Wkład pompy Na+/K+ w rytmiczne pękanie, badany za pomocą modelowania i dynamicznych analiz zacisków

Ricardo  Javier Erazo-Toscano; Parker  J. Ellingson; Ronald  L. Calabrese; Gennady  S. Cymbalyuk

doi:10.3791/61473

Artykuł metodologiczny

Wkład pompy Na⁺/K⁺ w rytmiczne pękanie, badany za pomocą modelowania i dynamicznych analiz zacisków

2.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61473

⸱

9 maja 2021

Ricardo Javier Erazo-Toscano¹^,² , Parker J. Ellingson² , Ronald L. Calabrese^*¹ , Gennady S. Cymbalyuk^*²

¹Department of Biology, Emory University, ²Neuroscience Institute, Georgia State University

^* These authors contributed equally

W tym artykule

Informacja o sprostowaniu

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Podsumowanie

Przedstawiona tutaj jest metoda badania roli pompy Na⁺/K⁺ i stałego prądu Na⁺ w interneuronach serca pijawek za pomocą dynamicznego zacisku.

Streszczenie

Pompa Na⁺/K⁺, często uważana za funkcję tła w aktywności neuronalnej, dostarcza prąd na zewnątrz (_pompa I), który reaguje na wewnętrzne stężenie Na⁺ ([Na⁺]_i). W neuronach pękających, takich jak te znajdujące się w sieciach neuronalnych centralnego generatora wzorców (CPG), które wytwarzają rytmiczne ruchy, można oczekiwać, że [Na⁺]_i, a tym samym _pompa I, będą się zmieniać w trakcie cyklu impulsu. Ta reakcja na aktywność elektryczną, w połączeniu z niezależnością od potencjału błonowego, nadaje _pompie I właściwości dynamiczne, które nie są typowe dla prądów opartych na kanałach (np. kanały bramkowane napięciem lub nadajnikiem lub nieszczelne). Co więcej, w wielu neuronach aktywność pompy jest modulowana przez różne modulatory, co jeszcze bardziej zwiększa potencjalną rolę _pompy I w rytmicznym wybuchu. W tym artykule pokazano, jak wykorzystać kombinację metod modelowania i dynamicznego zacisku w celu określenia, w jaki sposób _pompuję i jego interakcja z trwałym prądem Na⁺ wpływa na rytmiczną aktywność w CPG. W szczególności w tym artykule skupimy się na protokole dynamicznego zacisku i metodach modelowania obliczeniowego w interneuronach serca pijawek lekarskich.

Wprowadzenie

Bicie serca u pijawek jest sterowane przez CPG składający się z 9 bilateralnych par interneuronów serca (HN) rozmieszczonych w odpowiadającej im liczbie zwojów segmentowych w części środkowej ciała. Rdzeniem CPG są wzajemnie hamujące pary interneuronów zlokalizowane w 3^rd oraz 4^th zwoje segmentalne tworzące oscylatory półcentrum (HCO) (Rycina 1A). Neurony te nadal wykazują aktywność seryjną (bursting) po farmakologicznej izolacji synaptycznej z użyciem bikukulinu¹Inni, jak para w 7^th zwoje segmentalne (będące przedmiotem niniejszego protokołu) są również komórkami typu burster, zdolnymi do generowania aktywności seryjnej (bursting) w warunkach izolacji synaptycznej. Nie są one ze sobą połączone i otrzymują jedynie sygnały zstępujące, w związku z czym można je łatwo odizolować poprzez oddzielenie zwoju od reszty sznura nerwowego. Ta niezależna aktywność seryjna jest wrażliwa na wprowadzony prąd upływu, wywołany penetracją za pomocą ostrych mikroelektrod rejestrujących. ale gwałtownie pękają podczas rejestracji metodą luźnego patcha (loose patch)¹.

Zarówno pojedyncze neurony HN, jak i HN HCO zostały zamodelowane (modele pojedynczego przedziału izopotencjalnego neuronów HN oparte na modelu Hodgkina-Huxleya, zawierające wszystkie eksperymentalnie zidentyfikowane prądy synaptyczne i bramkowane napięciem), a wszystkie charakterystyki seryjnych wyładowań (burst) żywego układu zostały pomyślnie odwzorowane². Myomodulina, endogenny neuropeptyd u pijawek, wyraźnie skraca okres (T) rytmu wyładowań izolowanych neuronów HN oraz HN HCO. Modulator ten działa poprzez zwiększenie prądu h (prądu wewnątrzkomórkowego aktywowanego hiperpolaryzacją, I_h) i zmniejszenie I_pump³. Obserwacja ta doprowadziła do zbadania, w jaki sposób I_pump oddziałuje z I_h oraz jak ich wspólna modulacja wpływa na aktywność rytmiczną neuronów HN. Aktywacja pompy poprzez zwiększenie [Na⁺]_i (z użyciem jonoforu monensyny) przyspiesza rytm wyładowań HN zarówno w HN HCO, jak i w izolowanych neuronach HN⁴. Przyspieszenie to było zależne od I_h. W przypadku zablokowania I_h (2 mM Cs⁺), okres wyładowania nie uległ zmianie przy tej metodzie aktywacji pompy; jednak czas trwania wyładowania (BD) uległ skróceniu, a odstęp między wyładowaniami (IBI) uległ wydłużeniu zarówno w HN HCO, jak i w izolowanych neuronach HN⁴.

