą wybielacza i wyrzucić je do odpowiedniego pojemnika do spalenia.
    1. Odpipetować 20 ml pożywki do separacji limfocytów (LSM) do stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
    2. Ostrożnie, trzymając probówkę pod kątem 30°, bardzo delikatnie przeciśnij pipetą 20 ml krwi nad LSM, dotykając ścianki probówki. Unikaj mieszania krwi z LSM i stwórz widoczną i dobrze zdefiniowaną interfazę między tymi dwoma płynami.
      UWAGA: Można stosować krew obwodową lub wzbogacone produkty do leukaferezy.
    3. Odwirowywać probówki przez 25 minut, 1000 x g w temperaturze pokojowej. Nie używaj hamulca, ponieważ może to spowodować zmieszanie się obu faz w probówce (LSM i krwi).
    4. Ostrożnie wyjmij probówki z wirówki i umieść je w stojaku. Sprawdź, czy nie ma rzucającej się w oczy warstwy komórek (komórek jednojądrzastych), która utworzy się na skrzyżowaniu LSM (przezroczysty) i osocza (żółty), podczas gdy czerwone krwinki osadzają się na dnie probówki.
    5. Delikatnie zassać warstwę komórek jednojądrzastych za pomocą plastikowej pipety o pojemności 10 ml (około 5-8 ml) i umieścić ją w nowej stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Interfaza limfocytów składająca się z maksymalnie 2 różnych probówek może być ze sobą połączona.
    6. Przemyć komórki jednojądrzaste 2x, ponownie zawieszając w 45 ml PBS i odwirowując przy 800 x g przez 5 minut, w temperaturze pokojowej.
      UWAGA: Po tym etapie uzyskuje się osad komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) i badacz może przejść do etapu izolacji NK.
  2. Izolacja NK od PBMC
    1. Policz komórki z 2.1.6 i zawieś je ponownie w buforze separacyjnym NK (1x 108 PBMCs/mL).
    2. Pobrać 10 ml zawiesiny komórek (109 PBMC) i umieścić je w probówce o pojemności 50 ml.
    3. Dodać 500 μl (50 μl/ml buforu) mieszaniny przeciwciał do izolacji komórek NK i 10 μl (1 μl/ml buforu) mieszaniny przeciwciał izolujących anty-CD3 dodatnio do PBMC i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 min.
    4. Odwiruj kulki magnetyczne i dodaj 1 ml do mieszanki PBMC z przeciwciałami (100 μl kulek/ml PBMC). Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej, od czasu do czasu mieszając.
    5. Dodać 35 ml buforu izolacyjnego NK (3,5 ml buforu/ml PBMCs), wymieszać i umieścić na magnesie na 15 min (2,2 x 107 PBMCs/mL). Po tym czasie koraliki i komórki pozytywnie wybrane (wszystkie oprócz komórek NK) przylgną do ścianek rurki.
    6. Ostrożnie zebrać supernatant (zawierający komórki NK) za pomocą plastikowej pipety o pojemności 50 ml, nie dotykając boków ani dna probówki.
    7. Policz komórki za pomocą licznika komórek i odwiruj przy 800 x g przez 5 minut.
    8. Ponownie zawiesić izolowane komórki NK w ilości 5 x 106 komórek/ml w IMDM zawierającym 10% HS i umieścić je w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2 do czasu przeprowadzenia eksperymentu.
      UWAGA: Ten protokół izolacji NK określa liczbę komórek i objętości odczynników dostosowane do użycia probówki o pojemności 50 ml i dużego magnesu. Protokół ten można skalować w górę (w przypadku uzyskania większej liczby PBMC) poprzez powtarzanie etapów izolacji w różnych probówkach lub zmniejszać przez zmniejszanie objętości w probówce. Dla końcowych objętości 14-45 ml stosuje się probówkę z polistyrenu o pojemności 50 ml, dla objętości 4-14 stosuje się rurkę z polistyrenu o pojemności 15 ml, a dla objętości 1-4 ml rurkę z polistyrenu o pojemności 5 ml. Magnes jest inny i w każdym przypadku pasuje do niego odpowiednia rurka. Ilość mieszanki przeciwciał i kulek magnetycznych można również skalować w zależności od liczby komórek i końcowej objętości.
