Method Article

Ekstrakcja i oznaczanie ilościowe rozpuszczalnych, znakowanych radioaktywnie polifosforanów inozytolu z różnych gatunków roślin przy użyciu SAX-HPLC

DOI:

10.3791/61495

⸱

June 26th, 2020

 ,  ,  , 
1Department of Plant Nutrition, Institute of Crop Science and Resource Conservation, University of Bonn

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisujemy wysokosprawną chromatografię cieczową z silną wymianą anionów siewek znakowanych [3H]-mio-inozytolem, która jest bardzo czułą metodą wykrywania i ilościowego oznaczania polifosforanów inozytolu w roślinach.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Estry fosforanowe mio-inozytolu, zwane również fosforanami inozytolu (InsP), to klasa regulatorów komórkowych odgrywających ważną rolę w fizjologii roślin. Ze względu na ich ujemny ładunek, niską liczebność i podatność na aktywność hydrolityczną, wykrycie i kwantyfikacja tych cząsteczek jest wyzwaniem. Dotyczy to w szczególności wysoce ufosforylowanych form zawierających "wysokoenergetyczne" wiązania difosfo, zwanych również pirofosforanami inozytolu (PP-InsP). Ze względu na wysoką czułość, wysokosprawna chromatografia cieczowa z silną wymianą anionową (SAX-HPLC) roślin znakowanych [3H]-mio-inozytolem jest obecnie metodą z wyboru do analizy tych cząsteczek. Stosując [3H]-mio-inozytol do znakowania radioizotopem siewek roślin, różne gatunki InsP, w tym kilka izomerów nieenancjomerycznych, mogą być wykrywane i rozróżniane z wysoką czułością. W tym miejscu opisano konfigurację odpowiedniego systemu SAX-HPLC, a także cały przebieg procesu od uprawy roślin, znakowania radioaktywnego i ekstrakcji InsP po przebieg SAX-HPLC i późniejszą analizę danych. Przedstawiony tutaj protokół pozwala na dyskryminację i kwantyfikację różnych gatunków InsP, w tym kilku izomerów nieenancjomerycznych oraz PP-InsPs, InsP7 i InsP8, i może być łatwo dostosowany do innych gatunków roślin. Jako przykłady przeprowadzono analizy SAX-HPLC siewek rzodkiewnika pospolitego (Arabidopsis thaliana) i siewek rzodkiewnika japońskiego (Arabidopsis thaliana) oraz przedstawiono i omówiono pełne profile InsP. Opisana tutaj metoda stanowi obiecujące narzędzie do lepszego zrozumienia biologicznych ról InsP w roślinach.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prawie cztery dekady temu, fosforany inozytolu (InsP) pojawiły się jako cząsteczki sygnałowe, po tym jak Ins(1,4,5)P3 (InsP3) został zidentyfikowany jako drugi przekaźnik, który aktywuje uwalnianie Ca2+ za pośrednictwem receptora w komórkach zwierzęcych1,2. Do tej pory nie zidentyfikowano żadnego receptora InsP3 (IP3-R) u roślin, co kwestionuje bezpośrednią rolę sygnalizacyjną InsP3 w komórkach roślinnych3. Niezależnie od tego, InsP3 służy jako prekursor dla innych InsP zaangażowanych w kilka procesów rozwojowych roślin, w tym regulację określonych szlaków sygnałowych3,4,5,6,7,8. Na przykład InsP3 może być dalej fosforylowany do InsP6, znanego również jako "kwas fitynowy", który stanowi główne źródło fosforanów, mio-inozytolu i kationów, i wykazano, że odgrywa kluczową rolę w obronie roślin przed patogenami, eksportem mRNA i homeostazą fosforanów5,9,10,11,12.

Pirofosforany inozytolu (PP-InsPs) to klasa InsP, które zawierają co najmniej jedno wysokoenergetyczne wiązanie di-fosfo, początkowo zidentyfikowane w komórkach zwierzęcych, amebach i drożdżach, gdzie odgrywają kluczową rolę w różnych procesach komórkowych13,14,15. Pomimo przełomowych prac nad PP-InsP w roślinach16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26, funkcje biologiczne i tożsamość izomerów tych cząsteczek nadal pozostają w dużej mierze zagadkowe. W modelowej roślinie Arabidopsis thaliana zaproponowano komórkowy InsP8 w celu regulacji obrony przed owadami, roślinożercami i grzybami nekrotroficznymi poprzez koincydencyjne wykrywanie InsP8 i aktywnego jasmonianu przez kompleks receptorów ASK1-COI1-JAZ17. Ponadto zaproponowano rolę InsP8 i innych PP-InsP w homeostazie energetycznej i wykrywaniu składników odżywczych, a także homeostazie fosforanów17,23,24,25,26.

Niezależnie od zastosowanego systemu biologicznego, jednym z głównych wyzwań metodologicznych podczas badania InsP było niezawodne wykrywanie i precyzyjne oznaczanie ilościowe tych molekuł. Metody oparte na spektrometrii mas zostały wykorzystane do wykrycia InsP, w tym PP-InsP, z ekstraktów komórkowych. Jednak badania te nie zdołały rozróżnić różnych izomerów26,27. Inne podejście do analizy InsP wykorzystuje ściąganie InsP z lizatów komórkowych za pomocą kulek TiO2, a następnie elektroforezę w żelu poliakrylamidowym (PAGE) eluowanych InsP. InsP mogą być następnie barwione błękitem toluidynowym lub DAPI24,28,29. Jednak do tej pory nie jest możliwe wiarygodne wykrycie InsP niższych niż InsP5 z ekstraktów roślinnych przy użyciu tej metody. Niedawno opublikowano metodę wykorzystującą [13C]-mio-inozytol do analizy InsP metodą magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) jako alternatywę dla wysokosprawnej chromatografii cieczowej z wymianą silnego anionu (SAX-HPLC)30. Doniesiono, że technika ta osiąga podobną czułość w porównaniu z SAX-HPLC i umożliwia wykrywanie 5-InsP7, a także rozróżnianie różnych nieenancjomerycznych izomerów InsP5 z ekstraktów komórkowych. Jednak implementacja metody opartej na NMR wymaga chemicznie zsyntetyzowanego i niedostępnego komercyjnie [13C]-mio-inozytolu. Dlatego metodą stosowaną w większości przypadków jest znakowanie radioizotopowe próbek za pomocą [3H]-mio-inozytolu, a następnie SAX-HPLC31,32,33. Technika ta opiera się na wychwytywaniu radioaktywnego mio-inozytolu do rośliny i jego przekształcaniu w różne InsP przez połączoną aktywność dedykowanych kinaz komórkowych i fosfataz

.

InsP znakowane [3H] są następnie ekstrahowane kwasem i frakcjonowane za pomocą SAX-HPLC. Ze względu na ich ujemny ładunek, InsP silnie oddziałują z dodatnio naładowaną fazą stacjonarną kolumny SAX-HPLC i mogą być eluowane za pomocą gradientu buforu zawierającego rosnące stężenia fosforanów, aby wyprzedzić InsP z kolumny. Czas elucji zależy zatem od ładunku i geometrii gatunków InsP, które mają być oddzielone. W przypadku braku kolumn chiralnych, tylko izomery nieenancjomeryczne mogą być oddzielone przez ten protokół. Jednak wzorce znakowane radioaktywnie mogą być używane do przypisania izomerycznego charakteru określonego piku InsP. Wielokrotne wysiłki podejmowane w przeszłości przez różne laboratoria w celu wygenerowania oznakowanych i nieoznakowanych wzorców metodami (bio)chemicznymi lub oczyszczenia ich z różnych komórek i organizmów pomogły przypisać piki niektórym gatunkom InsP, a także zawęzić tożsamość izomeryczną poszczególnych gatunków InsP5,7,21,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43. Również niedawne wyjaśnienie szlaków enzymatycznych prowadzących do powstawania PP-InsP w roślinach, a także odkrycie efektora bakteryjnego typu III o specyficznej aktywności 1-fitazy, dostarczają informacji o tym, jak generować użyteczne standardy dla tych analiz10,17,18,22,23.

Wynikowe frakcje mogą być mierzone w liczniku scyntylacyjnym cieczy ze względu na β-rozpad trytu (3H). Wraz ze wzrostem czasu znakowania osiągana jest równowaga izotopowa w stanie ustalonym, po której uzyskane profile InsP powinny reprezentować status InsP rośliny31. Główną zaletą tego protokołu w porównaniu z innymi dostępnymi technikami jest wysoka czułość osiągnięta dzięki zastosowaniu bezpośredniego prekursora InsP i pomiarowi sygnału radioaktywnego.

