Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Dotchawicze podawanie preparatu suchego proszku myszom

12.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61469

⸱

25 lipca 2020

 ,  ,  , 
1Department of Pharmacology and Pharmacy, LKS Faculty of Medicine, The University of Hong Kong, 2Advanced Drug Delivery Group, Sydney Pharmacy School, Faculty of Medicine and Health, The University of Sydney

W tym artykule

Podsumowanie

Preparaty suchego proszku do inhalacji mają ogromny potencjał w leczeniu chorób układu oddechowego. Przed przystąpieniem do badań na ludziach konieczna jest ocena skuteczności preparatu w postaci suchego proszku w badaniach przedklinicznych. Przedstawiono prostą i nieinwazyjną metodę podawania suchego proszku myszom drogą dotchawiczą.

Streszczenie

Przy opracowywaniu preparatów suchego proszku do inhalacji, niezbędna jest ocena ich aktywności biologicznej w przedklinicznych modelach zwierzęcych. W pracy przedstawiono nieinwazyjną metodę dotchawniczego podawania preparatu suchego proszku do tchawicy u myszy. Przedstawiono urządzenie do ładowania suchego proszku, które składa się z końcówki pipety o pojemności 200 μl w żelu, połączonej ze strzykawką o pojemności 1 ml za pomocą trójdrogowego zaworu odcinającego. Niewielką ilość suchego proszku (1-2 mg) umieszcza się na końcówce pipety i rozprasza w 0,6 ml powietrza w strzykawce. Ponieważ końcówki do pipet są jednorazowe i niedrogie, różne preparaty suchego proszku można z wyprzedzeniem dodawać do różnych końcówek. Różne preparaty mogą być oceniane w tym samym eksperymencie na zwierzętach bez konieczności czyszczenia urządzenia i uzupełniania dawki, co pozwala zaoszczędzić czas i wyeliminować ryzyko zanieczyszczenia krzyżowego resztkami proszku. Stopień dyspersji proszku można sprawdzić na podstawie ilości proszku pozostałego w końcówce pipety. W zestawie znajduje się protokół intubacji u myszy z wykonanym na zamówienie źródłem światła i kaniulą prowadzącą. Właściwa intubacja jest jednym z kluczowych czynników wpływających na dotchawicze dostarczanie preparatu suchego proszku do głębokiego obszaru płuc myszy.

Wprowadzenie

Płucna droga podawania oferuje różne korzyści w dostarczaniu leków zarówno dla działań miejscowych, jak i ogólnoustrojowych. W leczeniu chorób płuc wysokie miejscowe stężenie leku można osiągnąć poprzez dostarczanie do płuc, zmniejszając w ten sposób wymaganą dawkę i zmniejszając częstość występowania ogólnoustrojowych działań niepożądanych. Co więcej, stosunkowo niska aktywność enzymatyczna w płucach może zmniejszać przedwczesny metabolizm leków. Płuca są również wydajne w wchłanianiu leków o działaniu ogólnoustrojowym ze względu na dużą i dobrze ukrwioną powierzchnię, niezwykle cienką warstwę komórek nabłonka i dużą objętość krwi w naczyniach włosowatych płucnych1.

Wziewne preparaty suchego proszku były szeroko badane pod kątem zapobiegania i leczenia różnych chorób, takich jak astma, przewlekła obturacyjna choroba płuc, cukrzyca i szczepienia płuc2,3,4. Leki w stanie stałym są na ogół bardziej stabilne niż w postaci płynnej, a inhalatory suchego proszku są bardziej przenośne i przyjazne dla użytkownika niż nebulizatory5,6. Przy opracowywaniu postaci wziewnych suchego proszku należy ocenić bezpieczeństwo, profil farmakokinetyczny i skuteczność terapeutyczną w przedklinicznych modelach zwierzęcych po podaniu dopulmonologicznym7. W przeciwieństwie do ludzi, którzy mogą aktywnie wdychać suchy proszek, dostarczanie suchego proszku przez płuca małym zwierzętom jest trudne. Konieczne jest ustalenie skutecznego protokołu dostarczania suchego proszku do płuc zwierząt.

