Ten protokół dostarcza niezawodnych metod dysocjacji guzów litych i izolacji komórek szpikowych w mysich śródskórnych lub podskórnych modelach guzów. Cytometria przepływowa pozwala na fenotypową charakterystykę heterogenicznych populacji szpiku w mikrośrodowisku guza, a sortowanie wykaże ich funkcjonalność w kontekście transferu adoptywnego.
Artykuł metodologiczny
Analiza funkcjonalna komórek szpikowych naciekających nowotwór za pomocą cytometrii przepływowej i transferu adoptywnego
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Przedział komórek szpikowych naciekających nowotwór reprezentuje heterogeniczną populację szeroko immunosupresyjnych komórek, które zostały wykorzystane przez guz do wspierania jego wzrostu. Ich akumulacja w tkance nowotworowej i wtórnej tkanki limfatycznej prowadzi do tłumienia przeciwnowotworowych odpowiedzi immunologicznych i dlatego jest celem interwencji terapeutycznej. Ponieważ wiadomo, że lokalne środowisko cytokin może dyktować programowanie funkcjonalne komórek szpikowych naciekających nowotwór, opracowano strategie manipulowania mikrośrodowiskiem guza (TME) w celu ekspresji krajobrazu cytokin bardziej sprzyjającego aktywności przeciwnowotworowych komórek szpikowych. Aby ocenić wywołane terapią zmiany w komórkach szpikowych naciekających nowotwór, w niniejszym artykule przedstawiono procedurę dysocjacji śródskórnej/podskórnej tkanki nowotworowej od myszy z guzem litym w ramach przygotowań do odzyskania leukocytów. Opracowane zostaną strategie analizy cytometrii przepływowej, które umożliwią identyfikację heterogenicznych populacji szpiku w obrębie izolowanych leukocytów oraz scharakteryzowanie unikalnych fenotypów szpikowych. Wreszcie, w artykule opisano sposób oczyszczania żywotnych komórek szpikowych do testów funkcjonalnych i określania ich wartości terapeutycznej w kontekście transferu adoptywnego.
Wprowadzenie
Mikrośrodowisko guza (TME) składa się z szybko rosnących komórek nowotworowych i otaczającego je heterogenicznego przedziału komórek zrębu. Ponieważ rosnące guzy są często słabo unaczynione, TME jest miejscem peryferyjnym charakteryzującym się wyjątkowo hipoksją, niedoborem składników odżywczych i kwasicą1. Aby przetrwać w tym krajobrazie, reakcje na stres nowotworowy i przeprogramowanie metaboliczne powodują wydzielanie rozpuszczalnych czynników, które sprzyjają przebudowie tkanek i angiogenezie, a także selektywnej rekrutacji komórek odpornościowych2. Ponieważ komórki szpikowe są jednym z najliczniejszych typów komórek krwiotwórczych w TME, rośnie zainteresowanie badaniem roli komórek szpikowych naciekających nowotwór w TME.
Komórki mieloidalne to heterogeniczna i plastyczna grupa wrodzonych komórek odpornościowych, w tym monocyty, makrofagi, komórki dendrytyczne i granulocyty. Chociaż odgrywają one kluczową rolę w homeostazie tkanek i adaptacyjnej regulacji odpowiedzi immunologicznej, ich funkcja może być polaryzująca w zależności od składu sygnałów aktywacyjnych w lokalnym mikrośrodowisku3. Guzy wykorzystują charakterystykę komórek szpikowych poprzez wydzielanie rozpuszczalnych czynników w TME. Te alternatywne sygnały mogą przekierować mielopoezę w kierunku niedojrzałego różnicowania i zniekształcić funkcję istniejących komórek szpikowych naciekających nowotwór3. Rzeczywiście, komórki szpikowe w TME często sprzyjają progresji raka i mogą hamować przeciwnowotworową odpowiedź immunologiczną, co prowadzi do niekorzystnego wpływu na terapię przeciwnowotworową.
