Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Fosfoproteomiczna strategia profilowania sygnalizacji stresu osmotycznego u rzodkiewnika

4.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61489

⸱

25 czerwca 2020

 ,  ,  , 
1Department of Plant Biology, Carnegie Institute for Science, 2Graduate School of Pharmaceutical Sciences, Kyoto University, 3Department of Biochemistry, Purdue University, 4Department of Chemistry, Purdue University, 5Shanghai Center for Plant Stress Biology, CAS Center for Excellence in Molecular Plant Sciences, Chinese Academy of Sciences

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawione tutaj jest podejście fosfoproteomiczne, a mianowicie fosfoproteomiczne oparte na końcówce do ekstrakcji stop and go, które zapewnia wysoką przepustowość i głębokie pokrycie fosfoproteomu Arabidopsis. Podejście to wyznacza przegląd sygnalizacji stresu osmotycznego u Arabidopsis.

Streszczenie

Fosforylacja białek jest kluczowa dla regulacji aktywności enzymu i ekspresji genów w warunkach osmotycznych. Fosfoproteomika oparta na spektrometrii mas (MS) zmieniła sposób badania transdukcji sygnału roślinnego. Jednak wymóg dużej ilości materiałów wyjściowych i wydłużony czas pomiaru MS w celu osiągnięcia głębokości pokrycia był czynnikiem ograniczającym dla wysokoprzepustowych badań globalnych zmian fosfoproteomicznych w roślinach. Aby poprawić czułość i przepustowość fosfoproteomiki roślin, opracowaliśmy podejście fosfoproteomiki oparte na końcówce ekstrakcji stop and go w połączeniu z etykietowaniem Tandem Mass Tag (TMT) w celu szybkiej i kompleksowej analizy zaburzeń fosforylacji roślin w odpowiedzi na stres osmotyczny. Wykorzystując prostotę i wysoką przepustowość techniki końcówek etapowych, cała procedura trwa około godziny przy użyciu dwóch końcówek do zakończenia etapów wzbogacania fosforeptydów, frakcjonowania i czyszczenia próbki, co sugeruje łatwość użycia i wysoką skuteczność tego podejścia. Takie podejście nie tylko zapewnia dogłębną analizę fosfoproteomiki roślin (identyfikacja > 11 000 fosfopeptydów), ale także wykazuje lepszą skuteczność separacji (< 5% nakładania się) między sąsiednimi frakcjami. Co więcej, multipleksowanie osiągnięto przy użyciu znakowania TMT w celu ilościowego określenia zmian fosfoproteomicznych u zmutowanych roślin typu dzikiego i snrk2. Podejście to zostało z powodzeniem wykorzystane do ujawnienia zdarzeń fosforylacji kinaz podobnych do Raf w odpowiedzi na stres osmotyczny, co rzuca światło na zrozumienie wczesnej sygnalizacji osmotycznej u roślin lądowych.

Wprowadzenie

Wysokie zasolenie, niska temperatura i susza powodują stresy osmotyczne, które są głównym czynnikiem środowiskowym wpływającym na produktywność roślin1,2. Fosforylacja białek jest jedną z najważniejszych modyfikacji potranslacyjnych pośredniczących w percepcji i transdukcji sygnału w odpowiedzi roślin na stres osmotyczny3,4,5. Kinaza białkowa 2 związana z SNF1 (SnRK2s) bierze udział w sygnalizacji stresu osmotycznego6. Dziewięciu z dziesięciu członków rodziny SnRK2 wykazuje znaczącą aktywację w odpowiedzi na stres osmotyczny7,8. Mutant snrk2.1/2/3/4/5/6/7/8/9/10 decuple (snrk2-dec) mający mutacje we wszystkich dziesięciu SnRK2 wykazywał nadwrażliwość na stres osmotyczny. W mutancie snrk2-dec indukowana stresem osmotycznym akumulacja 1,4,5-trifosforanu inozytolu (IP3), biosynteza kwasu abscysynowego (ABA) i ekspresja genów są silnie zmniejszone, co podkreśla istotną rolę SnRK2 w odpowiedziach na stres osmotyczny6. Jednak nadal nie jest jasne, w jaki sposób kinazy SnRK2s regulują te procesy biologiczne. Profilowanie zmian fosfoproteomicznych w odpowiedzi na stres osmotyczny jest skutecznym sposobem na wypełnienie tej luki i nakreślenie mechanizmów obronnych wyzwalanych przez stres osmotyczny u roślin.