  3. Barwienie populacji komórek NK do cytometrii przepływowej
    1. Pobrać 0,25 x 106 komórek na próbkę z kroku 2.2.8, usunąć pożywkę przez odwirowanie przy 800 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i ponownie zawiesić osad komórkowy w 500 μl PBS.
    2. Dodać barwnik żywotności zgodnie z zaleceniami producenta (1 μl barwnika odtworzonego DMSO na 1 ml zawiesiny komórek) i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 min.
    3. Umyć 2x przez ponowne zaparcie w 5 ml PBS i odwirować przy 800 x g przez 5 minut, w temperaturze pokojowej.
    4. Barwić odpowiednimi przeciwciałami anty-ludzkimi w 100 μl IMDM zawierającego 10% HS przez 30 minut na lodzie chronionym przed światłem (patrz Tabela 1). Wszystkie przeciwciała można połączyć i użyć w jednym etapie barwienia.
    5. Analizować próbki za pomocą cytometrii przepływowej w celu oceny czystości uzyskanej populacji komórek NK. Użyj metody bramkowania i analizy komórek, które zostały wcześniej opisane18,19.
  4. stymulacja komórek NK rozpuszczalną IL-15
    1. Ponownie zawiesić 0,75 x 106 komórek z kroków 2.2.8 lub 2.4.3 w 100 μl IMDM zawierającego 10% HS w studzience na płytce 96-dołkowej (okrągłe dno).
    2. Rozcieńczyć ludzką IL-15 do 1 μg/ml w IMDM zawierającym 10% HS. Dodać 100 μl rozcieńczonej ludzkiej IL-15 do komórek, aby osiągnąć końcowe stężenie 0,5 μg/mL.
      UWAGA: 0,5 μg/ml to stężenie nasycające IL-15. Niższe stężenia IL-15 lub innych cytokin, takich jak IL-2, IL-12 lub IL-18, mogą być testowane przez badaczy w razie potrzeby.
    3. Umieścić komórki w inkubatorze w temperaturze 37 °C i stymulować przez 48 godzin przed wykonaniem testu przepływu zewnątrzkomórkowego. Zawiesić niestymulowane (kontrolne) komórki o tym samym stężeniu i objętości w IMDM zawierającym 10% HS bez IL-15 i umieścić je w tym samym inkubatorze na 48 godzin.

3. Nawodnienie wkładu czujnika

UWAGA: 96 końcówek sondy wkładu czujnika zawiera pojedyncze fluorofory w stanie stałym dlaO2 i H+, które muszą być uwodnione w celu wykrycia zmianO2 i pH.

  1. Włącz analizator i pozwól mu się rozgrzać do 37 °C.
  2. Otwórz opakowanie wkładu czujnika i odłącz wkład czujnika od tabliczki narzędziowej. Dodać 200 μl roztworu kalibru do każdej studzienki płytki użytkowej i umieścić wkład czujnika z powrotem na płytce, sprawdzając, czy czujniki są całkowicie zanurzone w roztworze. W celu uzyskania optymalnych rezultatów należy inkubować wkład przez noc w temperaturze 37 °C w inkubatorze wolnym od CO2 , który jest odpowiednio nawilżony, aby zapobiec parowaniu. Zapobiegaj tworzeniu się pęcherzyków pod czujnikami podczas nawodnienia.
    UWAGA: Minimalny czas nawodnienia wkładu wynosi 4 godziny w temperaturze 37 °C w inkubatorze wolnym od CO2 . Alternatywnie można zastosować nocne nawodnienie wkładu czujnika 200 μl sterylnej wody o temperaturze 37 °C w inkubatorze bez CO2 , a następnie inkubację wkładu czujnika z 200 μl wstępnie podgrzanego roztworu kalibru 45 – 60 minut przed rozpoczęciem cyklu.