Chociaż wykazano, że strategie terapeutyczne promujące wyczerpanie immunosupresyjnych komórek szpikowych opóźniają wzrost guza4, brak swoistości docelowej grozi usunięciem immunostymulujących komórek szpikowych, które natomiast pomagają w rozwiązaniu raka. Te zapalne komórki szpikowe mogą wywierać głębokie działanie przeciwnowotworowe, w tym bezpośrednie zabijanie komórek nowotworowych i aktywację cytotoksycznych limfocytów T CD8 +5. Alternatywnie, strategie normalizujące skład i funkcję komórek szpikowych w TME wykazały sukces terapeutyczny6; Jednak mechanizmy biologiczne leżące u podstaw ich reedukacji w kierunku fenotypu przeciwnowotworowego nadal nie zostały w pełni poznane. Ostatecznie, kompleksowa charakterystyka nowotworowych komórek szpikowych jest niezbędna do dalszego doskonalenia terapii przeciwnowotworowej.
Niestety, powtarzalne dezagregowanie guzów w celu izolacji komórek szpikowych jest wyzwaniem. Komórki szpikowe pochodzące z guza są wrażliwe na manipulację ex vivo w porównaniu z innymi podzbiorami leukocytów, a agresywność przetwarzania guza może prowadzić do enzymatycznego rozszczepienia epitopów i zmniejszenia żywotności odzyskanych komórek7. Celem tej metody jest zapewnienie niezawodnego sposobu dysocjacji guza w celu zachowania integralności markera powierzchniowego do analizy i żywotności komórkowej do badania funkcjonalnego. W porównaniu z protokołami izolacji leukocytów naciekających nowotwór (TIL), które faworyzują ostrzejsze mieszanki enzymatyczne w celu zwiększenia powtarzalnego uwalniania różnych podzbiorów komórkowych, metoda ta faworyzuje bardziej konserwatywne trawienie enzymatyczne w celu maksymalizacji odzysku komórek szpikowych. Dostępne są również wysokopoziomowe strategie bramkowania przepływu wielokolorowego w celu identyfikacji podzbiorów komórek szpikowych guza myszy w celu dalszej charakterystyki i/lub sortowania.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
UWAGA: Wszystkie badania na zwierzętach były zgodne z wytycznymi Kanadyjskiej Rady ds. Opieki nad Zwierzętami i zostały zatwierdzone przez Radę Etyki Badań nad Zwierzętami Uniwersytetu McMaster.
1. Żniwo guza i dysocjacja
- Zaszczepić 6-8-tygodniowe, żeńskie myszy C57BL/6 śródskórnie/podskórnie 2 × 105 komórkami czerniaka B16, jak opisano przez Nguyen i wsp.8 Pozwól guzom rosnąć przez 7 dni przed zbiorem.
- Poddaj mysz eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy, upewniając się, że nie naruszysz przy tym guza. Przed zbiorem spryskaj mysz 70% etanolem.
- Za pomocą skalpela i nożyczek chirurgicznie usuń śródskórny/podskórny guz z otaczającej tkanki (w tym dołączonych węzłów chłonnych drenujących guz) i umieść guzy w wstępnie zważonej probówce do mikrofuge. Przechowywać na lodzie.
UWAGA: Przeprowadź pobieranie guzów w komorze bezpieczeństwa biologicznego do użytku dla zwierząt. Użyj stożkowej rurki o pojemności 15 ml w przypadku większych guzów. - Zważ guzy i dodaj 500 μl pożywki RPMI-1640 z 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) do każdej probówki, używając nożyczek, aby pociąć guzy na małe kawałki w probówce lub na płytce 6-dołkowej.
UWAGA: Kawałki guza powinny być na tyle małe, aby można je było wymieszać za pomocą pipety elektrycznej po dodaniu pożywki wytrawiającej. - Przygotować mieszaninę dysocjacyjną, rozpuszczając kolagenazę typu IV w stężeniu 0,5 mg/ml i DNazę w stężeniu 0,2 mg/ml w pożywce RPMI-1640 z 10% FBS i 5 mM chlorku wapnia.
