Artykuł metodologiczny

Ekran supresorowy do charakterystyki powiązań genetycznych regulujących chronologiczną długość życia u Saccharomyces cerevisiae

DOI:

10.3791/61506

⸱

17 września 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, William Paterson University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oto protokół do identyfikacji interakcji genetycznych za pomocą zwiększonej liczby kopii u Saccharomyces cerevisiae. Metoda ta pozwala naukowcom identyfikować, klonować i testować supresory w krótko żyjących mutantach drożdży. Testujemy wpływ wzrostu liczby kopii SIR2 na długość życia w autofagii mutanta zerowego.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Starzenie się to zależne od czasu pogorszenie normalnych procesów biologicznych organizmu, które zwiększa prawdopodobieństwo śmierci. Wiele czynników genetycznych przyczynia się do zmian w normalnym procesie starzenia. Czynniki te przecinają się w złożony sposób, o czym świadczy bogactwo udokumentowanych powiązań zidentyfikowanych i zachowanych w wielu organizmach. Większość z tych badań koncentruje się na utraconych funkcjach, mutantach zerowych, które pozwalają na szybkie badanie przesiewowe wielu genów jednocześnie. Jest znacznie mniej prac, które koncentrują się na scharakteryzowaniu roli, jaką w tym procesie odgrywa nadekspresja genu. W niniejszej pracy przedstawiamy prostą metodologię identyfikacji i klonowania genów w pączkujących drożdżach, Saccharomyces cerevisiae, do badań nad supresją krótkotrwałego fenotypu chronologicznego życia obserwowanego w wielu tłach genetycznych. Protokół ten został opracowany tak, aby był dostępny dla badaczy z wielu różnych środowisk i na różnych etapach akademickich. Gen SIR2, który koduje deacetylazę histonową, został wybrany do klonowania w wektorze pRS315, ponieważ pojawiły się sprzeczne doniesienia na temat jego wpływu na chronologiczną długość życia. SIR2 odgrywa również rolę w autofagii, która powstaje, gdy zostaje zakłócona przez delecję kilku genów, w tym czynnika transkrypcyjnego ATG1. Jako dowód zasady, klonujemy gen SIR2, aby przeprowadzić badanie supresorowe na fenotypie skróconej długości życia charakterystycznym dla mutanta atg1Δ z niedoborem autofagii i porównujemy go z inaczej izogenicznym, dzikim tłem genetycznym.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Starzenie się to zależna od czasu utrata integralności w niezliczonych procesach biologicznych, która ostatecznie zwiększa prawdopodobieństwo śmierci organizmu. Starzenie się jest prawie nieuniknione dla wszystkich gatunków. Na poziomie komórkowym istnieje kilka dobrze scharakteryzowanych cech charakterystycznych, które są związane ze starzeniem się, w tym: niestabilność genomu, zmiany epigenetyczne, utrata proteostazy, dysfunkcja mitochondriów, rozregulowane wykrywanie składników odżywczych, starzenie się komórek i zanik telomerów1,2. W organizmach jednokomórkowych, takich jak drożdże, prowadzi to do zmniejszenia potencjału replikacyjnego i chronologicznej długości życia3,4. Te zmiany komórkowe objawiają się w bardziej złożonych organizmach, takich jak ludzie, jako patologie, które obejmują nowotwory, niewydolność serca, neurodegenerację, cukrzycę i osteoporozę5,6,7. Pomimo wielu złożoności, które charakteryzują proces starzenia, te molekularne cechy charakterystyczne leżące u podstaw tego procesu są zachowane w bardzo rozbieżnych organizmach8,9,10. Identyfikacja zmian w tych szlakach podczas starzenia się doprowadziła do uświadomienia sobie, że można nimi manipulować poprzez zmiany stylu życia - wykazano, że ograniczenia dietetyczne znacznie wydłużają życie wielu organizmów11. Szlaki te zbiegają się i przecinają ze sobą i z wieloma innymi ścieżkami w złożony sposób. Wyjaśnienie i scharakteryzowanie tych interakcji stwarza potencjał dla interwencji terapeutycznych w celu przedłużenia życia i zdrowia12,13,14.

Zachowanie molekularnych podstaw starzenia pozwala na funkcjonalne rozbiór interakcji genetycznych leżących u podstaw tego procesu poprzez użycie prostszych organizmów modelowych - w tym u pączkujących drożdży, Saccharomyces cerevisiae15,16. Istnieją dwa znane typy starzenia modelowane przez pączkujące drożdże: starzenie chronologiczne (chronologiczna długość życia, CLS) i starzenie replikacyjne (replikacyjna długość życia, RLS)17. Starzenie chronologiczne mierzy czas, w którym komórka może przetrwać w stanie niedzielącym się. Jest to analogiczne do starzenia się obserwowanego w komórkach, które spędzają większość swojego życia w G0, takich jak neurons4. Alternatywnie, replikacyjna długość życia to liczba przypadków, w których komórka może się podzielić przed wyczerpaniem i jest modelem dla mitotycznie aktywnych typów komórek (np. liczba komórek potomnych, które może mieć komórka)18.

