Artykuł metodologiczny

Wkład pompy Na+/K+ w rytmiczne pękanie, badany za pomocą modelowania i dynamicznych analiz zacisków

DOI:

10.3791/61473

⸱

9 maja 2021

 ,  ,  , 
1Department of Biology, Emory University, 2Neuroscience Institute, Georgia State University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Informacja o sprostowaniu

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiona tutaj jest metoda badania roli pompy Na+/K+ i stałego prądu Na+ w interneuronach serca pijawek za pomocą dynamicznego zacisku.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pompa Na+/K+, często uważana za funkcję tła w aktywności neuronalnej, dostarcza prąd na zewnątrz (pompa I), który reaguje na wewnętrzne stężenie Na+ ([Na+]i). W neuronach pękających, takich jak te znajdujące się w sieciach neuronalnych centralnego generatora wzorców (CPG), które wytwarzają rytmiczne ruchy, można oczekiwać, że [Na+]i, a tym samym pompa I, będą się zmieniać w trakcie cyklu impulsu. Ta reakcja na aktywność elektryczną, w połączeniu z niezależnością od potencjału błonowego, nadaje pompie I właściwości dynamiczne, które nie są typowe dla prądów opartych na kanałach (np. kanały bramkowane napięciem lub nadajnikiem lub nieszczelne). Co więcej, w wielu neuronach aktywność pompy jest modulowana przez różne modulatory, co jeszcze bardziej zwiększa potencjalną rolę pompy I w rytmicznym wybuchu. W tym artykule pokazano, jak wykorzystać kombinację metod modelowania i dynamicznego zacisku w celu określenia, w jaki sposób pompuję i jego interakcja z trwałym prądem Na+ wpływa na rytmiczną aktywność w CPG. W szczególności w tym artykule skupimy się na protokole dynamicznego zacisku i metodach modelowania obliczeniowego w interneuronach serca pijawek lekarskich.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bicie serca u pijawek jest sterowane przez CPG składający się z 9 obustronnych par interneuronów serca (HN) rozmieszczonych w tyluż segmentach środkowej części ciała. Sercem CPG są wzajemnie hamujące się pary interneuronów zlokalizowane w 3. i 4. zwoju segmentowym, które tworzą oscylatory pół-środkowe (HCO) (Rysunek 1A). Neurony te nadal pękają, gdy są izolowane synaptycznie farmakologicznie za pomocą bicuculline1. Inne, takie jak para w 7. zwoju segmentowym (na którym skupia się ten protokół), są również bursterami, zdolnymi do wytwarzania wybuchowej aktywności, gdy są izolowane synaptycznie. Nie są one ze sobą połączone i otrzymują tylko zstępujące dane wejściowe, a zatem można je łatwo odizolować poprzez odcięcie ganglionu od reszty rdzenia nerwowego. Ta niezależna aktywność rozrywająca jest wrażliwa na wprowadzony prąd upływowy spowodowany penetracją ostrymi mikroelektrodami do nagrywania, ale energicznie pęka, gdy jest rejestrowana metodami luźnych łatek1.

Zarówno pojedyncze neurony HN, jak i HCO HN zostały wymodelowane (oparte na Hodgkinie-Huxleyu modele pojedynczych przedziałów izopotencjalnych neuronów HN, zawierające wszystkie eksperymentalnie zidentyfikowane prądy bramkowane napięciem i synaptycznymi), a wszystkie cechy wybuchu systemu żywego zostały pomyślnie przechwycone2. Miomodulina, endogenny neuropeptyd występujący w pijawkach, znacznie skraca okres (T) rytmu wybuchu izolowanych neuronów HN i HN HCO. Modulator ten działa w celu zwiększenia prądu h (prądu wewnętrznego aktywowanego hiperpolaryzacją, Ih) i zmniejszenia Ipump3. Ta obserwacja doprowadziła do zbadania, w jaki sposób pompa I oddziałuje z Ih i jak ich komodulacja przyczynia się do rytmicznej aktywności neuronów HN. Aktywacja pompy poprzez zwiększenie [Na+]i (przy użyciu jonoforu monenzyny) przyspiesza rytm wybuchu HN zarówno w HN HCO, jak i izolowanych neuronach HN4. Przyspieszenie to zależało od Ih. Gdy Ih było zablokowane (2 mM Cs+), okres impulsu nie był zmieniany przez tę metodę aktywacji pompy; jednak czas trwania impulsu (BD) został skrócony, a interwał rozbłysku (IBI) zwiększył się zarówno w HN HCO, jak i izolowanych neuronach HN4.

Dla tego protokołu, wszystkie prądy żywego neuronu HN(7), w tym prąd pompy, który pompuję, są włączone do modelu HN w następujący sposób:

figure-introduction-1 (1)

gdzie C to pojemność membrany (w nF), V to potencjał membrany (w V), t to czas (w s). Szczegółowe opisy prądów jonowych i równania zostały opisane gdzie indziej2,4. Kompletny neuron modelu HN działa w czasie rzeczywistym (Rysunek 2). Oprogramowanie zostanie udostępnione na GitHubie po publikacji i będzie nadawało się do uruchomienia na płytce do cyfrowego przetwarzania sygnału opisanej w Tabeli Materiałów. W tym przypadku nacisk kładziony jest na prąd pompy Na+/K+ (pompa I) oraz prądy bramkowane napięciem, które przyczyniają się do znacznego strumienia Na+: szybki prąd Na+ (INa) i stały prąd Na+ (IP). Maksymalne przewodności tych prądów wynoszą odpowiednio figure-introduction-2 figure-introduction-3. Pompa Na+/K+ wymienia trzy wewnątrzkomórkowe jony Na+ na dwa zewnątrzkomórkowe jony K+, wytwarzając w ten sposób prąd netto na zewnątrz. Co ważne, wypompowuje 3 razy więcej Na+ z neuronu, niż wskazuje ten prąd, co jest ważne dla obliczenia wewnątrzkomórkowego stężenia Na+.