UWAGA: Mieszanka dysocjująca musi być przygotowana na świeżo, aby zmaksymalizować aktywność kolagenazy. - Przenieś zmieloną zawiesinę guza do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i dodaj 10 ml mieszaniny dysocjacyjnej na 0,25 mg guza. Umieścić probówkę w wytrząsarce orbitalnej o kontrolowanej temperaturze na 30 minut w temperaturze 37 °C z mieszaniem 200 obr./min. Zneutralizować aktywność kolagenazy, dodając dwie objętości zimnej pożywki RPMI-1640 z 10% FBS i 2 mM kwasem etylenodiaminotetraoctowym (EDTA) i przechowywać w lodówce przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
- Krótko przemieszać i odpipetować zawiesinę do sitka o średnicy 40 μm na stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Użyj tłoka strzykawki i pożywki neutralizującej, aby zdezagregować pozostałą tkankę nowotworową i przemyć ją przez sitko. Odwirować zawiesinę przez 5 minut (500 × g, 4 °C), odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS) z 2% FBS i 1 mM EDTA.
2. Wzbogacanie TIL i barwienie metodą cytometrii przepływowej (FACS)
- Aby wzbogacić TIL do charakterystyki komórek szpikowych, należy użyć zestawu do magnetycznej separacji komórek przeznaczonego do selekcji biotynowo-dodatniej z biotynylowanymi przeciwciałami CD45.2 zgodnie z instrukcjami producenta (patrz Tabela materiałów).
- Ponownie zawiesić komórki w 200 μl buforu FACS (PBS z 0,5% w/v albuminy surowicy bydlęcej (BSA)) i przenieść je na 96-dołkową płytkę dolną w kształcie litery U.
UWAGA: Nie przekraczaj stężenia barwienia 1 × 108 komórek/ml. Dostosuj objętość i podziel próbki na wiele dołków, aby skompensować dużą liczbę komórek. - Odwirować płytkę przez 5 minut (500 × g, 4 °C) i odrzucić supernatant. Dodać 50 μl roztworu blokowego Fc (rozcieńczenie 1:200 oczyszczonego szczurzego anty-mysiego CD16/CD32 [patrz tabela materiałów) w buforze FACS, końcowe stężenie 2,5 μg/ml) i ponownie zawiesić komórki przez pipetowanie. Inkubować przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
- Dodać 50 μl buforu FACS zawierającego 2x stężenie przeciwciała barwiącego powierzchnię (rozcieńczenie 1:50 CD45.2, NK1.1, CD11c, F4/80, CD8a, Ly6C, CD11b, CD4, Ly6G) i możliwe do utrwalenia barwienie żywotności (FVS, rozcieńczenie 1:500) i wymieszać komórki przez pipetowanie. Inkubować przez 20 minut w temperaturze 4 °C.
UWAGA: Przykryj płytkę folią aluminiową, aby zminimalizować ekspozycję na światło. Przeciwciała należy miareczkować przed eksperymentem, aby empirycznie określić optymalne rozcieńczenie. - Przepłukać komórki dwukrotnie, dodając 200 μl buforu FACS do każdej studzienki, odwirowując zawiesinę (5 min, 500 × g, 4 °C) i odrzucając supernatant.
- Dodać 100 μl roztworu utrwalającego/przepuszczalnego (patrz tabela materiałów) do każdego dołka, wymieszać komórki pipetując i inkubować przez 20 minut w temperaturze 4 °C.
- Dodać 100 μl 1x buforu permeabilizacyjnego (patrz Tabela Materiałów) do każdej studzienki, odwirować płytkę przez 5 minut (500 × g, 4 °C) i odrzucić supernatant.
- Przemyć komórki, dodając 200 μl 1x buforu permeabilizacji do każdej studzienki, odwirowując zawiesinę (5 min, 500 × g, 4 °C) i odrzucając supernatant.
UWAGA: Eksperyment można wstrzymać na noc po ponownym zawieszeniu komórek w buforze przepuszczalnym. Przechowywać próbkę w temperaturze 4 °C i chronić przed światłem. Wznowić po krótkim wymieszaniu komórek przed odwirowaniem. - Dodać 100 μl buforu permeabilizacyjnego zawierającego 1x stężenie wewnątrzkomórkowego przeciwciała barwiącego (rozcieńczenie 1:100 syntazy tlenku azotu 2 (NOS2), arginazy 1 (Arg1)) i wymieszać komórki przez pipetowanie. Inkubować przez 20 minut w temperaturze 4 °C.