Ogólnym celem tej metody jest przedstawienie protokołu, który pozwala na funkcjonalne rozbiór genetyki starzenia się za pomocą S. cerevisiae. Chociaż przeprowadzono wiele doskonałych badań przez wielu badaczy, które doprowadziły do naszego obecnego zrozumienia, dla początkujących naukowców nadal dostępnych jest wiele możliwości, aby przyczynić się do rozwoju dziedziny starzenia się od wczesnych lat ich kariery akademickiej. Przedstawiamy przejrzystą metodologię, która pozwoli naukowcom na dalszy rozwój w dziedzinie starzenia się. Protokół ten został zaprojektowany tak, aby był dostępny dla wszystkich badaczy, niezależnie od etapu ich kariery akademickiej, zapewniając narzędzia niezbędne do formułowania i testowania własnych nowatorskich hipotez. Zaletą naszego podejścia jest to, że jest to opłacalna metoda, łatwo dostępna dla wszystkich badaczy, niezależnie od instytucji – i nie wymaga drogiego, specjalistycznego sprzętu niezbędnego dla niektórych protokołów19. Istnieje kilka różnych sposobów projektowania tego typu badań przesiewowych, podejście przedstawione w tej pracy jest szczególnie podatne na badania przesiewowe mutantów zerowych nieistotnych genów, które wykazują poważne skrócenie chronologicznej długości życia w porównaniu z izogenicznym szczepem drożdży typu dzikiego.

Jako dowód zasady, klonujemy SIR2, deacetylazę lizyny, o której stwierdzono, że wykazuje zarówno wydłużony, jak i skrócony CLS w przypadku nadekspresji. Niedawno stwierdzono, że nadekspresja SIR2 zwiększa CLS w drożdżach winiarskich; jednak kilka grup zgłosiło brak związku między rozszerzeniem SIR2 a CLS, pozostawiając jego rolę w characterized20,21,22. Ze względu na te sprzeczne doniesienia w literaturze, wybraliśmy ten gen, aby dodać niezależne badania, które pomogą wyjaśnić rolę SIR2 w chronologicznym starzeniu się, jeśli w ogóle. Dodatkowo, zwiększenie liczby kopii homologu SIR2 wydłuża żywotność systemu modeli nicieni23.

Autofagia to wewnątrzkomórkowy system degradacji, który dostarcza produkty cytozolowe, takie jak białka i organelle, do lizosomu24. Autofagia jest ściśle związana z długowiecznością poprzez swoją rolę w degradacji uszkodzonych białek i organelli w celu utrzymania homeostazy komórkowej25. Indukcja autofagii zależy od orkiestracji ekspresji wielu genów, a delecja genu ATG1 powoduje nienormalnie krótki CLS u pączkujących drożdży26. ATG1 koduje białko kinazę serynowo-treoninową wymaganą do tworzenia pęcherzyków w autofagii i szlaku cytoplazma-wakuola (grzybowy odpowiednik lizosomów)27,28. W tym miejscu przedstawiamy naszą metodę na ekranie zwiększonej liczby kopii, testując wpływ zwiększonej kopii SIR2 na CLS w typie dzikim i tle atg1-null. Metoda ta jest szczególnie przydatna dla młodszych badaczy i grup badawczych głównie w instytucjach licencjackich, z których wiele służy społecznościom niedostatecznie reprezentowanym w naukach ścisłych i ma ograniczone zasoby.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Zidentyfikuj potencjalne interakcje genetyczne do badań przesiewowych

  1. Zidentyfikuj podłoże genetyczne (tła) genetyczne do charakterystyki, które skutkuje nienormalnie skróconą chronologiczną długością życia (CLS) u Saccharomyces cerevisiae, korzystając z bazy danych genomu Saccharomyces (SGD, https://www.yeastgenome.org29,30), która kompiluje znane informacje fenotypowe dla tego organizmu.
    1. Wybierz kartę Funkcja z opcji w górnej części strony internetowej.
    2. Wybierz Fenotyp, a następnie wybierz Przeglądaj wszystkie fenotypy.
    3. W opcjach Ontologia Fenotypu Drożdży przewiń do podtytułu Rozwój i wybierz Chronologiczna długość życia, znajdująca się pod podtytułem Długość życia.
    4. Wybierz kwalifikator dla zmniejszonego, który pozwala na identyfikację genów, które wykazują fenotyp, który skutkuje zmniejszeniem chronologicznego fenotypu długości życia po usunięciu. Do tego dowodu metody wybrano atg1Δ, co skutkuje krótkotrwałym fenotypem CLS i jest zakłócone dla autofagii26.
  2. Zidentyfikuj gen(y) docelowy(e) do badań przesiewowych pod kątem interakcji genetycznych, które mogą tłumić fenotyp, w oparciu o zgłoszone lub przewidywane atrybuty ontologiczne mutanta zidentyfikowanego w części 1.2. Powtórz wyszukiwanie fenotypu, jak znaleziono w krokach 1.1.1-1.1.4 powyżej, odpytując o geny, które skutkują dłuższym CLS w przypadku nadekspresji w tle typu dzikiego. SIR2 został wybrany na podstawie zgłoszonego fenotypu CLS i zgłoszonych interakcji z autofagią31,32.

2. Przygotuj odczynniki

UWAGA: O ile nie określono inaczej, sterylizuj każdy roztwór w temperaturze 121 °C przez 20 minut, aby wysterylizować przed użyciem.

