Izolacja jąder z całej tkanki metodą bezdetergentową i enzymatyczną

Podsumowanie

Izolacja pojedynczych jąder opiera się na dysocjacji i przenikaniu błony komórkowej za pomocą detergentów, etapach, które wymagają optymalizacji i są podatne na wprowadzanie artefaktów technicznych. Demonstrujemy bezdetergentowy i bezenzymatyczny protokół szybkiej izolacji nienaruszonych jąder bezpośrednio z całej tkanki, uzyskując jądra odpowiednie do sekwencjonowania RNA pojedynczego jądra (snRNA-Seq) lub ATAC-seq.

Streszczenie

Wysokoprzepustowe profilowanie transkryptomu i epigenomu wymaga przygotowania zawiesiny pojedynczej komórki lub pojedynczego jądra. Przygotowanie zawiesiny z nienaruszoną komórką lub jądrami obejmuje dysocjację i przepuszczalność, etapy, które mogą wprowadzić niepożądany hałas i niepożądane uszkodzenia. W szczególności niektóre typy komórek, takie jak neurony, są trudne do dysocjacji na poszczególne komórki. Ponadto przepuszczalność błony komórkowej w celu uwolnienia jąder wymaga optymalizacji metodą prób i błędów, co może być czasochłonne, pracochłonne i nieopłacalne finansowo. Aby zwiększyć solidność i powtarzalność przygotowania próbki do sekwencjonowania o wysokiej przepustowości, opisano metodę szybkiej izolacji jąder opartych na kolumnach bez enzymów i detergentów. Protokół umożliwia skuteczną izolację jąder z całego mózgu danio pręgowanego w ciągu 20 minut. Izolowane jądra wykazują nienaruszoną morfologię jądrową i niską skłonność do agregacji. Co więcej, cytometria przepływowa umożliwia wzbogacenie jąder i usunięcie resztek komórkowych do dalszego zastosowania. Protokół, który powinien działać na tkankach miękkich i hodowanych komórkach, zapewnia prostą i dostępną metodę przygotowania próbki, którą można wykorzystać do profilowania o wysokiej przepustowości, upraszczając kroki wymagane do udanych eksperymentów z sekwencją RNA pojedynczych jąder i sekwencją ATAC.

Wprowadzenie

Jednokomórkowe sekwencje RNA (scRNA-Seq) i ATAC-seq są wszechstronnymi narzędziami do badania złożonych systemów biologicznych w rozdzielczości pojedynczej komórki. Są one szeroko stosowane do definiowania podtypów i stanów komórek, sieci genów oraz do oceny heterogeniczności komórek. Warunkiem wstępnym do przeprowadzenia sekwencjonowania scRNA jest przygotowanie zawiesiny pojedynczej komórki przez dysocjację tkankową. Ze względu na różnice w składzie i właściwościach mechanicznych macierzy zewnątrzkomórkowej, poszczególne tkanki wymagają optymalizacji protokołu dysocjacji w celu przygotowania zawiesiny pojedynczej komórki.

Dysocjacja tkanek na pojedyncze komórki zazwyczaj wiąże się z leczeniem enzymami trawiennymi, w tym kolagenazą, dyspasą lub trypsyną, w temperaturze 37 °C1^,2,3,4. Ponieważ maszyneria transkrypcyjna pozostaje aktywna w temperaturze 37 °C, dysocjacja enzymatyczna może wprowadzać artefakty ekspresji mRNA i szum^5,6. Warto zauważyć, że przedłużona inkubacja może indukować geny reagujące na stres i reakcję na szok cieplny w niejednorodny sposób – co prowadzi do technicznej zmienności w eksperymencie⁷.