W niniejszym protokole wszystkie prądy żywego neuronu HN(7), w tym prąd pompy, I_pump, zostały włączone do modelu HN w następujący sposób:

figure-introduction-1 (1)

gdzie C to pojemność błony (w nF), V to potencjał błonowy (w V), a t to czas (w s). Szczegółowe opisy i równania prądów jonowych zostały przedstawione w innych opracowaniach²^,⁴. Kompletny neuron w modelu HN pracuje w czasie rzeczywistym (Ryc. 2). Oprogramowanie zostanie udostępnione w serwisie GitHub po publikacji i będzie odpowiednie do uruchomienia na płytce cyfrowego przetwarzania sygnałów opisanej w Tabeli materiałów. W niniejszym badaniu przedmiotem analizy jest prąd pompy Na⁺/K⁺ (I_pump) oraz prądy bramkowane napięciem, które wnoszą istotny wkład w strumień Na⁺: szybki prąd Na⁺ (I_Na) oraz trwały prąd Na⁺ (I_P). Maksymalne przewodności tych prądów wynoszą odpowiednio figure-introduction-2 oraz figure-introduction-3 . Pompa Na⁺/K⁺ wymienia trzy wewnątrzkomórkowe jony Na⁺ na dwa zewnątrzkomórkowe jony K⁺, generując tym samym wypadkowy prąd wychodzący. Co ważne, pompa usuwa z neuronu 3 razy więcej Na⁺, niż wskazuje ten prąd, co jest istotne przy obliczaniu wewnątrzkomórkowego stężenia Na⁺.

Prąd pompy Na⁺/K⁺ zależy od wewnątrzkomórkowych stężeń Na⁺ i jest wyrażony następującą funkcją sigmoidalną:

figure-introduction-4 (2)

gdzie [Na]_i to wewnątrzkomórkowe stężenie Na⁺, figure-introduction-5 to maksymalny prąd pompy Na⁺/K⁺, [Na]_ih to wewnątrzkomórkowe stężenie Na⁺ dla połowy aktywacji pompy Na⁺/K⁺, a [Na]_is to czułość pompy Na⁺/K⁺ na [Na]_i. [Na]_i wzrasta w wyniku napływu Na⁺ przenoszonego przez I_P oraz I_Na i jest zmniejszane przez odpływ Na⁺ realizowany przez pompę Na⁺/K⁺. Wkład I_h i I_Leak do całkowitego strumienia Na⁺ jest niewielki i nie jest uwzględniany w modelu czasu rzeczywistego.

figure-introduction-6 (3)

gdzie v to objętość (~6,7 pL) wewnątrzkomórkowego rezerwuaru Na⁺, F to stała Faradaya, a pozakomórkowe stężenie Na⁺ pozostaje stałe.

Przewodności bramkowane napięciowo i przewodności przecieku – które reagują na potencjał błonowy – zostały odróżnione od prądu pompy, regulowanego przez obliczone wewnątrzkomórkowe stężenie Na⁺ ([Na⁺]_i). [Na⁺]_i narasta poprzez napływ Na⁺ za pośrednictwem szybkiego prądu Na⁺ (I_Na), który generuje potencjały czynnościowe (kolce), oraz trwałego prądu Na⁺ (I_P), który zapewnia depolaryzację wspierającą generowanie kolców. [Na⁺]_i jest z kolei redukowane przez działanie pompy poprzez usuwanie Na⁺ na zewnątrz. Przyjęto bazowe wartości dla żywych HN wynoszące figure-introduction-7 (5nS) oraz figure-introduction-8 (150 nS), a dodatkowo uwzględniamy każdą dodaną przewodność dynamic clamp figure-introduction-9 .

Celem opisanego tutaj protokołu jest precyzyjne i odwracalne manipulowanie I_pump w czasie rzeczywistym, aby zbadać, w jaki sposób oddziałuje ono z prądami sterowanymi napięciem (w obecnym protokole jest to trwały prąd Na⁺), kontrolując rytmiczne serie potencjałów w pojedynczych HNs. Aby osiągnąć ten cel, zastosowano metodę dynamic clamp, która na żądanie sztucznie wprowadza precyzyjną wartość dowolnego prądu obliczanego w trakcie działania modelu. Metoda ta ma przewagę nad manipulacją farmakologiczną pompą, która wpływa na całą tkankę, może wywoływać efekty pozatarczycowe, często trudne do odwrócenia, i nie pozwala na precyzyjne sterowanie. Dynamic clamp⁵^,⁶ odczytuje napięcie rejestrowanego neuronu w czasie rzeczywistym (Rysunek 1B), a następnie oblicza i wstrzykuje w czasie rzeczywistym wartość dowolnego prądu na podstawie równań modelu oraz wartości ustawionych dla figure-introduction-10 lub figure-introduction-11 . Podobne metody można łatwo zastosować do każdego neuronu, z którego można rejestrować aktywność wewnątrzkomórkową. Należy jednak przeskalować parametry do wybranego neuronu, a sam neuron powinien zostać odizolowany od wpływów synaptycznych, np. farmakologicznie.

Protokół

UWAGA: Bezkręgowce wykorzystywane jako obiekty doświadczalne nie podlegają regulacjom NIH ani uniwersytetów Emory i Georgia State. Niemniej jednak podjęto wszelkie środki w celu zminimalizowania cierpienia pijawek użytych w tej pracy.