UWAGA: Przykryj płytkę folią aluminiową, aby zminimalizować ekspozycję na światło. Przeciwciała należy miareczkować przed eksperymentem, aby empirycznie określić optymalne rozcieńczenie. - Dodać 100 μl 1x buforu permeabilizacyjnego do każdej studzienki, odwirować płytkę przez 5 minut (500 × g, 4 °C) i odrzucić supernatant.
- Przepłukać komórki, dodając 200 μl 1x buforu permeabilizacji do każdej studzienki, odwirowując zawiesinę (5 min, 500 × g, 4 °C) i odrzucając supernatant.
- Ponownie zawiesić komórki w 300 μl buforu FACS. Przefiltrować próbkę przez okrągłodenną probówkę z polistyrenu o pojemności 5 ml z nasadką sitową 40 μm przed wykonaniem analizy metodą cytometrii przepływowej.
3. Sortowanie komórek szpikowych nowotworu do badań funkcjonalnych
- Po zidentyfikowaniu pożądanych populacji komórek szpikowych za pomocą analizy cytometrii przepływowej, należy wstępnie wzbogacić masowe komórki szpikowe do sortowania za pomocą zestawu do magnetycznej separacji komórek przeznaczonego do selekcji CD11b lub CD11c-dodatniej zgodnie z instrukcjami producenta (patrz Tabela materiałów).
- Używając przeciwciał barwiących powierzchnię specyficznych dla pożądanych podzbiorów komórek szpikowych (rozcieńczenie CD11b, Ly6C, Ly6G w stosunku 1:100), wybarwić wstępnie wzbogacone komórki zgodnie z opisem w krokach 2.2-2.5.
UWAGA: Dołącz możliwą do naprawienia plamę żywotności, aby zapewnić sortowanie żywych komórek szpikowych. Nie przekraczać stężenia barwienia 1 × 108 komórek/ml. Dostosuj objętość i podziel próbki na wiele dołków, aby skompensować dużą liczbę komórek. - Ponownie zawiesić komórki w buforze do sortowania na zimno (PBS z 1% w/v BSA, 25 mM kwasu 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego (HEPES) i 1 mM EDTA). Przefiltrować próbkę przez okrągłodenną probówkę polipropylenową o pojemności 5 ml z nasadką sitka 40 μm. Trzymaj komórki na lodzie i przykryj probówkę folią aluminiową.
UWAGA: Dostosuj stężenie komórek/objętość do żądanej specyfikacji urządzenia do sortowania. - Przygotować probówkę do pobierania próbek z pożywką wychwytującą (5 ml okrągłodenna probówka polipropylenowa zawierająca PBS z 50% FBS).
UWAGA: Wypełnij probówki z 5 ml pożywki wychwytującej na noc przed sortowaniem. Wyrzuć wszystko, z wyjątkiem 1-2 ml pożywki wychwytującej, następnego dnia przed badaniem próbki. - Zmodyfikuj ustawienia urządzenia sortującego, aby zmniejszyć ciśnienie próbki i zapobiec zakłóceniom w tworzeniu się kropel. Wyposaż końcówkę dyszy 130 μm i wykorzystaj ustawienie 10 psi. Uruchomić próbkę przy niskim natężeniu przepływu z okresowym mieszaniem próbki przy 100 obr./min, upewniając się, że osadzanie kropelek znajduje się w środku probówki. Po sortowaniu należy przechowywać próbkę na lodzie.
- Inkubować próbkę przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Wirować probówkę przez 5 minut (500 × g, 4 °C), odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w żądanym podłożu do testów funkcjonalnych lub transferu adoptywnego.
4. Adoptywny transfer oczyszczonych komórek szpikowych nowotworu
- Zaszczepić śródskórnie 6-8-tygodniowe samice myszy C57BL/6 1 × 106 komórkami nowotworowymi czerniaka B16 zawieszonymi w 30 μl PBS.
