Artykuł metodologiczny

Model retinopatii indukowanej tlenem w chorobach niedokrwiennych siatkówki u gryzoni

8.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61482

⸱

16 września 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Faculty of Medicine and Health Technology, Tampere University & Tampere University Hospital, 2Experimentica Ltd, 3Eye Centre, Tampere University Hospital

W tym artykule

Podsumowanie

Retinopatia indukowana tlenem (OIR) może być używana do modelowania chorób niedokrwiennych siatkówki, takich jak retinopatia wcześniaków i proliferacyjna retinopatia cukrzycowa, a także służyć jako model dla badań potwierdzających słuszność koncepcji w ocenie leków antyangiogennych w chorobach neowaskularnych. OIR indukuje solidną i powtarzalną neowaskularyzację w siatkówce, którą można określić ilościowo.

Streszczenie

Jednym z powszechnie używanych modeli retinopatii niedokrwiennych jest model retinopatii indukowanej tlenem (OIR). W tym miejscu opisujemy szczegółowe protokoły indukcji modelu OIR i jego odczytów zarówno u myszy, jak i szczurów. Neowaskularyzacja siatkówki jest indukowana w OIR poprzez wystawienie młodych gryzoni na hiperoksję (myszy) lub naprzemienne poziomy hiperoksji i niedotlenienia (szczury). Podstawowymi odczytami tych modeli są wielkość obszarów neowaskularnych (NV) i jałowych (AVA) w siatkówce. Ten przedkliniczny model in vivo może być wykorzystany do oceny skuteczności potencjalnych leków antyangiogennych lub do zbadania roli określonych genów w angiogenezie siatkówki przy użyciu genetycznie zmodyfikowanych zwierząt. Model ma pewne specyficzne dla odkształcenia i dostawcy różnice w indukcji OIR, które powinny być brane pod uwagę podczas projektowania eksperymentów.

Wprowadzenie

Wiarygodne i powtarzalne modele eksperymentalne są potrzebne do badania patologii stojącej za angiogennymi chorobami oczu i do opracowania nowych metod leczenia tych wyniszczających chorób. Patologiczna angiogeneza jest cechą charakterystyczną wysiękowego zwyrodnienia plamki żółtej związanego z wiekiem (AMD) oraz wielu chorób niedokrwiennych siatkówki, w tym retinopatii wcześniaków (ROP), proliferacyjnej retinopatii cukrzycowej (PDR) i niedrożności żył siatkówki (RVO)1,2,3,4. Siatkówki ludzkie i gryzonia podlegają podobnemu schematowi rozwoju, ponieważ zarówno siatkówka ludzka, jak i gryzoń są jednymi z ostatnich tkanek, które są unaczynione. Zanim unaczynienie siatkówki całkowicie się rozwinie, siatkówka otrzymuje składniki odżywcze z naczynia szklistego, które z kolei cofa się, gdy unaczynienie siatkówki zaczyna się rozwijać1,2. U człowieka rozwój naczyń krwionośnych siatkówki kończy się przed urodzeniem, podczas gdy u gryzoni wzrost unaczynienia siatkówki następuje po urodzeniu. Ponieważ rozwój naczyniowy siatkówki zachodzi po urodzeniu u gryzoni, stanowi idealny system modelowy do badania angiogenezy2,3. Nowonarodzone gryzonie mają beznaczyniową siatkówkę, która rozwija się stopniowo, aż do osiągnięcia pełnego rozwoju siatkówki naczyniowej pod koniec trzeciego tygodnia po urodzeniu4. Rosnące naczynia krwionośne nowonarodzonych myszy są plastyczne i ulegają regresji podczas bodźca hiperoksji5.

ROP jest główną przyczyną ślepoty dziecięcej w krajach zachodnich, ponieważ dotyka prawie 70% wcześniaków z masą urodzeniową poniżej 1,250 g6,7. ROP występuje u wcześniaków, które rodzą się, zanim naczynia siatkówki zakończą swój normalny wzrost. ROP postępuje w dwóch fazach: w fazie I przedwczesny poród opóźnia wzrost naczyń siatkówki, podczas gdy po fazie II niedokończone unaczynienie rozwijającej się siatkówki powoduje niedotlenienie, które indukuje ekspresję angiogennych czynników wzrostu, które stymulują nowy i nieprawidłowy wzrost naczyń krwionośnych8. Model OIR jest szeroko stosowanym modelem do badania patofizjologii ROP i innych retinopatii niedokrwiennych, a także do testowania nowych kandydatów na leki2,3,9. Jest powszechnie uważany za powtarzalny model do przeprowadzania badań potwierdzających słuszność koncepcji potencjalnych leków antyangiogennych stosowanych w chorobach oczu i innych niż oczne. Dwa modele gryzoni, tj. OIR myszy i szczura, różnią się indukcją modelu i fenotypem choroby. Model szczurzy naśladuje fenotyp ROP dokładniej, ale model mysi zapewnia bardziej solidny, szybki i powtarzalny model neowaskularyzacji siatkówki (NV). W modelu mysim NV rozwija się do centralnej siatkówki. Ten patologiczny odczyt jest ważny w badaniach skuteczności farmakologicznej w przypadku wielu retinopatii niedokrwiennych, takich jak PDR, RV i wysiękowe AMD, a także w chorobach angiogennych nieocznych, takich jak rak. Co więcej, dostępność myszy zmanipulowanych genetycznie (transgenicznych i nokautujących) sprawia, że mysi model OIR jest bardziej popularną opcją. Jednak ani mysi, ani szczurzy model OIR nie powoduje zwłóknienia siatkówki, które jest typowe dla chorób ludzi.

