Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Analiza systemowa odpowiedzi neurozapalnej i hemodynamicznej na urazowe uszkodzenie mózgu

3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61504

⸱

27 maja 2022

 ,  ,  ,  , 
1Wallace H. Coulter Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology and Emory University, 2George W. Woodruff School of Mechanical Engineering, Georgia Institute of Technology, 3Parker H. Petit Institute for Bioengineering and Bioscience, Georgia Institute of Technology, 4Department of Pediatrics, Emory University School of Medicine, 5Children's Research Scholar, Children's Healthcare of Atlanta

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół przedstawia metody charakteryzowania neurozapalnej i hemodynamicznej odpowiedzi na łagodne urazowe uszkodzenie mózgu oraz integracji tych danych jako części wielowymiarowej analizy systemów przy użyciu częściowej regresji metodą najmniejszych kwadratów.

Streszczenie

Łagodne urazowe uszkodzenia mózgu (mTBI) stanowią poważny problem zdrowia publicznego. Powtarzające się narażenie na mTBI może prowadzić do skumulowanych, długotrwałych deficytów funkcjonalnych. Liczne badania przeprowadzone przez naszą grupę i innych wykazały, że mTBI stymuluje ekspresję cytokin i aktywuje mikroglej, zmniejsza przepływ krwi i metabolizm w mózgu oraz upośledza reaktywność naczyń mózgowych. Co więcej, kilka prac wykazało związek między zaburzeniami tych markerów neurozapalnych i hemodynamicznych a zaburzeniami poznawczymi. W niniejszym artykule szczegółowo opisano metody charakteryzowania neurozapalnej i hemodynamicznej odpowiedzi tkanek na mTBI u myszy. W szczególności opisujemy, jak wykonać model spadku masy ciała mTBI, jak podłużnie zmierzyć przepływ krwi w mózgu za pomocą nieinwazyjnej techniki optycznej zwanej dyfuzyjną spektroskopią korelacji oraz jak przeprowadzić multipleksowany test immunologiczny Luminex na próbkach tkanki mózgowej w celu ilościowego określenia cytokin i immunomodulujących fosfoprotein (np. w obrębie szlaków MAPK i NFκB), które reagują i regulują aktywność mikrogleju i innych nerwowych komórek odpornościowych. Na koniec szczegółowo opisujemy, jak zintegrować te dane przy użyciu podejścia do analizy systemów wielowymiarowych, aby zrozumieć relacje między wszystkimi tymi zmiennymi. Zrozumienie zależności między tymi zmiennymi fizjologicznymi i molekularnymi ostatecznie umożliwi nam zidentyfikowanie mechanizmów odpowiedzialnych za mTBI.

Wprowadzenie

Przegląd
Łagodne urazowe uszkodzenia mózgu (mTBI) dotykają ~1,6-3,8 miliona sportowców rocznie1. Urazy te, w tym urazy podwstrząsowe i wstrząsowe, mogą powodować u pacjentów przejściowe objawy fizyczne, emocjonalne, psychologiczne i poznawcze2. Co więcej, powtarzające się mTBI (rmTBI) utrzymywane w "oknie podatności" może prowadzić do skumulowanej dotkliwości i czasu trwania konsekwencji poznawczych, które trwają dłużej niż skutki pojedynczego mTBI tylko 3, a ostatecznie nawet do trwałej utraty funkcji4,5,6. Chociaż wielu pacjentów wraca do zdrowia w stosunkowo krótkim czasie (<1 tydzień), 10-40% pacjentów cierpi na długotrwałe skutki mTBI przez > 1 miesiąc, a niektóre utrzymują się do 1 roku3,7,8,9. Pomimo częstości występowania i trwałych konsekwencji tych urazów, mechanizmy urazów są słabo poznane i nie istnieją skuteczne strategie leczenia.

Biorąc pod uwagę dużą zmienność wyników po mTBI/rmTBI, jednym z wyzwań w identyfikacji wczesnych etapów molekularnych wyzwalaczy z tkanki uzyskanej w końcowych badaniach mTBI/rmTBI jest brak danych podłużnych pokazujących definitywne "ostre powiązania molekularne" tych molekularnych czynników wyzwalających z długoterminowymi wynikami. Aby sprostać temu wyzwaniu, nasza grupa odkryła, że ostro zmniejszony przepływ krwi w mózgu, mierzony ostro za pomocą narzędzia optycznego zwanego spektroskopią korelacji rozproszonej (DCS), silnie koreluje z długoterminowym wynikiem poznawczym w mysim modelu rmTBI10. Korzystając z tego biomarkera hemodynamicznego, wykazaliśmy, że myszy z ostro niskim przepływem krwi w mózgu (a co za tym idzie, gorszym przewidywanym długoterminowym wynikiem) mają jednocześnie ostry wzrost neuronalnej fosfosygnalizacji zarówno w obrębie szlaków MAPK, jak i NFκB, wzrost neuronalnej ekspresji cytokin prozapalnych i wzrost ekspresji fagocytów / markera mikrogleju Iba111. Dane te sugerują możliwą rolę neuronalnej fosfosygnalizacji, ekspresji cytokin i aktywacji mikrogleju zarówno w ostrej regulacji przepływu krwi w mózgu po urazie, jak i w wyzwalaniu kaskady sygnalizacyjnej, która prowadzi do dysfunkcji neuronów i gorszych wyników poznawczych. W tym artykule szczegółowo opisujemy nasze podejście do jednoczesnego badania zarówno środowiska hemodynamicznego, jak i neurozapalnego po rmTBI oraz sposobu integracji tych złożonych zestawów danych. W szczególności nakreślamy procedury dla czterech kluczowych kroków tego kompleksowego podejścia: (1) model spadku masy ciała łagodnego urazowego uszkodzenia mózgu, (2) ocena przepływu krwi w mózgu za pomocą spektroskopii korelacji rozproszonej, (3) kwantyfikacja środowiska neurozapalnego oraz (4) integracja danych (Rysunek 1). Poniżej przedstawiamy krótkie wprowadzenie do każdego z tych kluczowych kroków, aby pomóc czytelnikom zapoznać się z uzasadnieniem naszych metod. Pozostała część manuskryptu zawiera szczegółowy protokół dla każdego z tych kluczowych kroków.

Model spadku masy ciała łagodnego urazowego uszkodzenia mózgu
Chociaż istnieje wiele doskonałych przedklinicznych modeli powtarzającego się łagodnego TBI12,13,14,15,16,17,18, stosujemy dobrze ugruntowany i klinicznie istotny model zamkniętego urazu głowy ze spadkiem wagi. Kluczowe cechy tego modelu to (1) uderzenie w nienaruszoną czaszkę/skórę głowy, po którym następuje nieograniczony obrót głowy wokół szyi, (2) brak jawnego strukturalnego uszkodzenia mózgu, obrzęku, uszkodzenia bariery krew-mózg, ostra śmierć komórek lub przewlekła utrata tkanki mózgowej oraz (3) trwałe (do 1 roku) deficyty poznawcze, które pojawiają się dopiero po wielokrotnych uderzeniach19 (Rysunek 2).