4. Test strumienia zewnątrzkomórkowego

  1. Przygotowanie płyt powlekanych klejem
    UWAGA: Ponieważ pomiar parametrów metabolicznych odbywa się w mikrokomorze utworzonej na dnie 96-dołkowej płytki testowej, komórki zawiesiny muszą być najpierw przyklejone do dna studzienki. Stosuje się klej komórkowy wyekstrahowany z małża Mytilus edulis. Producent kleju komórkowego zaleca stężenie powłoki od 1 do 5 μg/cm2. Studzienka mikropłytki do hodowli komórkowej analizatora ma powierzchnię około 0,110cm2. Tak więc dla stężenia 5 μg/cm2 wymagane jest około 0,55 μg kleju. Ponieważ 25 μl roztworu kleju zostanie użyte do pokrycia każdego dołka, optymalne stężenie roztworu kleju dla mikropłytek do hodowli komórkowych analizatora wynosi około 22,4 μg/ml (22,4 μg/ml x 0,025 ml = 0,56 μg).
    1. Przygotować 2,5 ml roztworu kleju komórkowego (22,4 μg/ml) w 0,1 M wodorowęglanie sodu o pH 8,0. Wodorowęglan zapewnia optymalne pH dla przyczepności komórek, które według producenta wynosi od 6,5 do 8,0.
    2. Odpipetować pipetą 25 μl roztworu kleju komórkowego do każdego dołka na płytce testowej i inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Następnie usunąć roztwór i przemyć 2x 200 μl sterylnej wody/studzienki. Pozostaw studzienki do wyschnięcia, trzymając płytkę otwartą przez 15 minut w kapturze do hodowli komórkowych.
      UWAGA: Powlekane talerze można przechowywać do 1 tygodnia w temperaturze 4 °C.
  2. Wysiew komórek w płytkach pokrytych klejem
    1. Odwirować komórki z kroku 2.4.3 przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Usuń supernatanty i umyj komórki w podgrzanym mitochondrialnym podłożu do badania wysiłkowego (jeśli przeprowadzany jest test stresu mitochondrialnego) lub pożywce do testu wysiłkowego glikolizy (jeśli wykonywana jest próba wysiłkowa glikolizy). Ponownie zawiesić komórki osadkowe i ponownie zawiesić do preferowanego stężenia komórek w tym samym podłożu (objętość zawiesiny będzie zależeć od wybranego stężenia komórek; ponieważ każda studzienka będzie zawierać 180 μl zawiesiny komórek, należy przygotować 0,26 x 106, 0,52 x 106, 1,04 x 106, 2,08 x 106, 4,17 x 106 i 8,33 x 106 komórek/ml zawiesiny komórek dla 0,047 x 106, 0,094 x 106, 0,187 x 106, 0,375 x 106, 0,75 x 106 i 1. 5 x 10 odpowiednio6 komórek na studzienkę).
    2. Płytka 180 μl zawiesiny komórek na studzienkę wzdłuż boku każdej studzienki. Zalecana jest pipeta wielokanałowa. Użyj studzienek A1, A12, H1 i H12 płytki hodowlanej analizatora jako studzienek kontrolnych do korekcji tła. Dodać 180 μl pożywki do oznaczania w tych studzienkach (bez komórek). W razie potrzeby można zastosować dodatkowe studzienki kontrolne i jeśli jest wystarczająco dużo miejsca w płycie.
      UWAGA: Obecność surowicy może powodować słabe przyleganie komórek.
    3. Inkubować płytkę przez 30 minut w temperaturze 37 °C w inkubatorze wolnym od CO2 . W międzyczasie przygotuj 10x mieszanki (patrz krok 4.3 poniżej).
    4. Zmień ustawienia wirówki na zerowe hamowanie. Odwirować płytkę o sile 200 x g przez 5 minut. Obserwuj komórki pod mikroskopem, aby sprawdzić, czy tworzą monowarstwę na dnie studzienki. Przenieść płytki z powrotem do inkubatora wolnego od CO2 na 25 minut. Aby uzyskać najlepsze rezultaty, całkowity czas po poszyciu nie powinien być dłuższy niż około 1 godziny.