1. Przygotowanie wyizolowanego zwoju 7 z nerwu brzusznego pijawki

Utrzymywać pijawki Hirudo verbana w sztucznej wodzie stawowej (zawierającej 0,05% w/v soli morskiej) rozcieńczonej w wodzie dejonizowanej w temperaturze 16 °C w cyklu światło-ciemność 12:12.
Przygotować pijawki do sekcji poprzez znieczulenie zimnem w kruszonym lodzie przez >10 min, aż do momentu unieruchomienia.
Napełnić czarną, wyłożoną żywicą szalkę sekcyjną do głębokości ~1 cm schłodzonym roztworem soli zawierającym 115 mM NaCl, 4 mM KCl, 1,7 mM CaCl₂, 10 mM D-glukozy i 10 mM HEPES w wodzie dejonizowanej; pH skorygować do 7,4 za pomocą 1 M NaOH. Przypiąć pijawkę stroną grzbietową do góry w czarnej komorze wyłożonej żywicą (o wymiarach co najmniej 20 cm x 10 cm i głębokości co najmniej 2 cm powyżej warstwy żywicy, która musi mieć co najmniej 2 cm grubości).
Pod stereomikroskopem przy powiększeniu 20x z oświetleniem za pomocą skośnego prowadnika światła, wykonać cięcie podłużne o długości co najmniej 3 cm za pomocą 5 mm nożyczek sprężynowych przez ścianę ciała w przedniej 1/3^ciej części ciała. Użyć szpilek, aby odsunąć ścianę ciała i odsłonić organy wewnętrzne.
UWAGA: Wszelkie zgromadzone pokarmy z krwi można usunąć za pomocą ssania pipetą Pasteura wypalaną ogniowo.
Wyizolować pojedynczy zwoj średni ciała 7 (siódmy wolny zwoj segmentowy położony za mózgiem).
1. Otworzyć zatokę, w której znajduje się sznur nerwowy, używając 5 mm nożyczek sprężynowych. Należy upewnić się, że zatoka została rozcięta grzbietowo i brzusznie, pozostawiając dwa pasma zatoki. Użyć ostrych pęsety nr 5, aby pomóc w prowadzeniu cięcia i przytrzymać zatokę.
2. Pozostawić zatokę przytwierdzoną do każdego z dwóch bocznych korzeni nerwowych wychodzących ze zwoju (przylega ona ściśle do każdego korzenia), aby wykorzystać te pasma zatoki do przypięcia zwoju.
3. Usunąć zwoj z ciała, przecinając rostralne i kaudalne wiązki nerwów łączących zwoje (tak daleko od 7^mego zwoju, jak to możliwe) oraz pasma zatoki, a następnie przeciąć korzenie bocznie od miejsca ich wychodzenia z zatoki.
Przypiąć zwoj (używając starych, stępionych pęset nr 5) za pomocą skróconych szpilek entomologicznych typu minuten, stroną brzuszną do góry, w przezroczystych, wyłożonych żywicą szalkach Petriego. Wbić szpilki w pasma zatoki i luźną tkankę przylegającą do korzeni oraz łączników rostralnych i kaudalnych, jak najdalej od zwoju.
UWAGA: Żywica nie może być grubsza niż 3 mm, jeśli podczas rejestracji ma być zapewnione dobre oświetlenie od dołu. Należy upewnić się, że zwoj jest napięty zarówno podłużnie, jak i poprzecznie.
Zwiększyć powiększenie stereomikroskopu do 40x lub więcej i dostosować oświetlenie skośne tak, aby ciała komórek neuronalnych były łatwo widoczne na powierzchni brzusznej zwoju, tuż pod perineurium.
Usunąć perineurium zwoju (odpowiekać) za pomocą mikronożyczek.
1. Rozpocząć odpowiekanie od przecięcia luźnej osłonki między korzeniami po jednej stronie, a następnie kontynuować cięcie bocznie na drugą stronę, dbając o to, aby ostrza nożyczek pozostawały powierzchowne i nie uszkodziły ciał komórek neuronalnych znajdujących się bezpośrednio pod osłonką.
2. Wyonać podobne powierzchowne cięcie w kierunku kaudalnym od cięcia bocznego wzdłuż linii środkowej.
3. Następnie chwycić kaudaloboczną klapę osłonki po jednej stronie za pomocą cienkiej pęsety nr 5, odciągnąć ją od zwoju i odciąć mikronożyczkami.
4. Powtórzyć czynność po drugiej stronie; procedura ta odsłania oba neurony HN(7) do rejestracji za pomocą mikroelektrod.
Umieścić szalkę z preparatem w układzie rejestrującym i poddać superfuzji roztworem soli z przepływem 5 mL/min w temperaturze pokojowej.

2. Identyfikacja i rejestracja interneuronów serca pijawki za pomocą mikroelektrod ostrych

Przez cały czas rejestracji neuronu HN(7) (rejestracje trwają od 30 do 60 min), należy pozyskiwać i digitalizować ślady prądu i napięcia wewnątrzkomórkowego za pomocą elektrometru neurofizjologicznego z częstotliwością próbkowania 5 kHz, wykorzystując cyfrowy system akwizycji danych (analogowo-cyfrowy, A do D) i stymulacji (cyfrowo-analogowy, D do A), a następnie wyświetlać je na ekranie komputera.
UWAGA: Do akwizycji danych (A do D) można użyć dowolnego komercyjnego lub dedykowanego oprogramowania oraz karty A do D/D do A. System D do A i dedykowane oprogramowanie są wymagane do zastosowania dynamicznego zaciskania (dynamic clamp).
Pod stereomikroskopem z powiększeniem 50-100x i ciemnym polem oświetlenia od dołu, należy wstępnie zidentyfikować neuron HN(7) z pary bilateralnej na podstawie jego kanonicznej lokalizacji w pozycji tylno-bocznej w siódmym zwoju środkowego ciała.
Następnie należy dążyć do penetracji domniemanego neuronu HN(7) ostrą mikroelektrodą wypełnioną 2 M octanem potasu i 20 mM KCl, używając mikromanipulatora.
1. Umieścić mikroelektrodę bardzo blisko ciała komórki docelowej.
2. Stale obserwować rejestrowany potencjał za pomocą elektrometru i ustawić ten potencjał na 0 mV przed penetracją neuronu.
3. Przebić neuron mikroelektrodą, powoli wprowadzając elektrodę wzdłuż jej osi długiej za pomocą manipulatora. Używając funkcji impulsu (buzz) elektrometru, ustawionej na czas trwania 100 ms, aż do momentu zaobserwowania ujemnego przesunięcia potencjału błony i intensywnej aktywności impulsowej.
Ustawić elektrometr w trybie nieciągłego zaciskania prądowego (DCC) ≥ 3 kHz, aby jednocześnie rejestrować potencjał błony i prąd przechodzący za pomocą pojedynczej mikroelektrody (kompensację pojemności ustawić tuż poniżej poziomu oscylacji, a następnie zmniejszyć o 10%).
1. Monitorować stabilizację elektrody podczas DCC na oscyloskopie.
2. Wstrzyknąć stały prąd -0,1 nA za pomocą wstrzykiwacza prądu stałego elektrometru przez minutę lub dwie, aby ustabilizować pomiar.
Ostatecznie zidentyfikować neuron HN(7) po charakterystycznym kształcie impulsu i słabej aktywności seryjnej (bursting) (Rycina 1Ci).
Wszelkie analizy danych przeprowadzić w trybie offline po zakończeniu eksperymentu i zapisać wszystkie dane na dysku.