Ocena przepływu krwi w mózgu za pomocą dylacyjnej spektroskopii korelacyjnej
Spektroskopia korelacji dyfuzyjnej (DCS) to nieinwazyjna technika optyczna, która mierzy przepływ krwi5,20,21. W DCS źródło światła bliskiej podczerwieni umieszcza się na powierzchni tkanki. Detektor umieszcza się w stałej odległości od źródła na powierzchni tkanki, aby wykryć światło, które zwielokrotniło się rozproszone w tkance (Rysunek 3). Rozpraszanie poruszających się czerwonych krwinek powoduje wahania wykrytego natężenia światła w czasie. Prosty model analityczny znany jako teoria dyfuzji korelacyjnej służy do powiązania tych fluktuacji intensywności ze wskaźnikiem przepływu krwi (CBFi, Rysunek 4). Chociaż jednostki CBFi (cm2 / s) nie są tradycyjnymi jednostkami przepływu (ml / min / 100 g), poprzednie badanie na myszach wykazało, że CBFi silnie koreluje z przepływem krwi w mózgu mierzonym za pomocą spinu tętniczego oznaczonego MRI21.

Dla porównania, instrument DCS używany tutaj został zbudowany wewnętrznie i składa się z lasera o długości 852 nm o długości koherencji, tablicy 4 fotodiod lawinowych zliczających fotony oraz sprzętowej płytki autokorelatora (pojedynczy tau, 8 kanałów, minimalny czas próbkowania 100 ns)21,22. Dane są pozyskiwane za pomocą domowego oprogramowania napisanego w LabView. Interfejs zwierzęcy dla urządzenia składa się ze światłowodu wielomodowego 400 μm (zakres długości fali 400-2200 nm, rdzeń z czystej krzemionki, TECS Hard Cladding) oraz światłowodu detektora jednomodowego 780 nm (zakres długości fali 780-970 nm, rdzeń z czystej krzemionki, TECS Hard Cladding, 730 ± 30 nm odcięcie w drugim trybie) oddalonych od siebie o 6 mm i osadzonych w czarnym czujniku wydrukowanym w 3D (4 mm x 8 mm, Rysunek 3).

Kwantyfikacja środowiska neurozapalnego
Chociaż zapalenie nerwów jest regulowane przez różne procesy komórkowe, dwa kluczowe istotne mechanizmy to sygnalizacja zewnątrzkomórkowa przez cytokiny / chemokiny i sygnalizacja wewnątrzkomórkowa przez fosfoproteiny. Aby zbadać środowisko neurozapalne mózgu po urazie, mózgi są ekstrahowane od myszy, mikropreparowane, a cytokiny/chemokiny i fosfoproteiny są oznaczane ilościowo za pomocą Luminex ( Rysunek 5, Rysunek 6, Rysunek 7). Multipleksowane testy immunologiczne Luminex umożliwiają jednoczesną kwantyfikację zróżnicowanego zbioru tych białek poprzez sprzężenie testów immunoenzymatycznych (ELISA) z fluorescencyjnie znakowanymi kulkami magnetycznymi. Odrębne znaczniki fluorescencyjne są używane dla każdego interesującego białka, a kulki każdego znacznika są funkcjonalizowane przeciwciałem wychwytującym przeciwko temu konkretnemu białku. Setki kulek do wychwytywania każdego białka miesza się ze sobą, umieszcza na 96-dołkowej płytce i inkubuje z próbką. Po inkubacji próbki magnes jest używany do uwięzienia kulek w studzience, podczas gdy próbka jest wypłukiwana. Następnie biotynylowane przeciwciało detekcyjne wiąże się z analitem będącym przedmiotem zainteresowania, tworząc kanapkę przeciwciało-antygen podobną do tradycyjnego testu ELISA, ale z testem ELISA dla każdego białka występującym na innym fluorescencyjnie znakowanym kulce. Dodanie streptawidyny sprzężonej z fikoerytryną (SAPE) kończy każdą reakcję. Następnie przyrząd Luminex odczytuje kulki i rozdziela sygnał zgodnie z każdym znacznikiem/białkiem fluorescencyjnym.

Integracja danych
Ze względu na dużą liczbę analitów (np. cytokin) mierzonych w teście Luminex, analiza danych może być trudna do zinterpretowania, jeśli każde białko określone ilościowo jest analizowane indywidualnie. Aby uprościć analizę i uchwycić trendy obserwowane wśród analitów, używamy metody analizy wielowymiarowej zwanej częściową regresją metodą najmniejszych kwadratów (PLSR, Rysunek 8)23. PLSR działa poprzez identyfikację osi wag odpowiadających każdemu mierzonemu białku (tj. cytokinom lub fosfobiałkom, zwanym "zmiennymi predykcyjnymi"), które razem optymalnie wyjaśniają kowariancję mierzonych białek ze zmienną odpowiedzi (np. mózgowy przepływ krwi). Wagi są określane jako "ładunki" i są łączone w wektor znany jako zmienna utajona (LV). Poprzez rzutowanie (określane jako "punktacja") zmierzonych danych białkowych na każdym z dwóch LV, dane można ponownie wykreślić pod kątem tych LV. Po obliczeniu PLSR używamy rotacji varimax do zidentyfikowania nowej LV, która maksymalizuje kowariancję między projekcjami próbki na LV a zmienną predyktora24. Takie podejście pozwala nam zdefiniować LV1 jako oś, dla której wariancja zmiennej odpowiedzi jest najlepiej wyjaśniona. LV2 maksymalizuje kowariancję między zmienną odpowiedziową a danymi resztkowymi LV1, które mogą być związane ze zmiennością biologiczną lub techniczną między próbkami. Na koniec przeprowadzamy walidację krzyżową Leave One Out (LOOCV), aby upewnić się, że model PLSR nie jest silnie zależny od żadnej pojedynczej próbki23.

W tym protokole szczegółowo opisujemy metody charakteryzowania neurozapalnej i hemodynamicznej odpowiedzi tkanek na mTBI. Ogólny przepływ pracy jest opisany w Rysunek 1. W tym protokole myszy są poddawane jednemu lub więcej mTBI przy użyciu modelu zamkniętego urazu głowy ze spadkiem wagi. Przepływ krwi w mózgu jest mierzony wzdłużnie przed i w wielu punktach czasowych po urazie. W momencie zainteresowania badaniem zmian neurozapalnych zwierzę zostaje poddane eutanazji, a mózg zostaje pobrany. Obszary mózgu będące przedmiotem zainteresowania są izolowane za pomocą mikrodysekcji, a następnie poddawane lizie w celu ekstrakcji białka. Lizaty są następnie wykorzystywane zarówno do multipleksowanych testów immunologicznych ekspresji cytokin i fosfobiałek Luminex, jak i Western blot. Na koniec ten holistyczny zestaw danych jest integrowany za pomocą częściowej analizy regresji metodą najmniejszych kwadratów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury z udziałem zwierząt zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) Uniwersytetu Emory i były prowadzone zgodnie z wytycznymi NIH dotyczącymi opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych.