  3. Przygotowanie 10 roztworów roboczych do załadowania do wkładu czujnika
    UWAGA: Każda z 96 końcówek sondy wkładu czujnika zawiera 4 porty (A, B, C i D), które można wykorzystać do sekwencyjnego wstrzykiwania związków do poszczególnych studzienek.
    1. Aby przeprowadzić test stresu mitochondrialnego, przygotuj po 2,5 ml 10 μM oligomycyny, 1 mM DNP i mieszaniny 10 μM rotenonu i 10 μM antymycyny A w mitochondrialnym teście stresu (użyj roztworów podstawowych z kroku 1.2.3). Końcowe stężenia w studzience po wstrzyknięciu wynoszą 1 μM oligomycyny, 0,1 mM DNP i 1 μM antymycyny A/rotenonu.
    2. Aby przeprowadzić test wysiłkowy glikolizy, należy przygotować 2,5 ml mieszaniny 10 μM rotenonu i 10 μM antymycyny A w pożywce do oznaczania stresu glikolizy (użyć roztworów podstawowych z kroku 1.2.3). Rozpuść glukozę w pożywce do prób stresowych glikolizy dla roztworu o stężeniu 100 mM i 2-deoksy-glukozę (2-DG) w pożywce do prób warunków skrajnych glikolizy dla roztworu o stężeniu 500 mM. Końcowe stężenia w studzience po wstrzyknięciu wynoszą 10 mM glukozy, 1 μM antymycyny A/rotenonu i 50 mM 2-DG.
    3. Podgrzej roztwory do temperatury 37 °C, sprawdź pH i w razie potrzeby dostosuj do 7,4. Związki obciążeniowe przygotowane w kroku 4.3.1. (w przypadku testu wysiłkowego mitochondriów) lub 4.3.2 (w przypadku testu obciążenia glikolizy) do portów A, B i C uwodnionego wkładu czujnika (od kroku 3.2) przy użyciu wielokanałowego mikropipetora i prowadnic ładowania portów dostarczonych z wkładem, jak pokazano w tabeli 2.
      UWAGA: Aby zapewnić prawidłowe wstrzyknięcie we wszystkich studzienkach podczas testu, każda seria używanych portów (np. wszystkie porty A) musi zawierać tę samą objętość wtrysku na całym wkładzie czujnika. Dotyczy to studzienek korekcyjnych tła, a nawet tych studzienek, które nie zostały wykorzystane w eksperymencie.
    4. Inkubować załadowany wkład czujnika w temperaturze 37 °C w inkubatorze wolnym od CO2 podczas ustawiania programu.
  4. Ustalanie protokołów oznaczania strumienia zewnątrzkomórkowego
    1. Otwórz oprogramowanie analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego i za pomocą zakładek Definicje grup i Mapa płyt wskaż grupy studzienek, które mają podobne warunki (np. studzienki z tą samą liczbą komórek lub studzienki z komórkami spoczynkowymi lub komórkami stymulowanymi przez IL-15). Wskaż również studzienki korekcyjne tła (domyślnie zostaną ustawione studzienki A1, A12, H1 i H12, ale można użyć dodatkowych studzienek) i puste studzienki.
    2. Zainstaluj program opisany w Tabeli 3 w oprogramowaniu za pomocą zakładki Protokół.
    3. Rozpocznij program za pomocą zakładki Uruchom test. Umieść wkład czujnika (uwodniony i załadowany 10 związkami) i płytkę użytkową na tacy. Po etapie kalibracji (15 – 20 min), po wyświetleniu monitu, wymień płytkę kalibru na płytkę testową (bez pokrywy) z dołączonymi ogniwami. Po tym przebieg jest w pełni zautomatyzowany (maszyna wykona wszystkie pomiary i wtryski).
