Artykuł metodologiczny

Analiza systemowa odpowiedzi neurozapalnej i hemodynamicznej na urazowe uszkodzenie mózgu

DOI:

10.3791/61504

⸱

27 maja 2022

 ,  ,  ,  , 
1Wallace H. Coulter Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology and Emory University, 2George W. Woodruff School of Mechanical Engineering, Georgia Institute of Technology, 3Parker H. Petit Institute for Bioengineering and Bioscience, Georgia Institute of Technology, 4Department of Pediatrics, Emory University School of Medicine, 5Children's Research Scholar, Children's Healthcare of Atlanta

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół przedstawia metody charakteryzowania neurozapalnej i hemodynamicznej odpowiedzi na łagodne urazowe uszkodzenie mózgu oraz integracji tych danych jako części wielowymiarowej analizy systemów przy użyciu częściowej regresji metodą najmniejszych kwadratów.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Łagodne urazowe uszkodzenia mózgu (mTBI) stanowią poważny problem zdrowia publicznego. Powtarzające się narażenie na mTBI może prowadzić do skumulowanych, długotrwałych deficytów funkcjonalnych. Liczne badania przeprowadzone przez naszą grupę i innych wykazały, że mTBI stymuluje ekspresję cytokin i aktywuje mikroglej, zmniejsza przepływ krwi i metabolizm w mózgu oraz upośledza reaktywność naczyń mózgowych. Co więcej, kilka prac wykazało związek między zaburzeniami tych markerów neurozapalnych i hemodynamicznych a zaburzeniami poznawczymi. W niniejszym artykule szczegółowo opisano metody charakteryzowania neurozapalnej i hemodynamicznej odpowiedzi tkanek na mTBI u myszy. W szczególności opisujemy, jak wykonać model spadku masy ciała mTBI, jak podłużnie zmierzyć przepływ krwi w mózgu za pomocą nieinwazyjnej techniki optycznej zwanej dyfuzyjną spektroskopią korelacji oraz jak przeprowadzić multipleksowany test immunologiczny Luminex na próbkach tkanki mózgowej w celu ilościowego określenia cytokin i immunomodulujących fosfoprotein (np. w obrębie szlaków MAPK i NFκB), które reagują i regulują aktywność mikrogleju i innych nerwowych komórek odpornościowych. Na koniec szczegółowo opisujemy, jak zintegrować te dane przy użyciu podejścia do analizy systemów wielowymiarowych, aby zrozumieć relacje między wszystkimi tymi zmiennymi. Zrozumienie zależności między tymi zmiennymi fizjologicznymi i molekularnymi ostatecznie umożliwi nam zidentyfikowanie mechanizmów odpowiedzialnych za mTBI.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przegląd
Łagodne urazowe uszkodzenia mózgu (mTBI) dotykają ~1,6-3,8 miliona sportowców rocznie1. Urazy te, w tym urazy podwstrząsowe i wstrząsowe, mogą powodować u pacjentów przejściowe objawy fizyczne, emocjonalne, psychologiczne i poznawcze2. Co więcej, powtarzające się mTBI (rmTBI) utrzymywane w "oknie podatności" może prowadzić do skumulowanej dotkliwości i czasu trwania konsekwencji poznawczych, które trwają dłużej niż skutki pojedynczego mTBI tylko 3, a ostatecznie nawet do trwałej utraty funkcji4,5,6. Chociaż wielu pacjentów wraca do zdrowia w stosunkowo krótkim czasie (<1 tydzień), 10-40% pacjentów cierpi na długotrwałe skutki mTBI przez > 1 miesiąc, a niektóre utrzymują się do 1 roku3,7,8,9. Pomimo częstości występowania i trwałych konsekwencji tych urazów, mechanizmy urazów są słabo poznane i nie istnieją skuteczne strategie leczenia.

Biorąc pod uwagę dużą zmienność wyników po mTBI/rmTBI, jednym z wyzwań w identyfikacji wczesnych etapów molekularnych wyzwalaczy z tkanki uzyskanej w końcowych badaniach mTBI/rmTBI jest brak danych podłużnych pokazujących definitywne "ostre powiązania molekularne" tych molekularnych czynników wyzwalających z długoterminowymi wynikami. Aby sprostać temu wyzwaniu, nasza grupa odkryła, że ostro zmniejszony przepływ krwi w mózgu, mierzony ostro za pomocą narzędzia optycznego zwanego spektroskopią korelacji rozproszonej (DCS), silnie koreluje z długoterminowym wynikiem poznawczym w mysim modelu rmTBI10. Korzystając z tego biomarkera hemodynamicznego, wykazaliśmy, że myszy z ostro niskim przepływem krwi w mózgu (a co za tym idzie, gorszym przewidywanym długoterminowym wynikiem) mają jednocześnie ostry wzrost neuronalnej fosfosygnalizacji zarówno w obrębie szlaków MAPK, jak i NFκB, wzrost neuronalnej ekspresji cytokin prozapalnych i wzrost ekspresji fagocytów / markera mikrogleju Iba111. Dane te sugerują możliwą rolę neuronalnej fosfosygnalizacji, ekspresji cytokin i aktywacji mikrogleju zarówno w ostrej regulacji przepływu krwi w mózgu po urazie, jak i w wyzwalaniu kaskady sygnalizacyjnej, która prowadzi do dysfunkcji neuronów i gorszych wyników poznawczych. W tym artykule szczegółowo opisujemy nasze podejście do jednoczesnego badania zarówno środowiska hemodynamicznego, jak i neurozapalnego po rmTBI oraz sposobu integracji tych złożonych zestawów danych. W szczególności nakreślamy procedury dla czterech kluczowych kroków tego kompleksowego podejścia: (1) model spadku masy ciała łagodnego urazowego uszkodzenia mózgu, (2) ocena przepływu krwi w mózgu za pomocą spektroskopii korelacji rozproszonej, (3) kwantyfikacja środowiska neurozapalnego oraz (4) integracja danych (Rysunek 1). Poniżej przedstawiamy krótkie wprowadzenie do każdego z tych kluczowych kroków, aby pomóc czytelnikom zapoznać się z uzasadnieniem naszych metod. Pozostała część manuskryptu zawiera szczegółowy protokół dla każdego z tych kluczowych kroków.

Model spadku masy ciała łagodnego urazowego uszkodzenia mózgu
Chociaż istnieje wiele doskonałych przedklinicznych modeli powtarzającego się łagodnego TBI12,13,14,15,16,17,18, stosujemy dobrze ugruntowany i klinicznie istotny model zamkniętego urazu głowy ze spadkiem wagi. Kluczowe cechy tego modelu to (1) uderzenie w nienaruszoną czaszkę/skórę głowy, po którym następuje nieograniczony obrót głowy wokół szyi, (2) brak jawnego strukturalnego uszkodzenia mózgu, obrzęku, uszkodzenia bariery krew-mózg, ostra śmierć komórek lub przewlekła utrata tkanki mózgowej oraz (3) trwałe (do 1 roku) deficyty poznawcze, które pojawiają się dopiero po wielokrotnych uderzeniach19 (Rysunek 2).

