Artykuł metodologiczny

Elektroretinogram ze sprzężeniem bezpośrednim (DC-ERG) do rejestrowania wywołanych światłem reakcji elektrycznych nabłonka barwnikowego siatkówki myszy

DOI:

10.3791/61491

⸱

14 lipca 2020

 ,  ,  ,  , 
1Retinal Neurophysiology Section, National Eye Institute, National Institutes of Health, 2Ocular and Stem Cell Translational Research Section, National Eye Institute, National Institutes of Health, 3Human Visual Function Core, National Eye Institute, National Institutes of Health

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy metodę rejestrowania wywołanych światłem reakcji elektrycznych nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) u myszy za pomocą techniki znanej jako DC-ERG, po raz pierwszy opisanej przez Marmorsteina, Peacheya i współpracowników na początku 2000 roku.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nabłonek barwnikowy siatkówki (RPE) to wyspecjalizowana monowarstwa komórek strategicznie rozmieszczona między siatkówką a naczyniówką, która utrzymuje ogólny stan zdrowia i integralność strukturalną fotoreceptorów. RPE jest spolaryzowany, wykazując receptory lub kanały zlokalizowane wierzchołkowo i podstawowo i wykonuje wektorowy transport wody, jonów, metabolitów i wydziela kilka cytokin.

Nieinwazyjne pomiary funkcji RPE in vivo mogą być wykonywane za pomocą bezpośrednio sprzężonych ERG (DC-ERG). Metodologia stojąca za DC-ERG została zapoczątkowana przez Marmorsteina, Peacheya i współpracowników przy użyciu niestandardowego systemu rejestracji stymulacji, a następnie zademonstrowana przy użyciu dostępnego na rynku systemu. Technika DC-ERG wykorzystuje szklane kapilary wypełnione buforowanym roztworem soli Hanka (HBSS) do pomiaru wolniejszych reakcji elektrycznych RPE wywołanych zmianami stężenia w przestrzeni podsiatkówkowej wywołanymi światłem w wyniku aktywności fotoreceptorów. Przedłużony bodziec świetlny i długość nagrania DC-ERG sprawiają, że jest on podatny na dryft i szumy, co skutkuje niską wydajnością użytecznych nagrań. W tym miejscu przedstawiamy szybką, niezawodną metodę poprawy stabilności nagrań przy jednoczesnej redukcji szumów poprzez wykorzystanie podciśnienia do redukcji/eliminacji pęcherzyków, które powstają w wyniku odgazowania HBSS i uchwytu elektrody. Dodatkowo artefakty linii energetycznej są tłumione za pomocą regulatora napięcia/kondycjonera mocy. Dołączamy niezbędne protokoły stymulacji światłem dla dostępnego na rynku systemu ERG, a także skrypty do analizy składowych DC-ERG: fala c, szybka oscylacja, szczyt świetlny i odpowiedź wyłączenia. Ze względu na większą łatwość zapisów i szybki przebieg analizy, ten uproszczony protokół jest szczególnie przydatny w pomiarze związanych z wiekiem zmian w funkcji RPE, progresji choroby oraz w ocenie interwencji farmakologicznej.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nabłonek barwnikowy siatkówki (RPE) to monowarstwa wyspecjalizowanych komórek, które wyściełają tylny segment oka i pełnią kluczowe funkcje w celu utrzymania homeostazy siatkówki1. RPE wspiera fotoreceptory, regenerując ich pigment wzrokowy wychwytujący fotony w procesie zwanym cyklem wzrokowym2, uczestnicząc w dobowej fagocytozie końcówek segmentów zewnętrznych zrzucanych3, oraz w transporcie składników odżywczych i produktów przemiany materii między fotoreceptorami a naczyniówką włosowatą4,5. Nieprawidłowości w funkcjonowaniu RPE leżą u podstaw wielu chorób siatkówki u ludzi, takich jak zwyrodnienie plamki żółtej związane z wiekiem6, wrodzona ślepota Lebera7,8 i Najlepsza dystrofia plamki żółtej w kształcie szklistości9. Ponieważ tkanki oka dawcy są często trudne do pozyskania wyłącznie do celów badawczych, modele zwierzęce z modyfikacjami genetycznymi mogą stanowić alternatywny sposób badania rozwoju chorób siatkówki10,11. Dodatkowo, pojawienie się i zastosowanie technologii CRISPR cas9 pozwala teraz na wprowadzenie genomu (knock-in) lub delecję (knock-out) w prostym, jednoetapowym procesie, przewyższając ograniczenia wcześniejszych technologii celowania w geny12. Gwałtowny wzrost dostępności nowych modeli myszy13 wymaga bardziej wydajnego protokołu nagrywania, aby nieinwazyjnie oceniać działanie RPE.