  1. Płynne podłoże YPAD: Dodaj 1% ekstraktu drożdżowego, 2% peptonu, 2% dekstrozy (glukozy) i 40 mg adeniny (w postaci odwodnionego siarczanu adeniny) na litr podwójnie destylowanej wody. Dobrze wymieszaj z mieszadłem magnetycznym.
  2. Płynne podłoże LB: Dodaj trypton (10 g), ekstrakt drożdżowy (5 g) i chlorek sodu (10 g) na litr podwójnie destylowanej wody. Dobrze wymieszaj z mieszadłem magnetycznym.
  3. Przygotuj 1000 razy (100 mg/ml) bulion ampicyliny w wodzie podwójnie destylowanej. Dobrze wymieszaj i przefiltruj, wysterylizuj.
  4. Syntetyczne kompletne podłoże płynne – leucyna (SC-LEU): Dodać 1,7 g drożdżowej zasady azotowej bez aminokwasów, 2% glukozy, 1,92 g mieszanki SC-LEU Dropout, 5 g siarczanu amonu na litr podwójnie destylowanej wody. Dobrze wymieszaj z mieszadłem magnetycznym.
  5. Bufor TE: Wymieszaj Tris (10 mM stężenie końcowe), EDTA (1 mM stężenie końcowe) w roztworze z podwójnie destylowaną wodą. Dobrze wymieszaj z mieszadłem magnetycznym.
  6. Przygotuj 50% PEG 3350 w roztworze z podwójnie destylowaną wodą. Dobrze wymieszaj z mieszadłem magnetycznym.
  7. Przygotować 1 M i 100 mM roztwór octanu litu z wodą podwójnie destylowaną. Dobrze wymieszać z mieszadłem magnetycznym.
    UWAGA: Aby przygotować stałe płytki agarowe, dodać 20 g agaru (na litr z podwójnie destylowaną wodą) do pożywki przygotowanej w 2.1 i 2.2 powyżej przed autoklawowaniem. W przypadku przygotowywania ampicyliny należy dodać 1 ml ampicyliny do pożywki opisanej w ppkt 2.2 powyżej, po ostygnięciu do temperatury około 60 °C. Wlać do sterylnych płytek i pozostawić do zastygnięcia na 48–72 godziny przed użyciem. Przechowuj talerze w temperaturze 4 °C w celu dłuższego przechowywania.