Kolejną wadą generowania zawiesiny pojedynczej komórki jest trudność w uzyskaniu żywotnych i nienaruszonych typów komórek o skomplikowanej morfologii. W szczególności neurony, adipocyty i podocyty są trudne do wyizolowania^8,9,10,11. Na przykład Wu i współpracownicy wykazali brak podocytów kłębuszkowych w profilach scRNA dorosłej myszy nerki¹². Podobne nieoptymalne obserwacje zostały poczynione w odniesieniu do odzyskiwania połączonych neuronów z tkanki mózgowej^8,13,14. Podsumowując, protokoły dysocjacji mogą wprowadzać błąd wykrywania w kierunku łatwiejszej do dysocjacji typów komórek, prowadząc do błędnego przedstawienia architektury komórkowej narządu.

Aby przezwyciężyć techniczny szum i stronniczość wprowadzoną podczas przygotowywania próbki w scRNA-Seq., izolacja i profilowanie jądra stanowi atrakcyjną alternatywę. Ponieważ morfologia jądrowa jest podobna u różnych typów komórek, izolacja jąder omija problem izolowania nienaruszonych i żywotnych komórek o złożonej morfologii. Na przykład Wu i współpracownicy wykazali skuteczne profilowanie podocytów kłębuszkowych za pomocą jednojądrowego RNA-Seq. (Sekwencja snRNA) nerki dorosłej myszy, której brakowało w scRNA-Seq¹². Co ciekawe, badania porównawcze między sekwencją RNA pojedynczej komórki i pojedynczego jądra sugerują spadek indukcji genów odpowiedzi na stres i szok cieplny za pomocą snRNA-Seq¹². Badania sugerują ponadto wysoką korelację między genami wykrytymi za pomocą tych dwóch metod. Jednak niedawne badanie nad ludzkim mikroglejem nie wykryło aktywacji genetycznej w chorobie Alzheimera¹⁵. Tak więc w pewnych kontekstach snRNA-Seq jest odpowiednią alternatywą dla scRNA-Seq^16,17. Dodatkowo, izolacja jądrowa może być wykorzystana do jednokomórkowego ATAC-Seq., dostarczając informacji o regionach otwartej chromatyny w poszczególnych komórkach.

Protokół izolacji jąder składa się z trzech głównych etapów: i) lizy błony komórkowej opartej na detergentach w celu uwolnienia jądra; ii) homogenizacja tkanek za pomocą homogenizatora Dounce; oraz iii) wzbogacanie jąder i usuwanie resztek komórkowych za pomocą wirowania gradientowego lub cytometrii przepływowej^{18,19,20,21,22}. Wśród nich pierwsze dwa kroki zależą od rodzaju tkanki i muszą być empirycznie zoptymalizowane. Łagodny detergent prowadzi do częściowego pęknięcia błony komórkowej i nieefektywnego pobierania jąder z tkanki²³. Z drugiej strony, wysoki poziom detergentu i ostra homogenizacja prowadzą do pęknięcia błony jądrowej i ich utraty^24,25. Pęknięte jądra mają tendencję do zlepiania się ze sobą i tworzenia agregatów, które, jeśli nie zostaną usunięte, mogą prowadzić do artefaktów w dalszym eksperymencie profilowania.

Aby obejść problemy związane z optymalizacją detergentów do izolacji jąder, wprowadzamy protokół izolowania nienaruszonych jąder od świeżych próbek przy użyciu metody wolnej od detergentów i opartej na kolumnie wirowej. Protokół daje jądra z całego narządu w ciągu 20 minut, ograniczając indukcję transkrypcji artefaktów. Wyizolowane jądra mogą być wzbogacone o FACS dla pojedynczych jąder RNA-Seq. oraz ATAC-seq, zapewniając prostą i uniwersalną metodę, która umożliwia niezawodne i powtarzalne profilowanie o wysokiej przepustowości.

Protokół

Wszystkie procedury przedstawione poniżej zostały wykonane zgodnie z instytucjonalnymi (Université Libre de Bruxelles (ULB)) oraz krajowymi wytycznymi etycznymi i regulacjami dotyczącymi dobrostanu zwierząt, które zostały zatwierdzone przez komitet etyczny ds. dobrostanu zwierząt (CEBEA) z Université Libre de Bruxelles (protokoły 578N-579N).