Prąd pompy Na+/K+ zależy od wewnątrzkomórkowych stężeń Na+ i jest wyrażony przez następującą funkcję sigmoidalną:

figure-introduction-4 (2)

gdzie [Na]i jest wewnątrzkomórkowym stężeniem Na+, figure-introduction-5 to maksymalny prąd pompy Na+/K+, [Na]ih to wewnątrzkomórkowe stężenie Na+ dla połowy aktywacji pompy Na+/K+, a [Na] to czułość pompy Na+/K+ na [ Na]i. [Na]i powstaje w wyniku napływów Na+ przenoszonych przez IP i INa i jest zmniejszane przez wypływ Na+ pompy Na+/K+. Udział nieszczelności Ih i I w całkowitym strumieniu Na+ jest niewielki i nie jest uwzględniany w modelu czasu rzeczywistego.

figure-introduction-6 (3)

gdzie, v jest objętością (~6,7 pL) wewnątrzkomórkowego zbiornika Na+, F jest stałą Faradaya, a stężenie zewnątrzkomórkowego Na+ jest utrzymywane na stałym poziomie.

Przewodnictwo bramkowane napięciem i nieszczelności zostało zróżnicowane - reagują one na potencjał membrany - od prądu pompy, który jest regulowany przez obliczone wewnątrzkomórkowe stężenie Na+ ([Na+]i). [Nie +]i jest budowane poprzez wejście Na+ poprzez szybki prąd Na+ (INa), który wytwarza potencjały czynnościowe (skoki) i trwały prąd Na+ (IP), który zapewnia depolaryzację wspierającą skoki. [Nie +]i jest z kolei redukowane przez działanie pompy poprzez wytłaczanie Na+. Założono, że podstawowe wartości HN wynoszące figure-introduction-7(5nS) i figure-introduction-8(150 nS) i uwzględniamy wszelkie dodane zaciski dynamiczne figure-introduction-9.

Celem opisanego tutaj protokołu jest precyzyjne i odwracalne manipulowanie pompą I w czasie rzeczywistym, aby odkryć, jak oddziałuje ona z prądami bramkowanymi napięciem (trwały prąd Na+ w obecnym protokole) w celu kontrolowania rytmicznego pękania w pojedynczych HNs. Aby osiągnąć ten cel, zastosowano zacisk dynamiczny, który sztucznie wprowadza, na polecenie, precyzyjną ilość dowolnego prądu, którą można obliczyć w trakcie pracy modelu. Ta metoda ma przewagę nad farmakologiczną manipulacją pompy, która wpływa na całą tkankę, może mieć efekty niezgodne z celem, które często są trudne do odwrócenia i nie można nimi precyzyjnie manipulować. Zacisk dynamiczny5,6 odczytuje napięcie zarejestrowanego neuronu w czasie rzeczywistym (Rysunek 1B) oraz oblicza i wstrzykuje w czasie rzeczywistym ilość dowolnego prądu na podstawie równań modelu i ustawionych wartości dowolnego figure-introduction-10 lub figure-introduction-11. Podobne metody można łatwo zastosować do każdego neuronu, który można zarejestrować wewnątrzkomórkowo. Jednak parametry będą musiały zostać przeskalowane do wybranego neuronu, a neuron powinien zostać odizolowany od wejść synaptycznych, np. farmakologicznie.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Obiekty doświadczalne na zwierzętach bezkręgowych nie są regulowane przez NIH ani Uniwersytety Stanowe Emory i Georgia. Podjęto jednak wszelkie środki, aby zminimalizować cierpienie pijawek używanych w tej pracy.