3. Zaprojektuj strategię klonowania, aby sklonować SIR2 do wektora pRS315

  1. Zaprojektuj startery PCR do amplifikacji genu SIR2 do klonowania do wektora pRS315.
    1. Projektuj startery ręcznie, aby uzyskać komplementarność nukleotydów 21–22 z regionami międzygenowymi przed i za SIR2. Upewnij się, że cały gen wraz z nieulegającymi translacji regionami mRNA został sklonowany, mapując te cechy z dostępnych zestawów danych33,34.
    2. Upewnij się, że konstrukcja startera PCR powoduje uzyskanie starterów do przodu i do tyłu, które mają temperaturę topnienia (Tm) powyżej 53 °C i poniżej 60 °C.
      UWAGA: Idealnie byłoby, gdyby oba startery miały Tm tak blisko siebie, jak pozwala na to sekwencja, z przybliżoną zawartością GC między 40-50%, upewniając się, że unikasz powtórzeń dinukleotydów i równoważy rozkład GC i AT w całej sekwencji.
    3. Po zaprojektowaniu starterów PCR, które pozwolą na wytworzenie amplikonu do klonowania, dodaj miejsca docelowe trawienia enzymu restrykcyjnego (R.E.D.) do końca 5' każdego startera, które są kompatybilne z wektorem klonowania plazmidu. W tej metodzie miejsce trawienia enzymu restrykcyjnego HindIII (5'-AAGCTT-3') dodaje się do przedniego startera, a miejsce trawienia enzymu restrykcyjnego SacII (5'-CCGCGG-3') dodaje się do dolnego, odwróconego startera.
      UWAGA: Użycie miejsc SacII i HindIII wymaga, aby uzgodnione miejsce cięcia dla każdej endonukleazy nie było obecne w genie docelowym. Jeśli którykolwiek z enzymów jest ukierunkowany na gen docelowy, należy wybrać alternatywne enzymy restrykcyjne. Istnieje wiele takich, które są kompatybilne z regionem polilinkera na wektorze pRS315.
    4. Na koniec dodaj zwis sekwencji czterech nukleotydów (5'-NNNN-3') do końca 5' każdego startera, aby umożliwić enzymowi restrykcyjnemu związanie się i strawienie amplikonu. Po zaprojektowaniu starterów należy zlecić komercyjną syntezę oligonukleotydów do wykorzystania w klonowaniu genu SIR2.
    5. Ponowne zawieszenie starterów PCR: Odwirować startery PCR za pomocą stołowego mikrofuge'u z maksymalną prędkością przez 4 minuty. Dodać roztwór TE, aby uzyskać stężenie podstawowe 100 μM. Przechowywać stężenie wyjściowe w temperaturze -20 °C i rozcieńczyć w stosunku 1/10 do stosowania w aplikacjach PCR.
      UWAGA: Aby uzyskać zapas 100 μM, rozpuść startery w objętości sterylnego buforu TE, która jest 10x większa niż ilość nmoli w probówce ze starterem, używając mikrolitrów TE. Na przykład, jeśli probówka zawiera 15,6 nmoli startera, dodaj 156 μl buforu TE.
  2. Wyizoluj gDNA drożdży typu dzikiego do amplifikacji PCR konstruktu klonującego SIR2.
    UWAGA: Na rynku dostępnych jest kilka wysokiej jakości opcji izolowania gDNA drożdży. Wykorzystanie zestawu, który zawiera trawienie ściany komórkowej grzyba za pomocą zymoliazy, skutkuje lepszą jakością gDNA (wyższa wydajność, mniej zanieczyszczeń). Poniższy protokół konsekwentnie zwraca wysokie stężenie i czystość. Szczegóły dotyczące polecanego przez nas zestawu można znaleźć w Tabeli Materiałów.
    1. Hoduj 5 ml kultury drożdży typu dzikiego przez 48-72 godziny do fazy po logarytmie w wzbogaconych podłożach, takich jak YPAD. Osadzać komórki drożdży w >800 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej, usunąć pożywkę wzrostową i ponownie zawiesić w 120 μl buforu do trawienia zymoliazy uzupełnionego 5 μl zymoliazy (2 jednostki enzymu/μl). Wymieszać próbkę przez wirowanie i inkubować w temperaturze 37 °C przez 40 minut.
    2. Dodać 120 μl chaotropowego buforu do lizy (np. chlorku guanidyny), 250 μl chloroformu i wirować próbkę przez 60 s.
    3. Odwirować przy >8 000 x g przez 2 minuty i przenieść supernatant do kolumny oczyszczającej w sterylnej probówce zbiorczej.
    4. Wirować przy >8 000 x g przez 60 s i odrzucić przepływ. gDNA zostanie połączone z matrycą kolumny.
    5. Przepłukać kolumnę dwukrotnie 300 μl buforu płuczącego na bazie etanolu, powtarzając etap wirowania od góry (3.2.4). Odrzuć przepływ po każdym zakręceniu. Przenieść kolumnę do probówki do mikrofuge o pojemności 1,5 ml, dodać 60 μl buforu TE i inkubować w temperaturze pokojowej przez 60 s. Wiruj próbkę przez 30 sekund, aby wymyć DNA.
      UWAGA: Określ stężenie DNA w próbce (absorbancja przy 260 nm) i jakość (absorbancja 260 nm/280 nm). Typowa wydajność wyniesie 100–200 ng/μl gDNA przy współczynniku absorbancji przy 260 nm/280 nm jak najbardziej zbliżonym do 1,8.
  3. Amplifikacja i izolacja wektora plazmidu pRS315 do klonowania.
    UWAGA: Na rynku dostępnych jest kilka wysokiej jakości opcji oczyszczania wektorów plazmidowych. Na tym etapie zalecana jest chemia kolumny na bazie krzemionki. Opisane poniżej zmiany doprowadziły do najwyższego stężenia i czystości. Szczegóły znajdują się w Tabeli Materiałów.
    1. Hoduj 5 ml kultury E. coli zawierającej wektor pRS315 przez noc w pożywce LB+ ampicyliny (80 μg/ml). Osadzać kulturę przez odwirowanie w temperaturze 8 000 x g > przez 2 minuty w temperaturze pokojowej (15–25 °C).
    2. Ponownie zawiesić granulowane komórki bakteryjne w 250 μl buforu TE z RNazą A (100 μg/ml) i przenieść do probówki mikrowirówkowej. Upewnij się, że nie pozostały żadne grudki komórek.
    3. Dodać 250 μl buforu do lizy i wymieszać, odwracając probówkę 6–8 razy. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Nie pozwól, aby liza trwała dłużej niż 5 minut – preferowane jest trochę mniej.