      UWAGA: Możliwe jest przeprowadzenie mitochondrialnego testu wysiłkowego i glikolitycznego testu wysiłkowego na tej samej płytce, o ile określone związki zostaną załadowane do odpowiednich portów (oligomycyna, DNP i antymycyna/rotenon odpowiednio w portach A, B i C studzienek, w których przeprowadzany jest mitochondrialny test wysiłkowy; glukoza, antymycyna/rotenon i 2-DG w portach A, B i C odpowiednio odwiertów, w których przeprowadza się test warunków skrajnych glikolizy), te same objętości do wstrzykiwań są używane w każdej serii portów, a studzienki dla każdego testu są prawidłowo identyfikowane za pomocą zakładek Definicje grup i Mapa płyt w oprogramowaniu.
    4. Po zakończeniu przebiegu pobierz dane i przeanalizuj je za pomocą oprogramowania.

5. Określanie numeru komórki

UWAGA: Wyniki mogą być znormalizowane, aby uwzględnić możliwe różnice w numerze komórki. Można zastosować dwa główne podejścia opisane poniżej.

  1. Oznaczanie zawartości DNA
    1. Usunąć pozostałą pożywkę do oznaczania za pomocą pipety z każdej studzienki. Podczas zasysania pożywki należy uważać, aby nie naruszyć komórek. Płytkę można przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu analizy.
      UWAGA: Etap zamrażania jest ważny dla efektywnej lizy komórek i oznaczania zawartości DNA.
    2. Przygotować 1x roztwór buforu do lizy komórek do testu proliferacji komórek (20x) w wodzie destylowanej (200 μl/studzienkę).
    3. Dodaj podstawowy roztwór barwnika do testu proliferacji komórek (400x) do 1x buforu do lizy komórek. Do wykrycia od 50 do 50 000 komórek na studzienkę należy użyć 1x barwnika do oznaczania proliferacji komórek. W przypadku większej liczby komórek zaleca się stosowanie barwnika do testu proliferacji komórek o stężeniu końcowym wyższym niż 1x. W takim przypadku należy użyć barwnika do oznaczania proliferacji komórek o 5-krotnym stężeniu końcowym (rozcieńczyć roztwór podstawowy testu proliferacji komórek 80-krotnie do 1x buforu do lizy komórek).
    4. Dodać 200 μl odczynnika do oznaczania proliferacji komórek do każdego dołka. Próbki należy inkubować przez 2–5 minut w temperaturze pokojowej. Chronić przed światłem.
    5. Zmierzyć fluorescencję próbek przy wzbudzeniu: 480 nm; emisji: 520 nm za pomocą czytnika mikropłytek fluorescencyjnych zgodnie z zaleceniami producenta.
  2. Oznaczanie zawartości białka
    1. Ostrożnie, całkowicie odessać pożywkę do oznaczania z każdej studzienki, nie dotykając komórek, i zamrozić komórki w temperaturze -20 °C przez co najmniej 1 godzinę. Alternatywnie, komórki mogą być przechowywane w stanie zamrożonym przez dłuższy czas (do 1 tygodnia) do czasu przeprowadzenia analizy.
    2. Dodać 50 μl pożywki do lizy testu radioimmunoprecypitacyjnego (RIPA) uzupełnionej 1x inhibitorami proteazy (ze 100x roztworu podstawowego) do każdej studzienki. Umieść płytkę na wytrząsarce na 5 minut w temperaturze pokojowej, a następnie inkubuj płytkę na lodzie przez 30 minut, aby uzyskać pełną lizę komórek.
    3. Odwirować płytkę przez 5 minut przy 200 x g w temperaturze pokojowej. Ten krok spowoduje osadzenie szczątków komórkowych, aby zapobiec zakłóceniom pomiaru białka.
    4. Zmierz stężenie białka za pomocą testu kwasu bicinchoninowego (BCA) zgodnie z zaleceniami producenta.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wyizolowanie komórek NK z krwi obwodowej zapewnia czystą i żywotną populację

Badanie przepływu zewnątrzkomórkowego opiera się na pomiarze stężenia H+ i O2 w dołku i nie pozwala na odróżnienie różnych populacji komórek ani ocenę ich żywotności. Z tego powodu uzyskanie wysoce czystej i żywotnej populacji komórek docelowych było kluczowym krokiem do powodzenia tych eksperymentów.