Pomiar reakcji elektrycznych RPE wywołanych światłem można osiągnąć za pomocą techniki elektroretinogramu bezpośrednio sprzężonego (DC-ERG). W połączeniu z konwencjonalnymi zapisami ERG, które mierzą odpowiedzi komórek fotoreceptora (załamek a) i bipolarny (fala b)14, DC-ERG może określić, w jaki sposób właściwości odpowiedzi RPE zmieniają się wraz ze zwyrodnieniem siatkówki15,16,17 czy też dysfunkcja RPE poprzedza utratę fotoreceptorów. Protokół ten opisuje metodę zaadaptowaną z pracy Marmorsteina, Peacheya i współpracowników, którzy jako pierwsi opracowali technikę DC-ERG16,18,19,20 i poprawia odtwarzalność oraz łatwość użycia.

Zapis DC-ERG jest trudny do wykonania ze względu na długi czas akwizycji (9 minut), podczas którego jakiekolwiek przerwanie lub wprowadzenie szumu może skomplikować interpretację danych. Zaletą tej nowej metody jest to, że linie podstawowe osiągają stan ustalony w krótszym czasie, co zmniejsza prawdopodobieństwo, że zwierzę obudzi się przedwcześnie ze znieczulenia i jest mniej podatne na tworzenie się pęcherzyków w elektrodach kapilarnych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół jest zgodny z wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami zawartymi w protokole badań na zwierzętach, zatwierdzonym przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Narodowego Instytutu Oka.

1. Importowanie protokołów stymulacji światłem dla DC-ERG

UWAGA: Postępuj zgodnie z poniższymi wskazówkami, aby zaimportować protokoły stymulacji światłem dla DC-ERG do oprogramowania systemu ERG (Tabela materiałów). Protokół składa się z 0,5-minutowego interwału przed bodźcem, po którym następuje krok światła (10 cd/m 2) przez 7 minut, a kończący się 1,5-minutowym interwałem po bodźcu. Natężenie światła 10 cd/m2 (1 log10 cd/m2) zostało wybrane, ponieważ wywołuje około połowy maksymalnej odpowiedzi dla wszystkich składników DC-ERG w myszy WT 18,21. Fala c i szybkie oscylacje są szczególnie interesujące, ponieważ pochodzenie tych reakcji elektrycznych jest dobrze scharakteryzowane i może być izolowane i dalej badane w modelach RPE in vitro (np. iPSC-RPE). Zastosowanie innych natężeń światła może wydobyć dodatkowe informacje, na przykład reakcja wyłączenia ulega odwróceniu polaryzacji przy jaśniejszych bodźcach świetlnych i może wykazywać różnice przy intensywności, przy której następuje to odwrócenie. Użytkownik ma możliwość zmiany ustawień natężenia światła według własnego uznania.

  1. Otwórz oprogramowanie systemowe ERG.
  2. Kliknij Centrum bazy danych.
  3. Kliknij Nowy (podaj nową nazwę pliku bazy danych). Kliknij Zapisz. W wyskakującym okienku pojawi się: "Utworzono bazę danych, czy chcesz połączyć się z nowym plikiem bazy danych?" Kliknij Tak. Bieżąca nazwa bazy danych powinna teraz odzwierciedlać nową nazwę pliku.
  4. Kliknij na Transfer In w oknie Centrum sterowania bazą danych.
  5. Wybierz Plik uzupełniający 1: LightProtocols - TRANSFER. EXP. Kliknij Otwórz.
  6. Kliknij Zamknij (Centrum sterowania bazą danych) po zakończeniu paska postępu.
  7. Kliknij zielony przycisk Start.
  8. Kliknij przycisk Nowy w oknie Wybierz pacjenta. Utwórz nową rodzinę pacjenta opisującą model myszy, wprowadź datę urodzenia (DOB, mm/dd/rrrr), przełącz przycisk płci (M/F) na odpowiedni opis. Kliknij przycisk Zamknij, aby zapisać szczegóły eksperymentu.
  9. Kliknij Protokoły. Dostosowane do ciemności protokoły ERG i DC-ERG powinny być teraz widoczne.
  10. Na koniec umieść plik Long Flash.col w następującym folderze C:\ERG User Files\Long Flash.col.