    4. Dodać 350 μl buforu neutralizacyjnego i natychmiast dokładnie wymieszać, odwracając probówkę 10 razy. Wirować przez 10 minut przy >8 000 x g.
    5. Ostrożnie przenieść supernatant z góry do krzemionkowej kolumny wirowej za pomocą pipetowania. Wirować przez 30 sekund i wyrzucić przepływ.
    6. Dodać 500 μl buforu do przemywania o wysokiej zawartości soli i odwirować jak w kroku 3.3.5. Odrzuć przepływ. Przemyć kolumnę wirową wiążącą DNA, dodając 750 μl buforu płuczącego na bazie etanolu w celu usunięcia pozostałości soli i odwirować jak w kroku 3.3.5.
    7. Odrzucić przepływ i odwirować przez dodatkowe 2 minuty przy >8 000 x g, aby usunąć resztki buforu do płukania. Umieść kolumnę wirującą w czystej, oznaczonej probówce mikrowirówkowej o pojemności 1.5 ml. Aby wymyć DNA, dodać 20 μl buforu TE do środka kolumny wirowej, inkubować przez 1 minutę w temperaturze pokojowej i wirować przez 1 minutę w temperaturze >8 000 x g.
    8. Za pomocą spektrofotometru określić ilość (absorbancja przy 260 nm) i jakość (absorbancja 260 nm/280 nm) DNA. Typowy plon wynosi 1–2 μg/μl.
  4. Amplifikacja PCR genu kandydującego, SIR2, z genomowego DNA typu dzikiego
    1. Aby wytworzyć amplikon odpowiedni do klonowania, należy użyć polimerazy PCR o wysokiej wierności (HF), aby uniknąć niezamierzonego generowania mutacji w amplifikowanej sekwencji.
      UWAGA: Na rynku dostępnych jest wiele różnych opcji PCR o wysokiej wierności. Aby ułatwić optymalizację warunków reakcji PCR, należy użyć kombinacji dwóch: jednego będącego standardowym buforem HF i drugiego zoptymalizowanego pod kątem wysokiej GC i złożonych amplikonów. Szczegóły znajdują się w Tabeli Materiałów.
    2. PCR wzmacnia konstrukt SIR2 do klonowania, jak opisano w Tabeli 1.
      UWAGA: Aby zmaksymalizować sukces na etapach klonowania, można skonfigurować wiele identycznych 50 μl i zagęścić je na etapie czyszczenia kolumny PCR. Pamiętaj, aby ustawić jeden brak matrycy gDNA reakcja kontrolna (kontrola negatywna).
    3. Ustaw warunki cykliczne PCR zgodnie z opisem w tabeli 2.
      UWAGA: Różne pary starterów różnią się temperaturą wyżarzania, a różne polimerazy działają z różnymi prędkościami. Upewnij się, że optymalizujesz warunki amplifikacji w oparciu o wybrany enzym i specyfikacje kombinacji starterów zgodnie z projektem.
    4. Sprawdź powodzenie reakcji PCR, wizualizując reakcję PCR, która wytworzyłaby około 2,5 kb fragmentu DNA, na 1,0% żelu agarozowym TAE (z 0,5 μg/ml bromku etydyny do wizualizacji).
  5. Trawienie i ligacja genu kandydującego, SIR2, do wektora plazmidowego pRS315.
    1. Przeprowadzić trawienie restrykcyjne wektora i insertu: 625 ng DNA (wektor lub wstawka), q.s. woda, aby doprowadzić końcową objętość reakcji do 50 μl, 5 μl buforu, 1 μl SacII i 1 μl HindIII. Inkubować trawienie restrykcyjne w temperaturze 37 °C przez 3 godziny, a następnie w temperaturze 80 °C przez 20 minut w celu podgrzania dezaktywacji enzymów. Digesty można przechowywać w temperaturze 4 °C przed przejściem do następnego etapu.
    2. Ustaw reakcję ligacji 15 μl, aby utworzyć pożądany plazmid: 6 μl sterylnej wody, 2 μl strawionego wektora (50 ng DNA), 4 μl strawionej wstawki (100 ng DNA), 2 μl buforu reakcyjnego T4 i 1 μl ligazy T4 DNA. Reakcje ligacji inkubować przez noc w temperaturze 16 °C, a następnie w temperaturze 80 °C przez 20 minut w celu podgrzania i dezaktywacji enzymu.
      UWAGA: Skonfiguruj kontrolę bez wkładki, zastępując wkładkę dodatkowymi 4 μl sterylnej wody (łącznie 10 μl).
    3. Przekształć reakcje ligacji w E. coli.
      UWAGA: Dostępnych jest wiele opcji dla kompetentnych komórek, które są dostępne. W protokole tym wykorzystuje się chemicznie kompetentne ogniwa, które przed użyciem są przechowywane w temperaturze -80 °C.
      1. Rozmrozić probówkę o pojemności 50 μl zamrożonych, kompetentnych komórek E. coli na lodzie do momentu rozmrożenia i natychmiast dodać 15 μl reakcji ligacji. Przesuń rurkę kilka razy. Natychmiast umieść probówki z powrotem w lodzie i inkubuj przez 30 minut.
      2. Szokować termicznie komórki przez 20 s w łaźni wodnej dokładnie w temperaturze 42 °C, a następnie natychmiast umieścić probówki z lodem na 2 minuty inkubacji. Dodać 450 μl pożywki odzyskującej w temperaturze pokojowej (np. SOC lub LB) do każdej reakcji przemiany i inkubować przez 60 minut w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem.
      3. Dla każdej reakcji przemiany należy rozcieńczyć komórki w stosunku 1:10. Stosując technikę sterylną, rozprowadź 150 μl nierozcieńczonych komórek i rozcieńczenia 1:10 na płytkach ampicyliny LB + (80 μg/mL)35. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez noc.
  6. Badanie przesiewowe transformantów prospektywnych dla wektora nadekspresji.
    1. Stosując sterylną technikę, zaszczepij potencjalne transformanty, które wyrosły do 5 ml LB + (80 μg/mL) ampicyliny i rosną przez noc. Postępując zgodnie z procedurą opisaną w sekcji 3.3.1–3.3.7 powyżej, wyizolować plazmidy z każdego potencjalnego transformantu i przeprowadzić badanie przesiewowe w celu pomyślnej integracji insertu poprzez trawienie restrykcyjne, a następnie elektroforezę żelową na 1,0% żelu agarozowym TAE (z 0,5 μg/ml bromku etydyny do wizualizacji).