1. Model łagodnego urazowego uszkodzenia mózgu z wykorzystaniem metody spadania ciężarka

  1. Przygotuj zestaw do upuszczania ciężarka. Zamocuj imadło na płaskiej powierzchni z prowadnicą o długości 1 m (średnica wewnętrzna 2,54 cm) ustawioną pionowo (sprawdź za pomocą poziomicy). Do zadania uderzenia użyj śruby o masie 54 g (średnica korpusu 0,95 cm, średnica łba 2 cm, długość 10,2 cm).
  2. Krótko znieczul mysz. Wprowadź mysz w stan narkozy, stosując 4,5% izofluranu w 10% tlenie przez 45 sekund. Potwierdź wystarczającą głębokość znieczulenia, sprawdzając brak reakcji na uciśnięcie palca u nogi.
  3. Wywołaj uraz.
    1. Szybko wybudź mysz z narkozy i ułóż ją w pozycji brzusznej na środku cienkiej membrany (fragment tkanki o wymiarach 1,2 cm x 21,3 cm).
    2. Używając obu rąk, naciągnij tkankę, trzymając mysz w pozycji brzusznej na środku. Unieruchom ogon myszy pod kciukiem. Ustaw głowę myszy pod rurką prowadzącą (Rysunek 2).
    3. Upuść śrubę z góry rurki prowadzącej na grzbietową stronę głowy myszy, celując w obszar między tyłem oczu a przodem uszu. W momencie uderzenia mysz przebije tkankę, co pozwoli na gwałtowny przyspieszenie głowy względem szyi (Rysunek 2).
  4. Rekonwalescencja
    1. Po uderzeniu ułóż mysz w pozycji grzbietowej na podgrzewaczce o temperaturze 37 °C w powietrzu pokojowym. Monitoruj rekonwalescencję przez 1 h po urazie. W ciągu 1 h myszy powinny być w stanie normalnie się poruszać, znaleźć pokarm i wodę oraz nie wykazywać rażących deficytów motorycznych.
      UWAGA: Zgodnie z zatwierdzeniem przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt nie stosuje się leków przeciwbólowych, co uzasadnione jest zakłócającym wpływem analgezji na badane parametry (np. przepływ krwi mózgowej, markery stanu zapalnego). Utrata przytomności, definiowana jako czas od wybudzenia z narkozy do momentu odzyskania odruchu prostowania, jest spodziewana i zazwyczaj trwa od 20 s do 3 minut (Tabela dodatkowa 1). Mogą być obserwowane krótkie (<30 s) epizody bezdechu i/lub aktywności przypominającej drgawki, szczególnie po powtarzalnych urazach głowy wykonywanych raz dziennie.
  5. Powtórz w razie potrzeby. Uraz ten można powtarzać raz dziennie, co tydzień lub co miesiąc. Liczba i odstępy między urazami zależą od pożądanej srogości uszkodzenia. Zazwyczaj stosujemy pięć uderzeń w odstępach jednodobowych, aby wywołać wyraźne deficyty w uczeniu przestrzennym i pamięci.
    UWAGA: Poprzednie badania wykazały, że pięć uderzeń w odstępach jednodobowych jest wystarczających do wywołania deficytów uczenia przestrzennego i pamięci trwających ponad 1 rok po urazie, bez wystąpienia obrzęku, krwotoku lub jawnych uszkodzeń strukturalnych mózgu19. Myszy są ważone codziennie i ściśle monitorowane pod kątem oznak odwodnienia, deficytów motorycznych oraz utraty apetytu. W przypadku odwodnienia myszom podaje się wilgotną karmę i raz dziennie wykonuje się podskórny zastrzyk 1 mL soli fizjologicznej. Aby zapobiec niepotrzebnemu cierpieniu i zapewnić humanitarny punkt końcowy, myszy są uśpione, jeśli: odwodnienie utrzymuje się lub nasila >24 h po podskórnym podaniu soli fizjologicznej, masa ciała spadnie o ponad 20% w stosunku do poziomu wyjściowego sprzed urazu, lub pojawią się i utrzymują przez >1 h po urazie deficyty motoryczne, takie jak krążenie w kółko lub przeciąganie łap.