Myszy są powszechnie używane jako badawcze modele zwierzęce, ponieważ są ekonomiczne i dobrze się rozmnażają. Są również łatwe w obsłudze, a wiele modeli chorób jest dobrze ugruntowanych. Istnieją dwa główne podejścia do podawania suchego proszku do płuc myszy: inhalacja i podanie dotchawicze. Do inhalacji mysz umieszcza się w komorze na całe ciało lub tylko nos, gdzie suchy proszek jest aerozolowany, a zwierzęta wdychają aerozol bez sedacji8,9. Wymagany jest drogi sprzęt, a skuteczność dostarczania leków jest niska. Podczas gdy komora na całe ciało może być technicznie mniej wymagająca, komora naświetlania tylko na nos może zminimalizować narażenie na działanie narkotyków na powierzchnię ciała. Niezależnie od tego, nadal trudno jest precyzyjnie kontrolować i określać dawkę dostarczaną do płuc. Suchy proszek osadza się głównie w okolicy nosogardzieli, gdzie widoczny jest klirens śluzowo-rzęskowy10. Co więcej, myszy znajdujące się w komorze są narażone na znaczny stres podczas procesu podawania, ponieważ są ograniczone i pozbawione dostępu do pożywienia i wody11. W przypadku podawania dotchawiczego na ogół odnosi się do wprowadzenia substancji bezpośrednio do tchawicy. Aby to osiągnąć, istnieją dwie różne techniki: tracheotomia i intubacja ustno-tchawicza. Ta pierwsza wymaga zabiegu chirurgicznego, który polega na nacięciu tchawicy, które jest inwazyjne i rzadko stosowane do podawania proszku. Tylko druga technika jest tutaj opisana. W porównaniu z metodą inhalacyjną, podawanie dotchawicze jest częściej stosowaną metodą podawania do płuc u myszy ze względu na wysoką skuteczność dostarczania przy minimalnych stratach leku12,13. Jest to prosta i szybka metoda na precyzyjne dostarczenie myszce niewielkiej ilości proszku w ciągu kilku miligramów. Chociaż mysz jest anatomicznie i fizjologicznie odmienna od człowieka i podczas procesu intubacji wymagane jest znieczulenie, podanie dotchawicze omija górne drogi oddechowe i oferuje bardziej skuteczny sposób oceny aktywności biologicznej preparatu suchego proszku, takiej jak wchłanianie płucne, biodostępność i efekty terapeutyczne14,15.

Aby podać suchy proszek dotchawiczo, mysz musi być zaintubowana, co może być trudne. W artykule opisano wytwarzanie wykonanego na zamówienie insuflatora suchego proszku i urządzenia do intubacji. Przedstawiono procedury intubacji i wdmuchiwania suchego proszku do płuc myszy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Eksperymenty przeprowadzone w tym badaniu zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Wykorzystania Żywych Zwierząt do Nauczania i Badań (CULATR), Uniwersytet w Hongkongu. W tym badaniu zastosowano preparaty suchego proszku przygotowane metodą liofilizacji rozpyłowej (SFD) zawierające 0,5% informacyjnego RNA lucyferazy (mRNA), 5% syntetycznego peptydu PEG12KL4 i 94,5% mannitolu (w/w) w celu wykazania ekspresji mRNA w klasie płuc16. Mediana masy średnicy aerodynamicznej (MMAD) proszku SFD wynosi 2,4 μm. Suszony rozpyłowo (SD) mannitol w proszku służy do badania wpływu objętości powietrza użytego w dyspersji proszku16. MMAD proszku SD wynosi 1,5 μm.

