Przedstawione tutaj jest podejście fosfoproteomiczne, a mianowicie fosfoproteomiczne oparte na końcówce do ekstrakcji stop and go, które zapewnia wysoką przepustowość i głębokie pokrycie fosfoproteomu Arabidopsis. Podejście to wyznacza przegląd sygnalizacji stresu osmotycznego u Arabidopsis.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Fosfoproteomiczna strategia profilowania sygnalizacji stresu osmotycznego u rzodkiewnika
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Fosforylacja białek jest kluczowa dla regulacji aktywności enzymu i ekspresji genów w warunkach osmotycznych. Fosfoproteomika oparta na spektrometrii mas (MS) zmieniła sposób badania transdukcji sygnału roślinnego. Jednak wymóg dużej ilości materiałów wyjściowych i wydłużony czas pomiaru MS w celu osiągnięcia głębokości pokrycia był czynnikiem ograniczającym dla wysokoprzepustowych badań globalnych zmian fosfoproteomicznych w roślinach. Aby poprawić czułość i przepustowość fosfoproteomiki roślin, opracowaliśmy podejście fosfoproteomiki oparte na końcówce ekstrakcji stop and go w połączeniu z etykietowaniem Tandem Mass Tag (TMT) w celu szybkiej i kompleksowej analizy zaburzeń fosforylacji roślin w odpowiedzi na stres osmotyczny. Wykorzystując prostotę i wysoką przepustowość techniki końcówek etapowych, cała procedura trwa około godziny przy użyciu dwóch końcówek do zakończenia etapów wzbogacania fosforeptydów, frakcjonowania i czyszczenia próbki, co sugeruje łatwość użycia i wysoką skuteczność tego podejścia. Takie podejście nie tylko zapewnia dogłębną analizę fosfoproteomiki roślin (identyfikacja > 11 000 fosfopeptydów), ale także wykazuje lepszą skuteczność separacji (< 5% nakładania się) między sąsiednimi frakcjami. Co więcej, multipleksowanie osiągnięto przy użyciu znakowania TMT w celu ilościowego określenia zmian fosfoproteomicznych u zmutowanych roślin typu dzikiego i snrk2. Podejście to zostało z powodzeniem wykorzystane do ujawnienia zdarzeń fosforylacji kinaz podobnych do Raf w odpowiedzi na stres osmotyczny, co rzuca światło na zrozumienie wczesnej sygnalizacji osmotycznej u roślin lądowych.
Wprowadzenie
Wysokie zasolenie, niska temperatura i susza powodują stresy osmotyczne, które są głównym czynnikiem środowiskowym wpływającym na produktywność roślin1,2. Fosforylacja białek jest jedną z najważniejszych modyfikacji potranslacyjnych pośredniczących w percepcji i transdukcji sygnału w odpowiedzi roślin na stres osmotyczny3,4,5. Kinaza białkowa 2 związana z SNF1 (SnRK2s) bierze udział w sygnalizacji stresu osmotycznego6. Dziewięciu z dziesięciu członków rodziny SnRK2 wykazuje znaczącą aktywację w....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Przygotowanie próbki
- Zbierz sadzonki kontrolne i poddane działaniu stresu (1 g) w folię aluminiową i błyskawicznie zamroź próbki w ciekłym azocie.
UWAGA: Wyższe stężenie białka obserwuje się zwykle u siewek dwutygodniowych niż u dojrzałych roślin. Jeden gram siewek generuje około 10 mg lizatu białkowego, co wystarcza do analizy MS. Wszystkie etapy wirowania odbywają się przy 16 000 x g w kroku 1. - Zmiel zamrożone sadzonki na drobny proszek za pomocą moździerza i tłuczka wypełnionego ciekłym azotem.