4. Przekształć wektor w atg1Δ i szczepy drożdży typu dzikiego

UWAGA: To jest wykonywane przy użyciu zmodyfikowanego protokołu transformacji octanu litu36.

  1. Osad 15 ml komórek drożdży typu dzikiego i atg1-null wyhodowanych przez noc w pożywce YPAD do wczesnej do środkowej fazy logarytmicznej (OD 600 nm = 0,4-0,9) wzrostu przez 3 minuty w > 800 x g w temperaturze pokojowej.
  2. Zdekantować supernatant, ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml sterylnego ddH2O i przenieść zawartość do probówki do mikrofuge o pojemności 1,7 ml. Granulować komórki przez 3 minuty w > 800 x g w temperaturze pokojowej.
  3. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w 250 μl 100 mM octanu litu, delikatnie pipetując. Podziel komórki na osobne probówki do mikrofuge dla każdej z transformacji, które wykonasz. Użyć 50 μl mieszanki komórka i octan litu na transformację.
  4. Skonfiguruj miks transformacji. Do każdej z przemian dodaj: 240 μL 50% PEG3350, 36 μL 1,0 M octanu litu i 5 μL DNA nasienia łososia (lub innego nośnika), gotowanego przez 5 minut i na lodzie.
    UWAGA: PEG jest bardzo lepki. Odpipetuj i dokładnie odmierz. Wymieszać pipetując po dodaniu każdego składnika przed przejściem dalej.
  5. Dodać 5 μl odpowiedniego plazmidu dla każdej przeprowadzonej transformacji. Zwiruj każdą tubkę, aby dokładnie wymieszać. Próbki inkubować w temperaturze 30 °C przez 45 minut. Próbki szoku termicznego w temperaturze 42 °C przez 10 min.
  6. Komórki osadkowe przez 3 minuty w > 800 x g w temperaturze pokojowej, ostrożnie usunąć mieszaninę transformacyjną i ponownie zawiesić próbki w 300 μL sterylnego ddH2O. Komórki w peletekach, powtarzając powyższy wir, ostrożnie usuń wodę i ponownie zawieś próbki w 200 μl sterylnego ddH2O.
  7. Ustaw rozcieńczenia 1/10 i 1/100 dla każdego przekształconego szczepu drożdży.
  8. Stosując technikę sterylną, należy podać 150 μl z każdej próbki na płytki SC-leucyny w celu wybrania plazmidów. Rozprowadzić komórki równomiernie i równomiernie i pozostawić płytkę do wyschnięcia, a następnie odwrócić i inkubować w temperaturze 30 °C, aby rosły przez 48–72 godzin < br /> UWAGA: Po wygenerowaniu odpowiedniego szczepu można go przechowywać przez długi czas w 25% glicerolu w temperaturze -80 °C. Kwantyfikacja obecnej liczby kopii może być określona za pomocą kilku metodologii, w tym qPCR, RNA-FISH lub innej odpowiedniej miary37,38.

5. Określ chronologiczną długość życia, aby przetestować skrócone tłumienie fenotypu CLS

  1. Zbadaj wpływ nadekspresji domniemanego supresora na CLS w krótkożyjących drożdżach, mutancie atg1Δ, określając liczbę jednostek tworzących kolonie (CFU), które pozostają w funkcji czasu39.
    UWAGA: Konieczne jest ustawienie tej części eksperymentu z odpowiednimi elementami sterującymi. W typowym eksperymencie porównany zostanie szczep drożdży typu dzikiego (WT) z pustym wektorem, WT z wektorem supresorowym, mutant delecji z pustym wektorem, a mutant delecyjny z wektorem supresorowym.
    1. Weź pojedynczą kolonię szczepu do zbadania i zaszczepij ją w pożywce SC-LEU. Hodować kulturę w temperaturze 30 °C przez 72 godziny, potrząsając.
    2. Za pomocą hemocytometru określ stężenie komórek obecnych w culture40.
    3. Rozcieńczyć podwielokrotność kultury, tak aby uzyskać jednolitą liczbę komórek w objętości 150 μl sterylnej wody. Umieścić kulturę na płytkach SC-LEU przy użyciu sterylnej techniki i hodować w temperaturze 30 °C przez 72 godziny. Te tabliczki to punkt czasowy trzeciego dnia, a eksperyment zostanie znormalizowany do tego punktu czasowego jako 100% wykonalności39.
      UWAGA: Liczba komórek powinna wynosić 200–500, wystarczająco duża do analizy i możliwa do opanowania liczba do zliczenia. W tym badaniu użyliśmy 200 ogniw do naszej ilości posiewu.
    4. Kontynuować inkubację kultur drożdży w temperaturze 30 °C, pobierając regularne porcje i posiewając zgodnie z opisem w ppkt 5.1.3. Kontynuuj ten proces, aż szczepy przestaną być żywotne, a następnie skompiluj i przeanalizuj wyniki.
      UWAGA: Pełna lista szczepów użytych w tym badaniu znajduje się w Tabeli 3.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ponieważ istnieją sprzeczne doniesienia na temat roli SIR2 podczas starzenia, wybraliśmy ten gen do badań jako potencjalny supresor skróconego fenotypu CLS mutanta atg1Δ26. Rola SIR2 jest nieco kontrowersyjna, ze sprzecznymi doniesieniami na temat jego roli w rozszerzaniu CLS, jednak została ona wyraźnie powiązana ze zwiększonym CLS w co najmniej jednym tle drożdży, z rolą zarówno w autofagii, jak i mitofagii22,31

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rozwikłanie zagadki genetyki starzenia się jest trudnym wyzwaniem, z wieloma możliwościami dalszych badań, które mogą potencjalnie przynieść znaczący wgląd w istniejące złożone interakcje. Istnieje wiele metod, które pozwalają na szybkie generowanie mutantów utraconych funkcji do badania szczepów zerowych drożdży45,46. Metoda ta przedstawia proste podejście do identyfikacji i klonowania genów na wektor pRS315 w celu badań supresorów nadekspresji. Jedną z zalet te...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie występuje konflikt interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

James T. Arnone chciałby podziękować za wsparcie studentom kursu Technologie Rekombinowanego DNA w 2017 i 2018 roku na Uniwersytecie Williama Patersona, którzy byli zaangażowani w ten projekt od samego początku, ale których wysiłki nie przekroczyły progu autorstwa: Christopher Andino, Juan Botero, Josephine Bozan, Brenda Calalpa, Brenda Cubas, Headtlove Essel Dadzie, Irvin Gamarra, Preciousgift Isibor, Wayne Ko, Nelson Mejia, Hector Mottola, Rabya Naz, Abdullah Odeh, Pearl Paguntalan, Daniel Raza'e, Gabriella Rector, Aida Shono i Matthew So. Jesteście wielkimi naukowcami i tęsknię za wami wszystkimi!