Zrozumienie, że wysoki poziom tlenu przyczynia się do rozwoju ROP w latach 50. XX wieku10,11 doprowadziło do opracowania modeli zwierzęcych. Pierwsze badania nad wpływem tlenu na unaczynienie siatkówki przeprowadzono w 1950 roku12,13,14 i do lat 90. XX wieku było wiele udoskonaleń modelu OIR. Badania przeprowadzone przez Smitha i wsp. w 1994 r. ustanowiły standard dla obecnego mysiego modelu OIR, który oddziela hialoidopatię od retinopatii15. Szerokie zastosowanie metody ilościowego oznaczania zaniku naczyń krwionośnych i patologicznego NV przez Connora i in. (2009) jeszcze bardziej zwiększyło jej popularność16. W tym modelu myszy umieszcza się w 75% tlenu (O2) przez 5 dni w P7, a następnie 5 dni w warunkach normoksyjnych. Hiperoksja od P7 do P12 powoduje regresję unaczynienia siatkówki w centralnej siatkówce. Po powrocie do warunków normoksyjnych siatkówka staje się niedotleniona (Ryc. 1A). Ze względu na bodźce niedotlenienia beznaczyniowej centralnej siatkówki, niektóre naczynia krwionośne siatkówki kiełkują w kierunku ciała szklistego, tworząc NV przesiatkowe, zwane kępkami przesiatkówkowymi2,3. Te kępki są niedojrzałe i hiperprzepuszczalne. Ilość NV osiąga szczyt na poziomie P17, po czym ulega regresji. Siatkówka jest w pełni rewaskularyzowana, a NV jest w pełni regresywna przez P23 - P25 (Rysunek 2A)2,3.

Model OIR szczurów (wykorzystujący różne poziomy O2) został po raz pierwszy opisany w latach 90-tych, pokazując, że różne poziomy O2 na poziomie 80% i 40% powodują bardziej wyraźne NV niż poniżej 80% O2 stała ekspozycja17. Później odkryto, że model przerywanej hipoksji, w którym O2 jest cyklicznie przenoszony od hiperoksji (50%) do hipoksji (10-12%), powoduje jeszcze więcej NV niż model 80/40% O218. W modelu 50/10% młode szczurów są narażone na działanie 50% przez 24 godziny, a następnie 24 godziny w 10% O2. Cykle te są kontynuowane do P14, kiedy to młode szczurów wracają do warunków normoksyjnych (Rysunek 1B). Podobnie jak u pacjentów z ROP, w modelu szczurzym obszary jałowe rozwijają się na obrzeżach siatkówki z powodu niedojrzałego splotu naczyniowego siatkówki (Ryc. 3).

W obu modelach, głównymi parametrami, które są zazwyczaj określane ilościowo, są rozmiar AVA i NV. Parametry te są zwykle analizowane z płaskich mocowań siatkówki, w których komórki śródbłonka są oznaczone4,16. Wcześniej ilość NV przesiatkowego oceniano na podstawie przekrojów siatkówki, licząc jądra komórek krwionośnych lub naczyniowych rozciągających się do ciała szklistego powyżej wewnętrznej błony granicznej. Głównym ograniczeniem tego podejścia jest to, że nie jest możliwe ilościowe określenie AVA.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Opisany tutaj protokół został zatwierdzony przez Narodową Komisję Etyki Zwierząt Finlandii (numer protokołu ESAVI/9520/2020 i ESAVI/6421/04.10.07/2017).

1. Zwierzęta doświadczalne i mysie indukcja modelu OIR

UWAGA: Użyj zwierząt kojarzonych w czasie, np. powszechnie używanych myszy C57BL/6J, aby uzyskać młode urodzone tego samego dnia. Stosować matki zastępcze, np. matki laktacyjne szczepu 129 (129S1/SvImJ lub 129S3/SvIM), do karmienia młodych w trakcie i po indukcji hiperoksji. Alternatywnie upewnij się, że dostępne są dodatkowe matki laktacyjne na wypadek, gdyby matki karmiące musiały zostać wymienione z powodu wyczerpania. Ogranicz wielkość miotu do 6-7 młodych na każdą matkę w przypadku korzystania z myszy/matek C57BL/6J (jeśli mioty są większe, młode mają zwykle ograniczony przyrost masy ciała)16.

  1. Zapisać masę ciała zwierząt przed i po indukcji hiperoksji oraz w momencie składania ofiary.
  2. Upewnij się, że na dnie klatki jest wystarczająca ilość jedzenia, aby tamy miały łatwy dostęp do jedzenia.
  3. Dodaj wapno sodowane z kolorowym wskaźnikiem na dno komory, aby wchłonąć nadmiar CO2 , gdy system filtracji nie jest używany.
  4. Monitoruj wilgotność i temperaturę wewnątrz komory i utrzymuj wilgotność w zakresie od 40 do 65%. W razie potrzeby zwiększ wilgotność w komorze, umieszczając na dnie komory naczynia z wodą (np. szalki Petriego).
  5. Skalibruj czujnikO2 przy 100%O2 i normalnym powietrzu w pomieszczeniu.
  6. Umieść myszy P7 w komorze i ustaw poziom O2 na 75%. Trzymaj myszy w komorze przez 5 dni, do P12. Unikaj otwierania komory podczas indukcji hiperoksji. Sprawdź ciśnienie gazu w butli O2 i wymień butlę w razie potrzeby. Monitoruj zwierzęta podczas indukcji.
  7. Wyjmij klatki dla myszy z komory i zważ wszystkie szczenięta. Pogrupuj młode na podstawie wagi, tak aby każda grupa eksperymentalna miała podobny rozkład masy u młodych.