1. Wykonanie insulatora suchego proszku i ładowanie suchego proszku

  1. (Opcjonalnie) Zneutralizować ładunki elektrostatyczne suchego proszku (w fiolce) i okrągłej końcówki do pipety o pojemności 200 μl bez filtra. Używaj pistoletu antystatycznego lub wagi z funkcją dejonizacji zgodnie z instrukcją producenta.
  2. Przygotuj papier wagowy o wymiarach około 4 cm x 4 cm. Złóż papier na pół po przekątnej, a następnie rozłóż go.
  3. Odważyć 1-2 mg suchego proszku na papierze wagowym.
  4. Napełnij końcówkę pipety z żelem proszkiem przez szerszy otwór końcówki. Delikatnie stukaj, aby upakować proszek, aż proszek utworzy luźne aglomeraty w pobliżu wąskiego końca końcówki (Rysunek 1A). Należy unikać zbyt ciasnego pakowania proszku, ponieważ może to utrudnić dyspersję proszku.
  5. Podłącz końcówkę z proszkiem do strzykawki o pojemności 1 ml przez trójdrożny kran (Rysunek 1B). Rozmiar strzykawki można zmieniać w zależności od objętości powietrza używanego do dyspersji proszku. Podczas łączenia należy trzymać końcówkę i strzykawkę pionowo, aby zapobiec rozsypaniu się proszku. Jeśli podanie nie zostanie wykonane natychmiast, należy użyć parafilmu do uszczelnienia otworów końcówki i przechowywać go tymczasowo w odpowiednich warunkach do czasu podania.

2. Produkcja urządzenia do intubacji

  1. Źródło światła (Rysunek 2)
    1. Przygotuj niestandardowe źródło światła z latarką z diodą elektroluminescencyjną (LED) i elastycznym światłowodem o średnicy 0,8-1 mm.
    2. Wykonaj wyśrodkowany otwór na przezroczystej soczewce latarki LED za pomocą wiertarki ręcznej lub wiertła, aby światłowód ledwo mógł przejść.
    3. Przełóż światłowód przez otwór. Włącz latarkę LED, aby dostosować pozycję i głębokość wsunięcia, aby uzyskać maksymalną jasność na drugim końcu światłowodu.
    4. Przymocuj światłowód na miejscu za pomocą przezroczystego kleju epoksydowego.
  2. Kaniula prowadząca (Rysunek 3)
    1. Weź plastikową pipetę Pasteura o pojemności 1 ml (Rysunek 3A) i przytrzymaj pipetę na obu końcach.
    2. Użyj lampy alkoholowej (lub innych źródeł ciepła w laboratorium, takich jak palnik Bunsena), aby podgrzać środek pipety, umieszczając ją na wysokości 5-10 cm nad płomieniem (Rysunek 3B). Obróć pipetę, aby upewnić się, że jest równomiernie podgrzana.
    3. Gdy plastik stanie się miękki i odkształcalny, odsuń pipetę od płomienia i delikatnie ją rozciągnij.
    4. Przetnij rozciągniętą pipetę na środku nożyczkami na część A i część B (Rysunek 3C-E). Części A należy używać jako pipety z cienką końcówką, a części B jako kaniuli prowadzącej. Aby zwiększyć szansę na udaną intubację za pomocą kaniuli prowadzącej, wykonaj skos (niezbyt ostry, który może zwiększyć ryzyko zranienia zwierzęcia) na końcu części B (Rysunek 3F). Po włożeniu końcówki pipety o pojemności 200 μl (do ładowania proszku) do kaniuli prowadzącej, powinna ona wystawać kaniuli na 1-2 mm.
      UWAGA: Kaniula prowadząca (część B) o odpowiednim wymiarze (średnica wewnętrzna i zewnętrzna) do intubacji może mieć igłę o rozmiarze 21, która mieści się w środku, podczas gdy może również pasować do igły o rozmiarze 17. Może być konieczne wielokrotne rozciągnięcie pipet w celu uzyskania odpowiedniego wymiaru.
    5. (Opcjonalnie): Wytnij mały otwór na szerszym końcu kaniuli prowadzącej, aby była bardziej elastyczna i łatwiej było utrzymać światłowód (Rysunek 3F). Otwór ten pozwala również na zamontowanie mikrorozpylacza do podawania ciekłego aerozolu.