1. Przygotuj odizolowany ganglion 7 z rdzenia nerwowego pijawki

  1. Utrzymuj pijawki Hirudo verbana w sztucznej wodzie stawowej (zawierającej 0,05% w/v soli morskiej) rozcieńczonej w wodzie dejonizowanej w temperaturze 16 °C w cyklu 12:12 jasno-ciemno.
  2. Przygotuj pijawki do sekcji, znieczulając je na zimno w łóżku z pokruszonego lodu przez >10 minut, aż do unieruchomienia.
  3. Napełnij czarne, wyłożone żywicą naczynie preparacyjne na głębokość ~1 cm schłodzonym roztworem soli fizjologicznej zawierającym 115 mM NaCl, 4 mM KCl, 1,7 mM CaCl2, 10 mM D-glukozy i 10 mM HEPES w wodzie dejonizowanej; pH dostosowane do 7,4 za pomocą 1 M NaOH. Przypnij pijawkę grzbietową do góry w czarnej komorze wyłożonej żywicą (co najmniej 20 cm x 10 cm z głębokością co najmniej 2 cm powyżej żywicy o grubości co najmniej 2 cm).
  4. Pod steromikroskopem przy 20-krotnym powiększeniu z ukośnym oświetleniem światłowodowym wykonaj podłużne cięcie o długości co najmniej 3 cm nożyczkami sprężynowymi o średnicy 5 mm przez ścianę ciała w rostralnej 1/3 części ciała. Użyj szpilek, aby odciągnąć ścianę ciała i odsłonić narządy wewnętrzne.
    UWAGA: Każdą przechowywaną mączkę z krwi można usunąć przez odsysanie za pomocą polerowanej ogniowo pipety Pasteura.
  5. Wyizoluj pojedynczy ganglion środkowej części ciała 7 (siódmy wolny zwój segmentowy ogonowy do mózgu).
    1. Otwórz zatokę, w której znajduje się rdzeń nerwowy, za pomocą nożyczek sprężynowych 5 mm. Pamiętaj, aby rozciąć zatokę grzbietowo i brzusznie, pozostawiając dwa paski zatoki. Użyj ostrych kleszczyków #5, aby pomóc poprowadzić cięcie i przytrzymać zatokę.
    2. Utrzymuj zatokę przyczepioną do każdego z dwóch obustronnych korzeni nerwowych, które wyłaniają się ze zwoju (ściśle przylega do każdego korzenia), aby użyć tych pasków zatoki do wyprowadzenia ganglionu.
    3. Usuń zwój z ciała, przecinając rostralne i ogonowe wiązki nerwów łącznych, które łączą zwoje (jak najdalej od 7. zwoju) i paski zatokowe, a następnie odetnij korzenie boczne do miejsca, w którym wyłaniają się z zatoki.
  6. Przypnij ganglion (za pomocą starych stępionych kleszczy #5) za pomocą skróconych minutowych szpilek do owadów, brzuszną stroną do góry, w przezroczystych, wyłożonych żywicą szalkach Petriego. Włożyć szpilki w paski zatoki i luźną tkankę przylegającą do korzeni oraz łączników rostralnych i ogonowych, jak najdalej od zwoju.
    UWAGA: Żywica nie może być grubsza niż 3 mm, jeśli podczas nagrywania ma być zapewnione dobre oświetlenie od dołu. Upewnij się, że ganglion jest napięty, zarówno wzdłużnie, jak i bocznie
  7. Zwiększ powiększenie mikroskopu stereoskopowego do 40x lub więcej i dostosuj ukośne oświetlenie tak, aby ciała komórek nerwowych były łatwo widoczne na brzusznej powierzchni zwoju tuż pod kroczem.
  8. Usuń krocze ganglionu (osłonki) za pomocą mikronożyczek.
    1. Rozpocznij usuwanie pochwy od przecięcia luźnej pochwy między korzeniami z jednej strony i kontynuuj cięcie na bok na drugą stronę, upewniając się, że ostrza nożyczek są powierzchowne i nie uszkadzają ciał komórek nerwowych bezpośrednio pod osłoną.
    2. Wykonaj podobne powierzchowne cięcie doogonowo od bocznego cięcia wzdłuż linii środkowej.
    3. Teraz chwyć ogonowo-boczną klapę pochwy z jednej strony cienkimi kleszczami #5, odciągnij ją od ganglionu i odetnij mikronożyczkami.
    4. Powtórz po drugiej stronie; ta procedura wystawia oba neurony HN(7) do rejestracji za pomocą mikroelektrod.
  9. Umieść naczynie do przygotowania w zestawie do nagrywania i zalej solą fizjologiczną o natężeniu przepływu 5 ml/min w temperaturze pokojowej.

2. Identyfikuj i rejestruj interneurony serca pijawki za pomocą ostrych mikroelektrod

  1. Na czas rejestracji neuronu HN(7) (nagrania trwają od 30 do 60 minut), pozyskuje i digitalizuje wewnątrzkomórkowe ślady prądu i napięcia z próbkowania elektrometru neurofizjologicznego z szybkością 5 kHz za pomocą cyfrowego systemu akwizycji danych (Analog do Digital, A do D) i stymulacji (Digital to Analog, D do A), i wyświetlić na ekranie komputera.
    UWAGA: Do pozyskiwania danych można użyć dowolnego komercyjnego lub niestandardowego oprogramowania i płytki od A do D/D do A (od A do D). Do zacisku dynamicznego wymagane są od D do A i niestandardowe oprogramowanie.
  2. Pod steromikroskopem pod kątem 50-100x z ciemnym polem oświetlonym od dołu, wstępnie zidentyfikuj neuron HN (7) pary obustronnej na podstawie jego kanonicznej lokalizacji w tylno-bocznej pozycji w siódmym zwoju środkowej części ciała.
  3. Teraz staraj się przeniknąć do domniemanego neuronu HN(7) za pomocą ostrej mikroelektrody wypełnionej 2 M octanem potasu i 20 mM KCl za pomocą mikromanipulatora.
    1. Umieść mikroelektrodę bardzo blisko korpusu komórki docelowej.
    2. Stale obserwuj zarejestrowany potencjał za pomocą elektrometru i ustaw ten potencjał na zero mV przed penetracją neuronu.
    3. Wniknij do neuronu za pomocą mikroelektrody, powoli kierując elektrodą wzdłuż jej długiej osi za pomocą manipulatora. Korzystając z funkcji brzęczenia elektrometru, ustaw czas trwania brzęczenia 100 ms, aż do zaobserwowania ujemnego przesunięcia potencjału błony i energicznego impulsu.
  4. Ustaw elektrometr w trybie cęgów prądu nieciągłego (DCC) ≥ 3 kHz, aby jednocześnie rejestrować potencjał membrany i przepuszczać prąd za pomocą pojedynczej mikroelektrody (kompensacja pojemności ustawiona na nieco poniżej dzwonienia, a następnie cofnięta o 10%).
    1. Monitoruj osiadanie elektrody podczas DCC na oscyloskopie.
    2. Wstrzyknij stały prąd -0,1 nA za pomocą iniektora prądu stałego elektrometru na minutę lub dwie, aby ustabilizować nagranie.
  5. Definitywnie zidentyfikuj neuron HN(7) po jego charakterystycznym kształcie kolca i słabej aktywności pękania (Rysunek 1Ci).
  6. Po zakończeniu eksperymentu przeprowadź analizę danych w trybie offline i zapisz wszystkie dane na dysku.