Spektrometria mas (MS) to potężna technika mapowania fosfoproteomu roślin9. Charakterystyka fosfoproteomiki roślin pozostaje jednak wyzwaniem ze względu na dynamiczny zakres proteomu roślinnego i złożoność lizatu roślinnego4. Aby sprostać tym wyzwaniom, opracowaliśmy uniwersalny przepływ pracy fosfoproteomicznego roślin, który eliminuje niepożądane zakłócenia, takie jak pigmenty fotosyntetyczne i metabolity wtórne, oraz umożliwia głębokie pokrycie fosfoproteomu roślinnego10. Kilka metod wzbogacania fosfopeptydów, takich jak chromatografia powinowactwa do immobilizowanych jonów metali (IMAC) i chromatografia tlenków metali (MOC), zostało opracowanych w celu wzbogacania fosfopeptydów przed analizą MS11,12,13,14,15,16. Kwaśne niefosfopeptydy współoczyszczające z fosfopeptydami są głównymi zakłóceniami w wykrywaniu fosfopeptydów. Wcześniej ustandaryzowaliśmy wartość pH i stężenie kwasów organicznych w buforze ładującym IMAC, aby wyeliminować wiązanie niefosfopeptydów, aby uzyskać ponad 90% swoistość wzbogacania z pominięciem etapu wstępnego frakcjonowania11.

Utrata próbki w wieloetapowym procesie wzbogacania i frakcjonowania fosfopeptydu ogranicza czułość identyfikacji fosfopeptydu i głębokość pokrycia fosfoproteomicznego. Końcówki do ekstrakcji typu stop-and-go (końcówki etapowe) to końcówki do pipet, które zawierają małe krążki do zaślepienia końca końcówki, które można połączyć z chromatografią do frakcjonowania peptydów i czyszczenia17. Utratę próbki podczas procedury końcówki etapu można zminimalizować, unikając przenoszenia próbki między probówkami. Z powodzeniem wdrożyliśmy końcówkę etapową w Ga3+-IMAC i Fe3+-IMAC w celu oddzielenia mało obfitych peptydów wielokrotnych fosforylowanych od pojedynczo fosforylowanych peptydów, co poprawiło głębokość ludzkiego fosfoproteomu15. Ponadto zastosowanie końcówki fazy odwróconej o wysokim pH (Hp-RP) wykazało szerszy zakres ludzkiego proteomu błonowego w porównaniu z chromatografią silnej wymiany kationowej (SCX) i silnej wymiany anionowej (SAX)18. Dlatego integracja technik etapów IMAC i Hp-RP może zwiększyć pokrycie fosfoproteomem roślin dzięki prostocie, wysokiej specyficzności i wysokiej przepustowości. Wykazaliśmy, że ta strategia zidentyfikowała ponad 20 000 miejsc fosforylacji z siewek rzodkiewnika, co stanowi zwiększoną głębokość fosfoproteomu roślinnego19.

Tutaj przedstawiamy protokół fosfoproteomiki oparty na końcówce etapu do profilowania fosfoproteomicznego u Arabidopsis. Ten przepływ pracy został zastosowany do zbadania zaburzeń fosfoproteomicznych siewek zmutowanych siewek typu dzikiego i snrk2-dec w odpowiedzi na stres osmotyczny. Analiza fosfoproteomiczna ujawniła miejsca fosforylacji zaangażowane w aktywację kinazy i wczesną sygnalizację stresu osmotycznego. Analiza porównawcza danych dotyczących fosfoproteomu typu dzikiego i zmutowanego snrk2-dec doprowadziła do odkrycia kaskady kinazy Raf-podobnej (RAF)-SnRK2, która odgrywa kluczową rolę w sygnalizacji stresu osmore u roślin wysokich.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie próbki