UWAGA: Zaszczepij myszy z wyprzedzeniem, tak aby wzrost guza nie przekraczał 100 mm3 do czasu transferu adoptywnego. - Ponownie zawiesić posortowane komórki szpikowe guza w PBS z 25 mM HEPES i 1 mM EDTA w stężeniu 2 × 106 komórek/ml. Przefiltrować próbkę przez okrągłodenną probówkę z polistyrenu o pojemności 5 ml z nasadką sitka o średnicy 40 μm. Trzymaj na lodzie.
- Indukuj i utrzymuj myszy w znieczuleniu za pomocą 3% izofluranu. Zastosuj maść okulistyczną, aby zapobiec suchości/urazowi oka.
- Do strzykawki 31 g należy załadować 50 μl zawiesiny komórek. Usunąć pęcherzyki powietrza, delikatnie potrząsając strzykawką. Oczyścić miejsce wstrzyknięcia za pomocą wacika nasączonego alkoholem.
- Za pomocą sterylnych kleszczy podnieś skórę u podstawy guza. Wbij igłę w przestrzeń podskórną pod niewielkim kątem do góry, aby wejść do guza od spod skóry. Za pomocą kleszczy ściskaj skórę otaczającą igłę i powoli dozuj objętość strzykawki. Kontynuuj szczypanie skóry kleszczami, powoli wyjmując igłę, a następnie użyj bawełnianego wacika, aby usunąć potencjalny wyciek.
UWAGA: W razie potrzeby należy przystąpić do wszelkich dodatkowych zabiegów terapeutycznych. - Pozwól myszom dojść do siebie po znieczuleniu.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Wyniki pokazują, że ta metoda daje wysoką wydajność komórek szpikowych z litych guzów mysich. Zachowanie integralności receptora i żywotności komórkowej ułatwia wiarygodną analizę funkcjonalną pożądanych podzbiorów szpiku. Te ulepszenia w izolacji komórek szpikowych pozwoliły na dostrzeżenie zmieniającej się funkcji wewnątrznowotworowych komórek szpikowych po normalizacji TME za pomocą inhibitora deacetylazy histonowej klasy I (HDACi), MS-275, podczas adoptywnej terapii limfocytami T. Protokoły izolacji TIL zazwyczaj nie...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Chociaż komórki szpikowe naciekające nowotwór występują w różnych stanach aktywacji i różnicowania w obrębie guza, zidentyfikowano kilka podzbiorów, w tym DC związane z nowotworem (TADC), neutrofile związane z nowotworem (TAN), komórki supresorowe pochodzenia mieloidalnego (MDSC) i makrofagi związane z nowotworem (TAM)12. Niestety, nakładająca się ekspresja markerów powierzchniowych komórek używanych do identyfikacji tych podzbiorów komórek szpikowych sprawia, że obecnie trudno jest fenotypowo odr...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie stwierdzono konfliktu interesów.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez Ontario Institute for Cancer Research poprzez finansowanie zapewnione przez rząd Ontario, a także przez Kanadyjskie Instytuty Badań nad Zdrowiem (FRN 123516 i FRN 152954), Kanadyjskie Towarzystwo Onkologiczne (grant 705143) oraz Instytut Badawczy Terry'ego Foxa (TFRI-1073).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Alexa Fluor 700 Mysz anty-mysz CD45.2 | BD Biosciences | 560693 | 1:100 |
| APC-Cy7 Mysz anty-mysz NK-1.1 | BD Biosciences | 560618 | 1:100 |
| Mysz biotynowa Anti-Mouse CD45.2 | BD Biosciences | 553771 | |
| BV421 Chomik Anty-Myszy CD11c | BD Biosciences | 562782 | 1:100 |
| BV650 Szczur Anty-Myszy F4/80 | BD Nauki biologiczne | 743282 | 1:100 |
| BV711 Szczurzy anty-mysz CD8a | BD Biosciences | 563046 | 1:100 |
| Kolagenaza, typ IV, proszek | Gibco | 17104019 | |
| DNase I | Roche | 10104159001 | |
| Mysz EasySep CD11b Zestaw pozytywnej selekcji II | Technologie komórek macierzystych | 18970 | |
| Mysz EasySep CD11c Zestaw pozytywnej selekcji II | Technologie komórek macierzystych | 18780 | |