3. Intubacja

  1. Znieczulić mysz (BALB/c, 7-9 tygodni) ketaminą (100 mg/kg) i ksylazyną (10 mg/kg) we wstrzyknięciu dootrzewnowym.
  2. Przygotuj platformę z pleksi i zamontuj ją na stojaku za pomocą zacisku (Rysunek 4A). Umieść znieczuloną mysz na platformie (pod kątem około 60° nachylenia) w pozycji leżącej. Wysokość i kąt nachylenia platformy można regulować za pomocą położenia zacisku na stojaku.
  3. Zawieś mysz, zaczepiając jej siekacze o nylonową nić dentystyczną (Rysunek 4B). Zabezpiecz pozycję myszy kawałkiem taśmy lub gumką.
  4. Wprowadzić światłowód do kaniuli prowadzącej przed intubacją z końcówką światłowodu na poziomie otworu kaniuli prowadzącej. Włącz latarkę LED, aby się zaświecić.
  5. Delikatnie wysuń język myszy za pomocą kleszczy, aby odsłonić jej tchawicę.
  6. Drugą ręką przytrzymaj kaniulę prowadzącą ze światłowodem w środku. Włóż je przez jamę ustną. Dzięki oświetleniu ze światłowodu otwór tchawicy można uwidocznić jako otwór między strunami głosowymi.
  7. Wyrównaj skos kaniuli prowadzącej w kierunku linii środkowej otworu (Rysunek 5A). Delikatnie zaintubuj kaniulę prowadzącą światłowodem do tchawicy, kierując najcieńszą końcówkę kaniuli na otwór tchawicy.
  8. Po intubacji szybko usuń światłowód i pozostaw kaniulę prowadzącą wewnątrz tchawicy (Rysunek 5B). Należy przestrzegać normalnego oddychania.
  9. Przytrzymaj pipetę z cienką końcówką (część A) przy otworze kaniuli prowadzącej i wdmuchnij niewielki podmuch powietrza (około 0,2 ml) do płuca myszy. Lekkie napompowanie w klatce piersiowej myszy wskazuje na prawidłową intubację. Wyjmij pipetę z cienką końcówką przed podaniem proszku.