Ocena przepływu krwi w mózgu za pomocą dylacyjnej spektroskopii korelacyjnej
Spektroskopia korelacji dyfuzyjnej (DCS) to nieinwazyjna technika optyczna, która mierzy przepływ krwi5,20,21. W DCS źródło światła bliskiej podczerwieni umieszcza się na powierzchni tkanki. Detektor umieszcza się w stałej odległości od źródła na powierzchni tkanki, aby wykryć światło, które zwielokrotniło się rozproszone w tkance (Rysunek 3). Rozpraszanie poruszających się czerwonych krwinek powoduje wahania wykrytego natężenia światła w czasie. Prosty model analityczny znany jako teoria dyfuzji korelacyjnej służy do powiązania tych fluktuacji intensywności ze wskaźnikiem przepływu krwi (CBFi, Rysunek 4). Chociaż jednostki CBFi (cm2 / s) nie są tradycyjnymi jednostkami przepływu (ml / min / 100 g), poprzednie badanie na myszach wykazało, że CBFi silnie koreluje z przepływem krwi w mózgu mierzonym za pomocą spinu tętniczego oznaczonego MRI21.

Dla porównania, instrument DCS używany tutaj został zbudowany wewnętrznie i składa się z lasera o długości 852 nm o długości koherencji, tablicy 4 fotodiod lawinowych zliczających fotony oraz sprzętowej płytki autokorelatora (pojedynczy tau, 8 kanałów, minimalny czas próbkowania 100 ns)21,22. Dane są pozyskiwane za pomocą domowego oprogramowania napisanego w LabView. Interfejs zwierzęcy dla urządzenia składa się ze światłowodu wielomodowego 400 μm (zakres długości fali 400-2200 nm, rdzeń z czystej krzemionki, TECS Hard Cladding) oraz światłowodu detektora jednomodowego 780 nm (zakres długości fali 780-970 nm, rdzeń z czystej krzemionki, TECS Hard Cladding, 730 ± 30 nm odcięcie w drugim trybie) oddalonych od siebie o 6 mm i osadzonych w czarnym czujniku wydrukowanym w 3D (4 mm x 8 mm, Rysunek 3).

Kwantyfikacja środowiska neurozapalnego
Chociaż zapalenie nerwów jest regulowane przez różne procesy komórkowe, dwa kluczowe istotne mechanizmy to sygnalizacja zewnątrzkomórkowa przez cytokiny / chemokiny i sygnalizacja wewnątrzkomórkowa przez fosfoproteiny. Aby zbadać środowisko neurozapalne mózgu po urazie, mózgi są ekstrahowane od myszy, mikropreparowane, a cytokiny/chemokiny i fosfoproteiny są oznaczane ilościowo za pomocą Luminex ( Rysunek 5, Rysunek 6, Rysunek 7). Multipleksowane testy immunologiczne Luminex umożliwiają jednoczesną kwantyfikację zróżnicowanego zbioru tych białek poprzez sprzężenie testów immunoenzymatycznych (ELISA) z fluorescencyjnie znakowanymi kulkami magnetycznymi. Odrębne znaczniki fluorescencyjne są używane dla każdego interesującego białka, a kulki każdego znacznika są funkcjonalizowane przeciwciałem wychwytującym przeciwko temu konkretnemu białku. Setki kulek do wychwytywania każdego białka miesza się ze sobą, umieszcza na 96-dołkowej płytce i inkubuje z próbką. Po inkubacji próbki magnes jest używany do uwięzienia kulek w studzience, podczas gdy próbka jest wypłukiwana. Następnie biotynylowane przeciwciało detekcyjne wiąże się z analitem będącym przedmiotem zainteresowania, tworząc kanapkę przeciwciało-antygen podobną do tradycyjnego testu ELISA, ale z testem ELISA dla każdego białka występującym na innym fluorescencyjnie znakowanym kulce. Dodanie streptawidyny sprzężonej z fikoerytryną (SAPE) kończy każdą reakcję. Następnie przyrząd Luminex odczytuje kulki i rozdziela sygnał zgodnie z każdym znacznikiem/białkiem fluorescencyjnym.

Integracja danych
Ze względu na dużą liczbę analitów (np. cytokin) mierzonych w teście Luminex, analiza danych może być trudna do zinterpretowania, jeśli każde białko określone ilościowo jest analizowane indywidualnie. Aby uprościć analizę i uchwycić trendy obserwowane wśród analitów, używamy metody analizy wielowymiarowej zwanej częściową regresją metodą najmniejszych kwadratów (PLSR, Rysunek 8)23. PLSR działa poprzez identyfikację osi wag odpowiadających każdemu mierzonemu białku (tj. cytokinom lub fosfobiałkom, zwanym "zmiennymi predykcyjnymi"), które razem optymalnie wyjaśniają kowariancję mierzonych białek ze zmienną odpowiedzi (np. mózgowy przepływ krwi). Wagi są określane jako "ładunki" i są łączone w wektor znany jako zmienna utajona (LV). Poprzez rzutowanie (określane jako "punktacja") zmierzonych danych białkowych na każdym z dwóch LV, dane można ponownie wykreślić pod kątem tych LV. Po obliczeniu PLSR używamy rotacji varimax do zidentyfikowania nowej LV, która maksymalizuje kowariancję między projekcjami próbki na LV a zmienną predyktora24. Takie podejście pozwala nam zdefiniować LV1 jako oś, dla której wariancja zmiennej odpowiedzi jest najlepiej wyjaśniona. LV2 maksymalizuje kowariancję między zmienną odpowiedziową a danymi resztkowymi LV1, które mogą być związane ze zmiennością biologiczną lub techniczną między próbkami. Na koniec przeprowadzamy walidację krzyżową Leave One Out (LOOCV), aby upewnić się, że model PLSR nie jest silnie zależny od żadnej pojedynczej próbki23.