3. Zbuduj HN w czasie rzeczywistym lub inny model neuronu

  1. Tworzenie niestandardowego oprogramowania przy użyciu karty cyfrowego przetwarzania sygnału (DSB; D do A i od A do D) w komputerze stacjonarnym w celu implementacji w czasie rzeczywistym prądów modelu opisanych w2,4 lub różnych prądach modelowych dla innych neuronów lub eksperymentów.
    1. Należy używać równań w stylu Hodgkina-Huxleya, ponieważ są one ogólnie preferowaną metodą przedstawiania prądów modelu.
    2. Zobacz7, aby uzyskać szczegółowy opis implementacji modelu HN w czasie rzeczywistym i dynamicznego zacisku przed dodaniem prądu pompy. Zapoznaj się z sekcją wprowadzającą, aby zapoznać się z opisem prądów, wewnątrzkomórkowego stężenia Na+ i przewodnictwa żywego neuronu HN(7) w modelu HN.

4. Implementacja i zmiana dynamicznych przewodności/prądów cęgowych

  1. Użyj niestandardowego oprogramowania do dynamicznego zacisku dla DSB, aby zaimplementować i zmienić w czasie rzeczywistym dowolny z dostępnych graficznych interfejsów użytkownika (Rysunek 3) (GUI), programowane przewodności i prądy HN w czasie rzeczywistym neuronu HN(7).
    UWAGA: Dla przypomnienia, figure-protocol-1 i figure-protocol-2 to odpowiednio maksymalna przewodność stałego prądu Na+ (I P) i maksymalnego prądu pompy (I pompa).
  2. Użyj pól wprowadzania GUI w oprogramowaniu, aby wprowadzić zmiany, gdy model jest uruchomiony, w figure-protocol-3 (pole PumpMaxL) i figure-protocol-4 (pole GpinHNLive) (Rysunek 3).
    UWAGA: Pola wprowadzania GUI akceptują wpisane wartości, a kroki 0,1 nA są zalecane dla figure-protocol-5 a kroki 1 nS są zalecane dla figure-protocol-6.
    1. Dodaj niewielkie ilości figure-protocol-7 i figure-protocol-8 z dynamicznym zaciskiem, aby ustabilizować pękanie neuronu HN(7), który jest osłabiony przez wyciek wywołany przez mikroelektrodę, jak pokazano na Rysunek 1Cii.
      UWAGA: Ostra penetracja mikroelektrody powoduje uszkodzenie membrany, które wyraża się zwiększoną przewodnością nieszczelności lub zmniejszoną rezystancją wejściową.
    2. Zacznij od dodania wartości figure-protocol-9 0,1-0,2 nA, która uzupełnia wyciek wywołany mikroelektrodą, ale zmniejsza pobudliwość, a następnie stopniowo zwiększaj figure-protocol-10, która zwiększa pobudliwość, aż do regularnego pękania, zwykle przy figure-protocol-11 ~1-4 nS (Rysunek 4A).
  3. Systematycznie zmieniaj te prądy (przyrosty 0,1 nA dla figure-protocol-12 i 1 nS dla figure-protocol-13) do zarejestrowanego neuronu HN(7) za pomocą dynamicznego zacisku (Rysunek 3) i oceń ich wpływ na charakterystykę impulsu: częstotliwość skoków (f: odwrotność średniej interwału międzyskokowego podczas wybuchu), interwał międzyimpulsowy (IBI: czas między ostatnim skokiem w jednej serii a pierwszym impulsem w następnej serii), czas trwania serii (BD: czas między pierwszym skokiem w serii a ostatnim impulsem w serii) i okresem serii (T: czas między pierwszym skokiem w serii a pierwszym skokiem w następnej serii).
    1. Zmień wartości figure-protocol-14 i figure-protocol-15, tak jak w demonstracji wideo, aby zapoznać się z techniką, a następnie wyruszyć w teren.
      1. Przytrzymaj figure-protocol-16 na określonej stałej wartości i przemiataj w krokach co 1 nS w zakresie figure-protocol-17 obsługując regularną aktywność burstingu.
      2. Teraz zwiększ stałą wartość figure-protocol-18 o 0,1 nA i ponownie przejdź przez zakres figure-protocol-19 obsługując regularną aktywność burstingu.
      3. Dla każdej zaimplementowanej pary parametrów zbierz dane zawierające co najmniej 8 impulsów, aby można było dokonać wiarygodnych średnich pomiarów f, IBI, BD i T.
      4. Kontynuuj wymiatanie tak długo, jak długo neuron pozostaje żywotny, co ocenia się na podstawie silnego skoku i stabilnego podstawowego potencjału oscylacji.
      5. Zbierz dane z kilku neuronów (od różnych zwierząt), aby wygenerować wykres złożony (Rysunek 5).