3. Budowa neuronu HN czasu rzeczywistego lub innego modelu neuronu

Stworzenie dedykowanego oprogramowania z wykorzystaniem płyty do cyfrowego przetwarzania sygnałów (DSB; przetwornik cyfrowo-analogowy i analogowo-cyfrowy) w komputerze stacjonarnym w celu implementacji w czasie rzeczywistym prądów modelowych opisanych w²^,⁴ lub inne prądy modelowe dla pozostałych neuronów bądź eksperymentów.
1. Należy stosować równania w stylu Hodgkina-Huxleya, ponieważ są one powszechnie preferowaną metodą reprezentowania prądów modelowych.
2. Zobacz⁷ w celu uzyskania szczegółowego opisu implementacji modelu HN w czasie rzeczywistym oraz dynamicznego zacisku przed dodaniem prądu pompowego. Opis prądów oraz wewnątrzkomórkowego Na należy znaleźć w sekcji wstępnej⁺ stężenia oraz przewodnościของ żywy neuron HN(7) w modelu HN.

4. Implementacja i modyfikacja dynamicznych przewodności/prądów w metodzie dynamic clamp

Użyj dedykowanego oprogramowania dynamic clamp dla DSB, aby zaimplementować i zmieniać w czasie rzeczywistym dowolny parametr dynamic clamp w graficznym interfejsie użytkownika (Rysunek 3dostępne przez interfejs graficzny użytkownika (GUI), zaprogramowane konduktancje i prądy modelu czasu rzeczywistego HN dla neuronu HN(7).
UWAGA: Przypominamy, że i maksymalne przewodnictwo trwałego prądu Na⁺ aktualny (I_P) oraz maksymalny prąd pompy (I_pompa), odpowiednio.
Aby wprowadzić zmiany w trakcie działania modelu, należy skorzystać z pól wprowadzania w interfejsie graficznym (GUI) oprogramowania w (pudełko PumpMaxL) i (pudełko GpinHNLive) (Rycina 3).
UWAGA: Pola wprowadzania w interfejsie graficznym użytkownika (GUI) przyjmują wartości wpisywane z klawiatury; zaleca się stosowanie kroków o wartości 0,1 nA dla or zaleca się stosowanie kroków o wartości 1 nS dla .
1. Dodaj niewielkie ilości i z wykorzystaniem dynamicznego zacisku (dynamic clamp) w celu stabilizacji aktywności seryjnej (bursting) neuronu HN(7), co zostaje osłabione przez wyciek wywołany mikroelektrodą, jak pokazano w Rycina 1Cii.
  UWAGA: Przebicie błony ostrą mikroelektrodą powoduje jej uszkodzenie, które objawia się zwiększoną przewodnością przeciekową lub zmniejszoną rezystancją wejściową.
2. Zacznij od dodania wartości o wartości 0,1–0,2 nA, co kompensuje wyciek wywołany mikroelektrodą, lecz obniża pobudliwość, a następnie stopniowo zwiększać , co zwiększa pobudliwość, aż do wystąpienia regularnych wyładowań seryjnych (burstingu), zazwyczaj przy wynoszącej od ok. 1 do 4 nS (Rycina 4A).
Systematycznie zmieniaj te prądy (w przyrostach 0,1 nA dla oraz 1 nS dla ) do zarejestrowanego neuronu HN(7) z zastosowaniem clampu dynamicznego (Rycina 3), a następnie ocenić ich wpływ na charakterystykę serii impulsów (bursts): częstotliwość impulsów (f: odwrotność średniego odstępu międzyimpulsowego w obrębie serii), odstęp między seriami (IBI: czas od ostatniego impulsu w jednej serii do pierwszego impulsu w następnej serii), czas trwania serii (BD: czas od pierwszego do ostatniego impulsu w obrębie serii) oraz okres serii (T: czas od pierwszego impulsu w jednej serii do pierwszego impulsu w serii następnej).
1. Zmień wartości i tak jak w demonstracji wideo, aby zapoznać się z techniką, a następnie przystąpić do samodzielnych działań.
  1. Przytrzymać przy konkretnej stałej wartości i przesuwaniu w przyrostach 1 nS w zakresie wspierające regularną aktywność seryjną.
  2. Teraz należy zwiększyć wartość stałą dla o 0,1 nA, a następnie ponownie przeprowadzić skanowanie w zakresie podtrzymując regularną aktywność seryjną.
  3. Dla każdej zaimplementowanej pary parametrów należy zebrać dane zawierające co najmniej 8 serii wyładowań (bursts), aby umożliwić wiarygodny pomiar średnich wartości f, IBI, BD oraz T.
  4. Kontynuuj serie pomiarów tak długo, jak neuron pozostaje żywy, co ocenia się na podstawie silnego generowania potencjałów czynnościowych oraz stabilnego potencjału spoczynkowego oscylacji.
  5. Zbierz dane z kilku neuronów (pochodzących od różnych zwierząt), aby wygenerować wykres zbiorczy (Rycina 5).