4. Podawanie proszku

  1. Trzymać końcówkę z proszkiem, która jest podłączona do strzykawki, jak opisano w kroku 1.5. Upewnij się, że przepływ powietrza między strzykawką a końcówką jest odłączony.
  2. Pociągnąć tłok strzykawki do tyłu, aby pobrać 0,6 ml powietrza.
    UWAGA: Objętość powietrza używanego do dyspersji proszku zależy od właściwości proszku i ilości załadowanego proszku. Jest to bardziej szczegółowo opisane w sekcji wyników.
  3. Przekręć zawór trójdrogowego zaworu odcinającego, aby połączyć przepływ powietrza między strzykawką a końcówką z proszkiem.
  4. Włóż końcówkę z proszkiem do kaniuli prowadzącej, która została już umieszczona w tchawicy myszy (Rysunek 5C). Chwycić kaniulę prowadzącą i mocno wcisnąć tłok strzykawki jednym ciągłym ruchem, aby rozproszyć proszek w postaci aerozoli do płuc.
    UWAGA: Wszelkie ruchy urządzenia do przodu powinny być zminimalizowane, aby uniknąć zranienia zwierzęcia.
  5. Zdejmij końcówkę i sprawdź, czy proszek wewnątrz końcówki został opróżniony. Jeśli nie, powtórz kroki od 4.1 do 4.4.
    UWAGA: Jeśli proszek jest zbyt ciasno zapakowany z powodu nadmiernego stukania, może nie zostać prawidłowo zdyspergowany.
  6. Po zakończeniu podawania wyjmij kaniulę prowadzącą z tchawicy.
  7. Pozwól myszy dojść do siebie, ustawiając ją poziomo w pozycji leżącej z językiem do połowy wysuniętym, aby uniknąć zablokowania dróg oddechowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Podczas stosowania inhalatora do proszków suchych w celu podania aerozolu proszkowego do płuc zwierzęcia, objętość użytego powietrza ma kluczowe znaczenie, ponieważ wpływa ona zarówno na bezpieczeństwo, jak i na efektywność dyspersji proszku. Aby zoptymalizować tę metodę, do dyspersji proszku suchego (1 mg mannitolu otrzymanego metodą suszenia rozpyłowego) wykorzystano różne objętości powietrza (0,3 mL, 0,6 mL i 1,0 mL), a masę myszy monitorowano przez 48 godzin po podaniu (Rycina 6). Zastos...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W artykule przedstawiono wykonane na zamówienie urządzenia do influacji suchego proszku i intubacji dotchawiczej. Na etapie ładowania proszku suchy proszek jest ładowany do końcówki do pipety o pojemności 200 μl z żelem. Ważne jest, aby delikatnie postukać w końcówkę, aby umożliwić luźne opakowanie proszku na wąskim końcu końcówki. Jeśli jednak proszek zostanie zapakowany zbyt ciasno, utkną w końcówce i nie będzie można ich odpowiednio rozprowadzić. Zaleca się neutralizację ładunków elektrostatycznych proszku i końcówki ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować Panom Rayowi Lee, Panu HC Leungowi i Panu Wallace'owi So za ich uprzejmą pomoc w stworzeniu źródła światła i insuplikatora proszku; oraz Wydziałowi Głównego Obiektu za pomoc w obrazowaniu zwierząt. Prace były wspierane przez Radę ds. Grantów Badawczych w Hongkongu (17300319).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
BALB/c myszSamica; 7-9 tygodni; Masa ciała 20-25 g
CleanCap Firefly Lucyferazy, mRNATriLink BiotechnologyL-7602
Insuflator suchego proszkuPennCenturyModel DP-4M
Ketamina 10%Alfasan International BVNA
Latarka z diodą elektroluminescencyjną (LED)Unilite InternationPS-K1
Mannitol (Pearlitol 160C)Roquette450001
Okrągła końcówka do pipety do ładowania żelu bez filtra (200 &mikro; L)Labcon1034-800-000
Nić nylonowaZasięg30017050
Jedna mililitrowa strzykawka bez igłyTerumoSS-01T
Światłowód ŚwiatłowódOMPF1000
peptyd PEG12KL4EZ Biolab(PEG12)-KLLLLKLLLLLLLLLLLLLLLLLLK-NH2
Plastikowa pipeta z cienką końcówką PasteuraAlpha LabotatoryLW4061
Zawór trójdrogowyBraunD201
Ksylazyna 2%Alfasan International BVPistolet
Zerostat 3MILTY5036694022153
antystatyczny NA