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Modelowanie z dodatkiem Ipump4 przybliżyło wyniki eksperymentów przedstawione w sekcji wprowadzającej i zaczęło wyjaśniać mechanizm pękania wspomagany pompą. Pokazany tutaj model czasu rzeczywistego został dostrojony (figure-results-1 i figure-results-2 wybrane parametry) tak, że wytwarza regularną aktywność rytmiczną mieszczącą się w granicach normalnej aktywności obserwowanej w eksperymentach - f, IBI, BD, T - i kontynuuje taką aktywność, gdy parametry modulowane miomoduliną figure-results-3 (maksymalny prąd pompy) i figure-results-4 (maksymalna przewodność prądu h) są zróżnicowane lub współzmienne w modelu. Wyznaczone wartości parametrów mogą być używane jako zestaw porównawczy lub kanoniczny do modelowania eksperymentów. W tych modelach pompa oscyluje przez cały cykl impulsu jako [Na+]i wokół poziomu bazowego. Pompa I przyczynia się do zakończenia impulsu podczas fazy impulsu, a wytwarzana przez nią hiperpolaryzacja aktywuje Ih podczas IBI; zwróć uwagę na maksymalny poziom Ih bliskiej inicjacji wybuchu (Rysunek 2).

Chociaż model HN w czasie rzeczywistym ma wszystkie zaimplementowane currents2,4 dostępne do dynamicznego zaciskania, tutaj skupiono się na figure-results-5 i figure-results-6, które są dostępne do zmian, gdy model jest uruchomiony w graficznym interfejsie użytkownika dynamicznego zacisku (Rysunek 3). Zacisk dynamiczny pozwala eksperymentatorowi dodawać (lub odejmować z ujemnym figure-results-7 lub figure-results-8) dowolne przewodnictwo lub prąd do neuronu sztucznie, który naśladuje zależność napięcia i jonów rzeczywistego przewodnictwa lub prądu. W ten sposób możliwe jest pełne zbadanie, w jaki sposób określone przewodnictwo/prąd oddziałuje z endogennymi przewodnictwem/prądami wewnątrz komórek (Rysunek 1). Model HN w czasie rzeczywistym wskazuje, że trwały prąd Na+ (IP) w neuronach HN przyczynia się w dużej mierze do wejścia Na+, silnie wpływając na [Na+]i (Rysunek 2), a zatem pompuję. Ponieważ IP jest aktywny przy stosunkowo ujemnych potencjałach błonowych, przeciwstawia się pompowaniu I nawet podczas IBI.

Te obserwacje wskazują, że pouczające jest badanie interakcji między figure-results-9 i figure-results-10 w izolowanych neuronach HN z dynamicznym zaciskiem, jak omówiono wcześniej8,9,10. Eksperymenty te (w toku) są wykonywane z ostrymi zapisami mikroelektrod w pojedynczych, synaptycznie izolowanych neuronach HN(7) (siódmy ganglion odcięty od rdzenia nerwowego). Do tej pory eksperymenty te pokazują, że silne pękanie jest przywracane w tonicznie aktywnych neuronach HN (z powodu penetracji mikroelektrod wprowadzonej nieszczelności) przez jednoczesne dodanie IP i pompy I z dynamicznym zaciskiem (Rysunek 4). Jest to ważna obserwacja wskazująca, że w tych neuronach dostępny jest mechanizm pękania (nawet gdy wyciek jest naruszony), który wynika z interakcji Ipump i IP. Wstępne wyniki wskazują na ich silną skomplikowaną interakcję, którą można zbadać w modelu i eksperymentach (Rysunek 5).

Podsumowując, pompowanie w odpowiedzi na okresowe wzrosty [Na+]i podczas aktywności burst przyczynia się do rytmu burst poprzez zakończenie burstu (zmniejszenie BD). Interakcja pompy IP i I stanowi mechanizm, który jest wystarczający do wspierania endogennej aktywności pękającej; mechanizm ten może przywrócić silne pękanie w interneuronach HN zarejestrowanych wewnątrzkomórkowo w zwoju 7. Interakcja między pompą IP i I przez [Na+]i wpływa na okres impulsu HN w sposób niemonotoniczny i zapewnia niezawodność autonomicznego burstingu. Wnioski te są zgodne z eksperymentami i modelowaniem w systemach kręgowców11,12.