W tym protokole szczegółowo opisujemy metody charakteryzowania neurozapalnej i hemodynamicznej odpowiedzi tkanek na mTBI. Ogólny przepływ pracy jest opisany w Rysunek 1. W tym protokole myszy są poddawane jednemu lub więcej mTBI przy użyciu modelu zamkniętego urazu głowy ze spadkiem wagi. Przepływ krwi w mózgu jest mierzony wzdłużnie przed i w wielu punktach czasowych po urazie. W momencie zainteresowania badaniem zmian neurozapalnych zwierzę zostaje poddane eutanazji, a mózg zostaje pobrany. Obszary mózgu będące przedmiotem zainteresowania są izolowane za pomocą mikrodysekcji, a następnie poddawane lizie w celu ekstrakcji białka. Lizaty są następnie wykorzystywane zarówno do multipleksowanych testów immunologicznych ekspresji cytokin i fosfobiałek Luminex, jak i Western blot. Na koniec ten holistyczny zestaw danych jest integrowany za pomocą częściowej analizy regresji metodą najmniejszych kwadratów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury dotyczące zwierząt są zatwierdzone przez Emory University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) i przestrzegają wytycznych NIH dotyczących opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych.

1. Model spadku masy ciała łagodnego urazowego uszkodzenia mózgu

  1. Przygotuj zestaw do zrzucania wagi. Zamontuj imadło na płaskiej powierzchni z rurą prowadzącą o długości 1 m (średnica wewnętrzna 2.54 cm) ustawioną pionowo (sprawdź za pomocą poziomicy). Do uderzenia użyj o wadze 54 g (podstawowa średnica korpusu 0,95 cm, średnica łba 2 cm, długość 10,2 cm).
  2. Krótko znieczulić mysz. Indukuj mysz 4,5% izofluranem w 100% tlenu przez 45 sekund. Potwierdź wystarczającą głębokość znieczulenia przy braku reakcji na uszczypnięcie palca u nogi.
  3. Wywołaj obrażenia.
    1. Szybko wyjmij mysz ze znieczulenia i połóż mysz na brzuchu na środku cienkiej błony (tkanka o wymiarach 11,2 cm x 21,3 cm).
    2. Użyj obu rąk, aby utrzymać napiętą tkankę, gdy mysz leży na środku. Zabezpiecz ogon myszy pod kciukiem. Umieść głowicę myszy pod rurką prowadzącą (Rysunek 2).
    3. Upuść od góry rurki prowadzącej na grzbietową część głowy myszy, dążąc do uderzenia między tylną częścią oczu a przednią częścią uszu. Po uderzeniu mysz wbije się w tkankę, co pozwoli na szybkie przyspieszenie głowy wokół szyi (Rysunek 2).
  4. Odzyskiwania
    1. Po uderzeniu połóż mysz na wznak na podkładce grzewczej o temperaturze 37 °C w powietrzu w pomieszczeniu. Monitoruj regenerację przez 1 godzinę po urazie. W ciągu 1 godziny myszy powinny być w stanie normalnie się poruszać, znajdować pożywienie i wodę oraz nie wykazywać dużych deficytów motorycznych.
      UWAGA: Analgezja nie jest stosowana za zgodą Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt, co jest uzasadnione ze względu na mylący wpływ analgezji na parametry będące przedmiotem zainteresowania (tj. przepływ krwi w mózgu, markery stanu zapalnego). Utrata przytomności, definiowana jako czas od wyjęcia z narkozy do czasu odzyskania odruchu prostującego, jest oczekiwana i zwykle trwa od 20 s do 3 minut (Tabela uzupełniająca 1). Można zaobserwować krótkie (<30 s) epizody bezdechu i/lub aktywności podobnej do napadów, szczególnie po powtarzających się urazach głowy raz dziennie.
  5. Powtórz w razie potrzeby. Ten uraz może się powtarzać raz dziennie, co tydzień lub co miesiąc. Liczba i odstępy między urazami zależą od pożądanego stopnia urazu. Zazwyczaj stosujemy pięć uderzeń w odstępach raz dziennie, aby wywołać silne deficyty w uczeniu się przestrzennym i pamięci.
    UWAGA: Wcześniejsze badania wykazały, że pięć uderzeń w odstępach raz dziennie wystarczy, aby wywołać deficyty w uczeniu się przestrzennym i pamięci trwające ponad 1 rok po urazie bez obrzęku, krwotoku lub jawnegouszkodzenia strukturalnego mózgu. Myszy są codziennie ważone i ściśle monitorowane pod kątem oznak odwodnienia, deficytów motorycznych i utraty apetytu. W przypadku odwodnienia myszom podaje się wilgotną karmę i podskórne wstrzyknięcie 1 ml soli fizjologicznej raz dziennie. Aby zapobiec niepotrzebnemu cierpieniu i zapewnić humanitarny punkt końcowy, myszy są poddawane eutanazji, jeśli: odwodnienie utrzymuje się lub pogarsza >24 godziny po podskórnym leczeniu solą fizjologiczną, masa ciała zmniejsza się o ponad 20% w stosunku do wartości wyjściowej sprzed urazu, deficyty motoryczne, takie jak krążenie lub przeciąganie łapami, pojawiają się i utrzymują >1 godzinę po urazie.