  1. Zbierz sadzonki kontrolne i poddane działaniu stresu (1 g) w folię aluminiową i błyskawicznie zamroź próbki w ciekłym azocie.
    UWAGA: Wyższe stężenie białka obserwuje się zwykle u siewek dwutygodniowych niż u dojrzałych roślin. Jeden gram siewek generuje około 10 mg lizatu białkowego, co wystarcza do analizy MS. Wszystkie etapy wirowania odbywają się przy 16 000 x g w kroku 1.
  2. Zmiel zamrożone sadzonki na drobny proszek za pomocą moździerza i tłuczka wypełnionego ciekłym azotem.
  3. Dodać 1 ml buforu do lizy ((6 M guanidyna-HCl w 100 mM Tris-HCl, pH 8,5) z 10 mM chlorowodorkiem tris (2-karboksyetylo)fosfiny (TCEP), 40 mM chloroacetamidu 2-chloroacetamidu (CAA), inhibitorem proteazy i koktajlem inhibitorów fosfatazy) do moździerza i wymieszać za pomocą tłuczka.
  4. Przenieść lizat roślinny do probówki o pojemności 1,5 ml i podgrzewać w temperaturze 95 °C przez 5 minut.
  5. Umieść probówkę na lodzie na 10 minut. Sonikuj probówkę na lodzie przez 10 s, zatrzymaj się na 10 s i powtórz trzykrotnie.
  6. Odwirować probówkę przez 20 minut i podać 150 μl lizatu roślinnego do probówki o pojemności 1,5 ml.
  7. Do probówki dodać 600 μl 100% metanolu. Wiruj i odkręć rurkę.
  8. Do probówki dodać 150 μl 100% chloroformu. Wiruj i odkręć rurkę.
  9. Dodać 450 μl ddH2O do probówki. Wirować i odwirowywać probówkę przez 3 minuty.
  10. Odrzuć górną warstwę wodną. Do probówki dodać 600 μl 100% metanolu. Wirować probówkę przez 3 minuty, a następnie wyrzucić roztwór.
  11. Granulki białkowe przemyć 600 μL 100% metanolu. Odrzuć roztwór i wysusz na powietrzu osad białka.
  12. Zawiesić granulki białka w 600 μl buforu wytrawiającego (12 mM deoksycholanu sodu (SDC)/12 mM lauroilosarkozynianu sodu (SLS) w 100 mM Tris-HCl, pH 8,5). Sondować probówkę Sonicing, aż zawiesina zostanie zhomogenizowana.
  13. Zmierz stężenie białka za pomocą zestawu BCA i dostosuj stężenie do 4 μg/μl za pomocą buforu wytrawiającego. Przenieś 100 μl lizatu (400 μg białek) do nowej probówki.
  14. Dodać 292 μl 50 mM wodorowęglanu trietyloamonu (TEAB) i 8 μl Lys-C (2,5 jednostki/ml) do probówki. Inkubować probówkę w temperaturze 37 °C przez 3 godziny.
  15. Do probówki dodać 100 μl 50 mM TEAB z 8 μg trypsyny. Inkubować probówkę w temperaturze 37 °C przez 12 godzin.
  16. Do probówki dodać 25 μl 10% kwasu trifluorooctowego (TFA). Wirować i odwirowywać probówkę przez 20 minut w temperaturze 4 °C.
  17. Przenieść supernatant do kondycjonowanej kolumny odsalającej w celu odsalania. Wysuszyć eluat za pomocą koncentratora wirówki próżniowej.
    UWAGA: Aktywuj żywicę za pomocą 1 ml metanolu, a następnie 1 ml 0,1% TFA w 80% acetonitrylu (ACN). Przepłukać rozpuszczalnik organiczny co najmniej 3 ml 0,1% TFA w 5% ACN. Załadować zakwaszone próbki peptydów przygotowane w kroku 1.16 do kolumny, a następnie przemyć kolumnę co najmniej 3 ml 0,1% TFA w 5% ACN. W przypadku próbek o wysokim stężeniu soli może być konieczne więcej płukania. Eluować fosfopeptydy za pomocą 1 ml 0,1% TFA w 80% ACN.