figure-results-11
Rysunek 1: Aktywność elektryczna interneuronu serca pijawki i implementacja pompy I i I P z dynamicznym zaciskiem. (A) Normalna aktywność pękania rejestrowana jednocześnie, zewnątrzkomórkowo (na górze) i wewnątrzkomórkowo (na dole), w biciu serca pijawki HCO z trzeciego zwoju, schemat zarejestrowanych neuronów i ich wzajemnie hamujących połączeń synaptycznych po prawej. (B) Schemat zacisku dynamicznego podczas rejestracji interneuronu HN(7) w izolowanym zwoju 7; należy zauważyć, że nie ma interakcji synaptycznej między dwoma interneuronami HN (7). (Ci) Pęknięcie w interneuronie HN(7) z uszkodzonym przeciekiem. (Cii) Bardziej wytrzymałe pękanie można uzyskać, dodając dynamiczną pompę zaciskową I (figure-results-12 = 0,1 nA), która uzupełnia nieszczelność wywołaną mikroelektrodą, ale obniża pobudliwość, oraz figure-results-13 (1 nS), co zwiększa pobudliwość. Czarne linie przerywane wskazują wartości linii bazowej. Skróty: HN = interneuron serca; HCO = oscylator półśrodkowy; Ipompa = prąd zewnętrzny; IP = stały prąd Na+; figure-results-14 = maksymalny prąd pompy Na+/K+; figure-results-15 = maksymalna przewodność stałego prądu Na+; Vm = potencjał błonowy; [Nie +]i = stężenie wewnętrzne Na+. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-16
Rysunek 2: Model pojedynczego interneuronu HN pokazujący ślady potencjału błonowego (Vm), Ih, Ipump, [Na+]i, iI P. Prądy hiperpolaryzacyjne na zewnątrz są ujemne, a prądy depolaryzujące do wewnątrz są dodatnie. Czarne linie przerywane wskazują wartości linii bazowej. Skróty: HN = interneuron serca; Ipompa = prąd zewnętrzny; IP = stały prąd Na+; figure-results-17 = maksymalny prąd pompy Na+/K+; Ih = prąd wewnętrzny aktywowany hiperpolaryzacją; figure-results-18 = maksymalna przewodność stałego prądu Na+; figure-results-19 = maksymalna przewodność prądu wewnętrznego aktywowanego hiperpolaryzacją; Vm = potencjał błonowy; [Nie +]i = stężenie wewnętrzne Na+. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-20
Rysunek 3: Graficzny interfejs użytkownika modelu interneuronu serca (HN) w czasie rzeczywistym i dynamicznego zacisku zaimplementowany na cyfrowej płytce przetwarzania sygnału. Lewy górny róg: Czerwone pola matematyczne to pola parametrów określane przez użytkownika dla modelu w czasie rzeczywistym, podczas gdy pola Blue Live to pola parametrów określane przez użytkownika używane w zacisku dynamicznym. El = potencjał odwrócenia prądu upływu; Gl = przewodność nieszczelności; Gh = maksymalna przewodność prądu h; Gp = P prąd maksymalna przewodność; GCaS = maksymalna przewodność powolnego prądu wapniowego; PumpMax = maksymalny prąd pompy; [GSyn2 maksymalne przewodnictwo synaptyczne do odpowiedniego neuronu; Próg przekroczenia kolca ThreshSyn2 do pośredniczenia w potencjale synaptycznym - te używane do tworzenia hybrydowego (żywego/modelowego) oscylatora pół-środkowego, nie zilustrowanego tutaj.]. Lewy dolny róg dla zacisku dynamicznego. Po lewej stronie znajduje się 5 obliczonych wartości dynamicznych zmiennych cęgowych: Ipompa = prąd wtryskiwanej pompy; Ih = wstrzyknięty prąd h (nie używany tutaj); IP = wstrzykiwany prąd P; NaI = obliczone wewnętrzne stężenie Na+; ENa = obliczony potencjał odwrócenia sodu. Lewy dolny róg dla zacisku dynamicznego. Po prawej stronie obliczanych zmiennych znajduje się 6 pól parametrów określonych przez użytkownika: GNa = zakładane endogenne szybkie maksymalne wykorzystanie przewodności sodu do obliczenia strumienia Na+ związanego z potencjałami czynnościowymi; PumpMaxL = maksymalny prąd pompy, który ma być wtryskiwany przez zacisk dynamiczny; Naih patrz równanie (2); Gh = maksymalna przewodność w celu określenia prądu h, który ma być wstrzykiwany przez cęgi dynamiczne; Gp = zakładana endogenna maksymalna przewodność prądu P używana do obliczenia strumienia Na+ związanego z endogennym prądem P; GpinHNLive = maksymalna przewodność w celu wyznaczenia prądu P, który ma być wstrzykiwany przez cęgi dynamiczne. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-21
Rysunek 4: Dynamiczna analiza zacisków niezależnych pęknięć HN(7). Regulacja w górę figure-results-22 od (A) 4.0 nS do (B) 9.0 nS spowalnia niezależny rytm wybuchu HN. Ślady eksperymentalne wskazują na rytmiczne pękanie w izolowanym neuronie HN(7) z dynamicznym zaciskiem. Zakresy oscylacji [Na+]i i Vm zwiększają się wraz z regulacją w górę figure-results-23. Ślady od góry do dołu: zarejestrowane Vm, wstrzyknięta I pompa, obliczone [Na+]i i wstrzyknięte IP. Czarne linie przerywane wskazują wartości linii bazowej. Skróty: HN = interneuron serca; Ipompa = prąd zewnętrzny; IP = stały prąd Na+; figure-results-24 = maksymalny prąd pompy Na+/K+; figure-results-25 = maksymalna przewodność stałego prądu Na+; Vm = potencjał błonowy; [Nie +]i = stężenie wewnętrzne Na+. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-26
Rysunek 5: Dynamiczna analiza zacisków niezależnych pęknięć HN(7). Regulacja w górę figure-results-27 ma tendencję do zmniejszania się, po czym następuje zwiększony okres wybuchu HN. W indywidualnych eksperymentach (punkty połączone liniami) za pomocą dynamicznego zacisku, figure-results-28 wartości były przemiatane, podczas gdy figure-results-29 było utrzymywane na stałym poziomie. Kolory reprezentują różne stałe poziomy dodanych figure-results-30 używane w różnych eksperymentach. Skróty: HN = interneuron serca; figure-results-31 = maksymalny prąd pompy Na+/K+; figure-results-32 = maksymalna przewodność stałego prądu Na+. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Modelowanie, zacisk dynamiczny i wynikające z niego analizy są użytecznymi technikami do badania, w jaki sposób poszczególne i grupy przewodnictwa/prądów jonowych przyczyniają się do aktywności elektrycznej neuronów (Rysunek 1, Rysunek 2, Rysunek 4 i Rysunek 5). Zastosowanie tych technik pokazuje, w jaki sposób prąd pompy Na+/K+ (pompa I) oddziałuje z prądami bramkowanymi napięciem, w szczególności z trwałym prądem Na+ (I P), aby promować solidne pękanie w rdzeniu generatora wzorców bicia serca pijawki. Łącząc dynamiczne eksperymenty cęgowe i modelowanie, możliwe jest testowanie modeli bardziej bezpośrednio niż jest to możliwe przy użyciu zwykłych technik zapisu napięcia i cęgów prądowych. Wyniki uzyskane z eksperymentów z zaciskiem dynamicznym (rysunek 5) zostaną wykorzystane do dalszego udoskonalenia modelu HN. Podstawowa metoda dynamicznego zaciskania zademonstrowana tutaj może być dostosowana tak, aby odzwierciedlała właściwości dowolnego badanego neuronu, jeśli można określić matematyczny model prądów neuronalnych za pomocą eksperymentów z cęgami napięciowymi.