SAX-HPLC próbek wyekstrahowanych z roślin lub innych organizmów znakowanych [3H]-mio-inozytolem jest powszechnie używany do wykrywania i kwantyfikacji InsP, począwszy od niższych gatunków InsP do PP-InsPs, stanowiąc cenne narzędzie do lepszego zrozumienia metabolizmu, funkcji i sposobów działania InsP. Jak dotąd, metoda ta jest również najodpowiedniejszym wyborem dla badaczy szczególnie zainteresowanych gatunkami o niższym poziomie InsP. Chociaż podstawy tej procedury, na której opiera się opisany tutaj protokół, zostały już wcześniej opisane7,21,31,34, nadal brakuje szczegółowego protokołu dostosowanego do analizy InsP pochodzenia roślinnego, a zwłaszcza PP-InsPs. W poprzednich publikacjach informowano o trudnościach w wiarygodnym wykryciu niskiej zawartości PP-InsP, zwłaszcza InsP8, ze względu na jeden lub więcej z następujących czynników: stosunkowo małe ilości materiału roślinnego, [3H]-mio-inozytol o niskiej aktywności właściwej (> 20 Ci/mmol), stosowanie ekstrakcyjnych, które albo nie są oparte na kwasie nadchlorowym, albo są stężone poniżej 1 M, różne neutralizujące, a także nieoptymalne gradienty lub detekcja [3H] za pomocą detektora on-line. W porównaniu z tamtymi badaniami, przedstawiony tutaj protokół został zaprojektowany z myślą o niezawodnym wykrywaniu PP-InsPs7,21,34.

Tutaj prezentujemy szczegółowy przebieg pracy, począwszy od konfiguracji sprzętu, poprzez uprawę roślin i etykietowanie, ekstrakcję InsP i sam przebieg SAX-HPLC. Chociaż metoda została zoptymalizowana pod kątem modelowej rośliny A. thaliana, można ją łatwo zmodyfikować w celu zbadania innych gatunków roślin, jak pokazano tutaj z pierwszym zgłoszonym profilem InsP modelowej rośliny strączkowej Lotus japonicus. Chociaż użycie różnych gatunków roślin może wymagać pewnej optymalizacji, przewidujemy, że będą one niewielkie, co czyni ten protokół dobrym punktem wyjścia do dalszych badań nad InsP roślin. Aby ułatwić ewentualne optymalizacje, wskazujemy każdy krok w protokole, w którym możliwe są modyfikacje, a także wszystkie krytyczne kroki, które mogą być wyzwaniem przy ustalaniu metody po raz pierwszy. Dodatkowo informujemy, w jaki sposób dane uzyskane tą metodą można wykorzystać do ilościowego oznaczania określonych InsP oraz jak można analizować i porównywać różne próbki.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Konfiguracja systemu HPLC

  1. Skonfiguruj system składający się z dwóch niezależnych pomp HPLC (pompa binarna), po jednej dla każdego bufora. Obie pompy muszą być sterowane razem za pomocą komputera z odpowiednim oprogramowaniem lub za pomocą pompy głównej. Wdrożyć płukanie uszczelnienia tłoka dla obu pomp, albo za pomocą siły grawitacji, albo za pomocą trzeciej pompy niskiego ciśnienia. Wyznaczyć jedną pompę dla buforu A (określaną jako pompa A) i jedną dla bufora B (określaną jako pompa B).
    UWAGA: Oba muszą być w stanie wytworzyć ciśnienie do 60 bar (6 MPa) i natężenie przepływu co najmniej 0,5 ml/min.
  2. Podłącz obie pompy do mieszalnika dynamicznego.
  3. Podłączyć mieszalnik do zaworu iniekcyjnego z pętlą próbki o pojemności co najmniej 1 ml.
  4. Podłączyć zawór wtryskowy do kolumny z kapilarą za pomocą odpowiednich końcówek.
  5. Podłączyć kolumnę do kolektora frakcji za pomocą kapilary o odpowiedniej długości.
    UWAGA: Ten opis opiera się na naszym systemie HPLC (patrz Tabela materiałów), który wymaga więcej ręcznych kroków niż nowsze i bardziej wyrafinowane systemy. Nasz system umożliwia łatwy dostęp i modyfikację wszystkich komponentów. Można również zastosować pompy czwartorzędowe (z opisanym tutaj gradientem binarnym), które doprowadzą do uzyskania profili elucji i ogólnej jakości analiz podobnych do tych osiąganych za pomocą pomp binarnych.

2. Przygotowanie, kolumny i systemu HPLC

  1. Przygotować do ekstrakcji rozpuszczalnych InsP: bufor ekstrakcyjny (1 M HClO4) i bufor neutralizacyjny (1 M K2CO3 ). Przygotuj oba z ultra czystą wodą dejonizowaną. Są stabilne w temperaturze pokojowej przez kilka miesięcy. Bezpośrednio przed ekstrakcją dodać EDTA do obu roztworów do końcowego stężenia 3 mM (np. z przefiltrowanego roztworu podstawowego EDTA o stężeniu 250 mM).
    UWAGA: HClO4 (kwas nadchlorowy) jest silnie.
  2. Przygotować do przebiegu SAX-HPLC: bufor A (1 mM EDTA) i bufor B (1 mM EDTA, 1,3 M (NH4)2HPO4; pH 3,8 z H3PO4). Przygotuj oba przy użyciu ultraczystej wody dejonizowanej, a następnie przeprowadź filtrację próżniową za pomocą filtrów membranowych o wielkości porów 0,2 μm. Są one stabilne w temperaturze pokojowej przez kilka miesięcy.
    UWAGA: EDTA powinien być zawarty we wszystkich, aby zapobiec interakcjom kationów z InsP, które mogłyby skutkować zmienionym ładunkiem InsP lub nawet nierozpuszczalnymi kompleksami soli InsP.
  3. Zaprogramuj gradient w następujący sposób: 0\u20122 min, 0% bufor B; 2\u20127 min, do 10% bufora B; 7\u201268 min, do 84% bufora B; 68\u201282 min, do 100% bufora B; 82\u2012100 min, 100% bufor B, 100\u2012101 min, do 0% bufora B; 101\u2012125 min, Bufor 0% B. Optymalne natężenie przepływu dla tego gradientu wynosi 0,5 ml/min.
    1. Podczas biegu zbieraj ułamki co minutę, zaczynając od minuty 1 do minuty 96. Pozostałe 30 minut gradientu służy do mycia kolumny i układu i nie musi być zbierane do zliczania scyntylacyjnego.
  4. Jeśli to możliwe, należy ustawić maksymalne osiągalne ciśnienie przed awaryjnym wyłączeniem pomp HPLC na 80 bar (8 MPa). Zapobiega to krytycznym uszkodzeniom żywicy kolumny.
  5. W przypadku korzystania z nowej kolumny SAX HPLC należy ją dokładnie umyć (>50 ml) przefiltrowaną ultraczystą wodą dejonizowaną przed pierwszym użyciem.
    UWAGA: Zapewni to usunięcie zawartego metanolu, zapobiegając w ten sposób wytrącaniu się soli w późniejszych etapach. Jeśli to możliwe, użyj oddzielnej pompy HPLC. Jeśli nie jest to możliwe, upewnij się, że HPLC została przepłukana wodą przed umyciem kolumny. Natężenie przepływu nie powinno przekraczać 2 ml/min. Po umyciu kolumna jest gotowa do analizy i przy odpowiednim obchodzeniu się z nią może być >używana przez 20–40 przebiegów. Następnie rozdzielczość będzie się sukcesywnie zmniejszać. Przedłużone mycie buforem A (>1 h) i wykonanie kroku 2.6 może pomóc w wydłużeniu żywotności kolumny. Jeśli spadek rozdzielczości będzie się powtarzał, kolumnę należy wymienić. Gradient można dostosować, aby zwiększyć separację między określonymi gatunkami polifosforanu inozytolu lub skrócić całkowity czas pracy. Stosowanie różnych systemów HPLC (o różnej objętości pustych przestrzeni lub różnej objętości naczyń włosowatych) silnie wpłynie na czas retencji. Ponadto zmiany kolumn mają niewielki wpływ na czasy przechowywania.
  6. Wykonaj "próbny przebieg". Zamiast wyekstrahowanej próbki, wstrzyknąć przefiltrowaną ultraczystą wodę dejonizowaną do systemu HPLC i uruchomić standardowy gradient. Frakcje nie muszą być zbierane.
    UWAGA: Krok 2.6 jest opcjonalny. Należy go jednak wykonać, jeśli zachodzi jedna z następujących sytuacji: Zainstalowano nową kolumnę; System HPLC był wcześniej używany do innej metody; System HPLC nie był używany dłużej niż 3 dni; Wystąpił problem z poprzednim uruchomieniem.