2. Ocena mózgowego przepływu krwi za pomocą spektroskopii korelacyjnej rozproszonej

  1. Akwizycja danych DCS
    1. Usuń owłosienie skóry głowy. Ponieważ metoda DCS działa najlepiej w przypadku braku owłosienia, konieczne jest usunięcie futra z głowy przed rozpoczęciem eksperymentów. Zazwyczaj usuwanie włosów przeprowadza się od 1 do 3 dni przed rozpoczęciem badania.
      1. Wprowadzić myszy w stan znieczulenia, stosując 4,5% izofluranu w 10% tlenie przez 45 sekund, a następnie utrzymać znieczulenie przy użyciu 1–2% izofluranu w 10% tlenie.
      2. Wygolić głowę w obszarze między oczami a uszami. Następnie, użyć kremu do depilacji w celu usunięcia futra z głowy, zgodnie z Rysunek 3.
      3. Pozwolić zwierzęciu dojść do siebie po znieczuleniu na podgrzewaczu, a następnie umieścić je z powrotem w klatce.
    2. Pomiar mózgowego przepływu krwi za pomocą DCS. Aby zminimalizować artefakty ruchowe podczas pomiaru, badaj myszy pod wpływem krótkotrwałej anestezji izofluranem.
      UWAGA: Przez cały czas trwania pomiarów należy wizualnie monitorować oddychanie oraz reakcję na ucisk palców stopy i w razie potrzeby dostosować stężenie izofluranu, aby zapewnić stałą głębokość znieczulenia. Znaczące różnice w głębokości znieczulenia mogłyby zmienić przepływ krwi ze względu na znane efekty naczynioruchowe izofluranu.25.
      1. Wprowadzić w znieczulenie przy użyciu 4,5% izofluranu w 10% tlenie przez 45 sekund, a następnie podtrzymać znieczulenie stosując 1,0–1,75% izofluranu w 10% tlenie. Potwierdzić odpowiednią głębokość znieczulenia poprzez brak reakcji na uciśnięcie palca u stopy oraz prawidłowy oddech (od ok. 60 do 80 oddechów na minutę).
      2. Po 2-minutowym okresie stabilizacji ostrożnie umieść czujnik DCS nad prawą półkulą w taki sposób, aby górna krawędź czujnika optycznego pokrywała się z tylną częścią oka, a bok czujnika znajdował się wzdłuż linii środkowej (Rysunek 3). Przykryć czujnik dłonią, aby osłonić go przed światłem pokojowym. Należy zebrać dane przez 5 sekund (częstotliwość próbkowania 1 Hz).
      3. Umieść czujnik ponownie nad lewą półkulą i zarejestruj 5 sekund danych.
      4. Powtórzyć 3 razy na półkulę, aby uwzględnić lokalne heterogeniczności pod powierzchnią tkanki.
    3. Odzyskiwanie
      1. Wybudź mysz z narkozy i umieść ją na podkładce grzewczej.
      2. Po odzyskaniu przez mysz odruchu prostowania należy umieścić ją z powrotem w klatce.
  2. Analiza danych DCS
    1. Przeprowadź wstępną kontrolę jakości. Każda klatka danych DCS składa się z zmierzonej znormalizowanej funkcji autokorelacji intensywności, Dynamiczne rozpraszanie światła; symbol g2(τ); wykres do analizy wielkości cząstek; badanie rozpraszania. (Rycina 4A), oraz częstotliwość zliczania fotonów (kHz).
      1. Aby usunąć klatki danych z istotnymi artefaktami ruchowymi, należy odrzucić klatki danych, dla których wartość średnia ogona Dynamiczne rozpraszanie światła; symbol g2(τ); wykres do analizy wielkości cząstek; badanie rozpraszania. krzywa (tj. Równanie stanu równowagi statycznej, \(g_2(\tau > 0,018\text{ s})\), na wykresie eksperymentalnym do analizy danych.) jest > 1.005.
      2. Aby usunąć klatki danych o niskim stosunku sygnału do szumu, należy odrzucić klatki danych, jeśli wykryta szybkość zliczania fotonów wynosi < 20 kHz.
    2. Wyznaczenie indeksu przepływu krwi w mózgu. Przy użyciu fminsearch w programie Matlab dopasuj każdy ith ramka danych pomiarowych Równowaga statyczna, ΣFx=0, schemat metody; układ spektroskopowy do pomiaru widm absorpcji przejściowej. dla CBFi(i). Ogranicz dopasowania do Schemat fotoniczny; formuła nierówności g₂(τ)>1,05; pomiar wzbudzenia optycznego; analiza emisji.or wyznacz wartość CBFi która minimalizuje następującą funkcję kosztu:
      Wzór chi-kwadrat dla dopasowania danych; równanie; analiza statystyczna w badaniach naukowych.
      Gdzie sumowanie odbywa się po wszystkich zmierzonych czasach opóźnienia,τ z indeksem j; symbol matematyczny stałej czasowej w systemach dynamicznych.i Korelacja fotonowa; \( g_{2,fit}(\tau) \); wykres; układ laserowy do analizy danych; wzbudzenie optyczne. jest półnieskończonym jednorodnym rozwiązaniem równania dyfuzji korelacyjnej (Rycina 4B):
      Równanie statycznego rozpraszania światła, \( g_{2,fit}(\tau) \), schemat modelu matematycznego dla analizy korelacji.
      Tutaj β jest współczynnikiem koherencji określonym przez układ eksperymentalny, Równanie spektroskopii korelacyjnej dyfuzyjnej do analizy przepływu krwi; optyczna metoda pomiarowa., Równanie równowagi statycznej \( r_1 = \sqrt{\rho^2 + z_0^2} \); wzór matematyczny., Równanie określające obliczanie promienia, \(r_2 = \sqrt{\rho^2 + (z_0 + 2z_b)^2}\), w analizie geometrycznej., Równanie równowagi statycznej z₀=1/μ'ₛ, optyczna metoda pomiarowa., Schemat formuły stanu równowagi statycznej: \(z_b = 2(1+R_{\text{eff}})/3\mu_s(1-R_{\text{eff}})\)., Reff =0,493 przy założonym współczynniku załamania światła tkanki równym 1,4, ρ wynosi 6 mm i μa i μ's współczynnik absorpcji i zredukowany współczynnik rozpraszania tkanki (przyjęto odpowiednio 0,25 i 9,4/cm10,26,27).
      UWAGA: Ponieważ wartość β może zmieniać się o około 10% w czasie, należy dopasować każdą ramkę danych dla β oraz CBFi jednocześnie.
    3. Przeprowadź wtórną kontrolę jakości. W obrębie każdego powtórzenia (składającego się z 5 ramek danych) odrzuć wartości odstające. Wartości odstające definiuje się jako te CBFi wartości wykraczające poza 1,5 odchylenia standardowego od średniego CBFi dla tego powtórzenia. Jeśli więcej niż jeden punkt danych zostanie zidentyfikowany jako wartość odstająca, należy odrzucić całe powtórzenie.
    4. Szacowanie średniego wskaźnika mózgowego przepływu krwi: Szacowanie średniego CBFi na półkulę, obliczając średnią ze wszystkich ramek danych dla wszystkich powtórzeń (Rycina 4C). Jeśli nie zaobserwowano istotnych różnic między półkulami, należy wyciągnąć średnią z obu półkul, aby uzyskać szacunkową wartość średniego globalnego CBF.i.