Wyizolowanie komórek NK z krwi obwodowej przeprowad...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym artykule ustaliliśmy protokół skutecznego izolowania i hodowli czystych i żywotnych pierwotnych ludzkich komórek NK z krwi obwodowej. Zoptymalizowaliśmy również warunki pomiaru aktywności metabolicznej tych komórek NK ocenianej na podstawie wskaźnika zużycia tlenu i wskaźnika zakwaszenia zewnątrzkomórkowego za pomocą analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego. W porównaniu z innymi metodami respirometrycznymi, analizator strumienia zewnątrzkomórkowego jest szybki, wymaga niewielkiej liczby komórek i umożliwia badan...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Autorzy dziękują Dr. Michaelowi N. Sackowi (National Heart, Lung, and Blood Institute) za wsparcie i dyskusję. Badanie to było wspierane przez Intramural Research Programs of the National Institutes of Health, National Cancer Institute oraz National Heart, Lung, and Blood Institute. JT jest wspierany przez program Ramon y Cajal (grant RYC2018-026050-I) MICINN (Hiszpania).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
2-Deoksy-D-glukoza (2-DG)MiliporeSigmaD8375-5GGlikoliza Test wysiłkowy Związek wtryskowy
2,4-Dinotrophenol (2,4-DNP)MilliporeRozłącznik SigmaD198501ETC / mitochondrialny test wysiłkowy Mieszanka wtryskiwacza
96 Well Cell Culture / Okrągłe dno z pokrywkąCostar3799Hodowla komórkowa NK
Antymycyna AMiliporeSigmaA8674Inhibitor kompleksu III / glikoliza i test stresu mitochondrialnego związek iniekcyjny
BD FACSDIVA SoftwareBD BiosciencesAkwizycja danych przepływu
BD LSR FortessaBD BiosciencesAkwizycja danych przepływu
Cell-TakCorning354240Klej komórkowy
Test proliferacji komórek CyQUANTThermoFisher ScientificC7026Test proliferacji komórek do ilościowego oznaczania DNA. Zawiera bufor do lizy komórek i barwnik CyQUANT GR
EasySep Human CD3 Positive Selection Kit IITechnologie komórek macierzystych17851Izolacja komórek NK z PBMC
Zestaw do wzbogacania ludzkich komórek NK EasySepTechnologie komórek macierzystych19055Izolacja komórek NK z PBMC
Technologie EasySep MagnetStemcell18001Izolacja komórek NK z PBMC
EDTA 0,5 M, pH 8Jakość Biologiczny10128-446NK sprzedam separacyjny
probówki FACSFalcon-Fisher Scientific352235Eksperyment cytometrii przepływowej
Falcon 50 ml Probówki stożkoweFalcon-Fisher Scientific14-432-22Separacja komórek NK
Surowica cielęca płodu (FCS)Gibco10437-028Bufor do separacji komórek NK
FlowJo SoftwareBD BiosciencesAnaliza danych przepływu
Glikokrzema MilliporeSigmaG8270Składnik mitochondrialnej pożywki do testów wysiłkowych. Test stresu glikolizy Związek wtryskiwacza
Halt Protease Inhibitor CocktailThermoFisher Scientific78429Inhibitor proteazy 100X. Zastosowanie w buforze do lizy RIPA Ludzka
IL-15Peprotech200-15-50ugStymulacja komórek NK
Surowica ludzka (HS)Valley Biomedical9C0539Pożywka do hodowli komórek NK
suplement IMDMGibco12440053komórka NK pożywka hodowlana
L-glutamina (200 mM)ThermoFisher Scientific25030-081Składnik pożywki do testów warunków skrajnych
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Barin KitThermoFisher ScientificL34965Barwnik żywotności do barwienia cytometrią przepływową
LSMmpbio50494XPBMCs separacja od ludzkiej krwi