3. Uprawa roślin i etykietowanie za pomocą [3H]-mio-inozytolu

UWAGA: Następujące kroki powinny być wykonywane z użyciem sterylnych komponentów i w sterylnych warunkach, podczas noszenia rękawiczek, aby chronić ręce przed zanieczyszczeniem radioznacznikiem. Pożywki roślinne, zwłaszcza zawierające sacharozę, są podatne na zanieczyszczenie mikrobiologiczne.

  1. Sterylizuj nasiona A. thaliana 1 ml 1,2% podchlorynu sodu przez 3 minuty, a następnie 1 ml 70% etanolu przez 3 minuty. Następnie dodaj 1 ml 100% etanolu, odpipetuj nasiona etanolem na okrągłą bibułę filtracyjną i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu pod przepływem laminarnym na czystej ławce.
    1. Używając nasion L. japonicus, umieść je w moździerzu i wyszoruj nasiona papierem ściernym przed sterylizacją, aby zapewnić wystarczającą zdolność kiełkowania.
  2. Wysiewaj nasiona rzodkiewnika w 1–2 rzędach na kwadratowych szalkach Petriego wypełnionych stałą pożywką wzrostową składającą się z roztworu soli Murashige i Skooga (MS) o połowie mocy, 1% sacharozy, 0,7% gumy gellan w wodzie dejonizowanej dostosowanej do pH 5,7 z KOH i pozwól im rozwarstwiać się przez co najmniej 1 dzień w temperaturze 4 °C w ciemności.
    1. W przypadku nasion lotosu wysiewaj je w 1 rzędzie na kwadratowych szalkach Petriego wypełnionych stałą pożywką wzrostową składającą się z 0,8% agaru bakteriologicznego w wodzie dejonizowanej i pozwól im rozwarstwiać się przez co najmniej 3 dni w temperaturze 4 °C w ciemności.
  3. Umieść płytki pionowo w inkubatorze wzrostu lub komorze klimatycznej i pozwól im rosnąć przez 10–12 dni w warunkach krótkiego dnia (8 godzin światła w temperaturze 22 °C, 16 godzin ciemności w temperaturze 20 °C).
  4. Przenieś 10-20 sadzonek do jednego dołka 12-dołkowej, przezroczystej, płaskodennej płytki do hodowli komórkowej, wypełnionej 2 ml roztworu soli MS o połowie mocy, uzupełnionego 1% sacharozą i dostosowanego do pH 5,7.
  5. Dodać 45 μCi [3H]-mio-inozytolu (30–80 Ci/mmol, rozpuszczonego w 90% etanolu) i wymieszać, delikatnie mieszając. Przykryj płytkę odpowiednią pokrywką i uszczelnij ją mikroporowatą taśmą chirurgiczną (np. taśmą mikroporową lub leukoporową), umieszczając ją z powrotem w inkubatorze wzrostu.
    UWAGA: [3H] to niskoenergetyczny emiter beta, który może stanowić szkodliwe zagrożenie promieniowaniem w przypadku wdychania, spożycia lub wchłonięcia przez gołą skórę. Zawsze noś rękawice podczas pracy z materiałami radioaktywnymi lub sprzętem, który ma bezpośredni lub pośredni kontakt z materiałem radioaktywnym. Należy również przestrzegać lokalnych przepisów dotyczących bezpiecznego obchodzenia się z substancjami promieniotwórczymi (np. noszenie dodatkowej odzieży ochronnej, korzystanie z dozymetru i regularne badania powierzchni pod kątem zanieczyszczeń).
  6. Po 5 dniach etykietowania usuń sadzonki z podłoża i krótko je umyj wodą dejonizowaną. Osusz je ręcznikami papierowymi i przenieś do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Nie przepełniaj probówki i nie umieszczaj więcej niż 100 mg FW/probówkę, co odpowiada około 10\u201220 17-dniowym siewkom.
    UWAGA: Nadmiar materiału roślinnego rozcieńczy kwas podczas procesu ekstrakcji i znacznie zmniejszy wydajność ekstrakcji.
    1. Błyskawicznie zamrozić probówkę w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu ekstrakcji.
      UWAGA: Próbki można przechowywać w temperaturze -80 °C przez kilka tygodni bez pogorszenia jakości próbki. Warunki wzrostu (pożywka, światło, temperatura, czas) mogą być modyfikowane zgodnie z potrzebami konkretnego eksperymentu lub gatunku rośliny. Należy jednak zachować ostrożność podczas rozcieńczania [3H]-mio-inozytolu, w celu zapewnienia wymiernych przebiegów SAX-HPLC o dobrej jakości. Dlatego zaleca się rozpoczęcie od podanych tutaj stężeń [3H]-mio-inozytolu i w razie potrzeby stopniowe zmniejszanie. W czasie etykietowania rośliny mogą być poddawane różnym zabiegom (np. stresom środowiskowym lub czynnikom chemicznym) w celu oceny wpływu tych warunków na globalne InsP. Aby osiągnąć etykietowanie w stanie ustalonym, zalecamy etykietowanie roślin przez co najmniej 5 dni.

4. Ekstrakcja rozpuszczalnych InsP

UWAGA: Próbki i odczynniki należy przechowywać na lodzie podczas całego procesu ekstrakcji. Zawsze noś rękawice i okulary ochronne ze względu na wysokie ryzyko kontaktu z materiałem radioaktywnym, zwłaszcza podczas mielenia. Wszystko, co ma kontakt z próbkami, jest uważane za odpady radioaktywne i powinno być utylizowane zgodnie z lokalnymi przepisami dotyczącymi bezpiecznego usuwania materiałów promieniotwórczych.

  1. Przygotować roztwory robocze do buforu do ekstrakcji i neutralizacji, jak w kroku 2.1. Każda próbka będzie wymagała 600 μl buforu ekstrakcyjnego i 400 μl buforu neutralizacyjnego. Przechowuj na lodzie.
  2. Próbki należy pobrać z zamrażarki o temperaturze -80 °C i przechowywać w ciekłym azocie do czasu dalszego przetwarzania. Zmielić próbki tłuczkiem do mikrowirówek, aż zaczną się rozmrażać i dodać 500 μl lodowatego buforu ekstrakcyjnego. Kontynuuj mielenie, aż próbka zostanie całkowicie zhomogenizowana, a roztwór będzie miał ciemnozielony kolor (jeśli w próbce obecne są liście).
  3. Odwirować próbki przez 10 minut w temperaturze 4 °C przy ≥ 18000 x g. Przenieść supernatant do świeżej probówki o pojemności 1,5 ml. Należy pamiętać, że probówki używane do ekstrakcji są uważane za stałe odpady radioaktywne i muszą być odpowiednio zutylizowane.
  4. Ostrożnie dodać 300 μl buforu neutralizującego do ekstraktu. Wytrącanie białek i bulgotanie rozpocznie się natychmiast. Po minucie wymieszać za pomocą końcówki pipety i odczekać kilka sekund przed odpipetowaniem niewielkiej ilości (5 μl) na bibułce pH (najlepiej w zakresie pH 6–9). Ostatecznie pH powinno wynosić od 7 do 8.
    1. W razie potrzeby dodać niewielkie ilości (zwykle 10–20 μl) buforu neutralizującego lub buforu ekstrakcyjnego, aż do osiągnięcia pożądanego pH. Pozostawić próbki na lodzie przez co najmniej 1 godzinę przy otwartej pokrywie.
  5. Odwirowywać próbki przez 10 minut w temperaturze 4 °C i temperaturze ≥ 18 000 x g. Przenieść supernatant do świeżej probówki o pojemności 1,5 ml.
    UWAGA: Próbki mogą być bezpośrednio wykorzystane w serii SAX-HPLC lub przechowywane na lodzie (jeśli zostaną użyte później tego samego dnia) lub zamrożone w ciekłym azocie i przechowywane w temperaturze -80 °C przez 2–4 tygodnie. Aby zapewnić wysoką odtwarzalność i porównywalność, zaleca się, aby zawsze zamrażać próbki w ciekłym azocie na 5 minut, nawet jeśli będą one później bezpośrednio wykorzystywane. Dłuższe przechowywanie wyekstrahowanych próbek w temperaturze -80 °C jest możliwe, o ile próbki są rozmrażane tylko raz. Jeśli do analizy używane są zamrożone próbki, upewnij się, że po rozmrożeniu nie są widoczne żadne cząstki. W przeciwnym razie należy ponownie odwirować przez 10 minut w temperaturze 4 °C w temperaturze ≥ 18 000 x g i przenieść supernatant do świeżej probówki o pojemności 1,5 ml.