2. Zwierzęta doświadczalne i indukcja modelu OIR szczurów (przy użyciu systemu półzamkniętego)

UWAGA: Użyj zwierząt kojarzonych w czasie, aby młode urodziły się tego samego dnia. W przypadku OIR szczurów należy użyć zwiększonej wielkości miotu, około 18 młodych / matkę, aby uzyskać wystarczającą indukcję NV w modelu szczurzym. Połącz młode z kilku miotów, aby uzyskać wystarczającą liczbę młodych do każdego miotu.

  1. Zapisać masę ciała zwierząt przed i po indukcji oraz w momencie składania ofiary.
  2. Upewnij się, że na dnie klatki jest wystarczająca ilość jedzenia, aby tamy miały łatwy dostęp do jedzenia.
  3. Dodaj wapno sodowane z kolorowym wskaźnikiem na dno komory, aby wchłonąć nadmiar CO2, gdy system filtracji nie jest używany.
  4. Monitoruj wilgotność i temperaturę wewnątrz komory. Wchłoń dodatkową wilgoć (generowaną przez wiele szczurów), dodając żel krzemionkowy na dnie komory.
  5. Skalibruj czujnikO2 przy 100% N2 i normalnym powietrzu w pomieszczeniu.
  6. Umieść szczury w komorze w temperaturze P0 (kilka godzin po urodzeniu). Ustaw poziomO2 na 50% i podłącz butlęO2 do komory na 24 godziny. Następnie przełącz ustawienia na 10%O2 i podłącz butlę z azotem (N2) do komory na 24 godziny. Kontynuuj 24-godzinną jazdę na rowerze między 50% a 10% poziomemO2 przez 14 dni.
  7. Monitoruj zużycie gazu i dobrostan zwierząt podczas badania. Otwórz komorę podczas wymiany między 50/10%O2 i w razie potrzeby dodaj więcej jedzenia i wody. Zmień klatki zwierząt na czyste podczas indukcji.
  8. Wyjmij klatki dla szczurów z komory i zważ wszystkie młode. Pogrupuj młode na podstawie masy, tak aby każda grupa doświadczalna miała podobny rozkład masy w młodych.

3. Podawanie leków (opcjonalnie)

UWAGA: Powszechnie stosowaną drogą podawania leków w OIR jest leczenie doszklistkowe (ivt), w P12-P14 dla myszy i w P14 dla szczurów. Określ dzień leczenia na podstawie konfiguracji eksperymentalnej. Gdy w eksperymentach wykorzystuje się wiele miotów młodych, należy podzielić grupy leczone tak, aby zawierały zwierzęta ze wszystkich miotów. Najlepiej, wstrzyknąć lek tylko do jednego oka i zachować oko przeciwległe jako kontrolę.

  1. Zważyć zwierzęta i narysować znaki identyfikacyjne na ogonie i/lub uchu.
  2. Znieczulić zwierzę albo znieczuleniem do wstrzykiwań (na przykład mieszanina ketaminy i medetomidyny, 30 mg/kg i 0,4 mg/kg dla myszy), albo znieczuleniem wziewnym (izofluran w stężeniu 2-3,5% izofluranu i przepływie powietrza 200-350 ml/min). Sprawdź głębokość znieczulenia, ściskając palce u stóp. Podczas zabiegu należy trzymać zwierzę na poduszce grzewczej.
  3. W celu znieczulenia miejscowego nałóż kroplę środka przeciwbólowego na powiekę. Ostrożnie otwórz powiekę kleszczami przed wykonaniem IVT, ponieważ myszy i szczury otwierają oczy wokół P14. Nanieś kroplę środka przeciwbólowego (np. chlorowodorku oksybuprokainy) na rogówkę.
  4. Zastosuj kroplę jodu przed wykonaniem iniekcji IVT.
  5. Do iniekcji dożylnej należy użyć szklanej strzykawki z dołączoną igłą 33-34 G. Dociśnij powieki w dół i chwyć gałkę oczną kleszczami. Wstrzyknięcie należy wykonać z tyłu rąbka, pod kątem około 45° igły skierowanej w stronę nerwu wzrokowego.
  6. Należy unikać wstrzykiwania więcej niż 1,0 μl do przestrzeni doszklistkowej. Trzymaj igłę na miejscu przez 30 s po wstrzyknięciu leku, aby uniknąć refluksu wstrzykniętego roztworu.
  7. Zbadaj oko (np. za pomocą oftalmoskopu) pod kątem jakichkolwiek powikłań, takich jak krwotoki lub uszkodzenie siatkówki, po wyjęciu igły. Po wstrzyknięciu nałóż maść z antybiotykiem na rogówkę.
    UWAGA: Objętość wstrzyknięcia ivt dla myszy powinna wynosić 0,5 – 1,0 μl.
  8. Odwróć znieczulenie (na przykład za pomocą α2-antagonisty medetomidyny (2,5 mg/kg) i wróć do klatki. Ściółkę należy przechowywać normalnie do końca badania.