3. Multiplekspresyjna analiza ilościowa cytokin i fosfoprotein przy użyciu testów Luminex

  1. Ekstrakcja tkanek
    UWAGA: Oznaczenie ilościowe cytokin mózgowych i białek sygnałowych w formie fosforylowanej za pomocą systemu Luminex wymaga ekstrakcji tkanek.
    1. Znieczul mysz, stosując 4,5% izofluranu w 10% tlenie przez 1-2 min. Sprawdź głębokość znieczulenia, badając brak reakcji na uciśnięcie palca stopy. Wykonaj eutanazję poprzez dekapitację.
    2. Pobierz tkankę.
      1. Wyjmij mózg. Zazwyczaj lewą półkulę utrwal do badań histologicznych, a z prawej półkuli wykonaj mikrodysekcję kilku obszarów z kory i hipokampa (Rysunek 5).
      2. Umieść wypreparowane próbki w probówkach do mikrocentryfugi i zamroź błyskawicznie w ciekłym azocie. W przypadku analizy białek wrażliwych na zamrażanie zaleca się podzielenie sekcji tkankowych przed zamrażaniem błyskawicznym, aby uniknąć późniejszych cykli zamrażania i odmrażania.
        UWAGA: Protokół można przerwać, a próbki tkanek przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu lizy próbek. Alternatywnie próbki można zlizować, a następnie przechowywać w temperaturze -80 °C.
    3. Liza próbek.
      1. Przygotuj bufor do lizy, dodając do niego inhibitor proteaz oraz 2 mM fluorku fenylometylosulfonylowego.
      2. Dodaj 150 µL wymieszanego buforu do lizy na około 3 µg tkanki zwierzęcej. Dla odniesienia próbki tkanki z kory wzrokowej myszy ważą około 3 µg.
      3. Aby zhomogenizować tkankę, przeprowadź mechaniczną turyturację, pipetując zawartość góra-dół około 15-20 razy za pomocą pipety 100 µL. W celu optymalnej turyturacji próbek można zastosować pestawyk do homogenizatora.
      4. Umieść probówki z próbkami na rotatorze przez 30 min w temperaturze 4°C.
      5. Centryfuguj próbki w temperaturze 4°C przez 10 min przy około 15 0 x g i zbierz supernatant. Próbki można przetwarzać natychmiast lub przechowywać w temperaturze -80°C do dalszej analizy.
        UWAGA: Lizaty próbek przygotowane według tego protokołu nadają się do analizy Western blot, w której można oznaczyć marker fagocytów/mikrogleju Iba1 i/lub marker aktywacji astrocytów GFAP, aby uzupełnić analizę cytokin i białek fosforylowanych w badaniach nad neurostanem zapalnym1.
  2. Protokół wieloanalitycznego immunoodznaczenia dla cytokin i białek fosforylowanych
    UWAGA: Mimo ogólnego podobieństwa istnieją pewne drobne różnice w protokołach dla zestawów do cytokin i białek fosforylowanych. Różnice te są zaznaczone w poszczególnych krokach. Poniżej przedstawiono etapy przygotowania próbek do analizy Luminex.
    1. Przygotowanie odczynników (dzień 1, tak samo dla cytokin i białek fosforylowanych)
      1. Pozostaw odczynniki do ogrzania do temperatury pokojowej (~30 min).
      2. Poddaj butelkę z wieloanalitycznymi kuleczkami magnetycznymi sonikacji przez 30 sekund, a następnie wortexuj przez 1 min. Upewnij się, że kuleczki magnetyczne są chronione przed światłem za pomocą folii aluminiowej lub użyj dołączonych butelek ochronnych.
      3. Przygotuj bufor do płukania, mieszając 0,1% Tween20 w 1xPBS lub alternatywnie użyj buforu do płukania dołączonego do zestawu.
    2. Przygotowanie zlizowanych próbek tkanek (dzień 1, tak samo dla cytokin i białek fosforylowanych)
      1. Jeśli próbki były wcześniej zamrożone, wyjmij zlizowane próbki tkanek z zamrażarki i pozwól im odtajać na lodzie (~20 min). Centryfuguj próbki przez 10 min przy 9 167 x g, aby usunąć osad.
      2. Przygotuj 25 µL próbki o optymalnym stężeniu białka określonym na podstawie analizy zakresu liniowego (patrz sekcja 3.3). Aby znormalizować całkowitą objętość dla wszystkich próbek, rozcieńcz je w buforze do analizy dołączonym do zestawu.
    3. Przygotowanie płytki 96-dołkowej (dzień 1, tak samo dla cytokin i białek fosforylowanych)
      1. Użyj płytki 96-dołkowej dołączonej do zestawu lub płytki z ciennym dnem (np. Brand Tech).
      2. Dodaj 20 µL buforu do płukania (lub 1x PBS, 0,1% Tween) do każdego dołka i mieszaj na wstrząsarce do płytek przez 10 min przy 750 obr./min.
      3. Zlej bufor do płukania i oprzyj płytkę o ręcznik papierowy, aby usunąć pozostałości.
    4. Procedura immunoodznaczenia dla cytokin (dzień 1)
      1. Dodaj do każdego dołka kolejno następujące składniki:
        1. Dodaj 25 µL buforu do analizy do wszystkich dołków.
          1. Dodaj dodatkowe 25 µL buforu do analizy WYŁĄCZNIE dołków tła. Dla każdego przebiegu eksperymentalnego przygotuj co najmniej dwa dołki tła. Dołki tła nie zawierają próbki i określają intensywność fluorescencji odczytywaną przez instrument bez próbki.
          2. Dodaj 25 µL każdej rozcieńczonej próbki do odpowiednich dołków z próbkami.
          3. Dodaj 25 µL 1x wieloanalitycznych kuleczek magnetycznych do wszystkich dołków (Rysunek 6). Pamiętaj o wortexowaniu kuleczek przez 1 min przed dodaniem dołków.
      2. Zapieczętuj płytkę za pomocą uszczelniacza i przykryj ją folią aluminiową. Inkubuj przez noc (12-16 h) w temperaturze 2-8 °C.
    5. Procedura immunoodznaczenia dla cytokin (dzień 2)
      1. Umieść płytkę 96-dołkową na separatorze magnetycznym, upewniając się, że dołki są wyrównane z magnesami. Pozostaw na 2 min. Zlej zawartość dołków, gdy płytka wciąż znajduje się na separatorze magnetycznym.
      2. Umyj płytkę 2 razy, wykonując następujące kroki:
        1. Dodaj 20 µL buforu do płukania do każdego dołka i umieść na wstrząsarce przez 2 min w temperaturze pokojowej.
        2. Umieść płytkę dołkową na separatorze magnetycznym przez 2 min w temperaturze pokojowej.