5. Przeprowadzanie testu HPLC

  1. Wyposażyć kolektor frakcji w 96 małych fiolek scyntylacyjnych (pojemność ~6 ml) i napełnić każdą fiolkę 2 ml odpowiedniego koktajlu scyntylacyjnego (np. płynnego koktajlu scyntylacyjnego Ultima-Flo AP) kompatybilnego z o niskim pH i wysokim stężeniu fosforanu amonu (patrz Tabela Materiałów).
    UWAGA: Liczba fiolek i wielkość fiolek zależą od użytego kolektora frakcji i licznika scyntylacyjnego. Ważne jest, aby zebrać przynajmniej pierwsze 90 frakcji, jeśli stosuje się opisany tutaj gradient, aby uzyskać pełny profil polifosforanu inozytolu. Należy również upewnić się, że każda fiolka i jej pokrywka są odpowiednio oznaczone, aby zapobiec pomieszaniu frakcji lub próbek.
  2. Uruchom system/pompy HPLC i przygotuj go do pracy. Aktywuj płyn do płukania uszczelnienia tłoka i utrzymuj go włączonym przez cały przebieg. Załadować próbkę, ręcznie wstrzykując cały supernatant z kroku 4.5 (około 750 μl) za pomocą odpowiedniej strzykawki (patrz tabela materiałów). Jeśli możliwe jest automatyczne wstrzyknięcie, przenieść próbkę do odpowiedniej fiolki z próbką. Przekręć zawór z pozycji "obciążenie" na pozycję "wtrysk" i uruchom gradient oraz kolektor frakcji.
    UWAGA: W zależności od zastosowanego systemu HPLC, procedura początkowa może się różnić, zwłaszcza w przypadku porównywania starszych systemów (jak opisano tutaj) z w pełni sterowanym programowo nowszym modelem. Bardzo ważne jest, aby upewnić się, że gradient, wstrzykiwanie próbki i pobieranie frakcji rozpoczynają się jednocześnie.
  3. Podczas trwania HPLC należy regularnie sprawdzać ciśnienie. Ciśnienie początkowe powinno wynosić około 18–24 barów (1,8–2,4 MPa) i powinno powoli wzrastać do 50–60 barów (5–6 MPa) po osiągnięciu 100% bufora B.
    UWAGA: Obniżone ciśnienie może wskazywać na nieszczelność w układzie, podczas gdy zwiększone ciśnienie wskazuje na blokadę. Wahania ciśnienia (≥ 3 bar w ciągu kilku sekund) mogą wskazywać na obecność powietrza w układzie. Należy pamiętać, że wszystko, co opuszcza kolumnę, a także każdy wyciek, który występuje przy wtryskiwaczu lub później, jest radioaktywny.
    UWAGA: Ciśnienie zależy również od systemu HPLC i może być niższe lub wyższe niż podane tutaj. Będzie powoli wzrastać po około 15–20 biegach. Nie musi to jednak mieć wpływu na jakość uzyskiwanych nakładów.
  4. Po serii szczelnie zamknij fiolki i wymieszaj frakcje z koktajlem scyntylacyjnym przez energiczne potrząsanie. Kontynuuj bezpośrednio pomiar lub trzymaj fiolki w pozycji pionowej, najlepiej w ciemności.
    UWAGA: Frakcje zmieszane z koktajlem scyntylacyjnym są stabilne przez tygodnie i można je później zmierzyć. Ponieważ okres półtrwania trytu wynosi 12,32 lat, utrata sygnału jest znikoma.
  5. Po zakończeniu wykonywania ostatniej próbki w ciągu dnia należy zatrzymać obie pompy HPLC.
  6. (Opcjonalnie) Aby wydłużyć żywotność systemu, zwłaszcza gdy nie jest on regularnie używany, umyj pompę B i kapilary, umieszczając kapilar z buforu B w butelce z buforem A i pozwól pompie pracować przez 10–15 minut. Przed kolejnym użyciem należy pamiętać o umieszczeniu kapilary w buforze B oraz odłączeniu pompy B od mieszalnika w celu przepłukania jej buforem B. Gdy pompa i kapilary zostaną ponownie napełnione buforem B, należy ponownie połączyć go z mieszalnikiem i system jest gotowy do użycia.

6. Mierzenie ułamków

  1. Włożyć fiolki do stojaków licznika scyntylacyjnego i odmierzać każdą fiolkę przez 5 minut w płynnym liczniku scyntylacyjnym.
  2. Najlepiej używać stojaków, które bezpośrednio pasują do małych fiolek i unikać zawieszania się w fiolkach większych (np. 20 ml) fiolkach, aby zmniejszyć błędy liczenia. Ustawienia oprogramowania używane w tym protokole są pokazane na rysunku uzupełniającym 1.
    UWAGA: Regularnie wykonuj protokół SNC (autonormalizacja i kalibracja) przy użyciu niehartowanych wzorców [3H]. Krótsze czasy liczenia (1–5 minut) są możliwe w celu skrócenia czasu oczekiwania. Jednak, aby zapewnić wysoką powtarzalność i dokładność liczenia, zaleca się 5 minut.

7. Analiza danych

  1. Eksportuj pomiary z licznika scyntylacyjnego jako plik arkusza kalkulacyjnego lub zgodny/konwertowalny format pliku. Oceń dane za pomocą komputera wyposażonego w program Excel lub podobne oprogramowanie oraz odpowiednie oprogramowanie do analizy, takie jak Origin.
  2. Przygotuj wykres liniowy 2-W, na którym zmierzone liczby minut (cpm) są wykreślane w stosunku do czasu przechowywania (patrz Rysunek 1, Rysunek 2).
  3. Aby porównać próbki ze sobą, znormalizuj dane, sumując cpm z każdej eluowanej frakcji od 25 do 96 minuty dla każdej pojedynczej próbki.
    UWAGA: Minuta 25 służy jako punkt odcięcia w celu wykluczenia z analizy nieinkorporowanych [3H]-mio-inozytolu, InsP1 i InsP2, ponieważ mają one tendencję do silnych wahań i nie mogą być dobrze oddzielone (przynajmniej z gradientem proponowanym w tym protokole), a tym samym silnie zmieniają współczynnik normalizacji ze względu na ich wysoką aktywność.
  4. Znormalizuj wszystkie dane do próbki o najniższym całkowitym cpm (we frakcjach 25–96), dzieląc całkowitą wartość cpm z próbki o najniższej wartości cpm (we frakcjach 25–96) przez całkowitą wartość cpm (we frakcjach 25–96) pozostałych próbek. Otrzymany współczynnik można następnie wykorzystać do normalizacji cpm z każdej frakcji, mnożąc cpm każdej frakcji przez współczynnik.
    UWAGA: Na końcu suma wartości cpm od minuty 25 do końca powinna być równa dla wszystkich próbek porównanych ze sobą. Tylko znormalizowane przebiegi powinny być prezentowane na tym samym wykresie/rysunku (gdy są przedstawione jako rzeczywiste profile). Rysunek uzupełniający 2 przedstawia przykład, w jaki sposób wykonuje się te kroki obliczeniowe (dla uproszczenia przy użyciu tylko ułamków 25–35 dwóch próbek). Jednak w niektórych przypadkach normalizacja danych nie jest konieczna. Na przykład, gdy piki są określane ilościowo zgodnie z krokiem 7.4 i prezentowane jako procenty całkowitych InsP (jak pokazano na Rysunek 3D). Jak wspomniano wcześniej, w przypadku przedstawiania wielu analiz obok siebie jako profili lub gdy do wniosków wykorzystuje się rzeczywistą zmierzoną aktywność (np. leczenie a) zwiększa InsP7 o x% w porównaniu z kontrolą, odnosząc się do wartości cpm InsP7 dla obu próbek, a nie do ich procentu w całkowitym InsP), konieczna jest normalizacja. Aby przeanalizować wpływ różnic w genotypie lub leczeniu na skuteczność znakowania, ważne jest, aby nie normalizować sytuacji, ponieważ unieważniłoby to te różnice. Jednak bezwzględna kwantyfikacja za pomocą tej metody jest trudna, ponieważ wydajność ekstrakcji za pomocą tego protokołu może być zmienna z różnych powodów, a czasami jest obserwowana nawet wtedy, gdy analizowana jest replika tego samego genotypu i zabiegu. Należy pamiętać, że w zależności od systemu HPLC, kolumny i gradientu użytego do analiz, może być konieczna zmiana punktu odcięcia.
  5. Aby przeprowadzić względne kwantyfikacje niektórych pików polifosforanu inozytolu, a następnie utworzyć wykresy słupkowe zawierające dane replikacji do analiz statystycznych, należy kontynuować analizę za pomocą specjalistycznego oprogramowania, które może obliczyć obszary pików chromatogramów (np. Pochodzenie). Patrz rysunek uzupełniający 3.
    UWAGA: Większość systemów HPLC, które są sterowane programowo, jest dostarczana z odpowiednim oprogramowaniem zdolnym do tego zadania. Szczyty są określane jako ułamki z wartościami cpm powyżej tła (które różnią się w pewnym stopniu między przebiegami) i czasami przechowywania, które są podobne do wcześniej opublikowanych danych. Czas retencji określonego piku jest określany w arkuszu kalkulacyjnym (np. Excel) i używany do przypisywania pików do obliczania całek oznaczonych (np. w Początku). Rysunek uzupełniający 3 ilustruje ten proces wyznaczania pików, odejmowania tła i całkowania pików.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wyniki pokazane tutaj mają na celu zilustrowanie możliwych wyników uzyskanych na podstawie różnic na poziomie technicznym i biologicznym. Pierwszym z nich są analizy z wykorzystaniem nowych i starych kolumn (Rysunek 1) oraz świeżych i przechowywanych próbek (Rysunek 3), a drugim ocena ekstraktów z dwóch różnych systemów roślinnych, A. thaliana (Rysunek 1, Rysunek 3) i L. japonicus (Rysunek 2).