4. Obrazowanie in vivo i elektroretinografia (opcjonalnie)

  1. W razie potrzeby należy przeprowadzić obrazowanie in vivo na żywych zwierzętach w okresie obserwacji, aby zarejestrować zmiany, które rozwijają się w siatkówce podczas odpowiedzi angiogennej. Na przykład wykonaj angiografię fluoresceinową (FA) lub skaningową laserową mikroskopię konfokalną 19, aby uwidocznić układ naczyniowy (Ryc. 4). Użyj optycznej tomografii koherentnej w domenie spektralnej (SD-OCT) do wizualizacji warstw siatkówki in vivo (Rysunek 4).
  2. W razie potrzeby zbadaj zmiany funkcjonalne w różnych populacjach komórek siatkówki po indukcji OIR za pomocą elektroretinografii (ERG) (Figura 5).

5. Pobieranie tkanek i przygotowanie płaskich mocowań siatkówki

UWAGA: Zbierz tkanki zgodnie z pożądaną hipotezą badawczą. W przypadku myszy należy pobrać próbki na przykład w punkcie P12 (w celu zbadania zanikania naczyń krwionośnych po fazie hiperoksycznej) lub w okresie niedotlenienia (P13-P17). Zbierz próbki OIR myszy w P17, który jest najczęstszym punktem czasowym pobierania próbek, aby wykryć pik ilości NV. W OIR szczurów zbierz próbki w P18-P21, aby zaobserwować największą ilość NV (Rysunek 3).

  1. Zważyć zwierzęta przed pobraniem próbek.
  2. Aby oznaczyć unaczynienie siatkówki, głęboko znieczulone zwierzęta można perfundować przezsercowo za pomocą dekstranu FITC. (Alternatywnie, wybarwić płaskie mocowania siatkówki izolektyną później).
  3. Uśmiercać zwierzęta za pomocą przedawkowania leków znieczulających (na przykład mieszaniny ketaminy i medetomidyny, 300 mg/kg i 4 mg/kg w przypadku myszy) lub wdychania CO2 .
  4. Zbierz oczy zwierząt, chwytając za gałkę oczną zakrzywionymi kleszczami, przetnij tkankę wokół oczu i wyjmij oko z orbity.
  5. Inkubować gałki oczne w świeżo przygotowanym, przefiltrowanym 4% paraformaldehydzie (w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami, PBS) przez 1-4 godziny. Usunąć utrwalacz i przemyć gałki oczne 3 x 10 min PBS. Siatkówki należy natychmiast wyciąć lub przechowywać je w PBS w temperaturze +4 °C.
    UWAGA: Paraformaldehyd jest toksyczny przez drogi oddechowe, w kontakcie ze skórą i po połknięciu. Prosimy o zapoznanie się z kartą charakterystyki przed rozpoczęciem pracy z nim.
    UWAGA: Nie należy wywierać nacisku na gałkę oczną podczas pobierania próbek lub jakiejkolwiek fazy przetwarzania tkanki, aby uniknąć odwarstwienia siatkówki, jeśli wykonywane są przekroje poprzeczne z całych gałek ocznych.
  6. Przygotuj płaskie mocowania siatkówki, aby określić ilościowo ilość NV i wielkość AVA. Alternatywnie, przetwórz gałki oczne/siatkówki do histologii lub analizy RNA lub białka. Wypreparuj siatkówkę pod mikroskopem stereoskopowym za pomocą mikronożyczek i kleszczy.
    1. Umieść gałkę oczną w PBS, aby była wilgotna i nakłuj gałkę oczną na rąbku za pomocą igły (23G) i przetnij wokół rąbka zakrzywionymi mikronożyczkami, aby usunąć tęczówkę i rogówkę.
    2. Ostrożnie umieść końcówkę nożyczek między twardówką a siatkówką i przetnij twardówkę w kierunku nerwu wzrokowego. Zrób to samo z drugą stroną gałki ocznej i ostrożnie przetnij/rozerwij twardówkę, aż miseczka siatkówki zostanie odsłonięta. Wyciągnij soczewkę z miseczki siatkówki i dodaj PBS do miseczki.
    3. Usuń wszystkie naczynia szkliste, ciało szkliste i zanieczyszczenia, nie uszkadzając siatkówki. Umyj siatkówkę, dodając PBS do miseczki siatkówki. Wykonaj cztery nacięcia (na godzinie 12, 3, 6 i 9) siatkówki prostymi mikronożyczkami, aby uzyskać strukturę przypominającą kwiat. Opcjonalnie wykonaj nacięcia ostrzem chirurgicznym przed zamontowaniem próbek. Podnieś siatkówkę za pomocą miękkiego pędzla do dołka w celu zabarwienia.
  7. Oznaczyć układ naczyniowy siatkówki za pomocą izolektyny B4, która barwi powierzchnię komórek śródbłonka (jeśli zwierzęta nie były perfundowane dekstranem FITC). Inkubować siatkówki w buforze blokującym (10% NGS + 0,5% Triton w TBS) przez 1 godzinę i przemywać 1% NGS + 0,1% Triton w TBS przez 10 minut. Inkubować siatkówki z fluorescencyjnym barwnikiem sprzężonym z izolektyną B4 (5-10 μg / ml) w 1% NGS + 0,1% Triton w TBS przez noc w temperaturze +4 °C, chroniąc przed światłem.
    UWAGA: W razie potrzeby oznacz inne komórki, takie jak komórki zapalne i perycyty, za pomocą specyficznych przeciwciał.
  8. Przemyj siatkówki 3x przez 10 minut 1% NGS + 0,1% Triton w TBS i unieś siatkówki na mikroskopijnym szkiełku, wewnętrzną siatkówką skierowaną do góry. Ostrożnie rozprowadź siatkówkę za pomocą miękkiego pędzla i usuń wszelkie pozostałe naczynia hialoidalne lub zanieczyszczenia. Dodaj podłoże montażowe do szkiełka nakrywkowego i umieść je na siatkówce. Przechowywać siatkówki w temperaturze +4 °C i chronić przed światłem.