Wyniki

Modelowanie z uwzględnieniem I_pump⁴ pozwoliło dokładniej przeanalizować wyniki eksperymentalne przedstawione w sekcji wstępnej i rozpoczęło wyjaśnianie mechanizmu burstingu wspomaganego pompą. Przedstawiony tutaj model w czasie rzeczywistym został dostrojony ( figure-results-1 oraz dobrano parametry figure-results-2 ) w taki sposób, aby generował regularną aktywność rytmiczną mieszczącą się w granicach normalnej aktywności zaobserwowanej w eksperymentach – f, IBI, BD, T – i nadal generował taką aktywność, gdy parametry modulowane przez myomodulinę figure-results-3 (maksymalny prąd pompy) oraz figure-results-4 (maksymalna przewodność prądu h) są zmieniane lub współzmieniane w modelu. Wyznaczone wartości parametrów mogą służyć jako punkt odniesienia lub zestaw kanoniczny dla eksperymentów modelowych. W tych instancjach modelu I_pump oscyluje w trakcie cyklu burstingu wraz z [Na⁺]_i wokół poziomu bazowego. I_pump przyczynia się do zakończenia burstingu podczas fazy burstu, a wywoływana przez nią hiperpolaryzacja aktywuje I_h podczas IBI; zwróć uwagę na maksymalny poziom I_h w pobliżu inicjacji burstu (Rycina 2).

Mimo że model HN w czasie rzeczywistym posiada zaimplementowane wszystkie prądy²^,⁴ dostępne do dynamicznej klamrowania, w niniejszej pracy skupiono się na figure-results-5 i figure-results-6 , które można zmieniać podczas działania modelu w interfejsie graficznym (GUI) dynamic clamp (Rycina 3). Dynamic clamp umożliwia eksperymentatorowi dodanie (lub odjęcie za pomocą ujemnego figure-results-7 lub figure-results-8 ) dowolną konduktancję lub prąd w neuronie w sposób sztuczny, który naśladuje zależność od napięcia i jonów rzeczywistej konduktancji lub prądu. W ten sposób możliwe jest pełne zbadanie, w jaki sposób konkretna konduktancja/prąd oddziałuje z endogennymi konduktancjami/prądami wewnątrz komórek (Rysunek 1). Model HN w czasie rzeczywistym wskazuje, że uporczywy Na⁺ bieżący (I_P) w neuronach HN odpowiada za znaczną część Na⁺ silny wpływ napływu [Na+⁺]_i (Rysunek 2) a tym samym, I_pompaPonieważ I_P jest aktywny przy stosunkowo ujemnych potencjałach błonowych i przeciwdziała I_pompa nawet podczas IBI.

Obserwacje te wskazują, że pożyteczne jest zbadanie oddziaływań pomiędzy figure-results-9 a figure-results-10 w izolowanych neuronach HN z wykorzystaniem dynamic clamp, zgodnie z wcześniejszymi rozważaniami⁸^,⁹^,¹⁰. Eksperymenty te (obecnie w toku) są prowadzone z wykorzystaniem rejestracji mikroelektrodami ostrymi w pojedynczych, synaptycznie izolowanych neuronach HN(7) (siódmy zwoj odcięty od sznura nerwowego). Do tej pory eksperymenty te wykazały, że intensywne serie impulsów (bursting) zostają przywrócone w tonicznie aktywnych neuronach HN (w których penetracja mikroelektrodą spowodowała wprowadzenie prądu przecieku) poprzez jednoczesne dodanie I_P i I_pump za pomocą dynamic clamp (Rysunek 4). Jest to istotna obserwacja wskazująca, że w tych neuronach (nawet przy zaburzeniach prądu przecieku) istnieje mechanizm generowania serii impulsów wynikający z oddziaływania I_pump i I_P. Wstępne wyniki wskazują na ich silne i złożone oddziaływanie, które można badać w modelu oraz w eksperymentach (Rysunek 5).

Podsumowując, I_pump w odpowiedzi na okresowe wzrosty [Na⁺]_i podczas aktywności seryjnej (bursting) przyczynia się do rytmu serii poprzez zakończenie serii (zmniejszenie BD). Interakcja I_P i I_pump stanowi mechanizm wystarczający do podtrzymania endogennej aktywności seryjnej; mechanizm ten może przywrócić stabilne serie w interneuronach HN rejestrowanych wewnątrzkomórkowo w zwoju 7. Interakcja między I_P a I_pump poprzez [Na⁺]_i wpływa w sposób niemonotoniczny na okres serii HN i zapewnia stabilność autonomicznego procesu seryjnego. Wnioski te są zgodne z eksperymentami i modelowaniem w systemach kręgowców¹¹^,¹².