2. Przygotowanie elektrody kapilarnej

  1. Przeciąć szklane kapilary o grubości 1,5 mm na pół, używając płytki ceramicznej (tabela materiałów), aby naciąć szkło i rozbić je czysto za pomocą stołu, aby zapewnić fizyczną siłę przeciwstawną i ustabilizować szkło.
    UWAGA: W razie potrzeby stępić odcięte końce.
  2. Używając palnika Bunsena (tabela materiałów), pozwól, aby ciepło lekko zagięło się w kapilarze, jednocześnie przytrzymując je nad płomieniem za pomocą kleszczy.

3. Napełnianie elektrod kapilarnych

  1. Podłączyć eksykator próżniowy do laboratoryjnej linii próżniowej przez wbudowany filtr (tabela materiałów).
  2. Wlej 30 ml zbilansowanego roztworu soli Hanksa (HBSS) (tabela materiałów) do otwartej stożkowej probówki o pojemności 50 ml i umieść ją (ze zdjętą nakrętką) w komorze próżniowej.
  3. Włącz odkurzacz i odgazuj HBSS podczas włączania komputera i sprzętu nagrywającego.
  4. Po 5\u201210 min wyłącz próżnię i użyj odgazowanego HBSS do napełnienia strzykawki 12 ml przez dołączoną igłę 25 G. Użyj go do wypełnienia podstaw uchwytów elektrod, zachodząc dodatkowe środki ostrożności, aby nie wprowadzić pęcherzyków.
    1. W tym celu zdejmij gwintowaną nakrętkę i ostrożnie wsuń igłę strzykawki przez uszczelkę z gumy silikonowej, aby dotrzeć do tylnej ścianki (granulki srebra/chlorku srebra) uchwytu.
      UWAGA: Granulki srebra / chlorku srebra są lepsze od uchwytów wykorzystujących drut srebrny, ponieważ zapewniają większą powierzchnię, co skutkuje stabilną linią bazową o niskim poziomie hałasu. Jednak granulki srebra/chlorku srebra wymagają ciekłego interfejsu wolnego od pęcherzyków powietrza, aby uzyskać dobre połączenie. Dlatego należy bardzo uważać, aby podczas tego procesu nie wprowadzać pęcherzyków powietrza.
    2. Stopniowo wstrzykiwać HBSS, aby wypełnić całą mikroelektrodę, powoli wycofując igłę strzykawki. Ponownie załóż gwintowaną nasadkę, ale nie dokjaj. Ponownie włożyć igłę strzykawki, aby wypełnić pustą przestrzeń w nasadce HBSS. Następnie napełnij szklaną kapilarę, trzymając ją poziomo, aby zapobiec ucieczce roztworu z drugiego końca.
    3. Przytrzymaj szklaną kapilarnę od zgiętego końca i powoli włóż przeciwległy koniec przez poluzowaną nasadkę, a następnie dokręć nakrętkę na miejsce.
      UWAGA: Szklane elektrody wypełnione HBSS utrzymują smarowanie oka myszy i zapobiegają odwodnieniu rogówki, które wystąpiłoby przy użyciu standardowych elektrod ze złotą pętlą.
  5. Ustaw uchwyty elektrod tak, aby elektrody kapilarne były pochylone do góry, aby umożliwić wypływ pęcherzyków. Uruchom odkurzacz na 5–10 minut, aby odgazować. Gaz ulatniający się z powierzchni szklanych i plastikowych wypchnie HBSS z uchwytów elektrod.
  6. Zatrzymaj się, a następnie powoli zwolnij podciśnienie. Napełnij uchwyty elektrod i szklane kapilary zgodnie z wcześniejszym opisem.
    UWAGA: Bąbelki mają tendencję do gromadzenia się na uszczelce z gumy silikonowej lub w jej pobliżu, a także mogą chować się w rowkach gwintowanej nasadki, dlatego należy zwrócić szczególną uwagę, aby obszary te były wolne od pęcherzyków.
  7. Zamontuj i zamocuj uchwyt mikroelektrody w wykonanym na zamówienie stojaku z klipsem T/magnetycznym przegubem kulowym (Rysunek 1A, wstawka). Aby wykonać niestandardowy stojak na uchwyt mikroelektrody, zmodyfikuj zacisk T (rurka o średnicy zewnętrznej 5/16"-11/32") #8 (Tabela materiałów), usuwając czarne klipsy poliacetalowe z jednej strony. Zleć obcięcie podstawy cylindra magnetycznych przegubów kulowych na pół, aby wyregulować wysokość (Tabela materiałów). Przymocuj zmodyfikowane zaciski T do mocujących kulkę magnetyczną za pomocą nakrętek o rozmiarze M3.
  8. Umieść uchwyt mikroelektrody w zmodyfikowanym zacisku w kształcie litery T i przytrzymaj go mocno na miejscu, wsuwając około 1-calowy, zwężający się drewniany uchwyt wykonany z łamania bawełnianego patyczka do czyszczenia (tabela materiałów) pod kątem. Użyj podstawy cylindra z magnesem ziem rzadkich, aby bezpiecznie ustawić niestandardowy stojak uchwytu elektrody na metalowej płycie stolika, umożliwiając obrót o 360° wokół osi 180°.