6. Analiza płaskich mocowań

  1. Wykonaj zdjęcia płaskich mocowań siatkówki za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego z obiektywem 10x. Skoncentruj się na powierzchownym splocie naczyniowym i neowaskularyzacji przesiatkowej. Utwórz obraz skanowania kafelków, aby uchwycić całą siatkówkę i scalić skany kafelków
  2. Określ ilościowo obrazy, mierząc AVA, obszar NV i całkowity obszar siatkówki za pomocą programu do przetwarzania obrazu (patrz tabela materiałów).
    1. Narysuj AVA i całkowity obszar siatkówki za pomocą narzędzia do rysowania odręcznego i wybierz obszary neowaskularne za pomocą narzędzia do zaznaczania. Oprogramowanie mierzy obszary zainteresowania w pikselach, a obszary AVA i NV (wyrażone w pikselach) można wykorzystać do obliczenia ich procentu w stosunku do całkowitej powierzchni siatkówki. Ponadto dostępne są niektóre narzędzia programowe do ilościowego określania NV.
      UWAGA: Niedawno wprowadzono w pełni zautomatyzowane programy typu open source do kwantyfikacji kluczowych wartości obrazów OIR przy użyciu sieci neuronowych głębokiego uczenia, które zapewniają niezawodne narzędzie do powtarzalnej kwantyfikacji AVA siatkówki i NV (np. https://github.com/uw-biomedical-ml/oir/tree/bf75f9346064f1425b8b9408ab792b1531a86c64)20,21.
  3. W przypadku stosowania przeciwciał do immunohistochemicznego wykrywania poszczególnych populacji komórek, należy określić ilościowo liczbę barwionych komórek (takich jak mikroglej, Rysunek 2B) z płaskich mocowań siatkówki ręcznie lub za pomocą automatycznych systemów analizy obrazu, jeśli jest to pożądane.

7. Statystyki

  1. Przeanalizuj dane o rozkładzie normalnym za pomocą testu t Studenta lub jednokierunkowej ANOVA, a następnie testu wielokrotnych porównań Dunnetta lub Tukeya, w zależności od potrzeb. Użyj testów nieparametrycznych, takich jak test U Manna-Whitneya lub test Kruskala Wallisa dla danych o rozkładzie nienormalnym. Rozważ różnice istotne statystycznie na poziomie P < 0,05.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Głównym wynikiem modelu jest fenotyp naczyniowy: wielkość AVAs oraz ilość NV. W mysim modelu OIR wazo-obliteracja występuje w centralnej części siatkówki (Rycina 2A), podczas gdy w modelu szczurzym rozwija się ona na obwodzie, co jest podobne do ludzkiego ROP22 (Rycina 3A). Dzieje się tak dlatego, że powierzchowny splot naczyniowy jest już rozwinięty w momencie narażenia myszy na hiperoksję, natomiast w modelu szczurzym siatkówka jest bez...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Nasilenie fenotypu choroby zależy zarówno od szczepu, jak i od dostawcy zarówno w mysich, jak i szczurzych modelach OIR23. Sugeruje to, że istnieje duża zmienność genotypowa w rozwoju patologii. Ogólnie rzecz biorąc, gryzonie pigmentowane rozwijają cięższy fenotyp niż gryzonie albinosy. Na przykład unaczynienie siatkówki albinosa BALB/c szybko rewaskularyzuje się po hiperoksji i w ogóle nie rozwija NV24. Podobnie u szczurów, pigmentowane brązowe szczury norweskie wykazują p...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy: dr Maria Vähätupa, Niina Jääskeläinen, dr Marc Cerrada-Gimenez i dr Rubina Thapa są pracownikami firmy Experimentica Ltd.

Autor, dr Giedrius Kalesnykas, jest pracownikiem (Prezesem i Dyrektorem Generalnym) oraz udziałowcem firmy Experimentica Ltd., która oferuje usługi badań kontraktowych z wykorzystaniem przedklinicznych modeli OIR wykorzystanych w niniejszym artykule.