1. Przygotowanie przed sekcją tkanek

1. Przygotuj 0,2% roztwór trikainy w PBS do eutanazji danio pręgowanego. Schłodzić roztwór na lodzie.
2. Przygotuj szalkę Petriego o średnicy 30 mm do rozdrobnienia tkanki.
3. Przygotuj lodowato zimny 1x PBS (10 ml na próbkę tkanki).
4. Schłodzić wirówkę do temperatury 4 °C.
5. Do izolacji jąder należy użyć zestawu do izolacji jąder bez detergentów (tabela materiałów).
6. Przed rozpoczęciem protokołu należy wstępnie schłodzić A i B znajdujące się w zestawie, umieszczając je na lodzie na co najmniej 30 minut przed izolacją jąder.
7. W przypadku pracy z wyizolowanymi jądrami należy pokryć odczynniki z tworzywa sztucznego, takie jak probówki i końcówki pipet, 5% roztworem BSA. W tym celu należy przygotować roztwór, rozpuszczając 2 g BSA w 40 ml PBS. Powlekanie przedmiotów z tworzyw sztucznych 5% BSA zmniejsza przywieranie jąder do plastiku. Ten etap zwiększa regenerację izolowanych jąder.
8. Pokryj końcówki pipet, pipetując 5% roztwór BSA 2-3 razy. Suszyć końcówki na powietrzu przez 2 godziny. Przygotuj 10 końcówek z tworzywa sztucznego na próbkę.
9. Pokryj probówki do pobierania jąder, wypełniając je 5% BSA. Odwróć rurki 3 razy, aby zapewnić wydajną powłokę. Usuń roztwór i wysusz probówki do góry nogami na czystej bibułce przez 2 godziny. Na każdą próbkę należy pokryć jedną probówkę zbiorczą dostarczoną w zestawie. Dodatkowo przygotować powlekane probówki o pojemności 1,5 ml do pobierania jąder po FACS.
   UWAGA: Szklane końcówki są zdecydowanie zalecaną alternatywą dla plastikowych końcówek do pipet, aby zminimalizować przywieranie.

2. Sekcja mózgu danio pręgowanego

1. Do eutanazji danio pręgowanego przygotuj szalkę Petriego o średnicy 90 mm z 25 ml lodowatego roztworu trikainy.
2. Ostrożnie wyjmij danio pręgowanego ze zbiornika za pomocą sieci rybackiej i umieść go na szalce Petriego.
3. Poddaj rybę eutanazji, pozostawiając ją w Tricaine na 5 minut.
4. Odetnij głowę zwierzęcia ostrą żyletką.
5. Za pomocą kleszczy delikatnie rozbij czaszkę i usuń tkanki miękkie, skórę i kości z brzusznej i grzbietowej strony czaszki.
6. Delikatnie przenieś mózg do świeżego 30-milimetrowego naczynia zawierającego lodowaty PBS.
7. Zmiel mózg na małe kawałki za pomocą żyletki, aby ułatwić ładowanie próbki na kolumnę wirową.