- Dodać 1 ml buforu do lizy ((6 M guanidyna-HCl w 100 mM Tris-HCl, pH 8,5) z 10 mM chlorowodorkiem tris (2-karboksyetylo)fo....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Aby zademonstrować wydajność tego schematu analizy, wykorzystano końcówki typu stage tip IMAC sprzężone z frakcjonowaniem za pomocą końcówek typu stage tip Hp-RP w celu pomiaru zmian fosfoproteomicznych w siewkach typu dzikiego oraz mutantów snrk2-dec z zastosowaniem lub bez zastosowania traktowania mannitolem przez 30 minut. Każda próbka była analizowana w trzech powtórzeniach biologicznych, a schemat eksperymentalny przedstawiono na Rysunku 1. Przetrawione peptydy (40 µg) z każdej.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Zakres dynamiczny i złożoność proteomu roślinnego i fosfoproteomu są nadal czynnikiem ograniczającym głębokość analiz fosfoproteomicznych. Pomimo możliwości jednoetapowej analizy LC-MS/MS w celu zidentyfikowania 10 000 miejsc fosforylacji21,22, pokrycie całego fosfoproteomu rośliny jest nadal ograniczone. W związku z tym w profilowaniu globalnego obrazu sieci sygnalizacyjnych roślin w odpowiedzi na stres środowiskowy wymagany jest fosfoproteomiczny przepływ pracy.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez Strategiczny Program Badawczy Chińskiej Akademii Nauk, Grant XDB27040106.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Probówka 1,5 ml | eppendorf | 22431081 | Protein LoBind, 1,5 mL, PCR czysta, bezbarwna, 100 probówek |
| 200 &mikro; L końcówka do pipety | Gilson | F1739311 | |
| 2-chloroacetamid | Sigma-Aldrich | C0267 | |
| kwas octowy | Sigma-Aldrich | 5438080100 | |
| acetonitryl | Sigma-Aldrich | 271004 | |
| wodorotlenek amonu | Sigma-Aldrich | 338818 | |
| fosforan amonu monbasic | Sigma-Aldrich | 216003 | |
| Zestaw do oznaczania białek BCA | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| igła z zakończeniem | Hamilton | 90516 | Piasta Kel-F (KF), typ punktowy 3, rozstaw 16 |
| koralików C18-AQ | Dr. Maisch | ReproSil-Pur-C18-AQ 5 µ m | |
| C8 Empore disk | 3 M | 2214 | 47 mm |
| Wirówka | eppendorf | 22620444 | |
| chloroform | |||
| Perseus 1.6.2.1 | Kwas https://maxquant.net/perseus/ | ||
| kwas | Sigma-Aldrich | 5330020050 | |
| Fryty | Agilent | 12131024 | do wkładów SPE |
| Chlorowodorek guanidyny | Sigma-Aldrich | 50933 | |
| H2O | Sigma-Aldrich | 1153334000 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Chlorek żelaza (III) | Sigma-Aldrich | 157740 | |
| LTQ-orbitrap | Thermo Fisher Scientific | Spektrometr masowy Velos Pro | |
| Thermo Fisher Scientific | LTQ-Orbitrap Velos Pro | ||
| metanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| nano LC | Thermo Fisher Scientific | Easy-nLC 1000 | |
| Ni-NTA kolumna wirowa | Qiagen | 31014 | |
| N-lauroilsarkozyna sól sodowa | Sigma-Aldrich | L9150 | |
| tłok | Hamilton | 1122-01 | Zespół tłoka N, RN, LT, LTN dla modelu 1702 (25 μ l) |
| wyszukiwarka | MaxQuant 1.5.4.1 | https://www.maxquant.org | |
| SEP-PAK Kartridż 50 mg | Wody | WAT054960 | |
| deoksycholan sodu | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| SpeedVac | Thermo Fisher Scientific | SPD121P | |
| TMT 6-plex | Thermo Fisher Scientific | 90061 | |
| Bufor wodorowęglanu trietyloamonu | Sigma-Aldrich | T7408 | |
| Kwas trifluorooctowy | Sigma-Aldrich | 91707 | |
| Chlorowodorek tris(2-karboksetylo)fosfiny | Sigma-Aldrich | C4706 | |
| Chlorowodorek trizmy | Sigma-Aldrich | T3253 |
Bibliografia
- Hasegawa, P. M., Bressan, R. A., Zhu, J. K., Bohnert, H. J. Plant cellular and molecular responses to high salinity. Annual Review Plant Physiology Plant Molecualr Biology. 51, 463-499 (2000).
- Janmohammadi, M., Zolla, L., Rinalducci, S. Low temperatur....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