4. Elektrody testowe

  1. Wlać HBSS do małego pojemnika (np. nakrętki stożkowej probówki o pojemności 50 ml).
  2. Delikatnie opuść w pełni zmontowane, wypełnione HBSS mikroelektrody kapilarne do nasadki zawierającej HBSS, aby wstępnie zrównoważyć elektrody i umieść elektrodę uziemiającą igłę (ogon/tylną nogę) oraz elektrodę referencyjną Ag/AgCl ze spiekanego granulatu (usta) w tym samym HBSS, aby zakończyć obwód (Rysunek 1A).
    UWAGA: Wszystkie kolejne kroki wykonuj przy przyciemnionym czerwonym świetle. Użyj latarki z czerwonym światłem, aby ustawić mysz i elektrody kapilarne. Pamiętaj, aby całkowicie wyłączyć wszystkie źródła światła przed rozpoczęciem nagrywania.
  3. Wybierz lub utwórz odpowiedni identyfikator (nazwisko rodowe) opisujący mysz, która ma być testowana i wybierz protokół DC-ERG, który ma zostać wykonany, kończąc rejestrację zgodnie z poniższą kolejnością.
    1. Kliknij Protokoły. Wybierz DC-ERG. Kliknij Uruchom. Pojawi się okno dialogowe: "Obecny pacjent to XXX [DATA URODZENIA: XX/XX/XX) Czy to jest poprawne dla wykonywanego testu?" Kliknij Tak. Następnie przejdź do "Krok 1/6".
  4. Zamknij drzwi do klatki Faradaya.
  5. Wyświetl tryb impedancji, klikając Impedancja i sprawdź, czy wartości dla odniesienia ust, uziemienia ogona i elektrod rejestrujących są dopuszczalne (patrz Rysunek 1B).
  6. Przetestuj stabilność linii bazowej (szum i dryft), klikając Krok (strzałka do przodu), aby wybrać Krok 4/6 "Długi błysk bez światła"
    UWAGA: Wielkość dryftu obserwowana po umieszczeniu elektrod w kąpieli HBSS jest na ogół mniejsza niż 500 μV na 80 s po ich ustabilizowaniu i jest równoważna dryftowi obserwowanemu, gdy elektrody są podłączone do myszy. W związku z tym odczyt elektryczny elektrod w kąpieli HBSS jest ważnym wskaźnikiem stanu elektrod. Hałas, mierzony od szczytu do szczytu, jest na ogół ~ 10-15% większy u myszy niż w kąpieli HBSS. Jest to prawdopodobnie spowodowane dodaniem artefaktów ruchowych z oddychania.
  7. Rozpocznij przeglądanie śladów, klikając Podgląd. Ścieżki powinny być niskoszumowe o amplitudzie międzyszczytowej <200 μV. Dopuszczalny jest niewielki dryft (<500 μV/80 s), który stopniowo zanika do linii bazowej (Rysunek 1C).