3. Izolacja pojedynczych jąder

1. Przenieść zmieloną tkankę do wkładu filtracyjnego znajdującego się w zestawie do izolacji jąder i dodać 200 μl zimnego buforu A w celu uwrażliwienia tkanki. Miel chusteczkę za pomocą plastikowej pałeczki dołączonej do zestawu przez 2 minuty.
2. Dodać 300 μl zimnego buforu A i inkubować wkład filtra na lodzie z otwartą nakrętką przez 10 minut.
3. Zakryj wkład i ponownie zawiesić tkankę, odwracając probówkę 5 razy.
4. Wirować przy 16 000 x g przez 30 s. Na tym etapie komórki są pękane podczas przechodzenia przez filtr i przykładana jest siła odśrodkowa o dużej prędkości. Przepływ zawiera nienaruszone jądra, które osadzają się na dnie rurki.
5. Wyrzuć filtr i ponownie zawieś granulkę, energicznie wirując przez 10 sekund.
6. Osadzać jądra, odwirowując roztwór o stężeniu 500 x g przez 3 minuty. Supernatant należy ostrożnie wyrzucić, ponieważ osad jądra jest bezbarwny.
7. Zawiesić osad w 0,8 ml zimnego buforu B i odwirować przy 600 x g przez 10 minut. Na tym etapie jądra są oddzielane od resztek błony. Otrzymany bezbarwny osad zawiera izolowane jądra.
8. Zawiesić wyizolowane jądra w 500 μl PBS z 5% BSA. Zawiesinę jąder należy utrzymywać na lodzie, aby wykonać FACS po oznaczaniu ilościowym.

4. Wizualizacja morfologii jąder

1. Potwierdź morfologię jądra przez barwienie Hoechsta. W tym celu należy usunąć 100 μl zawiesiny pojedynczych jąder w nowej probówce za pomocą końcówek pokrytych BSA. Aby wybarwić jądra, dodać 0,1 μl Hoechst (1 mg/ml). Delikatnie przekręć rurkę wirowo.
2. Przenieść zawiesinę jąder do naczynia o szklanym dnie w celu obrazowania.
3. Zobrazuj jądra za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego z ustawieniami wzbudzenia laserowego o długości fali ~405 nm (fioletowej).

5. Wzbogacanie jąder w oparciu o FACS

1. Przed wykonaniem FACS przefiltruj jądra za pomocą sitka komórkowego 40 μm do probówki pokrytej BSA.
2. Rozcieńczyć przefiltrowaną zawiesinę, dodając PBS z 5% BSA do końcowej objętości 1 000 μl.
3. Oznacz dwie probówki FACS z okrągłym dnem jako "kontrolne" i "poplamione". Probówka "kontrolna" będzie zawierała niebarwione jądra, podczas gdy probówka "barwiona" będzie zawierała jądra barwione Hoechstem.
4. Przenieść 250 μl zawiesiny jąder do probówki "kontrolnej" za pomocą końcówki do pipety pokrytej BSA.
5. Przenieść pozostałe 750 μl roztworu do probówki FACS oznaczonej jako "barwiona" i dodać 1 μl barwnika Hoechst w celu zabarwienia jąder. Mieszaj przez powolne wirowanie.
6. Załaduj niebarwioną próbkę kontrolną do sortownika komórek. Rekord 5000 wydarzeń.
7. Załaduj poplamione próbki i zarejestruj 5000 zdarzeń.
8. Narysuj bramki FACS, które umożliwiają identyfikację pojedynczych jąder. Jądra można wybrać, porównując sygnał fluorescencji Hoechsta między próbką kontrolną a próbką barwioną.
9. Sortować jądra Hoechsta dodatnie z barwionej probówki do nowej probówki o pojemności 1,5 ml zawierającej 50 μl PBS z 5% BSA.
   UWAGA: Izolowane jądra mogą być zbierane do pożądanego podłoża zgodnie z wymaganiami dalszej aplikacji.

Wyniki

--Protokół opisany powyżej został wykorzystany do wygenerowania zawiesiny pojedynczego jądra bezpośrednio z tkanki mózgowej danio pręgowanego. Izolacja trwa zazwyczaj 20 minut i należy unikać stosowania detergentów lub enzymów trawiennych. Schemat podsumowujący poszczególne kroki protokołu znajduje się w Rysunek 1, który można wydrukować w celu wykorzystania jako wskazówka.