Bibliografia

  1. Newman, S. P. Drug delivery to the lungs: challenges and opportunities. Therapeutic Delivery. 8 (8), 647-661 (2017).
  2. Setter, S. M., et al. Inhaled dry powder insulin for the treatment of diabetes mellitus. Clinical Therapeutics. 29 (5), 795-813 (2007).
  3. Muralidharan, P., Hayes, D., Mansour, H. M. Dry powder inhalers in COPD, lung inflammation and pulmonary infections. Expert Opinion on Drug Delivery. 12 (6), 947-962 (2015).
  4. de Boer, A. H., et al. Dry powder inhalation: past, present and future. Expert Opinion on Drug Delivery. 14 (4), 499-512 (2017).
  5. Das, S., Tucker, I., Stewart, P. Inhaled dry powder formulations for treating tuberculosis. Current Drug Delivery. 12 (1), 26-39 (2015).
  6. Okamoto, H., et al. Stability of chitosan-pDNA complex powder prepared by supercritical carbon dioxide process. International Journal of Pharmaceutics. 290 (1-2), 73-81 (2005).
  7. He, J., et al. Evaluation of inhaled recombinant human insulin dry powders: pharmacokinetics, pharmacodynamics and 14-day inhalation. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 71 (2), 176-184 (2019).
  8. Durham, P. G., Young, E. F., Braunstein, M. S., Welch, J. T., Hickey, A. J. A dry powder combination of pyrazinoic acid and its n-propyl ester for aerosol administration to animals. International Journal of Pharmaceutics. 514 (2), 384-391 (2016).
  9. Phillips, J. E., Zhang, X., Johnston, J. A. Dry powder and nebulized aerosol inhalation of pharmaceuticals delivered to mice using a nose-only exposure system. JoVE (Journal of Visualized Experiments). (122), e55454(2017).
  10. Nahar, K., et al. In vitro, in vivo and ex vivo models for studying particle deposition and drug absorption of inhaled pharmaceuticals). European Journal of Pharmaceutical Sciences. 49 (5), 805-818 (2013).
  11. Price, D. N., Muttil, P. Delivery of Therapeutics to the Lung. Methods in Molecular Biology. 1809, 415-429 (2018).
  12. Chang, R. Y. K., et al. Proof-of-Principle Study in a Murine Lung Infection Model of Antipseudomonal Activity of Phage PEV20 in a Dry-Powder Formulation. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 62 (2), (2018).
  13. Ito, T., Okuda, T., Takayama, R., Okamoto, H. Establishment of an Evaluation Method for Gene Silencing by Serial Pulmonary Administration of siRNA and pDNA Powders: Naked siRNA Inhalation Powder Suppresses Luciferase Gene Expression in the Lung. Journal of pharmaceutical sciences. 108 (8), 2661-2667 (2019).
  14. Patil, J. S., Sarasija, S. Pulmonary drug delivery strategies: A concise, systematic review. Lung India. 29 (1), 44-49 (2012).
  15. Ihara, D., et al. Histological Quantification of Gene Silencing by Intratracheal Administration of Dry Powdered Small-Interfering RNA/Chitosan Complexes in the Murine Lung. Pharmaceutical Research. 32 (12), 3877-3885 (2015).
  16. Qiu, Y., et al. Effective mRNA pulmonary delivery by dry powder formulation of PEGylated synthetic KL4 peptide. Journal of Controlled Release. 314, 102-115 (2019).
  17. Pfeifer, C., et al. Dry powder aerosols of polyethylenimine (PEI)-based gene vectors mediate efficient gene delivery to the lung. Journal of Controlled Release. 154 (1), 69-76 (2011).
  18. Kim, I., et al. Doxorubicin-loaded highly porous large PLGA microparticles as a sustained- release inhalation system for the treatment of metastatic lung cancer. Biomaterials. 33 (22), 5574-5583 (2012).
  19. Tonnis, W. F., et al. A novel aerosol generator for homogenous distribution of powder over the lungs after pulmonary administration to small laboratory animals. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 88 (3), 1056-1063 (2014).
  20. Hoppentocht, M., Hoste, C., Hagedoorn, P., Frijlink, H. W., de Boer, A. H. In vitro evaluation of the DP-4M PennCentury insufflator. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 88 (1), 153-159 (2014).
  21. Liao, Q., et al. Porous and highly dispersible voriconazole dry powders produced by spray freeze drying for pulmonary delivery with efficient lung deposition. International Journal of Pharmaceutics. 560, 144-154 (2019).
  22. Ito, T., Okuda, T., Takashima, Y., Okamoto, H. Naked pDNA Inhalation Powder Composed of Hyaluronic Acid Exhibits High Gene Expression in the Lungs. Molecular Pharmaceutics. 16 (2), 489-497 (2019).
  23. Chaurasiya, B., Zhou, M., Tu, J., Sun, C. Design and validation of a simple device for insufflation of dry powders in a mice model. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 123, 495-501 (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Intubacja myszydyspersja proszkukurek trójdrożnykońcówka do nakładania żelukaniula z włókna optycznegopodawanie przepływem powietrzadostarczanie do płucekspresja lucyferazy
Dotchawicze podawanie preparatu suchego proszku myszom
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.