        3. Zlej zawartość dołków, gdy płytka dołkowa wciąż znajduje się na separatorze magnetycznym.
      3. Dodaj 25 µL przeciwciała detekcyjnego na dołek (Rysunek 6). Przykryj folią. Inkubuj przez 1 godzinę na wstrząsarce do płytek (750 obr./min) w temperaturze pokojowej.
      4. Pozostaw przeciwciało detekcyjne i dodaj 25 µL streptawidyny-fykoerytryny (SAPE) do każdego dołka (Rysunek 6). Przykryj folią. Inkubuj przez 30 min na wstrząsarce do płytek (750 obr./min) w temperaturze pokojowej.
      5. Umieść płytkę dołkową na separatorze magnetycznym i pozostaw na 2 min. Zlej zawartość dołków i zdejmij z separatora magnetycznego.
      6. Umyj płytkę dołkową dwa razy (patrz krok 3.2.5.2).
      7. Dodaj 75 µL cieczy Luminex Drive Fluid (w przypadku instrumentu MAGPIX) do każdego dołka lub buforu do analizy (w przypadku instrumentu 200 lub FlexMap 3D). Resuspenduj kuleczki na wstrząsarce do płytek przez 5 min w temperaturze pokojowej.
      8. Odczytaj wynik na instrumencie Luminex (MAGPIX, 20 lub FlexMap 3D), korzystając z instrukcji obsługi w celu prawidłowej operacji (Rysunek 6).
    6. Procedura immunoodznaczenia dla białek fosforylowanych (dzień 1)
      1. Dodaj do każdego dołka kolejno następujące składniki:
        1. Dodaj 25 µL buforu do analizy do wszystkich dołków.
          1. Dodaj dodatkowe 25 µL buforu do analizy WYŁĄCZNIE dołków tła. Dla każdego przebiegu eksperymentalnego zaleca się przygotowanie co najmniej dwóch dołków tła. Dołki tła nie zawierają próbki i określają intensywność fluorescencji odczytywaną przez instrument bez próbki.
          2. Dodaj 25 µL każdej rozcieńczonej próbki do każdego dołka z próbką.
          3. Dodaj 25 µL 1x wieloanalitycznych kuleczek magnetycznych do wszystkich dołków (Rysunek 6).
            UWAGA: Zestaw do analizy Luminex dostarcza wieloanalityczne kuleczki magnetyczne w 20-krotnym roztworze zapasowym. Należy wortexować 20-krotny roztwór zapasowy kuleczek przez 2 min, a następnie rozcieńczyć go w buforze do analizy do stężenia 1x. Vortexuj 1-krotną zawiesinę kuleczek przez 1 min przed dodaniem dołków.
        2. Zapieczętuj płytkę za pomocą uszczelniacza i przykryj ją folią aluminiową. Inkubuj przez noc (12-16 godzin) w temperaturze 2-8 °C.
    7. Procedura immunoodznaczenia dla białek fosforylowanych (dzień 2)
      1. Umieść płytkę dołkową na separatorze magnetycznym, upewniając się, że płytka jest w pełni wyrównana z separatorem. Pozostaw na 2 min. Zlej zawartość dołków, gdy płytka wciąż znajduje się na separatorze magnetycznym.
      2. Umyj płytkę 2 razy (patrz krok b w procedurze immunoodznaczenia cytokin w dniu 2).
      3. Rozcieńcz 20-krotny roztwór zapasowy przeciwciała detekcyjnego do roztworu 1x w buforze do analizy. Dodaj 25 µL 1-krotnego przeciwciała detekcyjnego na dołek (Rysunek 6). Przykryj folią. Inkubuj przez 1 h na wstrząsarce do płytek (750 obr./min) w temperaturze pokojowej.
      4. Umieść płytkę 96-dołkową na separatorze magnetycznym i pozostaw na 2 min. Zlej zawartość dołków, zdejmij z separatora magnetycznego.
      5. Rozcieńcz 25-krotny roztwór zapasowy SAPE w buforze do analizy do buforu 1x. Dodaj 25 µL 1x SAPE (Rysunek 6). Przykryj folią i inkubuj przez 15 min na wstrząsarce do płytek (750 obr./min) w temperaturze pokojowej.
      6. Pozostaw SAPE w dołkach i dodaj 25 µL buforu amplifikacyjnego do każdego dołka. Przykryj folią.
      7. Inkubuj przez 15 min na wstrząsarce do płytek (750 obr./min) w temperaturze pokojowej.
      8. Umieść płytkę dołkową na separatorze magnetycznym przez 2 min. Zlej zawartość dołków i zdejmij z separatora magnetycznego.
      9. Dodaj 75 µL cieczy Luminex Drive Fluid (w przypadku instrumentu MAGPIX) lub buforu do analizy (w przypadku instrumentu 20 lub FlexMap 3D). Resuspenduj kuleczki na wstrząsarce do płytek przez 5 min w temperaturze pokojowej.
      10. Odczytaj wynik na instrumencie Luminex (MAGPIX, 20 lub FlexMap 3D), korzystając z instrukcji obsługi w celu prawidłowej operacji (Rysunek 6).
  3. Liniowość krzywej rozcieńczenia próbki
    1. Przygotowanie próbek: Wykonaj rozcieńczenia seryjne próbek testowych z różnym stężeniem białka całkowitego. Dla tkanek mózgowych w masie nałóż rozcieńczenia seryjne od 0-25 µg dla cytokin i od 0-12 µg dla białek fosforylowanych. Stężenie białka całkowitego można zmierzyć za pomocą testu kwasu bicinchoniniowego (BCA).
    2. Wieloanalityczne immunoodznaczenie: Wykonaj analizę Luminex (patrz sekcja 3.2) na wybranych próbkach.
    3. Analiza danych
      1. Nanieś wykres intensywności fluorescencji dla każdego białka względem ilości nałożonego białka (Rysunek 7).
      2. Dla każdego analitycznego składnika określ zakres nałożonego białka całkowitego, dla którego zależność między całkowitą ilością białka a odczytem intensywności fluorescencji jest liniowa (Rysunek 7).
      3. Aby określić ilość białka całkowitego, która powinna być nałożona podczas pełnego przebiegu analizy, zidentyfikuj liniową część krzywej dla każdego analitycznego składnika, a następnie wybierz stężenie białka mieszczące się w zakresie liniowym dla większości tych składników.
        UWAGA: Chociaż większość białek ma podobny zakres liniowy, zakresy te mogą nie pokrywać się dla wszystkich białek. Jeśli tak się stanie, konieczne może być wielokrotne badanie każdej próbki z różnymi ilościami nałożonego białka całkowitego. Alternatywnie próbki nieliniowe można pominąć w analizie. Ponadto niektóre białka mogą w ogóle nie wykazywać zakresu liniowego.