Mysz anty-ludzka CD3 BV711BD Biosciences563725Barwienie cytometrią przepływową komórek T
Mysz anty-ludzka CD56 PEBD Pharmingen555516barwienie metodą cytometrii przepływowej NK
Mysz anty-ludzka NKp46PE BD Pharmingen557991barwienie cytometrią przepływową NK
OligomycynaMilliporeSigma75351Inhibitor kompleksu V / mitochondrialny test wysiłkowy związek wtryskiwacza
PBS pH 7,4Gibco10010-023komórka NK Bufor separacyjny
Pierce BCA Zestaw do oznaczania białekThermoFisher Scientific23225Do oznaczania stężenia białka
Bufor RIPABoston BioProductsBP-115Liza komórek
MiliporyrotenonuSigmaR8875II / glikoliza i test stresu mitochondrialnego Związek wtryskiwacza
Seahorse Wave Controller SoftwareAgilentKontroler do analizatora Seahorse XFe96
Oprogramowanie komputerowe Seahorse WaveAgilentDo analizy danych
Seahorse XF Base MediumAgilent102353-100Pożywka bazowa do badania strumienia zewnątrzkomórkowego
Analizator Seahorse XFe96 Analizatorstrumienia zewnątrzkomórkowegoAgilent
Seahorse XFe96 FluxPakAgilent102416-100Zawiera 20 płytek do hodowli komórkowych XF96, 18 wkładów z czujnikiem XFe96, prowadnice ładowania do przenoszenia związków do wkładu testowego oraz 1 butelkę roztworu kalibru (500 ml).
Wodorowęglan soduMilliporeSigmaS5761Aby przygotować roztwór Cell-Tak
Pirogronian sodu (100 mM)ThermoFisher Scientific11360-070Składnik mitochondrialnej pożywki do testów wysiłkowych
Inhibitor kompleksu

Bibliografia

  1. Long, E. O., Kim, H. S., Liu, D., Peterson, M. E., Rajagopalan, S. Controlling natural killer cell responses: integration of signals for activation and inhibition. Annual Review of Immunology. 31, 227-258 (2013).
  2. Caligiuri, M. A. Human natural killer cells. Blood. 112 (3), 461-469 (2008).
  3. Anton, O. M., Vielkind, S., Peterson, M. E., Tagaya, Y., Long, E. O. NK Cell Proliferation Induced by IL-15 Transpresentation Is Negatively Regulated by Inhibitory Receptors. Journal of Immunology. 195 (10), 4810-4821 (2015).
  4. Henney, C. S., Kuribayashi, K., Kern, D. E., Gillis, S. Interleukin-2 augments natural killer cell activity. Nature. 291 (5813), 335-338 (1981).
  5. Anton, O. M., et al. Trans-endocytosis of intact IL-15Ralpha-IL-15 complex from presenting cells into NK cells favors signaling for proliferation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (1), 522-531 (2020).
  6. Marcais, A., et al. The metabolic checkpoint kinase mTOR is essential for IL-15 signaling during the development and activation of NK cells. Nature Immunology. 15 (8), 749-757 (2014).
  7. Mookerjee, S. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. Determining Maximum Glycolytic Capacity Using Extracellular Flux Measurements. PloS One. 11 (3), 0152016(2016).
  8. Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).
  9. Cheng, J., et al. Mitochondrial Proton Leak Plays a Critical Role in Pathogenesis of Cardiovascular Diseases. Advances in Experimental Medicine and Biology. 982, 359-370 (2017).
  10. Terren, I., Orrantia, A., Vitalle, J., Zenarruzabeitia, O., Borrego, F. NK Cell Metabolism and Tumor Microenvironment. Frontiers in Immunology. 10, 2278(2019).
  11. Felices, M., et al. Continuous treatment with IL-15 exhausts human NK cells via a metabolic defect. Journal of Clinical Investigation Insight. 3 (3), 96219(2018).