Rysunek 1: Schemat bezdetergentowej metody izolacji jąder opartej na kolumnach wirowych.
Graficzne przedstawienie poszczególnych etapów wykonywanych podczas ekstrakcji jąder ze świeżej tkanki mózgowej danio pręgowanego. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Wizualizacja morfologii jądrowej

Dla jakościowego potwierdzenia morfologii jądrowej, izolowane jądra zostały wybarwione metodą Hoechst i zobrazowane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Jądra wyglądały na nienaruszone, okrągłe i dobrze oddzielone (Ryc. 2). Co ważne, agregacja jądrowa, oznaka pęknięcia błony jądrowej, była nieobecna.

Ryc. 2: Izolacja pojedynczych jąder z mózgu danio pręgowanego.
Obraz z mikroskopii fluorescencyjnej jąder barwionych metodą Hoechsta wykazujący ich nienaruszoną morfologię. Podziałka skali: 10 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Wzbogacanie nienaruszonych jąder w oparciu o FACS

Wzbogacanie izolowanych jąder i usuwanie resztek komórkowych odbywało się za pomocą cytometrii przepływowej poprzez bramkowanie na obecność sygnału fluorescencji Hoechsta. Sygnał Hoechsta został wykryty po wzbudzeniu fioletowym laserem o długości fali 405 nm (Brilliant Violet 421 – BV421). Niebarwione jądra wykazywały fluorescencję tła (Rysunek 3A, Rysunek uzupełniający 1A), podczas gdy wybarwione jądra wykazywały silny sygnał fluorescencyjny (Rysunek 3B, Rysunek uzupełniający 1B). Jak pokazano w Rysunek 3C, jądra niebarwione i barwione Hoechstem były dobrze oddzielone w kanale fioletowym.

Rysunek 3: Izolowane jądra wykazują silny i specyficzny sygnał fluorescencyjny Hoechsta w cytometrii przepływowej.
Wykresy histogramu zawiesiny pojedynczych jąder przedstawiające rozkład barwienia Hoechsta. Hoechst jest wzbudzany przez fiolet, 405 nm, laser (Brilliant Violet 421 – BV421). Próbka niebarwiona (A) emituje sygnał w zakresie 10^{0-10 3}, natomiast jądra barwione Hoechstem (B) emitują sygnał w zakresie 10^{3-10 5}. Nałożenie intensywności fluorescencji emitowanej przez próbki niebarwione (szare) i barwione (niebieskie) (C) wykazuje wyraźną separację między tymi dwiema populacjami. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek uzupełniający 1: Strategia bramkowania cytometrii przepływowej dla izolowanych jąder. Reprezentatywne wykresy przepływu dla zawiesiny izolowanych jąder. Wyizolowane jądra analizowano za pomocą rozpraszania do przodu i fioletowego lasera BV421, który wzbudza Hoechsta przy długości fali 405 nm. Niebarwiona próbka (A) wyświetlała sygnał BV421 w zakresie 10^{0-10 3}. Spośród 13130 zdarzeń, 141 zdarzeń wykryto jako pojedyncze jądra na podstawie FSC-A (1,07% całości), a 0 zdarzeń dla jąder niebarwionych na podstawie sygnału BV421 (0% całości). Jądra barwione Hoechstem (B) wyświetlały sygnał BV421 w zakresie 10^{3-10 5}. Spośród 50000 zdarzeń, 2418 zdarzeń wykryto jako pojedyncze jądra na podstawie FSC-A (4,84% całości), a 2414 zdarzeń dla jąder Hoechsta dodatnich na podstawie sygnału BV421 (4,83% całości). Kliknij tutaj, aby pobrać ten rysunek.