2. Etykietowanie Tandem Mass Tag (TMT)

  1. Zawiesić wysuszone peptydy w 100 μl 200 mM kwasu 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego (HEPES) o pH 8,5.
  2. Rozpuścić odczynnik TMT dla każdego kanału (0,8 mg) w 40 μl bezwodnego ACN. Wiruj probówkę z odczynnikiem TMT przez 5 minut i odkręć ją.
  3. Przenieść 40 μl TMT do probówki z próbką i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: W tym eksperymencie kanały od 126 do 128 zostały oznaczone trzema biologicznymi powtórzeniami roślin bez leczenia mannitolem, a kanały od 129 do 131 zostały oznaczone trzema biologicznymi powtórzeniami roślin poddanych działaniu mannitolu.
  4. Dodać 8 μl 5% hydroksyloaminy i inkubować przez 15 min.
  5. Wymieszaj 6 próbek w probówce o pojemności 5 ml i dodaj 14 μl 10% TFA.
  6. Dodać 3,876 μl 0,1% TFA do probówki. Wiruj i zakręć w dół.
  7. Przenieść roztwór do kondycjonowanej kolumny odsalającej w celu odsalania. Wysuszyć eluat za pomocą parownika.

3. Przygotowanie końcówki etapu IMAC

  1. Użyj igły 16 G, aby przebić krążek fryty polipropylenowej.
    UWAGA: Trzymaj nóż prostopadle do powierzchni dysku i przekręć nóż kilka razy, aby upewnić się, że krążek jest całkowicie wycięty. Umieść dysk na szalce Petriego do przechowywania. Umieścić igłę w końcówce pipety o pojemności 200 μl i wepchnąć frytę do końcówki za pomocą tłoka.
  2. Delikatnie wciśnij frytę w końcówkę za pomocą tłoka, aby zakryć koniec końcówki.
    1. Umieść krążek fryty w końcówkach z takim samym naciskiem, co zapewnia lepszą odtwarzalność. Powtarzalność produkcji końcówek etapowych jest ważna dla stałego ciśnienia wstecznego, które wpływa na czas etapów wirówki i odtwarzalność między powtórzeniami technicznymi.
    2. Jeśli końcówki stolika wykazują wysokie ciśnienie wsteczne podczas etapu kondycjonowania, wyrzuć końcówki, aby uniknąć potencjalnego zatkania końcówki podczas ładowania próbek. Możliwe, że dysk został zbyt mocno wciśnięty na miejsce.
  3. Odwróć kolumnę wirową Ni-NTA i umieść na probówce o pojemności 1,5 ml.
  4. Za pomocą tłoka delikatnie dociśnij frytkę kulek Ni-NTA i wepchnij koraliki do tuby.
    UWAGA: Upewnij się, że fryta jest delikatnie dociskana, aby uniknąć potencjalnej utraty lub adsorpcji kulek na kolumnie wirowej.

4. Przygotowanie końcówki etapu Hp-RP

  1. Przygotuj końcówkę stolika Hp-RP zgodnie z opisem dla końcówki stolika IMAC za pomocą dysku C8.
    UWAGA: Nie przykładaj dużej siły do dysku, ponieważ może to spowodować gęsto upakowaną frytę i zwiększyć ciśnienie wsteczne końcówki stage. Wszystkie etapy wirowania odbywają się przy 1 000 x g przez 5 minut w kroku 4.
  2. Zawiesić 1 mg kulek C18 w 100 μl 100% metanolu i przepuścić roztwór kulek przez końcówkę.
  3. Dodać 20 μl buforu 8 (80% ACN/20% 200 mM NH4HCO2, pH 10,0) do końcówki stolika i przepuścić bufor 8 przez końcówkę przez odwirowanie.
  4. Dodać 20 μl buforu A (200 mM NH4HCO2) do końcówki stolika i przepuścić bufor A przez końcówkę przez odwirowanie.
    UWAGA: Zrównoważ wirówkę podczas użytkowania i upewnij się, że końcówka Hp-RP stage nie jest całkowicie wysuszona.