4. Regresja cząstkowych najmniejszych kwadratów

UWAGA: Do przeprowadzenia analizy metodą cząstkowych najmniejszych kwadratów (Partial Least Squares Analysis) udostępniono przykładowy kod R oraz przykładowy arkusz danych.

  1. Przygotowanie danych: Sformatuj dane zgodnie z dołączonym arkuszem przykładowych danych „MyData”. W pierwszym wierszu umieść nazwy zmiennych, w kolumnie A nazwy próbek, w kolumnie B zmienną odpowiedzi, a w kolumnach od C wzwyż wszystkie zmienne predyktora. Dwa ostatnie wiersze wypełnij danymi tła, a obu próbkom przypisz nazwę „Background”.
  2. Regresja metodą najmniejszych kwadratów częściowych w RStudio
    1. Zainstaluj program R ze strony www.r-project.org (bezpłatne oprogramowanie otwartoźródłowe).
    2. Zainstaluj RStudio Desktop ze strony www.rstudio.com (bezpłatna licencja open source).
    3. Pobierz udostępniony z tą publikacją przykładowy kod R „PLSR_Sample_Code.R” i zapisz go w tym samym folderze, w którym znajduje się arkusz z danymi. Otwórz plik z kodem w programie RStudio.
    4. W Użytkownik wejściowy sekcja, zmień „dataFileName” na nazwę arkusza danych.
    5. Wykonaj poniższe kroki, zaznaczając sekcję kodu do uruchomienia i klikając Uruchomienie w prawym górnym rogu skryptu.
      1. Załaduj niezbędne pakiety R, funkcje, adres katalogu roboczego oraz wprowadzone przez użytkownika wartości w RStudio (podrozdział „Wstępy”).
      2. Wczytaj dane do programu RStudio i przygotuj dane surowe do analizy poprzez odjęcie średniego sygnału tła od wszystkich pomiarów oraz standaryzację (z-scoring) każdego analitycznego składnika (podrozdział „Odczytywanie danych i odejmowanie tła”)(Rysunek 8A).
      3. Wykonanie regresji cząstkowych najmniejszych kwadratów w środowisku RStudio przy użyciu pakietu plsRglm w wersji 1.2.528 dostępny w Comprehensive R Archive Network (CRAN). Wykonaj rotację varimax (pakiet stats v3.6.2)23 w płaszczyźnie LV1-LV2 w celu zidentyfikowania nowej osi poziomej, która najlepiej rozdziela próbki pod względem zmiennej odpowiedzi (podrozdział „PLS”)Rycina 8B).
      4. Przeprowadź walidację krzyżową metodą pozostawienia jednej próbki (LOOCV), w której iteracyjnie pomijana jest jedna próbka z danych, a model PLSR jest obliczany ponownie. Oblicz odchylenie standardowe dla ładunków analitytów we wszystkich przebiegach LOOCV (podrozdział „LOOCV”).
  3. Tworzenie reprezentatywnych wykresów: Uruchom dostarczony kod przykładowy zgodnie z powyższym opisem, aby utworzyć reprezentatywne wykresy, które zostaną automatycznie wyeksportowane jako pliki pdf do katalogu roboczego (folderu zawierającego pliki z danymi i kodem).
    1. Utwórz mapę ciepła z przetworzonych danych, zgodnie z przedstawionym w Rycina 8A (podrozdział „PLS”). Oznacz każdy wpis kolorami zgodnie ze skalą zdefiniowaną przez z-score. Posortuj anality tylko w kolejności obliczonej dla interesującej nas zmiennej latentnej.
    2. Utwórz wykres wyników (scores plot), nanosząc wartości LV1 na oś poziomą, a wartości LV2 na oś pionową, zgodnie z przedstawionym na Rysunek 8B (podrozdział „PLS”). Pokoloruj każdy punkt danych zgodnie z pomiarem zmiennej odpowiedzi, aby zwizualizować zależność między każdą zmienną ukrytą a zmienną odpowiedzi.
    3. Utwórz wykres słupkowy przedstawiający ładunki dla każdej z Twoich zmiennych predykcyjnych, aby zwizualizować wkład każdego analitycznego składnika w zmienne latentne, jak pokazano w Rysunek 8C (podrozdział „LOOCV”).
    4. Stwórz wykres regresji wyników LV1 względem zmiennej odpowiedzi, aby zwizualizować, jak dobrze model PLSR rozdziela próbki, jak pokazano w Rycina 8D (podrozdział „PLS”).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wcześniej zgromadzone dane pochodziły z poprzednich badań, w których grupa ośmiu myszy C57BL/6 została poddana trzem urazom zamkniętym głowy (Rycina 2), wykonywanym raz dziennie1. W niniejszej pracy przepływ krwi mózgowej mierzono za pomocą dyfuzyjnej spektroskopii korelacyjnej 4 h po ostatnim urazie (Rycina 3, Rycina 4). Po ocenie CBF po urazie zwierzęta zostały uśmiercone, a tkankę mózgu pobrano w celu iloś...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W niniejszym artykule szczegółowo opisano metody oceny odpowiedzi hemodynamicznej i neurozapalnej na powtarzające się łagodne urazowe uszkodzenie mózgu. Ponadto pokazaliśmy, jak zintegrować te dane w ramach wielowymiarowej analizy systemowej przy użyciu częściowej regresji metodą najmniejszych kwadratów. W poniższym tekście omówimy niektóre z kluczowych kroków i ograniczeń związanych z protokołem, a także zalety/wady metod w porównaniu z istniejącymi metodami.

Model spadku masy ciała ł...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Podziękowania

Ten projekt był wspierany przez National Institutes of Health R21 NS104801 (EMB) i R01 NS115994 (LBW/EB) oraz Children's Healthcare of Atlanta Junior Faculty Focused Award (EMB). Prace te były również wspierane przez Departament Obrony Stanów Zjednoczonych poprzez Programy Badań Medycznych kierowane przez Kongres w ramach nagrody nr W81XWH-18-1-0669 (LBW/EMB). Opinie, interpretacje, wnioski i zalecenia są opiniami autora i niekoniecznie są zatwierdzone przez Departament Obrony. Niniejszy materiał opiera się na pracach wspieranych przez National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program w ramach grantu nr 1937971. Wszelkie opinie, ustalenia, wnioski lub zalecenia wyrażone w tym materiale są opiniami autorów i niekoniecznie odzwierciedlają poglądy National Science Foundation.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Pipetydowolna pipeta regulowana
Folia aluminiowaVWR89107-726
Zestaw do lizy komórek Bio-PlexC Bio-Rad
MARKA MARKA Płytki pureGrade Microplates, niesterylneBrandTech781602 96
Kompletna mini tabletka inhibitora proteazySigma-Aldrich11836153001
Krem do depilacjiAmazonNair
DiH2OVWRVWRL0200-1000
Ręczny magnetyczny blok separatora do 96-dołkowych płaskich płyt dennychMillipore Sigma Katalog40-285
Sprzętowa płyta autokorelatorawww.correlator.comFlex05-8ch
Isofluran 250 mLMED-VET INTERNATIONALRXISO-250
Kimwipe (11,2 x 21,3 cm)VWR21905-026
Laboratoryjny mieszalnik wirowyVWR10153-838
LabViewNational InstrumentsLabVIEW Luminex
200, HTS, FLEXMAP 3D lub MAGPIX z oprogramowaniem xPONENTLuminex Corporation
Luminex Drive FluidLuminexMPXDF-4PK
Płyn do osłonek LuminexEMD MilliporePŁYN OSŁONOWY
MILLIPLEX MAP Mysz Panel magnetyczny z cytokinami/chemokinami - wstępnie zmieszany 32 Plex - Test multipleksowy immunologicznyMillipore SigmaMCYTMAG-70K-PX32
MILLIPLEX MAPK/SAPK Sygnalizacja 10-Plex Kit-Cell Sygnalizacja Multiplex TestMillipore Sigma48-660MAG
Mini rotator LabRollerVWR10136-084
Fluorek fenylometylosulfonyluSigma-AldrichP7626-1G
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)VWR97064-158
Zgrzewarka do płytVWR82050-992
Rurki polipropylenowe do mikrofugiVWR20901-547
Mini LabRollerMillipore Sigma Z674591
Zbiorniki odczynnikówVWR89094-668
R Język
RStudiowww.rstudio.com
Sonicator
Wytrząsarka płytkowaVWR12620-926
Tween20Sigma-AldrichP9416-50ML
Akrylowa rura prowadząca o długości 1 mMcMaster-Carr49035K85
4-fotonowa fotodioda lawinowa zliczająca fotonyPerkin-ElmerSPCM-AQ4C-IO
400 um wielomodowe źródłoświatłowodowe Thorlabs Inc.FT-400-EMT
54 g śrubaAce Hardware0,95 cm podstawowa średnica korpusu, 2 cm średnica główki, 10,2 cm długość
780 nm detektor jednomodowy światłowódThorlabs Inc.780HP
852 nm laser o długiej długości koherencjiTOPTICA PhotonicsiBeam smart
regulowane 171304012 programowania