| EasySep Release Mouse Biotyna Positive Selection | Kit Technologie komórek macierzystych | 17655 | |
| FITC Rat Anti-Mouse Ly-6C | BD Biosciences | 553104 | 1:100 |
| Możliwa do naprawienia plama żywotności 510 | BD Biosciences | 564406 | 1:1000 |
| Zestaw roztworów do utrwalania/przepuszczalności (BD Cytofix/Cytoperm) | BD Biosciences | ||
| PE Rat Anti-CD11b | BD Biosciences | 557397 | 1:100 |
| PE-Cy7 Rat Anti-Mouse CD4 | BD Biosciences | 552775 | 1:100 |
| PerCP-Cy5.5 Rat Anti-Mouse Ly-6G | BD Biosciences | 560602 | 1:100 |
| Perm/Wash (BD Perm/Wash) | BD Biosciences | 554723 | |
| Oczyszczony szczur Anti-Mouse CD16/CD32 (blok BD Fc myszy) | BD Biosciences | 553141 | |
| Przeciwciało monoklonalne iNOS (CXNFT), APC | Thermo Fisher | 17-5920-82 | 1:100 |
| Arginaza ludzka/mysia 1/ARG1 Przeciwciało sprzężone z fluoresceiną | R& D Systems | IC5868F | 1:100 |
Bibliografia
- Paardekooper, L. M., Vos, W., vanden Bogaart, G. Oxygen in the tumor microenvironment: effects on dendritic cell function. Oncotarget. 10 (8), 883-896 (2019).
- Schouppe, E., De Baetselier, P., Van Ginderachter, J. A., Sarukhan, A. Instruction of myeloid cells by the tumor microenvironment: Open questions on the dynamics and plasticity of different tumor-associated myeloid cell populations. Oncoimmunology. 1 (7), 1135-1145 (2012).
- Jahchan, N. S., et al. Tuning the tumor myeloid microenvironment to fight cancer. Frontiers in Immunology. 10, 1611(2019).
- Srivastava, M. K., et al. Myeloid suppressor cell depletion augments antitumor activity in lung cancer. PLoS One. 7 (7), 40677(2012).
- Awad, R. M., De Vlaeminck, Y., Maebe, J., Goyvaerts, C., Breckpot, K. Turn back the TIMe: targeting tumor infiltrating myeloid cells to revert cancer progression. Frontiers in Immunology. 9, 1977(2018).
- Strauss, L., et al. Targeted deletion of PD-1 in myeloid cells induces antitumor immunity. Science Immunology. 5 (43), 1863(2020).
- Cassetta, L., et al. Deciphering myeloid-derived suppressor cells: isolation and markers in humans, mice and non-human primates. Cancer Immunology, Immunotherapy. 68 (4), 687-697 (2019).
- Nguyen, A., et al. HDACi delivery reprograms tumor-infiltrating myeloid cells to eliminate antigen-loss variants. Cell Reports. 24 (3), 642-654 (2018).
- Newton, J. M., Hanoteau, A., Sikora, A. G. Enrichment and characterization of the tumor immune and non-immune microenvironments in established subcutaneous murine tumors. Journal of Visual Experiments: JoVE. (136), e57685(2018).
- Engfeldt, P., Arner, P., Ostman, J. Nature of the inhibitory effect of collagenase on phosphodiesterase activity. Journal of Lipid Research. 26 (8), 977-981 (1985).
- Quah, B. J., Parish, C. R. The use of carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) to monitor lymphocyte proliferation. Journal of Visual Experiments: JoVE. (44), e2259(2010).
- Schupp, J., et al. Targeting myeloid cells in the tumor sustaining microenvironment. Cellular Immunology. 343, 103713(2019).
- Gabrilovich, D. I., Ostrand-Rosenberg, S., Bronte, V. Coordinated regulation of myeloid cells by tumours. Nature Reviews Immunology. 12 (4), 253-268 (2012).
- Seglen, P. O. Preparation of isolated rat liver cells. Methods in Cell Biology. 13, 29-83 (1976).
- Roussel, M., et al. Mass cytometry deep phenotyping of human mononuclear phagocytes and myeloid-derived suppressor cells from human blood and bone marrow. Journal of Leukocyte Biology. 102 (2), 437-447 (2017).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE
Poproś o pozwolenie