Autorzy pragną podziękować za nieocenione wsparcie ze strony Instruction and Research Technology na Uniwersytecie Williama Patersona za ich pomoc: Greg Mattison, Peter Cannarozzi, Rob Meyer, Dante Portella i Henry Heinitsh. Autorzy pragną również podziękować Biuru Rektora za wsparcie ART, Biuru Dziekana i Centrum Badań w Kolegium Nauki i Zdrowia za wsparcie tych prac, a także Wydziałowi Biologii za wsparcie tego projektu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Zestaw DNA grzybów/bakteriiZymo ResearchD6005
Enzym HindIIIHFNew England BiolabsR3104S
Phusion High-Fidelity DNA PolymerazaNew England BiolabsM0530S
Qiagen12123
Enzym SacIINew England BiolabsR0157S
Łosoś plemniki DNAThermofisherAM9680
T4 Ligaza DNANew England BiolabsM0202S
Zestaw miniprep plazmidu

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. López-Otín, C., Blasco, M. A., Partridge, L., Serrano, M., Kroemer, G. The hallmarks of aging. Cell. 153 (6), 1194-1217 (2013).
  2. Kenyon, C. The genetics of ageing. Nature. 464 (7288), 504-512 (2010).
  3. Petralia, R. S., Mattson, M. P., Yao, P. J. Aging and longevity in the simplest animals and the quest for immortality. Ageing Research Reviews. 16, 66-82 (2014).
  4. Longo, V. D., Fabrizio, P. Aging Research in Yeast. , Springer. 101-121 (2011).
  5. Campisi, J. Aging, cellular senescence, and cancer. Annual Review of Physiology. 75, 685-705 (2013).
  6. Galkin, F., Zhang, B., Dmitriev, S. E., Gladyshev, V. N. Reversibility of irreversible aging. Ageing Research Reviews. 49, 104-114 (2019).
  7. Khan, S. S., Singer, B. D., Vaughan, D. E. Molecular and physiological manifestations and measurement of aging in humans. Aging Cell. 16 (4), 624-633 (2017).
  8. Riera, C. E., Merkwirth, C., De Magalhaes Filho, C. D., Dillin, A. Signaling networks determining life span. Annual Review of Biochemistry. 85, 35-64 (2016).
  9. Powers, R. W., Kaeberlein, M., Caldwell, S. D., Kennedy, B. K., Fields, S. Extension of chronological life span in yeast by decreased TOR pathway signaling. Genes & Development. 20 (2), 174-184 (2006).
  10. Lapierre, L. R., Hansen, M. Lessons from C. elegans: signaling pathways for longevity. Trends in Endocrinology & Metabolism. 23 (12), 637-644 (2012).
  11. Fontana, L., Partridge, L., Longo, V. D. Extending healthy life span-from yeast to humans. Science. 328 (5976), 321-326 (2010).
  12. Houtkooper, R. H., Pirinen, E., Auwerx, J. Sirtuins as regulators of metabolism and healthspan. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (4), 225-238 (2012).
  13. Bitto, A., et al. Transient rapamycin treatment can increase lifespan and healthspan in middle-aged mice. elife. 5, 16351(2016).
  14. Fang, E. F., et al. NAD+ replenishment improves lifespan and healthspan in ataxia telangiectasia models via mitophagy and DNA repair. Cell Metabolism. 24 (4), 566-581 (2016).
  15. Kaeberlein, M., Kennedy, B. K. Large-scale identification in yeast of conserved ageing genes. Mechanisms of Ageing and Development. 126 (1), 17-21 (2005).
  16. Fabrizio, P., et al. Genome-wide screen in Saccharomyces cerevisiae identifies vacuolar protein sorting, autophagy, biosynthetic, and tRNA methylation genes involved in life span regulation. PLoS Genetics. 6 (7), (2010).
  17. Longo, V. D., Shadel, G. S., Kaeberlein, M., Kennedy, B. Replicative and chronological aging in Saccharomyces cerevisiae. Cell Metabolism. 16 (1), 18-31 (2012).
  18. He, C., Zhou, C., Kennedy, B. K. The yeast replicative aging model. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Basis of Disease. 1864 (9), 2690-2696 (2018).
  19. Lee, S. S., Vizcarra, I. A., Huberts, D. H., Lee, L. P., Heinemann, M. Whole lifespan microscopic observation of budding yeast aging through a microfluidic dissection platform. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (13), 4916-4920 (2012).
  20. Fabrizio, P., Longo, V. D. The chronological life span of Saccharomyces cerevisiae. Aging Cell. 2 (2), 73-81 (2003).
  21. Smith, J., Daniel, L., McClure, J. M., Matecic, M., Smith, J. S. Calorie restriction extends the chronological lifespan of Saccharomyces cerevisiae independently of the Sirtuins. Aging Cell. 6 (5), 649-662 (2007).
  22. Orozco, H., Matallana, E., Aranda, A. Genetic manipulation of longevity-related genes as a tool to regulate yeast life span and metabolite production during winemaking. Microbial Cell Factories. 12 (1), 1(2013).
  23. Tissenbaum, H. A., Guarente, L. Increased dosage of a sir-2 gene extends lifespan in Caenorhabditis elegans. Nature. 410 (6825), 227-230 (2001).