Optymalny przebieg SAX-HPLC jest przedstawiony na stronie Rysunek 1A\u2012C, który pokazuje pełne spektrum polifosforanu inozytolu uzyskane z ekstraktów A. thaliana po zliczeniu scyntylacyjnym. Zauważ, że piki są ładnie oddzielone i mogą być przypisane do różnych izomerów (lub par enancjomerów) na podstawie ruchliwości chromatograficznej opisanej wcześniej5,7.

Rysunek 2 pokazuje reprezentatywny wynik analizy SAX-HPLC siewek L. japonicus, które były uprawiane i znakowane w tych samych warunkach co siewki rzodkiewnika. Chociaż przypuszczalnie można zobaczyć wszystkie gatunki InsP i piki, które są znane z Arabidopsis, istnieją znaczne różnice dotyczące względnej (np. stosunek między izomerami) ilości określonych izomerów InsP, porównując profile obu gatunków. Na przykład ekstrakty z lotosu wykazały zwiększoną zawartość InsP3c, InsP4b, InsP5b i obniżoną InsP3a, InsP4a, InsP5a i InsP5c w porównaniu z Arabidopsis, co pozostawia miejsce na dalsze badania. Rysunek 2D ilustruje różne proporcje między izomerami InsP między Arabidopsis a Lotus.

Rysunek 3 pokazuje dwa profile InsP próbki, która została podzielona po ekstrakcji. Pierwsza połowa została natychmiast poddana analizie, a druga połowa dzień później, po przechowywaniu w temperaturze -80 °C. Należy zauważyć, że zaobserwowano tylko niewielkie różnice między różnymi próbkami (tj. czarne i czerwone linie na Rysunek 3A\u2012C, oraz Rysunek 3D). Pokazuje to, że jeden cykl zamrażania i rozmrażania nie uszkadza próbki, a sama metoda generuje powtarzalne wyniki.

figure-results-1
Rysunek 1: Typowy profil InsP udanej i nieudanej analizy SAX-HPLC przeprowadzonej za pomocą tego protokołu. (A\u2012C) Profil SAX-HPLC 17-dniowych siewek rzodkiewnika typu dzikiego (Col-0) znakowanych radioaktywnie [3H]-mio-inozytolem. Tego samego dnia przeprowadzono globalną ekstrakcję InsP i przebieg SAX-HPLC. (A) pełne widma; (B, C) Powiększenia profilu pokazanego w A. Wszystkie widoczne piki są podświetlone i przypisane do odpowiednich gatunków InsP. Na podstawie opublikowanych ruchliwości chromatograficznych5,7, InsP4a prawdopodobnie reprezentuje Ins(1,4,5,6)P4 lub Ins(3,4,5,6)P4, InsP5a reprezentuje InsP5 [2-OH], InsP5b reprezentuje InsP5 [4-OH] lub jego enancjomeryczną formę InsP5 [6-OH], a InsP5c reprezentuje InsP5 [1-OH] lub jego enancjomeryczną formę InsP5 [3-OH]. Izomeryczna natura InsP3a-c, InsP4b, InsP7 i InsP8 jest nadal nieznana. Panel (D) przedstawia profil SAX-HPLC identycznie uprawianych roślin, ale przy użyciu starej kolumny (>40 przebiegów). Widoczna jest wyraźna redukcja InsP6 w porównaniu z innymi gatunkami InsP oraz brak PP-InsP. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Reprezentatywny profil InsP roślin L. japonicus. Profil SAX-HPLC (A\u2012C) 17-dniowych siewek L. japonicus typu dzikiego (Gifu) znakowanych radioizotopem [3H]-mio-inozytolem. (A) pełne widma; (B, C) Powiększenia profilu pokazanego w A. Wszystkie widoczne piki są podświetlone i przypisane do odpowiednich gatunków InsP. Na podstawie opublikowanych ruchomości chromatograficznych5,7, InsP4a prawdopodobnie reprezentuje Ins(1,4,5,6)P4 lub Ins(3,4,5,6)P4, InsP5b prawdopodobnie reprezentuje InsP5 [4-OH] lub jego enancjomeryczną formę InsP5 [6-OH], a InsP5c prawdopodobnie reprezentuje InsP5 [1-OH] lub jego enancjomeryczną formę InsP5 [3-OH]. Izomeryczna natura InsP3a-c, InsP4b, InsP7 i InsP8 jest nieznana. (D) Porównanie poszczególnych gatunków InsP (w % całkowitej aktywności z elucji 25\u201296) A. thaliana (dane z Ryc. 1A\u2012C) i L. japonicus (dane z Ryc. 2A–C). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Profile InsP podzielonej próbki ilustrujące odtwarzalność analiz SAX-HPLC. (A\u2012C) Profile SAX-HPLC 17-dniowych siewek rzodkiewnika typu dzikiego (Col-0) znakowanych radioaktywnie [3H]-mio-inozytolem. Przed przebiegiem próbkę podzielono i natychmiast poddano ją jednemu połowa, a drugiej połowie dzień później po przechowywaniu w temperaturze -80 °C. A) Pełne widma; (B, C) Powiększenia profilu pokazanego w A. Wszystkie widoczne piki są podświetlone i przypisane do odpowiednich gatunków InsP. Na podstawie opublikowanych ruchomości chromatograficznych5,7, InsP4a prawdopodobnie reprezentuje Ins(1,4,5,6)P4 lub Ins(3,4,5,6)P4, InsP5a reprezentuje InsP5 [2-OH], InsP5a reprezentuje InsP5 [2-OH], InsP5b reprezentuje InsP5 [4-OH] lub jego enancjomeryczną formę InsP5 [6-OH], a InsP5c reprezentuje InsP5 [1-OH] lub jego forma enancjomeryczna InsP5 [3-OH]. Izomeryczna natura InsP3a-c, InsP4b, InsP7 i InsP8 jest nadal nieznana. Panel D przedstawia kwantyfikację InsP6 oraz PP-InsPs InsP7 i InsP8 obu serii. Wartości reprezentują ilość (w %) odpowiednich gatunków InsP w stosunku do wszystkich InsP (całkowita aktywność z elucji 25–96). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek uzupełniający 1: Ustawienia oprogramowania do zliczania scyntylacji cieczy za pomocą licznika scyntylacji światła. Przedstawiono zrzuty ekranu przedstawiające wersję oprogramowania, a także ustawienia używane do zliczania scyntylacyjnego próbek [3H] wykonanego za pomocą tego protokołu. Kliknij tutaj, aby pobrać ten rysunek.

Rysunek uzupełniający 2: Reprezentatywny przykład normalizacji danych. Zrzut ekranu arkusza roboczego pokazuje wszystkie kroki i formuły używane do normalizacji przebiegów SAX-HPLC względem siebie. Dla uproszczenia pokazano tylko frakcje 25–35 próbek. Kliknij tutaj, aby pobrać ten rysunek.