5. Pozycjonowanie myszy i elektrod

  1. Trzymaj myszy na noc w dobrze wentylowanym, szczelnym pudełku w celu adaptacji do ciemności.
  2. Znieczulić zwierzęta poprzez dootrzewnowe wstrzyknięcie ketaminy (80 mg/kg) i ksylazyny (8 mg/kg).
  3. Zastosuj miejscowo kroplę 0,5% proparakainy HCl, aby znieczulić rogówkę, a także kroplę 2,5% chlorowodorku fenylefryny i 0,5% tropikamidu, aby rozszerzyć źrenice.
  4. Przytnij wąsy myszy nożyczkami, aby zapobiec przypadkowemu drgawkom, które mogłyby zakłócić szklane elektrody kapilarne podczas nagrywania.
    UWAGA: Protokół bodźca DC-ERG w systemie ERG ma kilka wbudowanych procedur bodźców, które można wybrać, klikając Krok (strzałka do przodu) lub Krok (strzałka do tyłu). Tylko kroki 1, 4 i 5 w oprogramowaniu są wymagane do przygotowania i przeprowadzenia zapisu DC-ERG.
  5. W oprogramowaniu systemu ERG sprawdź, czy wybrano właściwego pacjenta. Kliknij zielony przycisk Protokoły. W obszarze Protocol Description (Opis protokołu) wybierz pozycję DC-ERG. Następnie kliknij Uruchom. Sprawdź, czy jest to prawidłowy wykonywany test, klikając Tak.
  6. Użyj bodźca czerwonego światła wyznaczonego w kroku 1/6, aby włączyć czerwone światło wewnątrz kopuły, aby pomóc ustawić mysz i elektrody podczas obserwacji zmian impedancji.
  7. Umieść mysz na podgrzewanym stole do nagrywania i ostrożnie przykryj skórę tylnej nogi za pomocą kleszczy. Trzymaj elektrodę igłową mocno jedną ręką i włóż ją podskórnie do tylnej nogi, aby zamocować ją na miejscu.
  8. Umieść elektrodę referencyjną Ag/AgCl (tabela materiałów) w jamie ustnej tak, aby spiekana osadówka spoczywała wzdłuż tylnego policzka i była utrzymywana na miejscu za zębami.
    UWAGA: Elektrody ze złotego drutu nie powinny być używane jako ustna elektroda odniesienia, ponieważ mają różne charakterystyki impedancji i zwiększają szum międzyszczytowy.
  9. Przed umieszczeniem elektrod kapilarnych w oku myszy przytrzymaj uchwyt elektrody ze szklanymi kapilarami pionowo, przesuń uchwyt elektrody palcem wskazującym, aby usunąć wszelkie pęcherzyki, które mogły zostać wprowadzone. Napełnij końcówkę HBSS za pomocą igły 25 G dołączonej do strzykawki i sprawdź, czy na końcówce nie ma pęcherzyków powietrza. Ustaw stojak uchwytu elektrody tak, aby otwarta końcówka naczyń włosowatych wypełnionych HBSS delikatnie stykała się z rogówką.
  10. Zachowaj szczególne środki ostrożności, aby uniknąć wprowadzania pęcherzyków powietrza, trzymając dozownik żelu do oczu z lubrykantem odwróconym do góry nogami i wyrzuć początkowe krople. Umieść kroplę nawilżającego żelu pod oczy na każdym oku, aby utrzymać przewodność i zapobiec wysuszeniu podczas nagrywania.

6. Nagrywanie DC-ERG

  1. Kliknij Krok (strzałka do przodu), aby wybrać Krok 4/6 "Długi błysk bez Li".
  2. Kliknij Impedancja. Użyj ekranu sprawdzania impedancji, aby sprawdzić rezystancję lewego i prawego oka. Oczekuje się, że wartości impedancji dla elektrod rejestrujących przy każdym oku będą podobne (~39 kΩ). Oczekuje się, że wartości impedancji zarówno dla elektrody uziemiającej, jak i elektrody odniesienia będą mniejsze niż 10 kΩ).
  3. Kliknij Podgląd, aby wyświetlić ślady dla lewego i prawego oka. Poczekaj, aż zostanie osiągnięty stabilny poziom bazowy (<10 min). Kliknij Zatrzymaj, aby wyjść z podglądu śledzenia.
    UWAGA: Nagłe zmiany kierunku dryftu lub nieprawidłowy szum w nagraniu nie poprawią się z czasem i będą wymagały zidentyfikowania elektrody kapilarnej, która wymaga uwagi. Najbardziej prawdopodobną przyczyną jest pęcherzyk wprowadzony do końcówki elektrody. Napełnij końcówkę HBSS. Kliknij ponownie Podgląd, aby sprawdzić linię bazową.
  4. Kliknij Krok (strzałka do przodu), aby wybrać Krok 5/6 "Długi błysk 10 cd 7 min".
  5. Kliknij Uruchom, aby rozpocząć nagrywanie (Rysunek 1D).

7. Eksport danych

  1. Wybierz "Pacjent" (nazwisko rodziny) opisujące nagranie myszy, które chcesz wyeksportować.
  2. Kliknij Stare testy.
  3. W obszarze Protocol Description (Opis protokołu) wybierz pozycję DC-ERG. Kliknij zielony przycisk Załaduj, aby załadować wcześniej pozyskane dane.
  4. Kliknij Krok (strzałka do przodu), aby przejść do kroku 5/6 "Long Flash 10 cd 7 min".
  5. Kliknij Eksportuj.
  6. Podaj nazwę pliku (np. filename.csv). Poprawna nazwa pliku musi zaczynać się od litery, po której następują litery, cyfry lub podkreślenia. Nie używaj znaków specjalnych ani łączników. Program do analizy danych (DCERG_Analysis.exe) wymaga, aby wpisy tabeli spełniały wymagania dotyczące nazw zmiennych.
  7. Umieść znacznik wyboru obok opcji Tabela danych. Obok pozycji separator wybierz pozycję Tab. Umieść znaczniki wyboru obok opcji Opcje (tytuły, pionowe), Uwzględnij wszystko (kroki, kanały, wyniki), kolumny danych (zawartość, wyniki, przeciągnięcia) i Format (plik).
  8. Następnie kliknij na Eksportuj (Rysunek 1E). Spowoduje to zapisanie pliku *.csv w folderze C:\Multifocusal.