Dr n. med. Tero Järvinen i dr n. med. Hannele Uusitalo-Järvinen nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy Marianne Karlsberg, Anne Mari Haapaniemi, Päivi Partanen i Anne Kankkunen za doskonałe wsparcie techniczne. Praca została sfinansowana przez Akademię Fińską, Fundację Päivikki i Sakari Sohlberg, Fundację Gruźlicy w Tampere, Fińską Fundację Medyczną, Fundację Badawczą Szpitala Okręgowego Pirkanmaa oraz Fundusz Badawczy Szpitala Uniwersyteckiego w Tampere.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Rozmiar 33, Mała piasta RN IgłaHamilton Company7803-05, 10mm, 25°, PS4Do iniekcji doszklistkowej
Adobe PhotoshopAdobe Inc.Do analizy obrazu
Pompa powietrza air100Eheim GmbH & Co. KG.143207Do znieczulenia wziewnego
Aparat anestezjologiczny 410 APUniventor Sp. z o.o.2360309Do znieczulenia wziewnego
AnalaR NORMAPUR Wapno sodowaneVWR International Ltd22666.362Do kontroli CO2 podczas indukcji modelu
Attane Vet 1000 mg/gVET MEDIC ANIMAL HEALTH OYvnr 17 05 79Do znieczulenia wziewnego
SzczotkaDo przygotowania płaskich mocowań
Gazowy dwutlenekNa ofiarę
Celeris D430 System ERGDiagnosys LLC121Do in vivo ERG
Naczynia do hodowli komórkowychGreiner Bio-One International GmbH664 160Do przygotowania płaskich uchwytów
Cepetor Vet 1 mg/mLVET MEDIC ANIMAL HEALTH OYvnr 08 78 96Do znieczulenia
Szkiełka nakrywkoweThermo Fisher Scientific15165452Do przygotowania płaskich mocowań
Sterowana przez O2 szafka InVivo, system filtrariatu aninalnego i osuszaczCoy ProduktyZamknięty system do indukcji modelu choroby, opcjonalnie dla systemu półzamkniętego
Czujnik O2 E702BioSphenix, Ltd.E207, 1801901Do pomiaru poziomu tlenu
Envisu R2200 Optyczny tomograf koherentny w domenie spektralnej (SD-OCT)Bioptigen, Inc.BPN000668Do obrazowania in vivo
Włócznie do oczuBeaver-Visitec International, Inc.0008685Do iniekcji doszklistkowej i obrazowania in vivo
Flexilux 600LL Źródło zimnego światłaMikron11140Do iniekcji doszklistkowej lub pobierania tkanek
Sól sodowa fluoresceinyMerck KGaAF6377-100GDo obrazowania in vivo
Jednostka wydechowa gazu (+Podwójny zawór 3-drogowy, maski na twarz myszy i szczura, filtr UNOsorb)UNO Roestvaststaal BVGEX 17015249Do znieczulenia wziewnego
Szklana strzykawka, model 65 RNHamilton Company7633-01Do iniekcji doszklistkowej
HRA2 Kardiocjagiograf siatkówki (FA)Heidelberg Engineering GmbHSpec-KT-05488Do obrazowania in vivo
Izolektyna GS-IB4, Alexa Fluor 488 SprzężonyThermo Fisher ScientificI21411Do oznaczania naczyń krwionośnych siatkówki płaskie mocowania
Ketaminol Vet 50 mg/mlIntervet International B.V.vnr 51 14 85Do znieczulenia
Medycyna Tlen gazowyDo indukcji modelu choroby
Myszy C57BL/6JRjJanvier LabsMożliwe również inne
szczepy Szkiełka mikroskopoweThermo Fisher ScientificJ1800AMNZDo przygotowania płaskich mocowań
Minims Powidon Jod 5% (jednostka)Bausch & Lomb U.K Limitedvnr 24 11 304Do wstrzykiwań doszklistkowych
Azot gazowyDo indukcji modelu choroby (szczur)
Oftan Chlora 10 mg/gSanten Pharmaceutical Co., Ltd.vnr 55 01 11Do wstrzykiwań doszklistkowych
Oftan Metaoksedrin 100 mg/mlSanten Pharmaceutical Co., Ltd.vnr 55 03 43Dla in vivo ERG
Oftan Obucain 4 mg/mlSanten Pharmaceutical Co., Ltd.vnr 55 03 50Do wstrzykiwań do ciała szklistego
Oftan Tropicamid 5 mg/mlSanten Pharmaceutical Co., Ltd.vnr 04 12 36Do obrazowania in vivo
kontroler ProOx Model 110 O2 i komora dla zwierzątBioSphenix, Ltd.803Do indukcji modelu choroby, system półzamknięty, opcjonalnie do systemu zamkniętego
ProOx Model P360 O2 sterownik i komora dla zwierzątBioSphenix, Ltd.538Do indukcji modelu choroby, system półzamknięty, opcjonalnie dla systemu zamkniętego
Szczury CD(SD)Charles River LaboratoriesMożliwe również inne szczepy
Revertor 5 mg/mLVET MEDIC ANIMAL HEALTH OYvnr 13 04 97Do odwrócenia znieczulenia
ŻelDo kontroli wilgotności podczas indukcji modelu
Systane Ultra 10mlAlconTamro 2050250Do nawilżania oczu
Urządzenie Systane Ultra 0,7mlAlconTamro 2064871Do nawilżania oka
Pipeta transferowaThermo Fisher Scientific1343-9108Do przygotowania uchwytów płaskich
VENTI-Line VL 180 PRIME SuszarkaVWRVL180S 170301Do suszenia żelu krzemionkowego
VisiScope SZT350 Mikroskop stereoskopowyVWR481067Do iniekcji doszklistkowej lub pobrania tkanek
węgla laboratoryjne krzemionkowy