  24. Huang, W. P., Klionsky, D. J. Autophagy in yeast: a review of the molecular machinery. Cell Structure and Function. 27 (6), 409-420 (2002).
  25. Barbosa, M. C., Grosso, R. A., Fader, C. M. Hallmarks of aging: an autophagic perspective. Frontiers in Endocrinology. 9, 790(2019).
  26. Aris, J. P., et al. Autophagy and leucine promote chronological longevity and respiration proficiency during calorie restriction in yeast. Experimental Gerontology. 48 (10), 1107-1119 (2013).
  27. Cheong, H., Nair, U., Geng, J., Klionsky, D. J. The Atg1 kinase complex is involved in the regulation of protein recruitment to initiate sequestering vesicle formation for nonspecific autophagy in Saccharomyces cerevisiae. Molecular Biology of the Cell. 19 (2), 668-681 (2008).
  28. Matsuura, A., Tsukada, M., Wada, Y., Ohsumi, Y. Apg1p, a novel protein kinase required for the autophagic process in Saccharomyces cerevisiae. Gene. 192 (2), 245-250 (1997).
  29. Cherry, J. M., et al. Saccharomyces Genome Database: the genomics resource of budding yeast. Nucleic Acids Research. 40, 700-705 (2012).
  30. Engel, S. R., et al. The reference genome sequence of Saccharomyces cerevisiae: then and now. G3: Genes, Genomes, Genetics. 4 (3), 389-398 (2014).
  31. Imai, S. I., Armstrong, C. M., Kaeberlein, M., Guarente, L. Transcriptional silencing and longevity protein Sir2 is an NAD-dependent histone deacetylase. Nature. 403 (6771), 795-800 (2000).
  32. Sampaio-Marques, B., et al. SNCA (α-synuclein)-induced toxicity in yeast cells is dependent on Sir2-mediated mitophagy. Autophagy. 8 (10), 1494-1509 (2012).
  33. Nagalakshmi, U., et al. The transcriptional landscape of the yeast genome defined by RNA sequencing. Science. 320 (5881), 1344-1349 (2008).
  34. De Boer, C. G., Hughes, T. R. YeTFaSCo: a database of evaluated yeast transcription factor sequence specificities. Nucleic Acids Research. 40, 169-179 (2012).
  35. Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques: plating methods. Journal of Visualized Experiments. (63), e3064(2012).
  36. Gietz, R. D., Woods, R. A. Methods in Enzymology. 350, Elsevier. 87-96 (2002).
  37. Salvi, S., et al. Serum and plasma copy number detection using real-time PCR. Journal of Visualized Experiments. (130), e56502(2017).
  38. McIsaac, R. S., et al. Visualization and analysis of mRNA molecules using fluorescence in situ hybridization in Saccharomyces cerevisiae. Journal of Visualized Experiments. (76), e50382(2013).
  39. Mirisola, M. G., Braun, R. J., Petranovic, D. Approaches to study yeast cell aging and death. FEMS Yeast Research. 14 (1), 109-118 (2014).
  40. Ricardo, R., Phelan, K. Counting and determining the viability of cultured cells. Journal of Visualized Experiments. (16), e752(2008).
  41. Lin, S. J., Guarente, L. Nicotinamide adenine dinucleotide, a metabolic regulator of transcription, longevity and disease. Current Opinion in Cell Biology. 15 (2), 241-246 (2003).
  42. Sikorski, R. S., Hieter, P. A system of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 122 (1), 19-27 (1989).
  43. Romanos, M. A., Scorer, C. A., Clare, J. J. Foreign gene expression in yeast: a review. Yeast. 8 (6), 423-488 (1992).
  44. Pfaffl, M. W. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Research. 29 (9), 45(2001).
  45. Storici, F., Resnick, M. A. The delitto perfetto approach to in vivo site-directed mutagenesis and chromosome rearrangements with synthetic oligonucleotides in yeast. Methods in Enzymology. 409, 329-345 (2006).
  46. DiCarlo, J. E., et al. Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems. Nucleic Acids Research. 41 (7), 4336-4343 (2013).
  47. Arnone, J. T. Genomic Considerations for the Modification of Saccharomyces cerevisiae for Biofuel and Metabolite Biosynthesis. Microorganisms. 8 (3), (2020).
  48. Murakami, C., Kaeberlein, M. Quantifying yeast chronological life span by outgrowth of aged cells. Journal of Visualized Experiments. (27), e1156(2009).
  49. Steffen, K. K., Kennedy, B. K., Kaeberlein, M. Measuring replicative life span in the budding yeast. Journal of Visualized Experiments. (28), e1209(2009).
  50. Huberts, D. H., Janssens, G. E., Lee, S. S., Vizcarra, I. A., Heinemann, M. Continuous high-resolution microscopic observation of replicative aging in budding yeast. Journal of Visualized Experiments. (78), e50143(2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Yeast GeneticsGene OverexpressionATG1 MutantSIR2 GenePlasmid CloningRestriction DigestionYeast TransformationLifespan Assay

Powiązane artykuły