Pomyślne zakończenie eksperymentów typu pokazanego tutaj wymaga starannego nabicia HN lub innego neuronu przy użyciu ostrej mikroelektrody, ponieważ silne pękanie jest ograniczane przez penetrację elektrody1. (Techniki rejestrowania łatek w całych komórkach, które minimalizują wprowadzony wyciek, mają również zastosowanie do innych neuronów, ale nie działają dobrze na neuronach pijawek). Bardzo ważne jest, aby przebicie neuronu HN spowodowało minimalne uszkodzenie neuronu (dodatkowy wyciek), a rezystancja wejściowa powinna być monitorowana i musi mieścić się w zakresie 60-100 MOhms dla udanych eksperymentów4.

Zacisk dynamiczny jest potężną techniką, ale ma ograniczenia narzucone przez geometrię neuronalną, ponieważ sztuczne przewodnictwa są realizowane w miejscu elektrody rejestrującej - zwykle w ciele komórki - a nie w miejscu, w którym prądy generujące rytm są zwykle zlokalizowane 5,6,10. W neuronach HN pijawek ciało komórki znajduje się elektrycznie blisko strefy integracji (głównego neurytu) neuronu, w której zlokalizowane są najbardziej aktywne prądy i inicjowane są kolce.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Christianowi Erxlebenowi za wstępne eksperymenty z dynamicznym zaciskiem na neuronach HN(7), które wykazały ich zdolność do pękania. Angela Wenning pomogła w eksperymentach, udzielając porad ekspertów. Dziękujemy NIH za finansowanie tych prac poprzez Grant 1 R21 NS111355 dla GSC i RLC.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
ZWIERZĘTA
Hirudo verbanaLeech.com, https://www.leech.com/collections/live-leechesżywe pijawki 2-3 gramy
CHEMIKALIA
SZTUCZNA WODA
CaCl2Sigma AldrichC5670-100G1,8 mM dodać jako ostatni po dostosowaniu pH
glukozySigmaAldrich G7021-100G10 mM
HEPESSigma AldrichH4034-100G10 mM
Instant Ocean (sól morska)Spectrum Brands Inc., Madison, WI0,05% (w/v) rozcieńczony w wodzie dejonizowanej
KClSigma AldrichP9333-500G4 mM
NaClSigma AldrichS7653-250G115 mM
NaOH 0,1 N RoztwórSigma Aldrich2105-50MLDostosuj do pH 7,4 za pomocą NaOH
mocne>MIKROELEKTRODY
K AcetatSigma AldrichP1190-100G2 M
KClSigma AldrichP9333-500G20 mM
sól fizjologiczna
SPRZĘT
#5 KleszczeNarzędzia do nauki precyzyjnej Dumont11251-30 LUB 11251-20Do ogólnego rozwarstwiania pijawek
AxoClamp 2A/2B Elektrometr DCCAxon Instruments Urządzenia molekularne2A/2BDo rejestracji potencjału błony neuronalnej i nieciągłego cęgów prądowych
żywicaDow Sylguard170Linie Ogólne naczynie preparacyjne
Szkło kapilarne 1 mm średnica zewnętrzna, 0,75 mm średnica wewnętrznaA-M Systems615000Do wytwarzania ostrych mikroelektrod
Przezroczysta żywicaDow Sylguard184Lines Szalka Petriego służąca do montażu ganglionu do elektrofizjologii
Kondensor ciemnego polaNikonDry 0,95-0,80 MBL 1210Do oświetlania preparatu ganglionu podczas nabijania komórki
Digidata 1440AAxon CNS Molecular Devices1440AWykonuje pomiary od A do D i od D do A w celu akwizycji danych i stymulacji podczas elektrofizjologii Cyfrowa
płytka przetwarzania sygnałudSpaceCLP1104Nasze oprogramowanie implementuje wszystkie przewodności/prądy w naszym modelu neuronu HN na płycie kontrolera PPC DS1103 dSPACE w czasie rzeczywistym z częstotliwością 20 kHz za pomocą graficznego interfejsu użytkownika ControlDesk (dSPACE, Paderborn, Niemcy)9. 
Falming/Brown Microelectrode PullerSutter InstrumentsP-97Do wytwarzania ostrych mikroelektrod
Oświetlacz o wysokiej intensywności Fiber-LiteDolan Jenner Industries170DDo oświetlania ogólnej sekcji i do oświetlania preparatu ganglionu podczas wbijania komórek
Wzmacniacz czołowy do AxoClamp 2AAxon InstrumentsHS-2A Wzmocnienie: 0,1LUTeraz część Molecular Devices do rejestracji potencjału błony neuronalnej i nieciągłego cęgowania prądu
ŚwiatłowódDolan Jenner IndustriesRev R 38 08 3729107Do oświetlania ogólnego rozwarstwienia oraz do oświetlania preparatu ganglionu podczas napalania komórek
MikromanipulatorSutter InstrumentsMPC-385Mikromanipulator do nabijania komórek za pomocą mikroelektrod
Mikromanipulator kontrolerSutter InstrumentsMPC-200Steruje mikromanipulatorami do nabijania komórek za pomocą mikroelektrod
Szpilki MinutenBioQuipŚrednica 0,15 mm 1208SANależy skrócić przez curtting do ~5 mm
Optyczna płytka stykowa 3' x 5' x 8"NewportPrzestarzałyZ 4 poniższymi izolatorami pneumatycznymi używanymi do budowy wolnej od wibracji przestrzeni roboczej do elektrofizjologii
OscyloskopHAMEG InstrumentsHM303-6Do monitorowania osadzania elektrod podczas DCC
Nożyczki sprężynowe Pascheff-WolffMoriaDostarczone przez Fine Science Tools (Foster City, CA) katalog # 15371-92
pClamp 9 OprogramowanieAxon Instruments9Teraz część Moleculear Devices wykorzystuje Digidata 1440 do akwizycji danych i stymulacji podczas elektrofizjologii
Izolatory pneumatyczne 28"NewportPrzestarzałyZ optyczną płytką stykową służącą do budowy wolnej od wibracji przestrzeni roboczej do elektrofizjologii
Oprogramowanie Simulink / MATLABMathWorks2006 (przestarzałe)Implementuje dynamiczny zacisk na płytce cyfrowego przetwarzania sygnału
Mikroskop stereoskopowyWildM5A10x Okulary używane do preparowania pijawki oraz usuwania i usuwania zwojów nerwowych
SteromikroskopDzikieM520x używane w stacji elektrofizjologicznej do wizualizacji neuronu do penetracji mikroelektrod
Nożyczki sprężynowe Student VannasNarzędzia do nauki91500-09Do ogólnego rozwarstwiania pijawek
W STAWIE< okulary