Rysunek uzupełniający 3: Wyznaczanie pików, odejmowanie tła i całkowanie za pomocą oprogramowania analitycznego. (A) Dane z analizy SAX-HPLC są ładowane do oprogramowania (minuty 28–96) i wybierane jest narzędzie do analizy pików. (B\u2012E) Linia bazowa jest definiowana ręcznie poprzez ustawienie punktów między poszczególnymi szczytami, a tło jest odejmowane. (F) Piki są wyznaczane ręcznie na podstawie wyglądu i opublikowanej ruchliwości chromatograficznej5,7. (G) Zakresy pików są definiowane ręcznie za pomocą wartości cpm. (H) Piki całkuje się i oblicza jako % wszystkich pików. Kliknij tutaj, aby pobrać ten rysunek.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym miejscu przedstawiamy wszechstronną i czułą metodę ilościowego oznaczania InsP, w tym PP-InsP w ekstraktach roślinnych, oraz udzielamy praktycznych wskazówek, jak ustalić tę metodę. Mimo że protokół jest ogólnie solidny, mogą wystąpić nieoptymalne przebiegi i analizy. W większości przypadków przebiegi te można zidentyfikować po silnym zmniejszeniu lub nawet całkowitej utracie silnie ufosforylowanych InsP, zwłaszcza gatunków PP-InsP InsP7 i InsP8. Możliwymi przyczynami mogą być zanieczyszczenia mikrobiologiczne materiału roślinnego oraz niewystarczająca dezaktywacja endogennych roślinnych hydrolaz PP-InsP podczas ekstrakcji z powodu niewystarczającego zmielenia i rozmrożenia materiału roślinnego, który nie będzie miał bezpośredniego kontaktu z buforem ekstrakcyjnym. Dalsze przyczyny to niedokładne dostosowanie pH przez niewystarczające lub nadmierne dodanie buforu neutralizującego lub po prostu niewystarczający materiał próbki. Te ostatnie mogą utrudniać wykrycie PP-InsP, ponieważ są one często obecne w bardzo małych ilościach w komórkach. Nadmiar materiału próbki lub nieefektywne suszenie na etapie 3.5 może spowodować rozcieńczenie kwasu nadchlorowego, co prowadzi również do niewystarczającej dezaktywacji enzymów i specyficznej utraty InsP6 i PP-InsP. Ilość materiału roślinnego, a także radioznaku użytego w tym protokole zostały zoptymalizowane w oparciu o koszty i wydajność, a zatem są bliskie najniższej ilości, która jest nadal wystarczająca do zapewnienia optymalnych wyników. Ponadto żywica kolumny będzie stopniowo tracić swoją zdolność rozdzielczą. Pierwszą oznaką tego procesu jest (z przyczyn nie do końca jasnych dla autorów) specyficzna utrata wyżej ufosforylowanych gatunków InsP, takich jak PP-InsP w widmie HPLC. Wraz z dalszym starzeniem się nawet InsP6 nie zostanie prawidłowo rozwiązany przez kolumnę (rysunek 1D). Dlatego użycie odpowiedniej kolumny, a także skrupulatne obchodzenie się z próbką i właściwa konserwacja składników HPLC mają kluczowe znaczenie dla zapewnienia dokładnych wyników.

Podczas porównywania próbek i serii, zwłaszcza gdy są one generowane przy użyciu różnych urządzeń (np. systemów i kolumn HPLC) lub w różnych dniach, kluczowe znaczenie ma normalizacja próbek względem siebie (zgodnie z opisem w kroku 7.3) i analizowanie ich w ten sam sposób. Tylko dzięki normalizacji możliwe i dokładne jest pokazanie wielu próbek na tym samym wykresie (rysunek 3). W celu ilościowego określenia poszczególnych InsP w stosunku do całkowitych InsP lub do innych określonych gatunków InsP nie jest konieczna normalizacja, o ile pokazane są tylko wartości względne, a nie wartości bezwzględne. Idealnie byłoby, gdyby pokazane były zarówno profile InsP, jak i kwantyfikacje. Jednak w niektórych przypadkach nie jest możliwe odpowiednie pokazanie dwóch lub więcej przebiegów na tym samym wykresie. Różne czasy przechowywania lub różne poziomy aktywności w tle mogą utrudniać porównywanie samych nieoznaczonych ilościowo profili SAX-HPLC. To samo dotyczy sytuacji, gdy trzeba porównać wiele próbek. W takich przypadkach konieczna jest dalsza ocena przy użyciu dodatkowego oprogramowania (np. Origin) do ilościowego oznaczania poszczególnych pików.

Autorzy są świadomi, że opisany tu protokół może być optymalizowany i musi być dostosowany do każdego indywidualnego pytania badawczego. Chociaż metoda ta jest zoptymalizowana pod kątem ekstraktów z Arabidopsis 7,17 w tym protokole, jest wszechstronna i może pomóc w określeniu profili InsP również innych gatunków roślin. Tutaj ilustrujemy tę możliwość, prezentując po raz pierwszy profil InsP dla L. japonicus, który nie wymagał modyfikacji warunków znakowania, ekstrakcji InsP ani przebiegu SAX-HPLC (ryc. 2). Warto zauważyć, że chociaż ogólnie rzecz biorąc, obserwuje się różnice między profilami InsP L. japonicus i Arabidopsis. Na przykład w L. japonicus InsP5 [4-OH] lub jego enancjomeryczna forma InsP5 [6-OH] są liczniejsze niż InsP5 [1-OH] lub jego enancjomeryczna forma InsP5 [3-OH] w porównaniu z Arabidopsis, gdzie InsP5 [1-OH] lub jego enancjomeryczna forma InsP5 [3-OH] są dominującymi gatunkami InsP5. Przewidujemy również, że zmiany w składzie pożywki, stężeniu [3H]-mio-inozytolu, wieku roślin, warunkach środowiskowych (np. świetle i temperaturze), dodawaniu związków chemicznych lub analizach interakcji roślina-mikroorganizmy wśród innych czynników, mogą wymagać zbadania i dostosowania.

Jedną z ważnych wad tej metody, którą należy wziąć pod uwagę, jest to, że etykietowanie odbywa się w (sterylnej) płynnej kulturze, która nie stanowi środowiska fizjologicznego dla większości roślin lądowych. Ponadto, ze względu na wysokie koszty [³H]-mio-inozytolu, objętość roztworu do etykietowania i wielkość naczynia hodowlanego są na ogół ograniczone, co również ogranicza wielkość roślin, które można wykorzystać. Uprawy w kulturze płynnej można uniknąć, infiltrując na przykład liście roślin uprawianych w glebie [³H]-mio-inozytolem, a następnie postępując zgodnie z opisanym tutaj protokołem, jak wcześniej opisano10.

Istnieje kilka wad tego protokołu w porównaniu z alternatywnymi metodami, takimi jak TiO2 pull-down, a następnie PAGE lub techniki oparte na spektrometrii mas. Ze względu na znakowanie [3H]-mio-inozytolem, tylko gatunki InsP, które bezpośrednio pochodzą z radioznakowanego mio-inozytolu, zostaną ostatecznie wykryte. Opisana tutaj metoda jest ślepa na inne izomery Ins, takie jak scyllozytol i inne izomery, z których niektóre zostały zidentyfikowane w niektórych roślinach44. Ponadto wykluczone zostaną mio-InsP pochodzące z innych szlaków, w tym te syntetyzowane przez syntezę de novo mio-inozytolu i mio-inozytolo-3-fosforanu poprzez izomeryzację glukozo-6-fosforanu, katalizowaną przez białka syntazy mio-inozytolo-3-fosforanowej (MIPS)45. Chociaż [32P] lub [33P]-ortofosforan mogą być używane jako alternatywne etykiety, ich stosowanie stanowi poważną wadę, ponieważ każda cząsteczka zawierająca fosforan, w tym obfite nukleotydy i ich pochodne, będzie znakowana. Cząsteczki te mogą być również ekstrahowane za pomocą tego protokołu i wiązać się z kolumną SAX, co spowoduje wysoki poziom aktywności tła, który będzie zakłócał identyfikację poszczególnych pików InsP5. Ponadto na oznaczanie ilościowe InsP i PP-InsP znakowanych znakami [32P] lub [33P] może mieć silny wpływ obrót ugrupowań fosforanowych i pirofosforanowych i może nie wykazywać masowego odczytu dla gatunków inozytolu.

Z drugiej strony, [3H]-mio-inozytol specyficznie znakuje cząsteczki zawierające mio-inozytol. InsP, lipidy zawierające inozytol, takie jak fosfoinozytydy i galaktynol są w tym przypadku oznakowane. Jednak tylko InsP będą analizowane za pomocą tego protokołu, ponieważ lipidy są nierozpuszczalne w buforze ekstrakcyjnym, a galaktynol nie wiąże się z kolumną SAX.