Bibliografia

  1. Langlois, J. A., Rutland-Brown, W., Wald, M. M. The epidemiology and impact of traumatic brain injury: a brief overview. Journal of Head Trauma Rehabilitation. 21 (5), 375-378 (2006).
  2. Iraji, A., et al. Resting State Functional Connectivity in Mild Traumatic Brain Injury at the Acute Stage: Independent Component and Seed-Based Analyses. Journal of Neurotrauma. 32 (14), 1031-1045 (2015).
  3. Guskiewicz, K. M., et al. Cumulative effects associated with recurrent concussion in collegiate football players: the NCAA Concussion Study. Journal of the American Medical Association. 290 (19), 2549-2555 (2003).
  4. Longhi, L., et al. Temporal window of vulnerability to repetitive experimental concussive brain injury. Neurosurgery. 56 (2), 364-374 (2005).
  5. Committee on Sports-Related Concussions in Youth, Board on Children, Youth, and Families, Institute of Medicine, National Research Council. Sports-Related Concussions in Youth: Improving the Science, Changing the Culture. , National Academies Press (US). Washington (DC). http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK169016/ (2014).
  6. Barkhoudarian, G., Hovda, D. A., Giza, C. C. The Molecular Pathophysiology of Concussive Brain Injury - an Update. Physical Medicine and Rehabilitation Clinics of North America. 27 (2), 373-393 (2016).
  7. McCrory, P., et al. Consensus statement on concussion in sport--the 4th International Conference on Concussion in Sport held in Zurich, November 2012. Clinical Journal of Sport Medicine. 23 (2), 89-117 (2012).
  8. Belanger, H. G., Vanderploeg, R. D., Curtiss, G., Warden, D. L. Recent neuroimaging techniques in mild traumatic brain injury. Journal of Neuropsychiatry and Clinical Neurosciences. 19 (1), 5-20 (2007).
  9. Sours, C., Zhuo, J., Roys, S., Shanmuganathan, K., Gullapalli, R. P. Disruptions in Resting State Functional Connectivity and Cerebral Blood Flow in Mild Traumatic Brain Injury Patients. PLoS ONE. 10 (8), 0134019(2015).
  10. Buckley, E. M., et al. Decreased Microvascular Cerebral Blood Flow Assessed by Diffuse Correlation Spectroscopy after Repetitive Concussions in Mice. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 35 (12), 1995-2000 (2015).
  11. Sankar, S. B., et al. Low cerebral blood flow is a non-invasive biomarker of neuroinflammation after repetitive mild traumatic brain injury. Neurobiology of Disease. 124, 544-554 (2019).
  12. Vagnozzi, R., et al. Temporal window of metabolic brain vulnerability to concussions: mitochondrial-related impairment--part I. Neurosurgery. 61, 379-388 (2007).
  13. Longhi, L., et al. Temporal window of vulnerability to repetitive experimental concussive brain injury. Neurosurgery. 56, 364-374 (2005).
  14. Fujita, M., Wei, E. P., Povlishock, J. T. Intensity- and interval-specific repetitive traumatic brain injury can evoke both axonal and microvascular damage. Journal of Neurotrauma. 29, 2172-2180 (2012).
  15. Angoa-Perez, M., et al. Animal models of sports-related head injury: bridging the gap between preclinical research and clinical reality. Journal of Neurochemistry. 129, 916-931 (2014).
  16. Prins, M. L., Hales, A., Reger, M., Giza, C. C., Hovda, D. A. Repeat traumatic brain injury in the juvenile rat is associated with increased axonal injury and cognitive impairments. Developmental Neuroscience. 32, 510-518 (2010).
  17. Viano, D. C., Hamberger, A., Bolouri, H., Saljo, A. Concussion in professional football: animal model of brain injury--part 15. Neurosurgery. 64, 1162-1173 (2009).
  18. Kane, M. J., et al. A mouse model of human repetitive mild traumatic brain injury. Journal of Neuroscience Methods. 203, 41-49 (2012).
  19. Meehan, W. P., Zhang, J., Mannix, R., Whalen, M. J. Increasing Recovery Time Between Injuries Improves Cognitive Outcome After Repetitive Mild Concussive Brain Injuries in Mice. Neurosurgery. 71 (4), 885-892 (2012).
  20. Durduran, T., Yodh, A. G. Diffuse correlation spectroscopy for non-invasive, micro-vascular cerebral blood flow measurement. NeuroImage. 85, 51-63 (2014).
  21. Sathialingam, E., et al. Small separation diffuse correlation spectroscopy for measurement of cerebral blood flow in rodents. Biomedical Optics Express. 9 (11), 5719(2018).
  22. Lee, S. Y., et al. Noninvasive optical assessment of resting-state cerebral blood flow in children with sickle cell disease. Neurophotonics. 6 (03), 1(2019).
  23. Wang, H., Liu, Q., Tu, Y. Interpretation of partial least-squares regression models with VARIMAX rotation. Partial Least Squares. 48 (1), 207-219 (2005).
  24. Eriksson, L., Byrne, T., Johansson, E., Trygg, J., Vikström, C. Multi- and Megavariate Data Analysis Basic Principles and Applications. Umetrics Academy. , (2013).
  25. Conzen, P. F., et al. Systemic and regional hemodynamics of isoflurane and sevoflurane in rats. Anesthesia and Analgesia. 74 (1), 79-88 (1992).
  26. Durduran, T., Choe, R., Baker, W. B., Yodh, A. G. Diffuse optics for tissue monitoring and tomography. Reports on Progress in Physics. 73 (7), 076701(2010).
  27. Lee, S. Y., et al. Small separation frequency-domain near-infrared spectroscopy for the recovery of tissue optical properties at millimeter depths. Biomedical Optics Express. 10 (10), 5362-5377 (2019).
  28. Bertrand, F., Maumy-Bertrand, M. plsRglm: Partial Least Squares Regression for Generalized Linear Models. , Available from: https://CRAN.R-project.org/package=pplsRglm (2019).
  29. White, B. R., Bauer, A. Q., Snyder, A. Z., Schlaggar, B. L., Lee, J. M., Culver, J. P. Imaging of functional connectivity in the mouse brain. PLoS One. 6, 16322(2011).
  30. Buckley, E. M., Parthasarathy, A. B., Grant, P. E., Yodh, A. G., Franceschini, M. A. Diffuse correlation spectroscopy for measurement of cerebral blood flow: future prospects. Neurophotonics. 1 (1), 011009(2014).
  31. Rowan, O., et al. Cerebrovascular reactivity measured in awake mice using diffuse correlation spectroscopy. Neurophotonics. 8 (1), (2021).
  32. Tate, J., Ward, G. Interferences in immunoassay. The Clinical Biochemist. Reviews. 25 (2), 105-120 (2004).
  33. Staples, E., Ingram, R. J. M., Atherton, J. C., Robinson, K. Optimising the quantification of cytokines present at low concentrations in small human mucosal tissue samples using Luminex assays. Journal of Immunological Methods. 394 (1-2), 1-9 (2013).
  34. Gierut, J. J., et al. Network-level effects of kinase inhibitors modulate TNF-α-induced apoptosis in the intestinal epithelium. Science Signaling. 8 (407), 129(2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Spektroskopia korelacji rozproszonejmultipleksowy test immunoabsorpcyjnyregresja cząstkowych najmniejszych kwadratówanaliza cytokinmózgowy przepływ krwiaktywacja mikroglejumodel Weight-Droptest Luminex
Analiza systemowa odpowiedzi neurozapalnej i hemodynamicznej na urazowe uszkodzenie mózgu
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.