5. Przygotowanie adaptera spin

  1. Użyj pęsety z ostrym końcem, aby przebić otwór na środku wieczka probówki o pojemności 1.5 ml.
  2. Włóż końcówkę stolika IMAC lub końcówkę stolika Hp-RP do otworu adaptera wirowego.
    UWAGA: Upewnij się, że stage końcówka nie znajduje się blisko dna adaptera wirowania.

6. Wzbogacanie fosfopeptydem za pomocą końcówki etapu IMAC

  1. Zawiesić kulki Ni-NTA 10 mg z 400 μl buforu ładującego (6% kwas octowy (AA), pH 3,0) i załadować cały roztwór kulek do każdej końcówki. Przepuścić roztwór przez końcówkę przez odwirowanie.
    UWAGA: Wszystkie etapy wirowania odbywają się przy 200 x g przez 3 minuty w kroku 6 oprócz kroku 6.8.
  2. Załaduj 100 μl 50 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA), aby usunąć jony niklu z końcówki stopnia IMAC i przepuścić roztwór przez końcówkę przez odwirowanie.
  3. Załadować 100 μl buforu ładującego do końcówki stolika i przepuścić roztwór przez końcówkę przez odwirowanie.
  4. Załaduj 100 μl 50 mM FeCl3 w 6% AA do końcówki stolika i przepuść roztwór przez końcówkę przez odwirowanie. Jony Fe3+ będą chelatować do końcówki etapu IMAC.
  5. Załadować 100 μl buforu ładującego, aby kondycjonować końcówkę stolika i przepuścić roztwór przez końcówkę przez odwirowanie.
  6. Załadować 100 μl buforu ładującego peptydami próbki przygotowanymi w kroku 2.7 do końcówki stolika i przepuścić roztwór przez końcówkę przez odwirowanie.
    UWAGA: Weź nową probówkę jako adapter wirowy, aby zebrać przepływ próbki i przechowuj przepływ w zamrażarce do przyszłej analizy.
  7. Załaduj 100 μl buforu płuczącego (4,5% AA i 25% ACN) do końcówki stolika i przepuść roztwór przez końcówkę przez odwirowanie.
  8. Wykonaj drugie mycie z buforem załadowczym. Załaduj 100 μl buforu ładującego do końcówki stolika i przepuść roztwór przez końcówkę za pomocą wirówki o pojemności 1000 × g przez 3 min.
    UWAGA: Upewnij się, że bufor myjący został zastąpiony buforem ładującym w końcówce stage, aby wyeliminować utratę fosfopeptydów podczas etapu elucji. Zrównoważyć końcówkę stopnia IMAC przed elucją, aby upewnić się, że stężenie ACN jest poniżej 5%.
  9. Przytnij końcówkę stage IMAC z przodu nożyczkami i umieść przyciętą końcówkę stage IMAC wewnątrz końcówki Hp-RP. Upewnij się, że dwie warstwy stage końcówki nie dotykają pokrywy wirówki.

7. Frakcjonowanie fosfopeptydem za pomocą końcówki stopnia Hp-RP C18

  1. Dodać 100 μl buforu elucyjnego (200 mM fosforanu amonu (NH4H2PO4)) do przyciętej końcówki stopnia IMAC i przepuścić roztwór przez dwie warstwy końcówek etapu przez odwirowanie.
    UWAGA: Jeśli roztwór nie przejdzie przez końcówkę stage, zwiększ prędkość wirowania. Wszystkie etapy wirowania odbywają się przy 1 000 x g przez 5 minut w kroku 7. Wszystkie Hp-RP są wymienione w tabeli 1.
  2. Wyrzuć końcówkę stopnia IMAC za pomocą pęsety i dodaj 20 μl buforu A do końcówki stolika Hp-RP i przepuść bufor przez końcówkę przez odwirowanie.
    UWAGA: Upewnij się, że cały bufor elucji przechodzi przez IMAC stage końcówka przed jego wyrzuceniem.
  3. Dodać 20 μl buforu 1 do elucji frakcji 1 i zebrać eluat w nowej probówce przez odwirowanie. Powtórz proces z 2, 3, 4, 5, 6, 7 i 8, aby zebrać każdą frakcję w nowej probówce. Wysuszyć końcowy eluat każdej frakcji za pomocą koncentratora próżniowego.
    UWAGA: Przygotować świeże frakcjonacyjne. Weź 8 nowych probówek jako adapter wirowania każdej frakcji. Zbierz eluat każdej frakcji w innym adapterze wirowania. Fosfopeptydy nie są stabilne w warunkach zasadowych, dlatego eluaty należy natychmiast wysuszyć koncentratorem lub zakwasić 10% TFA.