2. Ocena przepływu krwi w mózgu za pomocą dyfuzyjnej spektroskopii korelacyjnej

  1. Akwizycja danych DCS
    1. Usuń włosy ze skóry głowy. Ponieważ DCS działa najlepiej w przypadku braku włosów, konieczne jest usunięcie sierści na głowie przed rozpoczęciem eksperymentów. Zazwyczaj depilacja jest wykonywana 1-3 dni przed rozpoczęciem badania.
      1. Indukuj myszy 4,5% izofluranem w 100% tlenu przez 45 sekund i utrzymuj 1-2% izofluranu w 100% tlenie.
      2. Ogol głowę między oczami a uszami. Następnie użyj kremu do depilacji, aby usunąć sierść na głowie, jak w Rysunek 3.
      3. Pozwól zwierzęciu dojść do siebie po znieczuleniu na podkładce rozgrzewającej, a następnie wróć do klatki.
    2. Zmierz przepływ krwi w mózgu za pomocą DCS. Aby zminimalizować artefakty ruchu podczas pomiaru, badaj myszy w krótkim znieczuleniu izofluranem.
      UWAGA: Monitoruj wzrokowo oddychanie i reakcję na szczypanie palców u nóg podczas pomiarów i dostosuj stężenie izofluranu w razie potrzeby, aby zapewnić stałą głębokość znieczulenia. Znaczne różnice w głębokości znieczulenia mogą zmienić przepływ krwi, biorąc pod uwagę znane działanie naczyniomodulacyjne izofluranu25.
      1. Indukować 4,5% izofluranu w 100% tlenu przez 45 sekund, a następnie utrzymywać 1,0-1,75% izofluranu w 100% tlenie. Potwierdź wystarczającą głębokość znieczulenia poprzez brak reakcji na uszczypnięcie palca u nogi i normalne oddychanie (między ~60-80 oddechami na minutę).
      2. Po 2-minutowym okresie stabilizacji delikatnie oprzyj czujnik DCS na prawej półkuli tak, aby górna krawędź czujnika optycznego zrównała się z tylną częścią oka, a bok czujnika wyrównał się wzdłuż linii środkowej (Rysunek 3). Przyłóż dłoń do czujnika, aby osłonić go przed światłem w pomieszczeniu. Pozyskanie danych w ciągu 5 sekund (akwizycja z częstotliwością 1 Hz).
      3. Ustaw czujnik na lewej półkuli i uzyskaj 5 sekund danych.
      4. Powtórz 3 razy na półkulę, aby uwzględnić lokalne niejednorodności pod powierzchnią tkanki.
    3. Odzyskiwania
      1. Wyjmij mysz ze znieczulenia i umieść na podkładce rozgrzewającej.
      2. Po tym, jak mysz odzyska odruch prostowania, załóż ją z powrotem do klatki.
  2. Analiza danych DCS
    1. Przeprowadź wstępną kontrolę jakości. Każda klatka danych DCS składa się ze zmierzonej znormalizowanej funkcji autokorelacji intensywności, figure-protocol-1 (Rysunek 4A) oraz szybkość zliczania fotonów (kHz).
      1. Aby usunąć ramki danych ze znaczącym artefaktem ruchu, odrzuć ramki danych, dla których średnia wartość końca figure-protocol-2 krzywa (np. figure-protocol-3) wynosi > 1,005.
      2. Aby usunąć ramki danych o słabym stosunku sygnału do szumu, należy odrzucić ramki danych, jeśli wykryta szybkość zliczania fotonów wynosi < 20 kHz.
    2. Ekstrakt wskaźnika przepływu krwi w mózgu. Korzystając z fminsearch w Matlabie, dopasuj każdą itą mierzoną ramkę danych figure-protocol-4 dla CBFi(i). Ogranicz dopasowania do figure-protocol-5 i znajdź wartość CBFi, która minimalizuje następującą funkcję kosztu:
      figure-protocol-6
      Gdzie suma jest ponad wszystkimi zmierzonymi czasami opóźnienia,figure-protocol-7, oraz figure-protocol-8 jest półnieskończonym jednorodnym rozwiązaniem równania dyfuzji korelacji (Rysunek 4B):
      figure-protocol-9
      Tutaj β jest współczynnik koherencji określony przez układ eksperymentalny, figure-protocol-10, figure-protocol-11, figure-protocol-12, figure-protocol-13, figure-protocol-14, Reff =0,493 dla założonego wskaźnika załamania tkanki wynoszącego 1,4, ρ wynosi 6 mm, a μa i μ są współczynnikiem absorpcji i zmniejszonego rozpraszania tkanki (przyjmuje się, że wynosi odpowiednio 0,25 i 9,4/cm10,26,27).
      UWAGA: Ponieważ β może zmieniać się o ~10% w czasie, dopasuj każdą ramkę danych do β i CBFi.
    3. Wykonaj wtórną kontrolę jakości. W każdym powtórzeniu (które składa się z 5 ramek danych) odrzuć wartości odstające. Wartości odstające definiuje się jako te wartości CBFi, które mieszczą się poza 1,5 odchylenia standardowego średniej CBFi dla tego powtórzenia. Jeśli więcej niż 1 punkt danych zostanie zidentyfikowany jako wartość odstająca, odrzuć całe powtórzenie.
    4. Oszacuj średni wskaźnik przepływu krwi w mózgu: Oszacuj średni CBFi na półkulę, biorąc średnią ze wszystkich ramek danych dla wszystkich powtórzeń (Rysunek 4C). Jeśli nie obserwuje się znaczących różnic między półkulami, należy uśrednić na wszystkich półkulach, aby uzyskać oszacowanie średniego globalnego CBFi.