Bibliografia

  1. Chase, J. The evolution of retinal vascularization in mammals. A comparison of vascular and avascular retinae. Ophthalmology. 89 (12), 1518-1525 (1982).
  2. Sun, Y., Smith, L. E. H. Retinal vasculature in development and diseases. Annual Review of Vision Science. 4, 101-122 (2018).
  3. Vähätupa, M., Järvinen, T. A. H., Uusitalo-Järvinen, H. Exploration of oxygen-induced retinopathy model to discover new therapeutic drug targets in retinopathies. Frontiers in Pharmacology. 11, 873(2020).
  4. Stahl, A., et al. The mouse retina as an angiogenesis model. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (6), 2813-2826 (2010).
  5. Benjamin, L. E., Hemo, I., Keshet, E. A plasticity window for blood vessel remodelling is defined by pericyte coverage of the preformed endothelial network and is regulated by PDGF-B and VEGF. Development. 125 (9), 1591-1598 (1998).
  6. Bashinsky, A. L. Retinopathy of prematurity. North Carolina Medical Journal. 78 (2), 124-128 (2017).
  7. Ludwig, C. A., Chen, T. A., Hernandez-Boussard, T., Moshfeghi, A. A., Moshfeghi, D. M. The epidemiology of retinopathy of prematurity in the united states. Ophthalmic Surgery, Lasers and Imaging Retina. 48 (7), 553-562 (2017).
  8. Hartnett, M. E. Pathophysiology and mechanisms of severe retinopathy of prematurity. Ophthalmology. 122 (1), 200-210 (2015).
  9. Liu, C. H., Wang, Z., Sun, Y., Chen, J. Animal models of ocular angiogenesis: From development to pathologies. FASEB Journal. 31 (11), 4665-4681 (2017).
  10. Szewczyk, T. S. Retrolental fibroplasia; etiology and prophylaxis. American Journal of Ophthalmology. 35 (3), 301-311 (1952).
  11. Szewczyk, T. S. Retrolental fibroplasia and related ocular diseases; classification, etiology, and prophylaxis. American Journal of Ophthalmology. 36 (10), 1336-1361 (1953).
  12. Gerschman, R., Nadig, P. W., Snell, A. C. Jr, Nye, S. W. Effect of high oxygen concentrations on eyes of newborn mice. American Journal of Physiology. 179 (1), 115-118 (1954).
  13. Gyllnesten, L. J., Hellström, B. E. Experimental approach to the pathogenesis of retrolental fibroplasia. III. changes in the eye induced by exposure of newborn mice to general hypoxia. British Journal of Ophthalmology. 39 (7), 409-415 (1955).
  14. Curley, F. J., Habegger, H., Ingalls, T. H., Philbrook, F. R. Retinopathy of immaturity in the newborn mouse after exposure to oxygen imbalances. American Journal of Ophthalmology. 42 (3), 377-392 (1956).
  15. Smith, L. E., et al. Oxygen-induced retinopathy in the mouse. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 35 (1), 101-111 (1994).
  16. Connor, K. M., et al. Quantification of oxygen-induced retinopathy in the mouse: A model of vessel loss, vessel regrowth and pathological angiogenesis. Nature Protocols. 4 (11), 1565-1573 (2009).
  17. Penn, J. S., Tolman, B. L., Lowery, L. A. Variable oxygen exposure causes preretinal neovascularization in the newborn rat. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 34 (3), 576-585 (1993).
  18. Penn, J. S., Henry, M. M., Tolman, B. L. Exposure to alternating hypoxia and hyperoxia causes severe proliferative retinopathy in the newborn rat. Pediatric Research. 36 (6), 724-731 (1994).
  19. Ritter, M. R., et al. Three-dimensional in vivo imaging of the mouse intraocular vasculature during development and disease. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 46 (9), 3021-3026 (2005).
  20. Xiao, S., et al. Fully automated, deep learning segmentation of oxygen-induced retinopathy images. Journal of Clinical Investigation Insight. 2 (24), 97585(2017).
  21. Mazzaferri, J., Larrivee, B., Cakir, B., Sapieha, P., Costantino, S. A machine learning approach for automated assessment of retinal vasculature in the oxygen induced retinopathy model. Scientific Reports. 8 (1), 22251-22257 (2018).
  22. Kim, C. B., D'Amore, P. A., Connor, K. M. Revisiting the mouse model of oxygen-induced retinopathy. Eye and Brain. 8, 67-79 (2016).
  23. Barnett, J. M., Yanni, S. E., Penn, J. S. The development of the rat model of retinopathy of prematurity. Documenta Ophthalmologica. 120 (1), 3-12 (2010).
  24. Ritter, M. R., et al. Myeloid progenitors differentiate into microglia and promote vascular repair in a model of ischemic retinopathy. Journal of Clinical Investigation. 116 (12), 3266-3276 (2006).
  25. Floyd, B. N., et al. Differences between rat strains in models of retinopathy of prematurity. Molecular Vision. 11, 524-530 (2005).
  26. Scott, A., Powner, M. B., Fruttiger, M. Quantification of vascular tortuosity as an early outcome measure in oxygen induced retinopathy (OIR). Experimental Eye Research. 120, 55-60 (2014).
  27. Walsh, N., Bravo-Nuevo, A., Geller, S., Stone, J. Resistance of photoreceptors in the C57BL/6-c2J, C57BL/6J, and BALB/cJ mouse strains to oxygen stress: Evidence of an oxygen phenotype. Current Eye Research. 29 (6), 441-447 (2004).