Jak dotąd, różnice w stosunku do profilu roślinnego InsP generowanego przez znakowanie [3H]-mio-inozytolem w porównaniu z profilem określonym za pomocą TiO2 pulldown/PAGE pozostają nieznane, ponieważ takich porównań nie przeprowadzono w roślinach. Niedawne badanie na komórkach zwierzęcych odpowiedziało na to pytanie46. W tej pracy zidentyfikowano pulę InsP6, która jest niewidoczna przez znakowanie [3H]-mio-inozytolem, która powinna zatem pochodzić bezpośrednio z glukozo-6-fosforanu, porównując profile SAX-HPLC z żelami PAGE linii komórkowych ssaków. 24 godziny głodu fosforanów spowodowały 150% wzrost InsP6 podczas ilościowego oznaczania żeli PAGE InsP oczyszczonych za pomocą TiO2 pulldown. Analizy SAX-HPLC komórek znakowanych [3H]-mio-inozytolem, które były traktowane identycznie, wykazały wzrost tylko o 15% [3H]-InsP6. Jak wcześniej wspomniano, InsP niższe niż InsP5 są w większości przypadków niewykrywalne za pomocą analizy PAGE. Znakowanie radioaktywne, a następnie SAX-HPLC wydaje się być metodą z wyboru, o ile protokoły spektrometrii mas nie są zoptymalizowane pod kątem wykrywania tej grupy wysoce ujemnie naładowanych cząsteczek.

Kolejnym wyzwaniem pozostaje rozróżnienie enancjomerów w analizach SAX-HPLC (lub w dowolnej innej metodzie analizy InsP)10,17. Temu wyzwaniu można sprostać poprzez dodanie selektorów chiralnych, tj. związków enancjopurowych, takich jak amid L-argininy, które oddziałują z odpowiednimi cząsteczkami enancjomerycznymi, tworząc kompleksy diastereomeryczne, które można rozdzielić10. Według naszej wiedzy, podejście to zostało wdrożone tylko w celu rozróżnienia enancjomerycznych izomerów InsP5 InsP5 [1-OH] i InsP5 [3-OH] za pomocą analiz NMR10. Dyskryminacja innych par enancjomerowych lub skuteczna dyskryminacja enancjomerów za pomocą chiralnej analizy SAX-HPLC lub metod opartych na chiralnej PAGE nie została jeszcze zgłoszona i powinna być dalej rozwijana. Biorąc pod uwagę syntezę konserwatywną i konserwatywną regulację PP-InsP przez dostępność fosforu, przewidujemy, że szczególnie metody nieradioaktywne, takie jak metody oparte na PAGE lub MS, wraz z analizami składników odżywczych, pomogą w ugruntowaniu wysiłków na rzecz kalibracji danych teledetekcyjnych przeznaczonych do diagnozowania niedoborów składników odżywczych w uprawach 17,18,24,25. Jednak przedstawiona tutaj metoda może być nadal uważana za złoty standard w analizach InsP i będzie miała zasadnicze znaczenie dla odkrycia nowych funkcji tych intrygujących przekaźników w roślinach.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca została sfinansowana przez Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Niemiecką Fundację Badawczą) w ramach Niemieckiej Strategii Doskonałości - EXC-2070 – 390732324 (PhenoRob), Grupy Szkolenia Badawczego GRK2064 oraz indywidualnych grantów badawczych SCHA1274/4-1 i SCHA1274/5-1 dla G.S. Dziękujemy również Li Schlüterowi i Brigitte Ueberbach za pomoc techniczną.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
WirówkaEppendorf AGmodel: 5430 R
Wodorofosforan diamonu, ≥ 97 %Carl Roth GmbH + Co. KG0268.1
Kwas etylenodiaminotetraoctowy sól disodowa dwuwodna, ≥ 99 %, rocznie, ACSCarl Roth GmbH + Co. KG8043.2
Falcon 12-dołkowa, przezroczysta, płaska płytka do hodowli komórkowej z wielodołkową powłoką TC, z pokrywką, pakowana pojedynczo, sterylnaCorning Inc.
Kolektor frakcjiLAMBDA Instruments GmbHmodel: Kolektor
Inkubator wzrostupoly klima GmbHmodel: Pompy HPLC PK 520-LED
Kontron Instrumentsmodel: 420
Strzykawka HPLC do zaworów Rheodyne, 1 mlHamilton Company81365
Wtryskiwacz do HPLCModel Supelco: Reodyne 9725
Inositol, mio-[1,2-3H(N)]American Radiolabeled Chemicals Inc.ART 0261
Ciekły azotUniwersytet, Wydział
Licznik scyntylacyjny cieczyPerkinElmer Incmodel: TRI-CARB 2900TR
Mikro tłuczekCarl Roth GmbH + Co. KGCXH7.1
Filtr estrowy z mieszanej celulozy, seria ME (ME 24), zwykły, 0,2 i mikro; m wielkość porów, koło 47 mmHealthcare Nauki 10401770
Mieszalnik do HPLCKontron Instrumentsmodel: M 800
Murashige & Skoog podłoże, mieszanka soliDuchefa BiochemieM0221
Oprogramowanie OriginProOriginLab Corp.
Kwas ortofosforowy, ≥ 85 %, rocznie, ISOCarl Roth GmbH + Co. KG6366.1
Partisphere 5 & m Kolumna nabojowa SAX, 125 x 4,6 mmHichrom Limited4621-0505
Kwas nadchlorowy, 70 %, 99,999 % na bazie metali śladowychSzalka Petriego Sigma-Aldrich311421
kwadratowa, PS, przezroczysta, 120/120/17 mm, sterylnaGreiner Bio One International GmbH688161
bibuła wskaźnikowa pH pH 5,5 - 9,0, NeutralitMerck KGaA109564
PhytagelSigma-AldrichP8169
Węglan potasuCarl Roth GmbH + Co. KGP743.2
Probówki Safe-Lock, 1,5 mlEppendorf AG30120086
Pętla na próbkę do wtryskiwaczy 9725, objętość 2 mL, PEEKSupelco57648
Fiolka scyntylacyjna SNAPTWIST, 6,5 mlSimport Scientific Inc.S207-5
Sterylna ławkaLaboGenemodel: ScanLaf MARS 900
Sacharoza, ≥ 99,5 % rocznieCarl Roth GmbH + Co. KG4621.1
Ultima-Flo AP płynny koktajl scyntylacyjnyPerkinElmer Inc6013599
Ultraczysta woda dejonizowanaMilli-Q
Zestaw końcówek WVS bez kluczaHichrom Limited4631-1001
353043jednokanałowy OMNICOLLChemii GE ,