3. Multipleksowana kwantyfikacja cytokin i fosfobiałek za pomocą testów luminex

  1. Ekstrakcja tkanek
    UWAGA: Kwantyfikacja cytokin mózgowych i białek fosfo-sygnałowych za pomocą Luminex wymaga ekstrakcji tkanek.
    1. Znieczulaj mysz za pomocą 4,5% izofluranu w 100% tlenu przez 1-2 min. Sprawdź, czy nie ma głębokiej płaszczyzny znieczulenia poprzez brak reakcji na uszczypnięcie palca. Eutanazja przez ścięcie głowy.
    2. Zbierz tkankę.
      1. Usuń mózg. Zazwyczaj należy ustawić lewą półkulę na potrzeby histologii i przeprowadzić mikrosekcję kilku obszarów z prawej półkuli w obrębie kory mózgowej i hipokampa (Ryc. 5).
      2. Wypreparowane próbki umieścić w probówkach do mikrowirówek, błyskawicznie zamrozić w ciekłym azocie. W przypadku analizy białek wrażliwych na liofilizację optymalnym jest podział skrawków tkanek przed błyskawicznym zamrożeniem, aby uniknąć późniejszego zamrażania i rozmrażania.
        UWAGA: Protokół można wstrzymać, a próbki tkanek można przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu uzyskania próbek gotowych do lizy. Alternatywnie próbki mogą być poddawane lizie, a następnie przechowywane w temperaturze -80 °C.
    3. Liza próbek.
      1. Przygotować bufor do lizy, dodając inhibitor proteazy i 2 mM fluorek fenylometylosulfonylu do buforu do lizy.
      2. Dodać 150 μl zmieszanego buforu do lizy na około 3 μg tkanki zwierzęcej. Dla porównania, próbki tkanek kory wzrokowej myszy mają około 3 μg.
      3. Aby homogenizować tkankę, należy mechanicznie rozcierać tkankę, pipetując w górę iw dół ~15-20 razy za pomocą pipety o pojemności 1000 μL. W celu optymalnego rozdrobnienia próbki można użyć tłuczka homogenizatora.
      4. Umieścić probówki z próbkami na rotatorze na 30 minut w temperaturze 4°C.
      5. Odwirować próbki w temperaturze 4°C przez 10 minut przy ciśnieniu około 15 000 x g i zebrać supernatant. Próbki mogą być przetwarzane natychmiast lub przechowywane w temperaturze -80°C do dalszej analizy.
        UWAGA: Lizaty próbek przygotowane przy użyciu tego protokołu są zgodne z Western blot, z którego można analizować fagocyty/marker mikrogleju Iba1 i/lub marker aktywacji astrocytów GFAP w celu uzupełnienia analizy cytokin i fosfoprotein do badań nad zapaleniem nerwów11.
  2. Protokół multipleksowego testu immunologicznego dla cytokin i fosfobiałek
    UWAGA: Chociaż ogólnie są podobne, istnieją pewne drobne różnice w protokołach dla zestawów cytokin i fosfoprotein. Różnice są odnotowywane w każdym kroku. Kroki przygotowania próbek do testu Luminex opisano poniżej.
    1. Przygotowanie odczynników (dzień 1, taki sam dla cytokin i fosfoprotein)
      1. Pozwól odczynnikom ogrzać się do temperatury pokojowej (~30 min).
      2. Sonicate multipleksową butelkę z kulkami magnetycznymi przez 30 sekund, a następnie 1 minutę wirowania. Upewnij się, że koraliki magnetyczne multipleksowe są osłonięte przed światłem folią aluminiową lub użyj dostarczonych lekkich butelek ochronnych.
      3. Przygotuj bufor do płukania, mieszając 0,1% Tween20 w 1xPBS lub alternatywnie użyj bufora do płukania dostarczonego w zestawie.
    2. Przygotowanie próbek tkanek poddanych lizie (dzień 1, to samo dla cytokin i fosfoprotein)
      1. Jeśli zostały wcześniej zamrożone, wyjmij zlizowane próbki tkanek z zamrażarki i pozostaw do rozmrożenia na lodzie (~20 min). Odwirowywać próbki przez 10 minut przy sile 9,167 x g w celu usunięcia osadu.
      2. Przygotować 25 μl próbki o optymalnym stężeniu białka określonym przez analizę zakresu liniowego (patrz sekcja 3.3). Aby znormalizować całkowitą objętość wszystkich próbek, należy rozcieńczyć próbki w buforze testowym dostarczonym w zestawie.
    3. Przygotowanie płytki 96-dołkowej (dzień 1, taki sam dla cytokin i fosfobiałek)
      1. Użyj płytki 96-dołkowej dołączonej do zestawu lub płytki z cienkim dnem (np. Brand Tech).
      2. Dodaj 200 μl buforu do płukania (lub 1x PBS, 0,1% Tween) do każdej studzienki i mieszaj na wytrząsarce płytkowej przez 10 minut przy 750 obr./min.
      3. Zdekantuj bufor do mycia i postukaj płytką o ręcznik papierowy, aby usunąć pozostałości.
    4. Procedura testu immunologicznego na obecność cytokin (dzień 1)
      1. Dodaj następujące elementy do każdej studzienki w kolejności.
        1. Dodać 25 μl buforu do oznaczania do wszystkich studzienek.
          1. Dodaj 25 μl dodatkowego buforu testowego TYLKO do studzienek tła. Dla każdego przebiegu eksperymentalnego należy mieć co najmniej dwie studzienki tła. Studzienki tła nie mają załadowanej próbki i określają intensywność fluorescencji odczytywaną przez przyrząd bez próbki.
          2. Dodać 25 μl każdej rozcieńczonej próbki do odpowiednich dołków na próbki.
          3. Dodaj 25 μl 1x multipleksowych kulek magnetycznych do wszystkich studzienek (Rysunek 6). Pamiętaj, aby wirować koraliki przez 1 minutę przed dodaniem do studzienek.
      2. Uszczelnij płytkę uszczelniaczem do płyt i przykryj płytę folią aluminiową. Inkubować przez noc (12-16 godzin) w temperaturze 2-8 °C.
    5. Procedura testu immunologicznego na obecność cytokin (dzień 2)
      1. Umieść płytkę 96-dołkową na separatorze magnetycznym, upewniając się, że studzienki są wyrównane z magnesami. Odstaw na 2 minuty. Zdekantować zawartość studzienki, gdy płytka jest nadal przymocowana do separatora magnetycznego.
      2. Umyj płytkę 2 razy, wykonując następujące czynności.
        1. Do każdej studzienki dodać 200 μl buforu do płukania i umieścić na shakerze na 2 minuty w temperaturze pokojowej.
        2. Umieść płytkę studzienkową na separatorze magnetycznym na 2 minuty w temperaturze pokojowej.
        3. Zdekantować zawartość studzienki, gdy płytka studzienki jest nadal przymocowana do separatora magnetycznego.
      3. Dodać 25 μl przeciwciała wykrywającego na studzienkę (Ryc. 6). Przykryj folią. Inkubować przez 1 godzinę na wytrząsarce płytkowej (750 obr./min) w temperaturze pokojowej.
      4. Pozostaw przeciwciało wykrywające w środku i dodaj 25 μl streptawidyny-fikoerytryny (SAPE) do każdej studzienki (Ryc. 6). Przykryj folią. Inkubować przez 30 minut na wytrząsarce płytkowej (750 obr./min) w temperaturze pokojowej.
      5. Umieść płytkę studzienkową na separatorze magnetycznym i pozostaw na 2 minuty. Zdekantuj zawartość studzienki i odłącz od separatora magnetycznego.
      6. Umyć płytkę studzienki dwa razy (patrz krok 3.2.5.2).
      7. Dodać 75 μl płynu Luminex Drive Fluid (w przypadku korzystania z przyrządu MAGPIX) do każdej studzienki lub buforu testowego (w przypadku korzystania z przyrządu 200 lub FlexMap 3D). Ponownie zawieś koraliki na wytrząsarce talerzowej na 5 minut w temperaturze pokojowej.
      8. Czytaj na Luminex Instrument (MAGPIX, 200 lub FlexMap 3D), odwołując się do instrukcji obsługi dotyczącej prawidłowej obsługi (Rysunek 6).
    6. Procedura testu immunologicznego na obecność fosfoprotein (dzień 1)
      1. Dodaj następujące elementy do każdej studzienki w kolejności.
        1. Dodać 25 μl buforu do oznaczania do wszystkich studzienek.
          1. Dodaj 25 μl dodatkowego buforu testowego TYLKO do studzienek tła. Dla każdej serii eksperymentalnej zaleca się posiadanie co najmniej dwóch studni tła. Studzienki tła nie mają załadowanej próbki i określają intensywność fluorescencji odczytywaną przez przyrząd bez próbki.
          2. Dodać 25 μl każdej rozcieńczonej próbki do każdej studzienki na próbkę.
          3. Dodaj 25 μl 1x multipleksowych kulek magnetycznych do wszystkich studzienek (Rysunek 6).
            UWAGA: Zestaw testowy Luminex zapewnia multipleksowy koralik magnetyczny w 20-krotnym roztworze podstawowym. Pamiętaj, aby wirować 20x multipleksowy roztwór kulek magnetycznych przez 2 minuty, a następnie rozcieńczyć go w buforze testowym do 1x roztworu. Vortex 1x multipleksowe zawieszenie kulek magnetycznych przez 1 minutę przed dodaniem do studzienek.
        2. Uszczelnij płytkę uszczelniaczem do płyt i przykryj płytę folią aluminiową. Inkubować przez noc (12-16 godzin) w temperaturze 2-8 °C.
    7. Procedura testu immunologicznego na obecność fosfoprotein (dzień 2)
      1. Umieść płytkę studzienkową na separatorze magnetycznym, upewniając się, że płytka studzienki jest całkowicie wyrównana z separatorem magnetycznym. Odstaw na 2 minuty. Zdekantować zawartość studzienki, gdy płyta studzienki jest nadal przymocowana do separatora magnetycznego.
      2. Umyj płytkę 2 razy (patrz krok b w procedurze immunologicznej cytokin dzień 2).
      3. Rozcieńczyć 20-krotne przeciwciało wykrywające zapasy do 1x roztworu w buforze testowym. Dodaj 25 μL 1x przeciwciała wykrywającego na studzienkę (Ryc. 6). Przykryj folią. Inkubować przez 1 godzinę na wytrząsarce płytkowej (750 obr./min) w temperaturze pokojowej.
      4. Umieść płytkę 96-dołkową na separatorze magnetycznym i pozostaw na 2 minuty. Zdekantuj zawartość studzienki, odłącz od separatora magnetycznego.
      5. Rozcieńczyć 25x podstawowy SAPE w buforze testowym do 1x buforu. Dodaj 25 μL 1x SAPE (Rysunek 6). Przykryć folią i inkubować przez 15 minut na wytrząsarce płytkowej (750 obr./min) w temperaturze pokojowej.
      6. Pozostawić SAPE w studzienkach i dodać 25 μl buforu wzmacniającego do każdej studzienki. Przykryj folią.
      7. Inkubować przez 15 minut na wytrząsarce płytkowej (750 obr./min) w temperaturze pokojowej.
      8. Umieść płytkę studzienkową na separatorze magnetycznym na 2 minuty. Zdekantuj zawartość studzienki i odłącz od separatora magnetycznego.
      9. Dodać 75 μl płynu Luminex Drive Fluid (w przypadku korzystania z przyrządu MAGPIX) lub buforu testowego (w przypadku korzystania z przyrządu 200 lub FlexMap 3D). Ponownie zawieś koraliki na wytrząsarce talerzowej na 5 minut w temperaturze pokojowej.
      10. Przeczytaj na temat przyrządu Luminex (MAGPIX, 200 lub FlexMap 3D), odwołując się do instrukcji obsługi dotyczącej prawidłowej obsługi (Rysunek 6).
  3. Liniowość krzywej rozcieńczenia próbki
    1. Przygotowanie próbek: Seryjnie rozcieńczać próbki do badań o różnym stężeniu białka całkowitego. W przypadku masowych tkanek mózgowych należy obciążyć seryjne rozcieńczenia od 0-25 μg dla cytokin i 0-12 μg dla fosfoprotein. Całkowite stężenie białka można zmierzyć za pomocą testu kwasu bicinchoninowego (BCA).
    2. Multipleksowy test immunologiczny: Wykonać test Luminex (patrz punkt 3.2) na wybranych próbkach.
    3. analiza danych
      1. Wykreśl intensywność fluorescencji dla każdego białka w funkcji ilości załadowanego białka (Rysunek 7).
      2. Dla każdego analitu zidentyfikuj zakres całkowitego obciążenia białkiem, dla którego zależność między całkowitym białkiem a odczytem intensywności fluorescencji jest liniowa (Rysunek 7).
      3. Aby określić ilość białka całkowitego, którą należy załadować dla pełnego przebiegu testu, należy określić liniową część krzywej dla każdego analitu, a następnie wybrać stężenie białka, które mieści się w zakresie liniowym dla większości analitów.
        UWAGA: Chociaż większość białek ma podobny zakres liniowy, zakresy liniowe mogą nie nakładać się na siebie dla wszystkich białek. W takim przypadku może być konieczne wielokrotne przeprowadzenie każdej próbki z różnymi ilościami załadowanego białka całkowitego. Alternatywnie, próbki nieliniowe mogą zostać pominięte w analizie. Ponadto niektóre białka mogą w ogóle nie mieć zakresu liniowego.