figure-results-11
Rycina 1: Aktywność elektryczna interneuronów serca pijawki oraz implementacja I_pump i I_P za pomocą dynamic clamp. (A) Normalna aktywność seryjna (bursting) zarejestrowana jednocześnie zewnątrzkomórkowo (góra) i wewnątrzkomórkowo (dół) w oscylatorze półcentrum (HCO) serca pijawki z trzeciego zwoju; po prawej schemat zarejestrowanych neuronów i ich wzajemnie hamujących połączeń synaptycznych. (B) Schemat dynamic clamp podczas rejestracji interneuronu HN(7) w izolowanym zwoju 7; należy zauważyć brak interakcji synaptycznej między dwoma interneuronami HN(7). (Ci) Aktywność seryjna w interneuronie HN(7) z upośledzoną szczelnością błony (leak-compromised). (Cii) Silniejszą aktywność seryjną można uzyskać poprzez dodanie dynamic clamp I_pump ( figure-results-12 = 0.1 nA), który rekompensuje przeciek wywołany mikroelektrodą, ale obniża pobudliwość, oraz figure-results-13 (1 nS), który zwiększa pobudliwość. Czarne przerywane linie wskazują wartości bazowe. Skróty: HN = interneuron serca; HCO = oscylator półcentrum; I_pump= prąd wychodzący; I_P= trwały prąd Na⁺; figure-results-14 = maksymalny prąd pompy Na⁺/K⁺; figure-results-15 = maksymalna przewodność trwałego prądu Na⁺; Vm = potencjał błonowy; [Na⁺]_i = wewnątrzkomórkowe stężenie Na⁺. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-16
Rysunek 2: Model pojedynczego interneuronu HN przedstawiający przebiegi potencjału błonowego (Vm), I_h, I_pump, [Na⁺]_i oraz I_P. Zewnętrzne prądy hiperpolaryzujące są ujemne, a wewnętrzne prądy depolaryzujące są dodatnie. Czarne przerywane linie wskazują wartości bazowe. Skróty: HN = interneuron serca; I_pump= prąd zewnętrzny; I_P= trwały prąd Na⁺; figure-results-17 = maksymalny prąd pompy Na⁺/K⁺; I_h= wewnętrzny prąd aktywowany hiperpolaryzacją; figure-results-18 = maksymalna przewodność trwałego prądu Na⁺; figure-results-19 = maksymalna przewodność wewnętrznego prądu aktywowanego hiperpolaryzacją; Vm = potencjał błonowy; [Na⁺]_i = wewnętrzne stężenie Na⁺. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-20
Rycina 3: Graficzny interfejs użytkownika modelu interneuronu serca (HN) w czasie rzeczywistym oraz zacisku dynamicznego (dynamic clamp) zaimplementowanego na płytce cyfrowego przetwarzania sygnałów. Górny lewy róg: czerwone pola Math to pola parametrów określanych przez użytkownika dla modelu w czasie rzeczywistym, natomiast niebieskie pola Live to pola parametrów określanych przez użytkownika stosowane w zacisku dynamicznym. El = potencjał odwrócenia prądu przecieku; Gl = przewodnictwo przecieku; Gh = maksymalne przewodnictwo prądu h; Gp = maksymalne przewodnictwo prądu P; GCaS = maksymalne przewodnictwo wolnego prądu wapniowego; PumpMax = maksymalny prąd pompy; [GSyn2 maksymalne przewodnictwo synaptyczne do odpowiedniego neuronu; ThreshSyn2 próg przekroczenia kolca dla pośredniczenia w potencjale synaptycznym – używane do stworzenia hybrydowego (żywego/modelowego) oscylatora półcentrycznego, który nie jest tutaj przedstawiony.]. Dolny lewy róg dla zacisku dynamicznego. Po lewej stronie znajduje się 5 obliczonych wartości zmiennych zacisku dynamicznego: I_pump = wstrzyknięty prąd pompy; Ih = wstrzyknięty prąd h (tutaj nieużywany); IP = wstrzyknięty prąd P; NaI = obliczone wewnętrzne stężenie Na⁺; ENa = obliczony potencjał odwrócenia sodu. Dolny lewy róg dla zacisku dynamicznego. Po prawej stronie od zmiennych obliczonych znajduje się 6 pól parametrów określanych przez użytkownika: GNa = przyjęte endogenne maksymalne przewodnictwo szybkiego sodu użyte do obliczenia strumienia Na⁺ związanego z potencjałami czynnościowymi; PumpMaxL = maksymalny prąd pompy do wstrzyknięcia przez zacisk dynamiczny; Naih patrz równanie (2); Gh = maksymalne przewodnictwo do określenia prądu h do wstrzyknięcia przez zacisk dynamiczny; Gp = przyjęte endogenne maksymalne przewodnictwo prądu P użyte do obliczenia strumienia Na⁺ związanego z endogennym prądem P; GpinHNLive = maksymalne przewodnictwo do określenia prądu P do wstrzyknięcia przez zacisk dynamiczny. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

figure-results-21
Rysunek 4: Analiza dynamic clamp niezależnego wyładowywania seryjnego (bursting) HN(7). Zwiększenie figure-results-22 z (A) 4.0 nS do (B) 9.0 nS spowalnia rytm niezależnych wyładowań seryjnych HN. Ślady eksperymentalne pokazują rytmiczne wyładowania seryjne w izolowanym neuronie HN(7) z zastosowaniem dynamic clamp. Zakresy oscylacji [Na⁺]_i oraz Vm zwiększają się wraz ze zwiększeniem figure-results-23 . Ślady od góry do dołu: zarejestrowane Vm, wstrzyknięty I_pump, obliczone [Na⁺]_i oraz wstrzyknięty I_P. Czarne przerywane linie wskazują wartości bazowe. Skróty: HN = interneuron serca; I_pump= prąd wychodzący; I_P= trwały prąd Na⁺; figure-results-24 = maksymalny prąd pompy Na⁺/K⁺; figure-results-25 = maksymalna przewodność trwałego prądu Na⁺; Vm = potencjał błonowy; [Na⁺]_i = wewnątrzkomórkowe stężenie Na⁺. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

figure-results-26
Rysunek 5: Analiza dynamic clamp niezależnego wyładowywania seryjnego (bursting) neuronu HN(7). Uregulowanie w górę figure-results-27 wykazuje tendencję do spadku, po którym następuje wydłużenie okresu wyładowań HN. W poszczególnych eksperymentach (punkty połączone liniami) z wykorzystaniem techniki dynamic clamp, wartości figure-results-28 były zmieniane, podczas gdy figure-results-29 pozostawało stałe. Kolory reprezentują różne stałe poziomy dodanego figure-results-30 zastosowane w różnych eksperymentach. Skróty: HN = interneuron sercowy; figure-results-31 = maksymalny prąd pompy Na⁺/K⁺; figure-results-32 = maksymalna przewodność trwałego prądu Na⁺. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