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Berridge, M. J., Irvine, R. F. Inositol Phosphates and Cell Signaling. Nature. 341 (6239), 197-205 (1989).
  2. Streb, H., Irvine, R. F., Berridge, M. J., Schulz, I. Release of Ca-2+ from a Nonmitochondrial Intracellular Store in Pancreatic Acinar-Cells by Inositol-1,4,5-Trisphosphate. Nature. 306 (5938), 67-69 (1983).
  3. Krinke, O., Novotna, Z., Valentova, O., Martinec, J. Inositol trisphosphate receptor in higher plants: is it real. Journal of Experimental Botany. 58 (3), 361-376 (2007).
  4. Kuo, H. F., et al. Arabidopsis inositol pentakisphosphate 2-kinase, AtIPK1, is required for growth and modulates phosphate homeostasis at the transcriptional level. Plant Journal. 80 (3), 503-515 (2014).
  5. Kuo, H. F., et al. Arabidopsis inositol phosphate kinases IPK1 and ITPK1 constitute a metabolic pathway in maintaining phosphate homeostasis. Plant Journal. 95 (4), 613-630 (2018).
  6. Gillaspy, G. E. Lipid-mediated Protein Signaling. Capelluto, D. G. S. , Springer. Netherlands. 141-157 (2013).
  7. Stevenson-Paulik, J., Bastidas, R. J., Chiou, S. T., Frye, R. A., York, J. D. Generation of phytate-free seeds in Arabidopsis through disruption of inositol polyphosphate kinases. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (35), 12612-12617 (2005).
  8. Lemtiri-Chlieh, F., MacRobbie, E. A. C., Brearley, C. A. Inositol hexakisphosphate is a physiological signal regulating the K+-inward rectifying conductance in guard cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (15), 8687-8692 (2000).
  9. Lee, H. S., et al. InsP6-sensitive variants of the Gle1 mRNA export factor rescue growth and fertility defects of the ipk1 low-phytic-acid mutation in Arabidopsis. Plant Cell. 27 (2), 417-431 (2015).
  10. Blüher, D., et al. A 1-phytase type III effector interferes with plant hormone signaling. Nature Communications. 8, (2017).
  11. Murphy, A. M., Otto, B., Brearley, C. A., Carr, J. P., Hanke, D. E. A role for inositol hexakisphosphate in the maintenance of basal resistance to plant pathogens. Plant Journal. 56 (4), 638-652 (2008).
  12. Poon, J. S. Y., Le Fevre, R. E., Carr, J. P., Hanke, D. E., Murphy, A. M. Inositol hexakisphosphate biosynthesis underpins PAMP-triggered immunity to Pseudomonas syringae pv. tomato in Arabidopsis thaliana but is dispensable for establishment of systemic acquired resistance. Molecular Plant Pathology. 21 (3), 376-387 (2020).
  13. Wild, R., et al. Control of eukaryotic phosphate homeostasis by inositol polyphosphate sensor domains. Science. 352 (6288), 986-990 (2016).
  14. Shears, S. B. Inositol pyrophosphates: Why so many phosphates. Advances in Biological Regulation. 57, 203-216 (2015).
  15. Shears, S. B. Intimate connections: Inositol pyrophosphates at the interface of metabolic regulation and cell signaling. Journal of Cellular Physiology. 233 (3), 1897-1912 (2018).
  16. Desai, M., et al. Two inositol hexakisphosphate kinases drive inositol pyrophosphate synthesis in plants. Plant Journal. 80 (4), 642-653 (2014).
  17. Laha, D., et al. VIH2 Regulates the Synthesis of Inositol Pyrophosphate InsP8 and Jasmonate-Dependent Defenses in Arabidopsis. Plant Cell. 27 (4), 1082-1097 (2015).
  18. Laha, D., et al. Arabidopsis ITPK1 and ITPK2 Have an Evolutionarily Conserved Phytic Acid Kinase Activity. Acs Chemical Biology. 14 (10), 2127-2133 (2019).
  19. Dorsch, J. A., et al. Seed phosphorus and inositol phosphate phenotype of barley low phytic acid genotypes. Phytochemistry. 62 (5), 691-706 (2003).
  20. Flores, S., Smart, C. C. Abscisic acid-induced changes in inositol metabolism in Spirodela polyrrhiza. Planta. 211 (6), 823-832 (2000).
  21. Brearley, C. A., Hanke, D. E. Inositol phosphates in barley (Hordeum vulgare L) aleurone tissue are stereochemically similar to the products of breakdown of InsP(6) in vitro by wheat-bran phytase. Biochemical Journal. 318, 279-286 (1996).
  22. Laha, N. P., et al. ITPK1-Dependent Inositol Polyphosphates Regulate Auxin Responses in Arabidopsis thaliana. bioRxiv. , (2020).
  23. Laha, D., et al. Inositol Polyphosphate Binding Specificity of the Jasmonate Receptor Complex. Plant Physiology. 171 (4), 2364-2370 (2016).
  24. Dong, J. S., et al. Inositol Pyrophosphate InsP(8) Acts as an Intracellular Phosphate Signal in Arabidopsis. Molecular Plant. 12 (11), 1463-1473 (2019).
  25. Zhu, J., et al. Two bifunctional inositol pyrophosphate kinases/phosphatases control plant phosphate homeostasis. Elife. 8, (2019).
  26. Couso, I., et al. Synergism between Inositol Polyphosphates and TOR Kinase Signaling in Nutrient Sensing, Growth Control, and Lipid Metabolism in Chlamydomonas. Plant Cell. 28 (9), 2026-2042 (2016).
  27. Ito, M., et al. Hydrophilic interaction liquid chromatography-tandem mass spectrometry for the quantitative analysis of mammalian-derived inositol poly/pyrophosphates. Journal of Chromatography A. 1573, 87-97 (2018).
  28. Wilson, M. S. C., Saiardi, A. Inositol Phosphates Purification Using Titanium Dioxide Beads. Bio-Protocol. 8 (15), (2018).
  29. Loss, O., Azevedo, C., Szijgyarto, Z., Bosch, D., Saiardi, A. Preparation of Quality Inositol Pyrophosphates. Jove-Journal of Visualized Experiments. (55), e3027(2011).
  30. Harmel, R. K., et al. Harnessing C-13-labeled myo-inositol to interrogate inositol phosphate messengers by NMR Electronic supplementary information (ESI) available. Chemical Science. 10 (20), 5267-5274 (2019).
  31. Azevedo, C., Saiardi, A. Extraction and analysis of soluble inositol polyphosphates from yeast. Nature Protocols. 1 (5), 2416-2422 (2006).
  32. Shears, S. B. Inositol Phosphates: Methods and Protocols. Miller, G. J. , Springer US. 1-28 (2020).
  33. Wilson, M. S. C., Saiardi, A. Importance of Radioactive Labelling to Elucidate Inositol Polyphosphate Signalling. Topics in Current Chemistry. 375 (1), (2017).
  34. Stevenson-Paulik, J., et al. Inositol phosphate metabolomics: Merging genetic perturbation with modernized radiolabeling methods. Methods. 39 (2), 112-121 (2006).
  35. Liu, C., Riley, A. M., Yang, X., Shears, S. B., Potter, B. V. L. Synthesis and Biological Activity of d- and l-chiro-Inositol 2,3,4,5-Tetrakisphosphate: Design of a Novel and Potent Inhibitor of Ins(3,4,5,6)P4 1-Kinase/Ins(1,3,4)P3 5/6-Kinase. Journal of Medicinal Chemistry. 44 (18), 2984-2989 (2001).
  36. Hughes, P. J., Hughes, A. R., Putney, J. W., Shears, S. B. The regulation of the phosphorylation of inositol 1,3,4-trisphosphate in cell-free preparations and its relevance to the formation of inositol 1,3,4,6-tetrakisphosphate in agonist-stimulated rat parotid acinar cells. Journal of Biological Chemistry. 264 (33), 19871-19878 (1989).
  37. Shears, S. B., Kirk, C. J., Michell, R. H. The pathway of myo-inositol 1,3,4-trisphosphate dephosphorylation in liver. The Biochemical journal. 248 (3), 977-980 (1987).
  38. Stevenson-Paulik, J., Odom, A. R., York, J. D. Molecular and Biochemical Characterization of Two Plant Inositol Polyphosphate 6-/3-/5-Kinases. Journal of Biological Chemistry. 277 (45), 42711-42718 (2002).
  39. Stephens, L. R., Hawkins, P. T., Downes, C. P. An analysis of myo-[3H]inositol trisphosphates found in myo-[3H]inositol prelabelled avian erythrocytes. The Biochemical journal. 262 (3), 727-737 (1989).
  40. Saiardi, A., et al. Mammalian inositol polyphosphate multikinase synthesizes inositol 1,4,5-trisphosphate and an inositol pyrophosphate. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (5), 2306(2001).
  41. Azevedo, C., Burton, A., Bennett, M., Onnebo, S. M. N., Saiardi, A. Inositol Phosphates and Lipids: Methods and Protocols. Barker, C. J. , Humana Press. 73-85 (2010).
  42. Saiardi, A., Caffrey, J. J., Snyder, S. H., Shears, S. B. The Inositol Hexakisphosphate Kinase Family: CATALYTIC FLEXIBILITY AND FUNCTION IN YEAST VACUOLE BIOGENESIS. Journal of Biological Chemistry. 275 (32), 24686-24692 (2000).
  43. Brearley, C. A., Hanke, D. E. Inositol phosphates in the duckweed Spirodela polyrhiza L. Biochemical Journal. 314, 215-225 (1996).
  44. Pollard, J. K., Steward, F. C., Shantz, E. M. Hexitols in Coconut Milk - Their Role in Nurture of Dividing Cells. Plant Physiology. 36 (4), 492(1961).
  45. Donahue, J. L., et al. The Arabidopsis thaliana Myo-inositol 1-phosphate synthase1 gene is required for Myo-inositol synthesis and suppression of cell death. Plant Cell. 22 (3), 888-903 (2010).
  46. Desfougeres, Y., Wilson, M. S. C., Laha, D., Miller, G. J., Saiardi, A. ITPK1 mediates the lipid-independent synthesis of inositol phosphates controlled by metabolism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (49), 24551-24561 (2019).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Inositol PolyphosphatesSAX HPLC AnalysisPlant Seedling CultivationRadiolabeling With 3H InositolInositol Phosphate ExtractionHPLC System SetupFraction Collection MethodScintillation Counting ProcedureData Normalization AnalysisArabidopsis Thaliana

Related Articles