8. Analiza danych

  1. Pobierz i zainstaluj odpowiedni instalator środowiska uruchomieniowego (tabela materiałów)
  2. Pobierz i zainstaluj instalator DCERG_Analysis.exe.
    UWAGA: Spowoduje to zainstalowanie skryptu, który przeprowadzi analizę komponentów DC-ERG i utworzy skrót do uruchomienia programu w folderze Menu Start.
  3. Kliknij skrót utworzony w menu Start > folderze Programy.
  4. Wybierz wyeksportowany plik lub pliki danych (*.csv) do analizy. Użyj Ctrl + lewy przycisk myszy myszy, aby wybrać więcej niż jeden plik.
    UWAGA: Plik wykonywalny generuje dwa typy wykresów: 1) surowe dane są wykreślane z linią najlepszego dopasowania wskazującą zmierzony dryf; 2) Odpowiedź skorygowana o dryft jest wykreślana po wygładzeniu za pomocą średniej ruchomej (o rozpiętości ~5 s). Na podstawie tego wykresu identyfikowane są amplitudy i czas do osiągnięcia szczytu składowych DC-ERG: fala c, szybka oscylacja, szczyt światła i odpowiedź wyłączenia. Dane są następnie eksportowane w formacie tabeli do programu Excel, gdzie każdy arkusz odpowiada innemu nagraniu myszy. Po tych arkuszach znajdują się dwa arkusze podsumowujące: (i) zestawione amplitudy DC-ERG (mV); (ii) skompilowany czas DC-ERG do szczytów (początek światła, t = 0 min).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rysunek 2 to przykładowy zestaw danych od myszy miR-204 ko/ko cre/+ (warunkowy KO) i dzikich (WT). MiR-204 ko/ko cre/+ to myszy z warunkowym nokautem mikroRNA 204 w nabłonku barwnikowym siatkówki. Myszy te są generowane przez krzyżowanie myszy miR-204 z floksami (wyprodukowanymi przez NEIGEF)22 z myszami VMD2-CRE23. MiR-204 ulega silnej ekspresji w RPE, gdzie reguluje ekspresję białek krytycznych dla funkcji nabłonka, które utrzymują ścisłą int...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kroki krytyczne