  12. Miller, J. S., et al. A First-in-Human Phase I Study of Subcutaneous Outpatient Recombinant Human IL15 (rhIL15) in Adults with Advanced Solid Tumors. Clinical Cancer Research. 24 (7), 1525-1535 (2018).
  13. Conlon, K. C., et al. IL15 by Continuous Intravenous Infusion to Adult Patients with Solid Tumors in a Phase I Trial Induced Dramatic NK-Cell Subset Expansion. Clinical Cancer Research. 25 (16), 4945-4954 (2019).
  14. Dubois, S., et al. IL15 Infusion of Cancer Patients Expands the Subpopulation of Cytotoxic CD56(bright) NK Cells and Increases NK-Cell Cytokine Release Capabilities. Cancer Immunology Research. 5 (10), 929-938 (2017).
  15. Traba, J., et al. Fasting and refeeding differentially regulate NLRP3 inflammasome activation in human subjects. Journal of Clinical Investigation. 125 (12), 4592-4600 (2015).
  16. Traba, J., Miozzo, P., Akkaya, B., Pierce, S. K., Akkaya, M. An Optimized Protocol to Analyze Glycolysis and Mitochondrial Respiration in Lymphocytes. Journal of Visualized Experiments. (117), e54918(2016).
  17. Horan, M. P., Pichaud, N., Ballard, J. W. Review: quantifying mitochondrial dysfunction in complex diseases of aging. Journals of Gerontology. Series A, Biological Sciences and Medical Sciences. 67 (10), 1022-1035 (2012).
  18. Tognarelli, S., Jacobs, B., Staiger, N., Ullrich, E. Flow Cytometry-based Assay for the Monitoring of NK Cell Functions. Journal of Visualized Experiments. (116), e54615(2016).
  19. Theorell, J., Bryceson, Y. T. Analysis of Intracellular Ca(2+) Mobilization in Human NK Cell Subsets by Flow Cytometry. Methods in Molecular Biology. 1441, 117-130 (2016).
  20. Mookerjee, S. A., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. Quantifying intracellular rates of glycolytic and oxidative ATP production and consumption using extracellular flux measurements. Journal of Biological Chemistry. 292 (17), 7189-7207 (2017).
  21. O'Brien, K. L., Finlay, D. K. Immunometabolism and natural killer cell responses. Nature Reviews: Immunology. 19 (5), 282-290 (2019).
  22. Ahn, B. H., et al. A role for the mitochondrial deacetylase Sirt3 in regulating energy homeostasis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (38), 14447-14452 (2008).
  23. Stram, A. R., Payne, R. M. Post-translational modifications in mitochondria: protein signaling in the powerhouse. Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (21), 4063-4073 (2016).
  24. Armstrong, J. A., et al. Oxidative stress alters mitochondrial bioenergetics and modifies pancreatic cell death independently of cyclophilin D, resulting in an apoptosis-to-necrosis shift. Journal of Biological Chemistry. 293 (21), 8032-8047 (2018).
  25. Mookerjee, S. A., Goncalves, R. L. S., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. The contributions of respiration and glycolysis to extracellular acid production. Biochimica et Biophysica Acta. 1847 (2), 171-181 (2015).
  26. Mookerjee, S. A., Brand, M. D. Measurement and Analysis of Extracellular Acid Production to Determine Glycolytic Rate. Journal of Visualized Experiments. (106), e53464(2015).
  27. Lichtshtein, D., Kaback, H. R., Blume, A. J. Use of a lipophilic cation for determination of membrane potential in neuroblastoma-glioma hybrid cell suspensions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (2), 650-654 (1979).
  28. Michelet, X., et al. Metabolic reprogramming of natural killer cells in obesity limits antitumor responses. Nature Immunology. 19 (12), 1330-1340 (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

komórki Natural Killeranalizator przepływu zewnątrzkomórkowegopomiar glikolizyoddychanie mitochondrialnestymulacja IL-15separacja limfocytówcytometria przepływowaszybkość zużycia tlenuzakwaszenie zewnątrzkomórkoweanaliza metabolizmu komórkowego
Analiza metabolizmu ludzkich komórek NK
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.