Dyskusja

Profilowanie transkryptomu i epigenomu w rozdzielczości pojedynczej komórki zrewolucjonizowało badanie systemów biologicznych. Badania nad rozdzielczością pojedynczej komórki dla tkanki stałej zależą od dysocjacji narządu na pojedyncze komórki lub jądra. Dysocjacja jest destrukcyjną procedurą, która może wprowadzić artefakty techniczne, które mogą uniemożliwić opracowanie dokładnej reprezentacji systemu ^5,6. Na przykład dysocjacja enzymatyczna może uszkadzać komórki o złożonej morfologii, takie jak neurony lub podocyty, i może indukować ekspresję genów stresu i reakcji na szok cieplny ^7,12. Dodatkowo, użycie detergentu podczas dysocjacji może spowodować pęknięcie błony jądrowej i doprowadzić do agregacji^23,25. W związku z tym optymalizacja dysocjacji w celu uzyskania zawiesiny pojedynczej komórki lub jąder o najwyższej jakości ma kluczowe znaczenie dla powodzenia wysokoprzepustowych eksperymentów profilowania.

W tym miejscu demonstrujemy metodę izolacji jąder bez detergentów i enzymów, która umożliwia ekstrakcję nienaruszonych jąder z mózgu danio pręgowanego w czasie krótszym niż 20 minut. W wyniku protokołu powstają jądra o typowej morfologii i solidnej integralności (ryc. 2). Z pojedynczego mózgu danio pręgowanego o wadze 6 mg protokół daje w sumie 60 000 jąder określonych za pomocą hemocytometru. Wyizolowane jądra mogą być wykorzystywane do wielu dalszych zastosowań, w tym do sekwencjonowania snRNA, sekwencjonowania ATAC i barwienia immunologicznego. Izolowane jądra mogą zawierać zanieczyszczenie krzyżowe frakcjami cytoplazmatycznymi, w szczególności składnikami retikulum endoplazmatycznego i mitochondriów. W przypadku wysokoprzepustowych eksperymentów profilowania zdecydowanie zaleca się usuwanie resztek komórkowych, zwłaszcza mitochondriów. Cytometria przepływowa (ryc. 3) stanowi realną opcję oczyszczania jąder. Alternatywnie, gradient sacharozy może być również wykorzystany do usuwania zanieczyszczeń.

Protokół został przetestowany na tarczycy myszy (dane nie pokazane) i zapewnia wyniki podobne do tkanki mózgowej danio pręgowanego. Ogólnie rzecz biorąc, protokół zapewnia solidną, powtarzalną i uniwersalną metodę przygotowania zawiesiny pojedynczego jądra, pomagając uprościć logistykę eksperymentów profilowania o wysokiej przepustowości.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)	Carl Roth	90604-29-8	Frakcja albuminy V
Sortownik komórek	BD Biosciences		FACSAria III
Wirówka	Sartorius	A-14C
Probówki Eppendorfa (1,5 ml)	Eppendorf	22363204
Falcon (15 mL)	Corning	352096	Probówki wirówkowe z polipropylenu
Falcon (5 ml ) Corning		352052	Polistyrenowe probówki z okrągłym dnem
Cienkie kleszcze	Fine Science Tools	11295-10
Sitko do komórek Flowmi (40 μ m)	Sigma	BAH136800040
Mikroskop fluorescencyjny	Leica	DMI6000 B
Szklana butelka (250 ml)	VWR	215-1593
Naczynie ze szklanym dnem	World Precision Instruments	FD3510-100	Fluorodish 35 mm
Szklane pipety Pasteura	VWR	612-1701
Szklane gniazdo do pipet	Carl Roth	388.1	Pi-pump 2500
Roztwór barwnika barwiącego Hoechst	Abcam	ab228551	Hoechst 33342
Minutowy zestaw do izolacji jąder bez detergentów	Invent Biotechnologies	NI-024
PBS (10X)	Szalka Petriego ThermoFisher	70011069
(30 mm)	FisherScientific	11333704	Pyrex
szalka Petriego (90 mm)	Corning	758-10178-CS	Gosselin
Końcówki do pipet	VWR	89079	10 μ L, 200 μ L, 1000 μ L
Pipety	Gilson	F167380	Pipetman
Żyletka	Swann-Morton	7981809
Trikaina metan sulfonian	Sigma	E10521
Maszyna wirowa	Scientific Industries	SI-0236	Vortex-Genie 2