Dobry zapis DC-ERG wymaga stabilnych elektrod, które są wolne od pęcherzyków, które tworzą artefakty i niepożądany dryf, ponieważ są niezwykle wrażliwe na odgazowanie i zmiany temperatury. Istotne jest, aby osiągnąć stabilną linię bazową, gdy elektrody zostaną umieszczone w roztworze kąpieli HBSS przed przystąpieniem do nagrywania za pomocą myszy. Małe pęcherzyki mają tendencję do gromadzenia się u podstawy elektrody kapilarnej lub wokół uszczelki silikonowej i...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez wewnętrzne fundusze NEI. Autorzy serdecznie dziękują dr Sheldonowi Millerowi za jego wskazówki naukowe, porady techniczne i wiedzę specjalistyczną w zakresie fizjologii i chorób RPE. Autorzy dziękują Megan Kopera i personelowi zajmującemu się opieką nad zwierzętami za zarządzanie koloniami myszy, a także dr Tarunowi Bansalowi, Raymondowi Zhou i Yuan Wangowi za wsparcie techniczne.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Elektroda Ag/AgCl (ustna) WPIIncEP1Elektroda referencyjna do ust dla myszy
Ceramiczna płytkaSutter InstrumentCTSSłuży do cięcia szklanej rurki kapilarnej do odpowiedniego rozmiaru
Sztyft do czyszczenia z bawełnianą końcówkąPuritan Medical Products867-WC Bez klejuDo stosowania jako przekładka w celu poprawy dopasowania zespołu uchwytu elektrody
System elektroretinogramu (ERG)Diagnosys Sp. z o.oSystem E3System elektrofizjologii wizualnej do diagnozowania schorzeń okulistycznych w badaniach wzroku i próbach leków
Palnik BunsenaArgos TechnologiesBW20002460Lub odpowiednik szkła kształtowego pod płomieniem
Szklana rurka kapilarna (1,5 mm)Sutter InstrumentsBF150-75Do napełniania HBSS i nawiązywania kontaktu z rogówką
Hank' s Buforowany roztwór soli (HBSS)Thermo Fisher Scientific Inc14175-095Dostępny w handlu. Konserwacja w RT
Filtr liniowyWhatman6722-5001Do ochrony pompy próżniowej przed aerozolami
o niskim poziomie szumów do uchwytów mikroelektrodWPI Inc5372Sugerowany w celu poprawy długości i rozmieszczenia i zespołów uchwytów elektrod
Magnetyczny przegub kulowyWPI Inc500871Do magnetycznego pozycjonowania zespołu uchwytu elektrody na scenie
MatLabMathworksMatLab: Do edycji oprogramowania analitycznego
MatLab Curvefit ToolboxMathworksToolbox dla MatLab (wymagany tylko do edycji oprogramowania do analizy)
MatLab CompilerMathworksToolbox dla MatLab (wymagany tylko do edycji i ponownego wydania oprogramowania do analizy)
MatLab Runtime wersja 9.5MathworksR2018b (9.5)Wymagane do uruchomienia oprogramowania analitycznego: https://www.mathworks.com/products/compiler/matlab-runtime.html
Uchwyty mikroelektrod (45 stopni)WPI IncMEH345-15Do przytrzymywania naczyń włosowatych
Igła (25 ga)Covidien8881250313Do napełniania kapilar HBSS
Elektroda igłowa (uziemiająca) Rhythmlink13mm - jedna elctrodePodskórna elektroda igłowa (uziemiająca) dla myszy (igła o długości 13 mm, średnicy 0,4 mm, przewód 1,5 m)
Regulator/kondycjoner mocyFurmanP-1800Lub równoważny do usuwania przesunięcia DC od hałasu wprowadzanego przez linię energetyczną
Strzykawka (12 mL)Monoject1181200777Do napełniania kapilar klipsem HBSS
T-clipCole-Parmer06852-20Do montażu uchwytu elektrody
Eksykator próżniowyBel-Art420120000Przezroczyste dno i pokrywa
Leczenie farmakologiczne
Smar żel pod oczyAlcon0078-0429-47Pomaga smarować powierzchnię rogówki i utrzymywać kontakt elektryczny z elektrodami kapilarnymi
Chlorowodorek fenylefryny 2.5%Akorn17478-201-15Krótko działające krople do oczu z rozszerzaniem źrenic (do rozszerzania źrenic)
Chlorowodorek proparakainy 0,5%Akorn17478-263-12Znieczulenie miejscowe do wkraplania okulistycznego
Tropicamid 0,5%Akorn17478-101-12Krótko działające krople do oczu na rozszerzenie źrenic (do rozszerzania źrenic)
KsylazynaAnaSedsc-362949RxŚrodek przeciwbólowy i zwiotczający mięśnie
Zetamine (Ketamine HCl)VetOne501072Środek znieczulający do wstrzykiwań domięśniowych
. z poliwęglanu