4. Częściowa regresja metodą najmniejszych kwadratów

UWAGA: Przykładowy kod R i przykładowy arkusz kalkulacyjny danych są dostarczane do przeprowadzenia częściowej analizy metodą najmniejszych kwadratów.

  1. Przygotowanie danych: Sformatuj dane zgodnie z informacjami podanymi w dostarczonym przykładowym arkuszu kalkulacyjnym danych "MyData". Uwzględnij nazwy zmiennych w wierszu 1, nazwy próbek w kolumnie A, zmienną odpowiedzi w kolumnie B i wszystkie zmienne predyktorów w kolumnach C+. Wypełnij dwa ostatnie wiersze danymi tła i ustaw obie przykładowe nazwy na "Tło".
  2. Częściowa regresja metodą najmniejszych kwadratów w programie RStudio
    1. Zainstaluj R z www.r-project.org (bezpłatnego, open source).
    2. Zainstaluj program RStudio Desktop z www.rstudio.com (bezpłatna licencja typu open source).
    3. Pobierz przykładowy kod języka R dostarczony z tą publikacją "PLSR_Sample_Code.R" i zapisz go w tym samym folderze, który zawiera arkusz kalkulacyjny danych. Otwórz plik kodu w programie RStudio.
    4. W sekcji User Input (Dane wejściowe użytkownika) zmień wartość "dataFileName" na nazwę arkusza kalkulacyjnego danych.
    5. Wykonaj następujące kroki, podświetlając sekcję kodu do uruchomienia i klikając przycisk Uruchom w prawym górnym rogu skryptu.
      1. Załaduj niezbędne pakiety języka R, funkcje, adres katalogu roboczego i wartości wejściowe użytkownika do programu RStudio (podsekcja "Praktyki wstępne").
      2. Załaduj dane do RStudio i przygotuj surowe dane do przetworzenia, odejmując średni sygnał tła ze wszystkich pomiarów i oceniając z każdym analitem (podsekcja "Odczyt danych i odejmij tło")(Rysunek 8A).
      3. Wykonaj częściową regresję metodą najmniejszych kwadratów w programie RStudio przy użyciu pakietu plsRglm v1.2.528 dostępnego w sieci Comprehensive R Archive Network (CRAN). Wykonaj obrót varimax (pakiet statystyk v3.6.2)23 w płaszczyźnie LV1-LV2, aby zidentyfikować nową oś poziomą, która najlepiej oddziela próbki według zmiennej odpowiedzi (podsekcja "PLS")(Rysunek 8B).
      4. Przeprowadź krzyżową walidację Leave One Out (LOOCV), w której jedna próbka jest iteracyjnie pomijana w danych, a model PLSR jest ponownie obliczany. Oblicz odchylenie standardowe dla ładunków analitu we wszystkich przebiegach LOOCV (podsekcja "LOOCV").
  3. Utwórz reprezentatywne wykresy: Uruchom dostarczony przykładowy kod zgodnie z powyższym opisem, aby utworzyć reprezentatywne wykresy, które zostaną automatycznie wyeksportowane jako pliki pdf do katalogu roboczego (folderu zawierającego dane i pliki kodu).
    1. Utwórz mapę cieplną przetworzonych danych, jak pokazano w Rysunek 8A (podsekcja "PLS"). Pokoloruj każdy wpis wzdłuż spektrum zdefiniowanego przez z-score. Sortuj anality według kolejności obliczonej w interesującej nas zmiennej utajonej.
    2. Utwórz wykres wyników z wynikami LV1 wykreślonymi wzdłuż osi poziomej i wynikami LV2 wykreślonymi wzdłuż osi pionowej, jak pokazano w Rysunek 8B (podsekcja "PLS"). Pokoloruj każdy punkt danych zgodnie z jego pomiarem zmiennej odpowiedzi, aby zwizualizować relację między każdą zmienną utajoną a zmienną odpowiedzi.
    3. Utwórz wykres słupkowy przedstawiający obciążenia dla każdej ze zmiennych predyktora, aby zwizualizować, w jaki sposób każdy analit przyczynia się do zmiennych utajonych, jak pokazano w Rysunek 8C (podsekcja "LOOCV").
    4. Utwórz wykres regresji wyników LV1 względem zmiennej odpowiedzi, aby zwizualizować, jak dobrze model PLSR rozdziela próbki, jak pokazano w Rysunek 8D (podsekcja "PLS").