Modelowanie, zacisk dynamiczny i wynikające z niego analizy są użytecznymi technikami do badania, w jaki sposób poszczególne i grupy przewodnictwa/prądów jonowych przyczyniają się do aktywności elektrycznej neuronów (Rysunek 1, Rysunek 2, Rysunek 4 i Rysunek 5). Zastosowanie tych technik pokazuje, w jaki sposób prąd pompy Na⁺/K⁺ (_pompa I) oddziałuje z prądami bramkowanymi napięciem, w szczególności z trwałym prądem Na⁺ (_{I P}), aby promować solidne pękanie w rdzeniu generatora wzorców bicia serca pijawki. Łącząc dynamiczne eksperymenty cęgowe i modelowanie, możliwe jest testowanie modeli bardziej bezpośrednio niż jest to możliwe przy użyciu zwykłych technik zapisu napięcia i cęgów prądowych. Wyniki uzyskane z eksperymentów z zaciskiem dynamicznym (rysunek 5) zostaną wykorzystane do dalszego udoskonalenia modelu HN. Podstawowa metoda dynamicznego zaciskania zademonstrowana tutaj może być dostosowana tak, aby odzwierciedlała właściwości dowolnego badanego neuronu, jeśli można określić matematyczny model prądów neuronalnych za pomocą eksperymentów z cęgami napięciowymi.

Pomyślne zakończenie eksperymentów typu pokazanego tutaj wymaga starannego nabicia HN lub innego neuronu przy użyciu ostrej mikroelektrody, ponieważ silne pękanie jest ograniczane przez penetrację elektrody¹. (Techniki rejestrowania łatek w całych komórkach, które minimalizują wprowadzony wyciek, mają również zastosowanie do innych neuronów, ale nie działają dobrze na neuronach pijawek). Bardzo ważne jest, aby przebicie neuronu HN spowodowało minimalne uszkodzenie neuronu (dodatkowy wyciek), a rezystancja wejściowa powinna być monitorowana i musi mieścić się w zakresie 60-100 MOhms dla udanych eksperymentów⁴.

Zacisk dynamiczny jest potężną techniką, ale ma ograniczenia narzucone przez geometrię neuronalną, ponieważ sztuczne przewodnictwa są realizowane w miejscu elektrody rejestrującej - zwykle w ciele komórki - a nie w miejscu, w którym prądy generujące rytm są zwykle zlokalizowane ^5,6,10. W neuronach HN pijawek ciało komórki znajduje się elektrycznie blisko strefy integracji (głównego neurytu) neuronu, w której zlokalizowane są najbardziej aktywne prądy i inicjowane są kolce.

Podziękowania

Dziękujemy Christianowi Erxlebenowi za wstępne eksperymenty z dynamicznym zaciskiem na neuronach HN(7), które wykazały ich zdolność do pękania. Angela Wenning pomogła w eksperymentach, udzielając porad ekspertów. Dziękujemy NIH za finansowanie tych prac poprzez Grant 1 R21 NS111355 dla GSC i RLC.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
ZWIERZĘTA
Hirudo verbanaLeech.com	, https://www.leech.com/collections/live-leeches		żywe pijawki 2-3 gramy
CHEMIKALIA
SZTUCZNA WODA
CaCl₂	Sigma Aldrich	C5670-100G	1,8 mM dodać jako ostatni po dostosowaniu pH
glukozy	Sigma	Aldrich G7021-100G	10 mM
HEPES	Sigma Aldrich	H4034-100G	10 mM
Instant Ocean (sól morska)	Spectrum Brands Inc., Madison, WI		0,05% (w/v) rozcieńczony w wodzie dejonizowanej
KCl	Sigma Aldrich	P9333-500G	4 mM
NaCl	Sigma Aldrich	S7653-250G	115 mM
NaOH 0,1 N Roztwór	Sigma Aldrich	2105-50ML	Dostosuj do pH 7,4 za pomocą NaOH
mocne>MIKROELEKTRODY
K Acetat	Sigma Aldrich	P1190-100G	2 M
KCl	Sigma Aldrich	P9333-500G	20 mM
sól fizjologiczna
SPRZĘT
#5 Kleszcze	Narzędzia do nauki precyzyjnej Dumont	11251-30 LUB 11251-20	Do ogólnego rozwarstwiania pijawek
AxoClamp 2A/2B Elektrometr DCC	Axon Instruments Urządzenia molekularne	2A/2B	Do rejestracji potencjału błony neuronalnej i nieciągłego cęgów prądowych
żywica	Dow Sylguard	170	Linie Ogólne naczynie preparacyjne
Szkło kapilarne 1 mm średnica zewnętrzna, 0,75 mm średnica wewnętrzna	A-M Systems	615000	Do wytwarzania ostrych mikroelektrod
Przezroczysta żywica	Dow Sylguard	184	Lines Szalka Petriego służąca do montażu ganglionu do elektrofizjologii
Kondensor ciemnego pola	Nikon	Dry 0,95-0,80 MBL 1210	Do oświetlania preparatu ganglionu podczas nabijania komórki
Digidata 1440A	Axon CNS Molecular Devices	1440A	Wykonuje pomiary od A do D i od D do A w celu akwizycji danych i stymulacji podczas elektrofizjologii Cyfrowa
płytka przetwarzania sygnału	dSpace	CLP1104	Nasze oprogramowanie implementuje wszystkie przewodności/prądy w naszym modelu neuronu HN na płycie kontrolera PPC DS1103 dSPACE w czasie rzeczywistym z częstotliwością 20 kHz za pomocą graficznego interfejsu użytkownika ControlDesk (dSPACE, Paderborn, Niemcy)9.
Falming/Brown Microelectrode Puller	Sutter Instruments	P-97	Do wytwarzania ostrych mikroelektrod
Oświetlacz o wysokiej intensywności Fiber-Lite	Dolan Jenner Industries	170D	Do oświetlania ogólnej sekcji i do oświetlania preparatu ganglionu podczas wbijania komórek
Wzmacniacz czołowy do AxoClamp 2A	Axon Instruments	HS-2A Wzmocnienie: 0,1LU	Teraz część Molecular Devices do rejestracji potencjału błony neuronalnej i nieciągłego cęgowania prądu
Światłowód	Dolan Jenner Industries	Rev R 38 08 3729107	Do oświetlania ogólnego rozwarstwienia oraz do oświetlania preparatu ganglionu podczas napalania komórek
Mikromanipulator	Sutter Instruments	MPC-385	Mikromanipulator do nabijania komórek za pomocą mikroelektrod
Mikromanipulator kontroler	Sutter Instruments	MPC-200	Steruje mikromanipulatorami do nabijania komórek za pomocą mikroelektrod
Szpilki Minuten	BioQuip	Średnica 0,15 mm 1208SA	Należy skrócić przez curtting do ~5 mm
Optyczna płytka stykowa 3' x 5' x 8"	Newport	Przestarzały	Z 4 poniższymi izolatorami pneumatycznymi używanymi do budowy wolnej od wibracji przestrzeni roboczej do elektrofizjologii
Oscyloskop	HAMEG Instruments	HM303-6	Do monitorowania osadzania elektrod podczas DCC
Nożyczki sprężynowe Pascheff-Wolff	Moria		Dostarczone przez Fine Science Tools (Foster City, CA) katalog # 15371-92
pClamp 9 Oprogramowanie	Axon Instruments	9	Teraz część Moleculear Devices wykorzystuje Digidata 1440 do akwizycji danych i stymulacji podczas elektrofizjologii
Izolatory pneumatyczne 28"	Newport	Przestarzały	Z optyczną płytką stykową służącą do budowy wolnej od wibracji przestrzeni roboczej do elektrofizjologii
Oprogramowanie Simulink / MATLAB	MathWorks	2006 (przestarzałe)	Implementuje dynamiczny zacisk na płytce cyfrowego przetwarzania sygnału
Mikroskop stereoskopowy	Wild	M5A	10x Okulary używane do preparowania pijawki oraz usuwania i usuwania zwojów nerwowych
Steromikroskop	Dzikie	M5	20x używane w stacji elektrofizjologicznej do wizualizacji neuronu do penetracji mikroelektrod
Nożyczki sprężynowe Student Vannas	Narzędzia do nauki	91500-09	Do ogólnego rozwarstwiania pijawek