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Steinberg, R. H. Interactions between the retinal pigment epithelium and the neural retina. Documenta Ophthalmologica. 60 (4), 327-346 (1985).
  2. Sahu, B., Maeda, A. RPE Visual Cycle and Biochemical Phenotypes of Mutant Mouse Models. Methods in Molecular Biology. 1753, 89-102 (2018).
  3. Mazzoni, F., Safa, H., Finnemann, S. C. Understanding photoreceptor outer segment phagocytosis: use and utility of RPE cells in culture. Experimental Eye Resarch. 126, 51-60 (2014).
  4. Wimmers, S., Karl, M. O., Strauss, O. Ion channels in the RPE. Progress in Retinal Eye Research. 26 (3), 263-301 (2007).
  5. Gundersen, D., Orlowski, J., Rodriguez-Boulan, E. Apical polarity of Na,K-ATPase in retinal pigment epithelium is linked to a reversal of the ankyrin-fodrin submembrane cytoskeleton. Journal of Cell Biology. 112 (5), 863-872 (1991).
  6. Fletcher, E. L., et al. Studying age-related macular degeneration using animal models. Optometry and Vision Science. 91 (8), 878-886 (2014).
  7. Gu, S. M., et al. Mutations in RPE65 cause autosomal recessive childhood-onset severe retinal dystrophy. Nature Genetics. 17 (2), 194-197 (1997).
  8. Marlhens, F., et al. Mutations in RPE65 cause Leber's congenital amaurosis. Nature Genetics. 17 (2), 139-141 (1997).
  9. Marmorstein, A. D., et al. the product of the Best vitelliform macular dystrophy gene (VMD2), localizes to the basolateral plasma membrane of the retinal pigment epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 97 (23), 12758-12763 (2000).
  10. Chang, B. Mouse models for studies of retinal degeneration and diseases. Methods in Molecular Biology. 935, 27-39 (2013).
  11. Collin, G. B., et al. Mouse Models of Inherited Retinal Degeneration with Photoreceptor Cell Loss. Cells. 9 (4), (2020).
  12. Shrock, E., Güell, M. CRISPR in Animals and Animal Models. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 152, 95-114 (2017).
  13. Smalley, E. CRISPR mouse model boom, rat model renaissance. Nature Biotechnology. 34 (9), 893-894 (2016).
  14. Benchorin, G., Calton, M. A., Beaulieu, M. O., Vollrath, D. Assessment of Murine Retinal Function by Electroretinography. Bio Protocol. 7 (7), (2017).
  15. Zhang, C., et al. Regulation of phagolysosomal activity by miR-204 critically influences structure and function of retinal pigment epithelium/retina. Human Molecular Genetics. 28 (20), 3355-3368 (2019).
  16. Samuels, I. S., et al. Light-evoked responses of the retinal pigment epithelium: changes accompanying photoreceptor loss in the mouse. Journal of Neurophysiology. 104 (1), 391-402 (2010).
  17. Wu, J., Marmorstein, A. D., Peachey, N. S. Functional abnormalities in the retinal pigment epithelium of CFTR mutant mice. Experimental Eye Research. 83 (2), 424-428 (2006).
  18. Wu, J., Peachey, N. S., Marmorstein, A. D. Light-evoked responses of the mouse retinal pigment epithelium. Journal of Neurophysiology. 91 (3), 1134-1142 (2004).
  19. Peachey, N. S., Stanton, J. B., Marmorstein, A. D. Noninvasive recording and response characteristics of the rat dc-electroretinogram. Visual Neuroscience. 19 (6), 693-701 (2002).
  20. Samuels, I. S., Bell, B. A., Pereira, A., Saxon, J., Peachey, N. S. Early retinal pigment epithelium dysfunction is concomitant with hyperglycemia in mouse models of type 1 and type 2 diabetes. Journal of Neurophysiology. 113 (4), 1085-1099 (2015).
  21. Marmorstein, L. Y., et al. The light peak of the electroretinogram is dependent on voltage-gated calcium channels and antagonized by bestrophin (best-1). Journal of General Physiology. 127 (5), 577-589 (2006).
  22. Zhang, C., et al. Invest. Ophtalmol. Vis. Sci. Annual Meeting for the Association for Research in Vision and Ophthalmology. , 3568(2017).
  23. Iacovelli, J., et al. Generation of Cre transgenic mice with postnatal RPE-specific ocular expression. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 52 (3), 1378-1383 (2011).
  24. Wang, F. E., et al. MicroRNA-204/211 alters epithelial physiology. FASEB Journal. 24 (5), 1552-1571 (2010).
  25. He, L., Marioutina, M., Dunaief, J. L., Marneros, A. G. Age- and gene-dosage-dependent cre-induced abnormalities in the retinal pigment epithelium. American Journal of Pathology. 184 (6), 1660-1667 (2014).
  26. Gallemore, R. P., Steinberg, R. H. Light-evoked modulation of basolateral membrane Cl- conductance in chick retinal pigment epithelium: the light peak and fast oscillation. Journal of Neurophysiology. 70 (4), 1669-1680 (1993).
  27. Blaug, S., Quinn, R., Quong, J., Jalickee, S., Miller, S. S. Retinal pigment epithelial function: a role for CFTR. Documenta Ophthalmologica. 106 (1), 43-50 (2003).
  28. Gallemore, R. P., Griff, E. R., Steinberg, R. H. Evidence in support of a photoreceptoral origin for the "light-peak substance". Investigative Ophthalmology and Visual Science. 29 (4), 566-571 (1988).
  29. Shahi, P. K., et al. Abnormal Electroretinogram after Kir7.1 Channel Suppression Suggests Role in Retinal Electrophysiology. Science Reports. 7 (1), 10651(2017).
  30. Li, Y., et al. Mouse model of human RPE65 P25L hypomorph resembles wild type under normal light rearing but is fully resistant to acute light damage. Human Molecular Genetics. 24 (15), 4417-4428 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Bezpo rednio sprz ony ERGfunkcja RPE myszyodpowiedzi wywo ane wiat emprzygotowanie elektrod kapilarnychkapilary wype nione HBSSbadanie impedancji elektrodaktywno fotoreceptor wanaliza fali Czwi zane z wiekiem zmiany RPE

Powiązane artykuły