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Poprzednio zebrane dane pochodziły z wcześniejszych prac, w których grupa ośmiu myszy C57BL/6 została poddana trzem zamkniętym urazom głowy (Rysunek 2) rozmieszczone raz dziennie11. W tej pracy przepływ krwi w mózgu mierzono za pomocą spektroskopii korelacji rozproszonej 4 godziny po ostatnim urazie (Ryc. 3, Ryc. 4). Po ocenie CBF po urazie, zwierzęta zostały poddane eutanazji, a tkanka mózgowa została pobrana w celu ilościowego określeni...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W niniejszym artykule szczegółowo opisano metody oceny odpowiedzi hemodynamicznej i neurozapalnej na powtarzające się łagodne urazowe uszkodzenie mózgu. Ponadto pokazaliśmy, jak zintegrować te dane w ramach wielowymiarowej analizy systemowej przy użyciu częściowej regresji metodą najmniejszych kwadratów. W poniższym tekście omówimy niektóre z kluczowych kroków i ograniczeń związanych z protokołem, a także zalety/wady metod w porównaniu z istniejącymi metodami.

Model spadku masy ciała ł...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten projekt był wspierany przez National Institutes of Health R21 NS104801 (EMB) i R01 NS115994 (LBW/EB) oraz Children's Healthcare of Atlanta Junior Faculty Focused Award (EMB). Prace te były również wspierane przez Departament Obrony Stanów Zjednoczonych poprzez Programy Badań Medycznych kierowane przez Kongres w ramach nagrody nr W81XWH-18-1-0669 (LBW/EMB). Opinie, interpretacje, wnioski i zalecenia są opiniami autora i niekoniecznie są zatwierdzone przez Departament Obrony. Niniejszy materiał opiera się na pracach wspieranych przez National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program w ramach grantu nr 1937971. Wszelkie opinie, ustalenia, wnioski lub zalecenia wyrażone w tym materiale są opiniami autorów i niekoniecznie odzwierciedlają poglądy National Science Foundation.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Pipetydowolna pipeta regulowana
Folia aluminiowaVWR89107-726
Zestaw do lizy komórek Bio-PlexC Bio-Rad
MARKA MARKA Płytki pureGrade Microplates, niesterylneBrandTech781602 96
Kompletna mini tabletka inhibitora proteazySigma-Aldrich11836153001
Krem do depilacjiAmazonNair
DiH2OVWRVWRL0200-1000
Ręczny magnetyczny blok separatora do 96-dołkowych płaskich płyt dennychMillipore Sigma Katalog40-285
Sprzętowa płyta autokorelatorawww.correlator.comFlex05-8ch
Isofluran 250 mLMED-VET INTERNATIONALRXISO-250
Kimwipe (11,2 x 21,3 cm)VWR21905-026
Laboratoryjny mieszalnik wirowyVWR10153-838
LabViewNational InstrumentsLabVIEW Luminex
200, HTS, FLEXMAP 3D lub MAGPIX z oprogramowaniem xPONENTLuminex Corporation
Luminex Drive FluidLuminexMPXDF-4PK
Płyn do osłonek LuminexEMD MilliporePŁYN OSŁONOWY
MILLIPLEX MAP Mysz Panel magnetyczny z cytokinami/chemokinami - wstępnie zmieszany 32 Plex - Test multipleksowy immunologicznyMillipore SigmaMCYTMAG-70K-PX32
MILLIPLEX MAPK/SAPK Sygnalizacja 10-Plex Kit-Cell Sygnalizacja Multiplex TestMillipore Sigma48-660MAG
Mini rotator LabRollerVWR10136-084
Fluorek fenylometylosulfonyluSigma-AldrichP7626-1G
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)VWR97064-158
Zgrzewarka do płytVWR82050-992
Rurki polipropylenowe do mikrofugiVWR20901-547
Mini LabRollerMillipore Sigma Z674591
Zbiorniki odczynnikówVWR89094-668
R Język
RStudiowww.rstudio.com
Sonicator
Wytrząsarka płytkowaVWR12620-926
Tween20Sigma-AldrichP9416-50ML
Akrylowa rura prowadząca o długości 1 mMcMaster-Carr49035K85
4-fotonowa fotodioda lawinowa zliczająca fotonyPerkin-ElmerSPCM-AQ4C-IO
400 um wielomodowe źródłoświatłowodowe Thorlabs Inc.FT-400-EMT
54 g śrubaAce Hardware0,95 cm podstawowa średnica korpusu, 2 cm średnica główki, 10,2 cm długość
780 nm detektor jednomodowy światłowódThorlabs Inc.780HP
852 nm laser o długiej długości koherencjiTOPTICA PhotonicsiBeam smart
regulowane 171304012 programowania