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cymbalyuk, G. S., Gaudry, Q., Masino, M. A., Calabrese, R. L. Bursting in leech heart interneurons: cell-autonomous and network-based mechanisms. Journal of Neuroscience. 22, 10580-10592 (2002).
  2. Hill, A. A., Lu, J., Masino, M. A., Olsen, O. H., Calabrese, R. L. A model of a segmental oscillator in the leech heartbeat neuronal network. Journal of Computational Neuroscience. 10, 281-302 (2001).
  3. Tobin, A. E., Calabrese, R. L. Myomodulin increases Ih and inhibits the NA/K pump to modulate bursting in leech heart interneurons. Journal of Neurophysiology. 94, 3938-3950 (2005).
  4. Kueh, D., Barnett, W. H., Cymbalyuk, G. S., Calabrese, R. L. Na(+)/K(+) pump interacts with the h-current to control bursting activity in central pattern generator neurons of leeches. eLife. 5, 19322(2016).
  5. Sharp, A. A., O'Neil, M. B., Abbott, L. F., Marder, E. Dynamic clamp: computer-generated conductances in real neurons. Journal of Neurophysiology. 69, 992-995 (1993).
  6. Prinz, A. A., Abbott, L. F., Marder, E. The dynamic clamp comes of age. Trends in Neuroscience. 27, 218-224 (2004).
  7. Barnett, W., Cymbalyuk, G. Hybrid systems analysis: real-time systems for design and prototyping of neural interfaces and prostheses. Biohybrid systems: nerves, interfaces, and machines. Jung, R. , Wiley VCH Verlag. Weinheim. 115-138 (2011).
  8. Sorensen, M., DeWeerth, S., Cymbalyuk, G., Calabrese, R. L. Using a hybrid neural system to reveal regulation of neuronal network activity by an intrinsic current. Journal of Neuroscience. 24, 5427-5438 (2004).
  9. Olypher, A., Cymbalyuk, G., Calabrese, R. L. Hybrid systems analysis of the control of burst duration by low-voltage-activated calcium current in leech heart interneurons. Journal of Neurophysiology. 96, 2857-2867 (2006).
  10. Calabrese, R. L., Prinz, A. A. Realistic modeling of small neuronal networks. Computational Modeling Methods for Neuroscientists. DeSchutter, E. , MIT Press. MA, USA. 285-316 (2010).
  11. Rybak, I. A., Molkov, Y. I., Jasinski, P. E., Shevtsova, N. A., Smith, J. C. Rhythmic bursting in the pre-Bötzinger complex: mechanisms and models. Progress in Brain Research. 209, 1-23 (2014).
  12. Picton, L. D., Nascimento, F., Broadhead, M. J., Sillar, K. T., Miles, G. B. Sodium pumps mediate activity-dependent changes in mammalian motor networks. Journal of Neuroscience. 37, 906-921 (2017).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Sprostowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Contribution of the Na+/K+ Pump to Rhythmic Bursting, Explored with Modeling and Dynamic Clamp Analyses
Posted by JoVE Editors on 7/28/2021. Citeable Link.

An erratum was issued for: Contribution of the Na+/K+ Pump to Rhythmic Bursting, Explored with Modeling and Dynamic Clamp Analyses. An author name was updated.

The name of the first author was updated from:

Ricardo Javier Erazo Toscano

to:

Ricardo Javier Erazo-Toscano

Tagi

trwa y pr d sodowyinterneuron sercowymodelowanie obliczeniowezwoje pijawkiwewn trzkom rkowy s dpotencja b onowyzako czenie serii wy adowa

Powiązane artykuły