W STAWIE< okulary

Bibliografia

Cymbalyuk, G. S., Gaudry, Q., Masino, M. A., Calabrese, R. L. Bursting in leech heart interneurons: cell-autonomous and network-based mechanisms. Journal of Neuroscience. 22, 10580-10592 (2002).
Hill, A. A., Lu, J., Masino, M. A., Olsen, O. H., Calabrese, R. L. A model of a segmental oscillator in the leech heartbeat neuronal network. Journal of Computational Neuroscience. 10, 281-302 (2001).
Tobin, A. E., Calabrese, R. L. Myomodulin increases Ih and inhibits the NA/K pump to modulate bursting in leech heart interneurons. Journal of Neurophysiology. 94, 3938-3950 (2005).
Kueh, D., Barnett, W. H., Cymbalyuk, G. S., Calabrese, R. L. Na(+)/K(+) pump interacts with the h-current to control bursting activity in central pattern generator neurons of leeches. eLife. 5, 19322(2016).
Sharp, A. A., O'Neil, M. B., Abbott, L. F., Marder, E. Dynamic clamp: computer-generated conductances in real neurons. Journal of Neurophysiology. 69, 992-995 (1993).
Prinz, A. A., Abbott, L. F., Marder, E. The dynamic clamp comes of age. Trends in Neuroscience. 27, 218-224 (2004).
Barnett, W., Cymbalyuk, G. Hybrid systems analysis: real-time systems for design and prototyping of neural interfaces and prostheses. Biohybrid systems: nerves, interfaces, and machines. Jung, R. , Wiley VCH Verlag. Weinheim. 115-138 (2011).
Sorensen, M., DeWeerth, S., Cymbalyuk, G., Calabrese, R. L. Using a hybrid neural system to reveal regulation of neuronal network activity by an intrinsic current. Journal of Neuroscience. 24, 5427-5438 (2004).
Olypher, A., Cymbalyuk, G., Calabrese, R. L. Hybrid systems analysis of the control of burst duration by low-voltage-activated calcium current in leech heart interneurons. Journal of Neurophysiology. 96, 2857-2867 (2006).
Calabrese, R. L., Prinz, A. A. Realistic modeling of small neuronal networks. Computational Modeling Methods for Neuroscientists. DeSchutter, E. , MIT Press. MA, USA. 285-316 (2010).
Rybak, I. A., Molkov, Y. I., Jasinski, P. E., Shevtsova, N. A., Smith, J. C. Rhythmic bursting in the pre-Bötzinger complex: mechanisms and models. Progress in Brain Research. 209, 1-23 (2014).
Picton, L. D., Nascimento, F., Broadhead, M. J., Sillar, K. T., Miles, G. B. Sodium pumps mediate activity-dependent changes in mammalian motor networks. Journal of Neuroscience. 37, 906-921 (2017).

Przedruki i uprawnienia

Sprostowanie

Formal Correction: Erratum: Contribution of the Na⁺/K⁺ Pump to Rhythmic Bursting, Explored with Modeling and Dynamic Clamp Analyses
Posted by JoVE Editors on 7/28/2021. Citeable Link.

An erratum was issued for: Contribution of the Na⁺/K⁺ Pump to Rhythmic Bursting, Explored with Modeling and Dynamic Clamp Analyses. An author name was updated.

The name of the first author was updated from:

Ricardo Javier Erazo Toscano

to:

Ricardo Javier Erazo-Toscano

Tagi

trwały prąd sodowy interneuron sercowy modelowanie obliczeniowe zwoje pijawki wewnątrzkomórkowy sód potencjał błonowy zakończenie serii wyładowań

Wkład pompy Na+/K+ w rytmiczne pękanie, badany za pomocą modelowania i dynamicznych analiz zacisków