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Langlois, J. A., Rutland-Brown, W., Wald, M. M. The epidemiology and impact of traumatic brain injury: a brief overview. Journal of Head Trauma Rehabilitation. 21 (5), 375-378 (2006).
  2. Iraji, A., et al. Resting State Functional Connectivity in Mild Traumatic Brain Injury at the Acute Stage: Independent Component and Seed-Based Analyses. Journal of Neurotrauma. 32 (14), 1031-1045 (2015).
  3. Guskiewicz, K. M., et al. Cumulative effects associated with recurrent concussion in collegiate football players: the NCAA Concussion Study. Journal of the American Medical Association. 290 (19), 2549-2555 (2003).
  4. Longhi, L., et al. Temporal window of vulnerability to repetitive experimental concussive brain injury. Neurosurgery. 56 (2), 364-374 (2005).
  5. Committee on Sports-Related Concussions in Youth, Board on Children, Youth, and Families, Institute of Medicine, National Research Council. Sports-Related Concussions in Youth: Improving the Science, Changing the Culture. , National Academies Press (US). Washington (DC). http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK169016/ (2014).
  6. Barkhoudarian, G., Hovda, D. A., Giza, C. C. The Molecular Pathophysiology of Concussive Brain Injury - an Update. Physical Medicine and Rehabilitation Clinics of North America. 27 (2), 373-393 (2016).
  7. McCrory, P., et al. Consensus statement on concussion in sport--the 4th International Conference on Concussion in Sport held in Zurich, November 2012. Clinical Journal of Sport Medicine. 23 (2), 89-117 (2012).
  8. Belanger, H. G., Vanderploeg, R. D., Curtiss, G., Warden, D. L. Recent neuroimaging techniques in mild traumatic brain injury. Journal of Neuropsychiatry and Clinical Neurosciences. 19 (1), 5-20 (2007).
  9. Sours, C., Zhuo, J., Roys, S., Shanmuganathan, K., Gullapalli, R. P. Disruptions in Resting State Functional Connectivity and Cerebral Blood Flow in Mild Traumatic Brain Injury Patients. PLoS ONE. 10 (8), 0134019(2015).
  10. Buckley, E. M., et al. Decreased Microvascular Cerebral Blood Flow Assessed by Diffuse Correlation Spectroscopy after Repetitive Concussions in Mice. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 35 (12), 1995-2000 (2015).
  11. Sankar, S. B., et al. Low cerebral blood flow is a non-invasive biomarker of neuroinflammation after repetitive mild traumatic brain injury. Neurobiology of Disease. 124, 544-554 (2019).
  12. Vagnozzi, R., et al. Temporal window of metabolic brain vulnerability to concussions: mitochondrial-related impairment--part I. Neurosurgery. 61, 379-388 (2007).
  13. Longhi, L., et al. Temporal window of vulnerability to repetitive experimental concussive brain injury. Neurosurgery. 56, 364-374 (2005).
  14. Fujita, M., Wei, E. P., Povlishock, J. T. Intensity- and interval-specific repetitive traumatic brain injury can evoke both axonal and microvascular damage. Journal of Neurotrauma. 29, 2172-2180 (2012).
  15. Angoa-Perez, M., et al. Animal models of sports-related head injury: bridging the gap between preclinical research and clinical reality. Journal of Neurochemistry. 129, 916-931 (2014).
  16. Prins, M. L., Hales, A., Reger, M., Giza, C. C., Hovda, D. A. Repeat traumatic brain injury in the juvenile rat is associated with increased axonal injury and cognitive impairments. Developmental Neuroscience. 32, 510-518 (2010).
  17. Viano, D. C., Hamberger, A., Bolouri, H., Saljo, A. Concussion in professional football: animal model of brain injury--part 15. Neurosurgery. 64, 1162-1173 (2009).
  18. Kane, M. J., et al. A mouse model of human repetitive mild traumatic brain injury. Journal of Neuroscience Methods. 203, 41-49 (2012).
  19. Meehan, W. P., Zhang, J., Mannix, R., Whalen, M. J. Increasing Recovery Time Between Injuries Improves Cognitive Outcome After Repetitive Mild Concussive Brain Injuries in Mice. Neurosurgery. 71 (4), 885-892 (2012).
  20. Durduran, T., Yodh, A. G. Diffuse correlation spectroscopy for non-invasive, micro-vascular cerebral blood flow measurement. NeuroImage. 85, 51-63 (2014).
  21. Sathialingam, E., et al. Small separation diffuse correlation spectroscopy for measurement of cerebral blood flow in rodents. Biomedical Optics Express. 9 (11), 5719(2018).
  22. Lee, S. Y., et al. Noninvasive optical assessment of resting-state cerebral blood flow in children with sickle cell disease. Neurophotonics. 6 (03), 1(2019).
  23. Wang, H., Liu, Q., Tu, Y. Interpretation of partial least-squares regression models with VARIMAX rotation. Partial Least Squares. 48 (1), 207-219 (2005).
  24. Eriksson, L., Byrne, T., Johansson, E., Trygg, J., Vikström, C. Multi- and Megavariate Data Analysis Basic Principles and Applications. Umetrics Academy. , (2013).
  25. Conzen, P. F., et al. Systemic and regional hemodynamics of isoflurane and sevoflurane in rats. Anesthesia and Analgesia. 74 (1), 79-88 (1992).
  26. Durduran, T., Choe, R., Baker, W. B., Yodh, A. G. Diffuse optics for tissue monitoring and tomography. Reports on Progress in Physics. 73 (7), 076701(2010).
  27. Lee, S. Y., et al. Small separation frequency-domain near-infrared spectroscopy for the recovery of tissue optical properties at millimeter depths. Biomedical Optics Express. 10 (10), 5362-5377 (2019).
  28. Bertrand, F., Maumy-Bertrand, M. plsRglm: Partial Least Squares Regression for Generalized Linear Models. , Available from: https://CRAN.R-project.org/package=pplsRglm (2019).
  29. White, B. R., Bauer, A. Q., Snyder, A. Z., Schlaggar, B. L., Lee, J. M., Culver, J. P. Imaging of functional connectivity in the mouse brain. PLoS One. 6, 16322(2011).
  30. Buckley, E. M., Parthasarathy, A. B., Grant, P. E., Yodh, A. G., Franceschini, M. A. Diffuse correlation spectroscopy for measurement of cerebral blood flow: future prospects. Neurophotonics. 1 (1), 011009(2014).
  31. Rowan, O., et al. Cerebrovascular reactivity measured in awake mice using diffuse correlation spectroscopy. Neurophotonics. 8 (1), (2021).
  32. Tate, J., Ward, G. Interferences in immunoassay. The Clinical Biochemist. Reviews. 25 (2), 105-120 (2004).
  33. Staples, E., Ingram, R. J. M., Atherton, J. C., Robinson, K. Optimising the quantification of cytokines present at low concentrations in small human mucosal tissue samples using Luminex assays. Journal of Immunological Methods. 394 (1-2), 1-9 (2013).
  34. Gierut, J. J., et al. Network-level effects of kinase inhibitors modulate TNF-α-induced apoptosis in the intestinal epithelium. Science Signaling. 8 (407), 129(2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Spektroskopia korelacji rozproszonejmultipleksowy test immunoabsorpcyjnyregresja cz stkowych najmniejszych kwadrat wanaliza cytokinm zgowy przep yw krwiaktywacja mikroglejumodel Weight Droptest Luminex

Powiązane artykuły