8. Analiza LC-MS/MS i analiza danych

  1. Dodać 5 μl 0,1% kwasu mrówkowego (FA) i przeanalizować próbkę za pomocą spektrometru mas.
  2. Uruchom 90-minutowy gradient z buforem B 6-30% (80% ACN i 0,1% FA) dla każdej frakcji.
  3. Fragmentuj 10 pierwszych znakowanych peptydów za pomocą dysocjacji o wysokiej energii zderzenia (HCD). Przeszukaj bazę danych, aby zidentyfikować miejsca fosforylacji.
  4. Załaduj surowe pliki do oprogramowania MaxQuant, nazwij eksperymenty i ustaw ułamki oraz PTM.
    UWAGA: Samouczek oprogramowania MaxQuant można znaleźć pod adresem https://www.maxquant.org/.
  5. Wybierz jon reporterowy MS2 w typie przebiegu LC-MS/MS i 6plex TMT jako etykiety izobaryczne. Włącz filtrowanie według funkcji PIF i ustaw minimalny PIF na 0,75.
  6. Wybierz Acetyl (Białko N-term), Utlenianie (M) i Fosfo (STY) do panelu zmiennych modyfikacji. Wybierz Carbamidomethyl (C) jako stałe modyfikacje.
  7. Ustaw tryb trawienia jako specyficzny, wybierz Trypsynę/P jako enzym trawienny i dwa pominięte rozszczepienia.
  8. Ustaw współczynnik fałszywych wykryć PSM (FDR) i białko FDR na 0,01. Ustaw minimalny wynik dla zmodyfikowanych peptydów na 40.
  9. Dodaj bazę danych Arabidopsis thaliana do panelu plików fasta i uruchom przeszukiwanie bazy danych.
  10. Załaduj plik txt stron Phospho (STY) do oprogramowania Perseus po zakończeniu wyszukiwania.
    UWAGA: Szczegółowe samouczki dotyczące oprogramowania Perseus można znaleźć na stronie https://www.maxquant.org/perseus/.
  11. Odfiltruj miejsca odwróconej fosforylacji. Odfiltruj niezlokalizowane miejsca fosforylacji, używając prawdopodobieństwa lokalizacji 75% jako punktu odcięcia.
  12. Wykorzystaj intensywności miejsc fosforylacji do analizy statystycznej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Aby zademonstrować wydajność tego schematu analizy, wykorzystano końcówki typu stage tip IMAC sprzężone z frakcjonowaniem za pomocą końcówek typu stage tip Hp-RP w celu pomiaru zmian fosfoproteomicznych w siewkach typu dzikiego oraz mutantów snrk2-dec z zastosowaniem lub bez zastosowania traktowania mannitolem przez 30 minut. Każda próbka była analizowana w trzech powtórzeniach biologicznych, a schemat eksperymentalny przedstawiono na Rysunku 1. Przetrawione peptydy (40 µg) z każdej...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Zakres dynamiczny i złożoność proteomu roślinnego i fosfoproteomu są nadal czynnikiem ograniczającym głębokość analiz fosfoproteomicznych. Pomimo możliwości jednoetapowej analizy LC-MS/MS w celu zidentyfikowania 10 000 miejsc fosforylacji21,22, pokrycie całego fosfoproteomu rośliny jest nadal ograniczone. W związku z tym w profilowaniu globalnego obrazu sieci sygnalizacyjnych roślin w odpowiedzi na stres środowiskowy wymagany jest fosfoproteomiczny przepływ pracy...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Strategiczny Program Badawczy Chińskiej Akademii Nauk, Grant XDB27040106.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Probówka 1,5 mleppendorf22431081Protein LoBind, 1,5 mL, PCR czysta, bezbarwna, 100 probówek
200 &mikro; L końcówka do pipetyGilsonF1739311
2-chloroacetamidSigma-AldrichC0267
kwas octowySigma-Aldrich5438080100
acetonitrylSigma-Aldrich271004
wodorotlenek amonuSigma-Aldrich338818
fosforan amonu monbasicSigma-Aldrich216003
Zestaw do oznaczania białek BCAThermo Fisher Scientific23227
igła z zakończeniemHamilton90516Piasta Kel-F (KF), typ punktowy 3, rozstaw 16
koralików C18-AQDr. MaischReproSil-Pur-C18-AQ 5 µ m
C8 Empore disk3 M221447 mm
Wirówkaeppendorf22620444
chloroform
Perseus 1.6.2.1Kwas https://maxquant.net/perseus/
kwasSigma-Aldrich5330020050
FrytyAgilent12131024do wkładów SPE
Chlorowodorek guanidynySigma-Aldrich50933
H2OSigma-Aldrich1153334000
HEPESSigma-AldrichH3375
Chlorek żelaza (III)Sigma-Aldrich157740
LTQ-orbitrapThermo Fisher ScientificSpektrometr masowy Velos Pro
Thermo Fisher ScientificLTQ-Orbitrap Velos Pro
metanolSigma-Aldrich34860
nano LCThermo Fisher ScientificEasy-nLC 1000
Ni-NTA kolumna wirowaQiagen31014
N-lauroilsarkozyna sól sodowaSigma-AldrichL9150
tłokHamilton1122-01Zespół tłoka N, RN, LT, LTN dla modelu 1702 (25 μ l)
wyszukiwarkaMaxQuant 1.5.4.1https://www.maxquant.org
SEP-PAK Kartridż 50 mgWodyWAT054960
deoksycholan soduSigma-AldrichD6750
SpeedVacThermo Fisher ScientificSPD121P
TMT 6-plexThermo Fisher Scientific90061
Bufor wodorowęglanu trietyloamonuSigma-AldrichT7408
Kwas trifluorooctowySigma-Aldrich91707
Chlorowodorek tris(2-karboksetylo)fosfinySigma-AldrichC4706
Chlorowodorek trizmySigma-AldrichT3253
Oprogramowanie do analizy danych Sigma-Aldrich CX1058 etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)Sigma-Aldrich mrówkowy