  28. Chan, C. K., et al. Differential expression of pro- and antiangiogenic factors in mouse strain-dependent hypoxia-induced retinal neovascularization. Laboratory Investigation. 85 (6), 721-733 (2005).
  29. Stahl, A., et al. Postnatal weight gain modifies severity and functional outcome of oxygen-induced proliferative retinopathy. American Journal of Pathology. 177 (6), 2715-2723 (2010).
  30. Liegl, R., Priglinger, C., Ohlmann, A. Induction and readout of oxygen-induced retinopathy. Methods in Molecular Biology. 1834, 179-191 (2019).
  31. Holmes, J. M., Duffner, L. A. The effect of postnatal growth retardation on abnormal neovascularization in the oxygen exposed neonatal rat. Current Eye Research. 15 (4), 403-409 (1996).
  32. Holmes, J. M., Zhang, S., Leske, D. A., Lanier, W. L. The effect of carbon dioxide on oxygen-induced retinopathy in the neonatal rat. Current Eye Research. 16 (7), 725-732 (1997).
  33. Heiduschka, P., Plagemann, T., Li, L., Alex, A. F., Eter, N. Different effects of various anti-angiogenic treatments in an experimental mouse model of retinopathy of prematurity. Journal of Clinical and Experimental Ophthalmology. 47 (1), 79-87 (2019).
  34. Tokunaga, C. C., et al. Effects of anti-VEGF treatment on the recovery of the developing retina following oxygen-induced retinopathy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (3), 1884-1892 (2014).
  35. Tokunaga, C. C., Chen, Y. H., Dailey, W., Cheng, M., Drenser, K. A. Retinal vascular rescue of oxygen-induced retinopathy in mice by norrin. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (1), 222-229 (2013).
  36. Vähätupa, M., Uusitalo-Järvinen, H., Järvinen, T. A. H., Uusitalo, H., Kalesnykas, G. Intravitreal injection of PBS reduces retinal neovascularization in the mouse oxygen-induced retinopathy model. Investigative Ophthalmology & Visual Science. Abstract Issue. 57 (12), 3649(2016).
  37. Penn, J. S., et al. Angiostatic effect of penetrating ocular injury: Role of pigment epithelium-derived factor. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (1), 405-414 (2006).
  38. Becker, S., Wang, H., Stoddard, G. J., Hartnett, M. E. Effect of subretinal injection on retinal structure and function in a rat oxygen-induced retinopathy model. Molecular Vision. 23, 832-843 (2017).
  39. Sophie, R., et al. Aflibercept: A potent vascular endothelial growth factor antagonist for neovascular age-related macular degeneration and other retinal vascular diseases. Biological Therapy. 2, (2012).
  40. Mezu-Ndubuisi, O. J. In vivo angiography quantifies oxygen-induced retinopathy vascular recovery. Optometry and Vision Science. 93 (10), 1268-1279 (2016).
  41. Mezu-Ndubuisi, O. J., et al. In vivo retinal vascular oxygen tension imaging and fluorescein angiography in the mouse model of oxygen-induced retinopathy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (10), 6968-6972 (2013).
  42. Dailey, W. A., et al. Ocular coherence tomography image data of the retinal laminar structure in a mouse model of oxygen-induced retinopathy. Data in Brief. 15, 491-495 (2017).
  43. Mezu-Ndubuisi, O. J., Taylor, L. K., Schoephoerster, J. A. Simultaneous fluorescein angiography and spectral domain optical coherence tomography correlate retinal thickness changes to vascular abnormalities in an in vivo mouse model of retinopathy of prematurity. Journal of Ophthalmology. 2017, 9620876(2017).
  44. Pinto, L. H., Invergo, B., Shimomura, K., Takahashi, J. S., Troy, J. B. Interpretation of the mouse electroretinogram. Documenta Ophthalmologica. 115 (3), 127-136 (2007).
  45. Nakamura, S., et al. Morphological and functional changes in the retina after chronic oxygen-induced retinopathy. PLoS One. 7 (2), 32167(2012).
  46. Dorfman, A. L., Polosa, A., Joly, S., Chemtob, S., Lachapelle, P. Functional and structural changes resulting from strain differences in the rat model of oxygen-induced retinopathy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50 (5), 2436-2450 (2009).
  47. Vähätupa, M., et al. SWATH-MS proteomic analysis of oxygen-induced retinopathy reveals novel potential therapeutic targets. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (8), 3294-3306 (2018).
  48. Campos, M., Amaral, J., Becerra, S. P., Fariss, R. N. A novel imaging technique for experimental choroidal neovascularization. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (12), 5163-5170 (2006).
  49. Yanez, C. O., et al. Deep Vascular Imaging in Wounds by Two-Photon Fluorescence Microscopy. PLos One. 8 (7), 67559(2013).
  50. Wickramasinghe, L. C., et al. Lung and eye disease develop concurrently in supplemental oxygen-exposed neonatal mice. American Journal of Pathology. , 30287(2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Neowaskularyzacja siatk wkiekspozycja na hiperoksjindukcja hipoksjipreparaty siatk wki w rzucie p askimbarwienie izolektyn B4OCT w domenie spektralnejangiografia z fluoresceinelektroretinografialeczenie afliberceptem

Powiązane artykuły