Bibliografia

  1. Hasegawa, P. M., Bressan, R. A., Zhu, J. K., Bohnert, H. J. Plant cellular and molecular responses to high salinity. Annual Review Plant Physiology Plant Molecualr Biology. 51, 463-499 (2000).
  2. Janmohammadi, M., Zolla, L., Rinalducci, S. Low temperature tolerance in plants: Changes at the protein level. Phytochemistry. 117, 76-89 (2015).
  3. Umezawa, T., Takahashi, F., Shinozaki, K. Phosphorylation networks in the abscisic acid signaling pathway. Enzymes. 35, 27-56 (2014).
  4. Silva-Sanchez, C., Li, H., Chen, S. Recent advances and challenges in plant phosphoproteomics. Proteomics. 15 (5-6), 1127-1141 (2015).
  5. Wang, P., et al. Mapping proteome-wide targets of protein kinases in plant stress responses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (6), 3270-3280 (2020).
  6. Fujii, H., Verslues, P. E., Zhu, J. K. Arabidopsis decuple mutant reveals the importance of SnRK2 kinases in osmotic stress responses in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (4), 1717-1722 (2011).
  7. Wang, P., et al. Quantitative phosphoproteomics identifies SnRK2 protein kinase substrates and reveals the effectors of abscisic acid action. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (27), 11205-11210 (2013).
  8. Boudsocq, M., Barbier-Brygoo, H., Lauriere, C. Identification of nine sucrose nonfermenting 1-related protein kinases 2 activated by hyperosmotic and saline stresses in Arabidopsis thaliana. Journal of Biological Chemistry. 279 (40), 41758-41766 (2004).
  9. Li, J., Silva-Sanchez, C., Zhang, T., Chen, S., Li, H. Phosphoproteomics technologies and applications in plant biology research. Frontiers in Plant Science. 6, 430(2015).
  10. Hsu, C. C., et al. Universal plant phosphoproteomics workflow and its application to Tomato signaling in response to cold stress. Molecular & Cell Proteomics. 17 (10), 2068(2018).
  11. Tsai, C. F., et al. Immobilized metal affinity chromatography revisited: pH/acid control toward high selectivity in phosphoproteomics. Journal of Proteome Research. 7 (9), 4058-4069 (2008).
  12. Larsen, M. R., Thingholm, T. E., Jensen, O. N., Roepstorff, P., Jorgensen, T. J. Highly selective enrichment of phosphorylated peptides from peptide mixtures using titanium dioxide microcolumns. Molecular & Cell Proteomics. 4 (7), 873-886 (2005).
  13. Ruprecht, B., et al. Comprehensive and reproducible phosphopeptide enrichment using iron immobilized metal ion affinity chromatography (Fe-IMAC) columns. Molecular & Cell Proteomics. 14 (1), 205-215 (2015).
  14. Sugiyama, N., et al. Phosphopeptide enrichment by aliphatic hydroxy acid-modified metal oxide chromatography for nano-LC-MS/MS in proteomics applications. Molecular & Cell Proteomics. 6 (6), 1103-1109 (2007).
  15. Tsai, C. F., et al. Sequential phosphoproteomic enrichment through complementary metal-directed immobilized metal ion affinity chromatography. Analytical Chemistry. 86 (1), 685-693 (2014).
  16. Zhou, H., et al. Enhancing the identification of phosphopeptides from putative basophilic kinase substrates using Ti (IV) based IMAC enrichment. Molecular & Cell Proteomics. 10 (10), (2011).
  17. Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips. Nature Protocols. 2 (8), 1896-1906 (2007).
  18. Dimayacyac-Esleta, B. R., et al. Rapid high-pH reverse phase stageTip for sensitive small-scale membrane proteomic profiling. Analytical Chemistry. 87 (24), 12016-12023 (2015).
  19. Wang, P., et al. Reciprocal regulation of the TOR Kinase and ABA receptor balances plant growth and stress response. Molecular Cell. 69 (1), 100-112 (2018).
  20. Lin, Z., et al. A RAF-SnRK2 kinase cascade mediates early osmotic stress signaling in higher plants. Nature Communications. 11 (1), 613(2020).
  21. Humphrey, S. J., Azimifar, S. B., Mann, M. High-throughput phosphoproteomics reveals in vivo insulin signaling dynamics. Nature Biotechnology. 33 (9), 990-995 (2015).
  22. Bekker-Jensen, D. B., et al. An optimized shotgun strategy for the rapid generation of comprehensive human proteomes. Cell Systems. 4 (6), 587-599 (2017).
  23. Possemato, A. P., et al. Multiplexed phosphoproteomic profiling using titanium dioxide and immunoaffinity enrichments reveals complementary phosphorylation events. Journal Proteome Research. 16 (4), 1506-1514 (2017).
  24. Hogrebe, A., et al. Benchmarking common quantification strategies for large-scale phosphoproteomics. Nature Communications. 9 (1), 1045(2018).
  25. Wong, M. M., et al. Phosphoproteomics of Arabidopsis Highly ABA-Induced1 identifies AT-Hook-Like10 phosphorylation required for stress growth regulation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (6), 2354-2363 (2019).
  26. Yang, F., Melo-Braga, M. N., Larsen, M. R., Jorgensen, H. J., Battle Palmisano, G. through signaling between wheat and the fungal pathogen Septoria tritici revealed by proteomics and phosphoproteomics. Molecular & Cell Proteomics. 12 (9), 2497-2508 (2013).
  27. Tsai, C. F., et al. Tandem Mass Tag labeling facilitates reversed-phase liquid chromatography-mass spectrometry analysis of hydrophilic phosphopeptides. Analytical Chemistry. 91 (18), 11606-11613 (2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Fosfoproteomika ro lintechnika stage tipznakowanie TMTwzbogacanie IMACfrakcjonowanie przy wysokim pHdecuple mutant SnRK2kinazy podobne do RafArabidopsis thaliana
Fosfoproteomiczna strategia profilowania sygnalizacji stresu osmotycznego u rzodkiewnika
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.