Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Dostęp do cytotoksyczności i odpowiedzi komórek na biomateriały

4.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61512

⸱

8 lipca 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Integrated Clinical Practice, Faculty of Medicine, University of Coimbra, Coimbra, Portugal, 2Coimbra Institute for Clinical and Biomedical Research (iCBR) area of Environment Genetics and Oncobiology (CIMAGO), University of Coimbra, Coimbra, Portugal, 3Center for Innovative Biomedicine and Biotechnology (CIBB), University of Coimbra, Coimbra, Portugal, 4Clinical Academic Center of Coimbra, CACC, Portugal, 5Institute of Biophysics, Faculty of Medicine, University of Coimbra, Coimbra, Portugal, 6Laboratory of Oncobiology and Hematology, Faculty of Medicine, University of Coimbra, Coimbra, Portugal, 7Institute of Endodontics, Faculty of Medicine, University of Coimbra, Coimbra, Portugal, 8Institute of Experimental Pathology, Faculty of Medicine, University of Coimbra, Coimbra, Portugal

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ta metodologia ma na celu ocenę cytotoksyczności biomateriałów poprzez przygotowanie rozpuszczalnych ekstraktów, przy użyciu testów żywotności i analizy fenotypowej, w tym cytometrii przepływowej, RT-PCR, immunocytochemii i innych technik biologii komórkowej i molekularnej.

Streszczenie

Biomateriały kontaktują się bezpośrednio lub pośrednio z tkankami ludzkimi, dlatego ważne jest, aby ocenić ich cytotoksyczność. Ocenę tę można przeprowadzić za pomocą kilku metod, ale istnieje duża rozbieżność między zastosowanymi podejściami, co pogarsza odtwarzalność i porównanie uzyskanych wyników. W niniejszym artykule proponujemy protokół oceny cytotoksyczności biomateriałów przy użyciu ekstraktów rozpuszczalnych, które stosujemy do biomateriałów dentystycznych. Przygotowanie ekstraktów jest szczegółowe, od produkcji granulek do ich ekstrakcji w pożywce hodowlanej. Ocena cytotoksyczności biomateriałów opiera się na aktywności metabolicznej przy użyciu testu MTT, żywotności komórek przy użyciu testu sulforodaminy B (SBR), profilu śmierci komórki za pomocą cytometrii przepływowej oraz morfologii komórek przy użyciu Maya-Grünwalda Giemsy. Oprócz oceny cytotoksyczności opisano protokół oceny funkcji komórki oparty na ekspresji specyficznych markerów ocenianych za pomocą immunocytochemii i PCR. Protokół ten stanowi kompleksowy przewodnik po ocenie cytotoksyczności biomateriałów i skutków komórkowych, przy użyciu metodologii ekstraktów, w powtarzalny i solidny sposób.

Wprowadzenie

Biokompatybilność można zdefiniować jako zdolność materiału do integracji tkanki i wywołania korzystnej odpowiedzi terapeutycznej, wolnej od miejscowych i ogólnoustrojowych uszkodzeń1,2,3. Ocena biokompatybilności ma kluczowe znaczenie dla rozwoju każdego materiału przeznaczonego do użytku medycznego. W związku z tym protokół ten zapewnia systematyczne i kompleksowe podejście dla każdego badacza dążącego do opracowania nowych biomateriałów lub zbadania nowych zastosowań istniejących biomateriałów.

Testy cytotoksyczności in vitro są powszechnie stosowane jako pierwsza faza oceny biokompatybilności, przy użyciu pierwotnych hodowli komórkowych lub linii komórkowych. Wyniki stanowią pierwszy wskaźnik potencjalnego zastosowania klinicznego. Oprócz tego, że testy te mają kluczowe znaczenie dla rozwoju biomateriałów, są obowiązkowe, aby zachować zgodność z obowiązującymi przepisami dotyczącymi wprowadzania na rynek, wydanymi przez organy regulacyjne EUA i UE (certyfikat FDA i CE)4,5,6,7,8. Co więcej, standaryzowane testy w badaniach biomedycznych zapewniają znaczącą przewagę pod względem odtwarzalności i porównywania wyników różnych badań na podobnych biomateriałach lub urządzeniach9.

Wytyczne Międzynarodowej Organizacji Normalizacyjnej (ISO) są powszechnie używane przez wiele niezależnych laboratoriów komercyjnych, regulacyjnych i akademickich do testowania materiałów w dokładny i powtarzalny sposób. ISO 10993-5 odnosi się do oceny cytotoksyczności in vitro, a ISO 10993-12 informuje o przygotowaniu próbek10,11. Do badania biomateriałów dostępne są trzy kategorie, które należy wybrać w zależności od rodzaju materiału, tkanek kontaktujących się i celu leczenia: ekstrakty, kontakt bezpośredni i kontakt pośredni8,11,12,13. Ekstrakty otrzymuje się poprzez wzbogacenie pożywki do hodowli komórkowych w biomateriał. W przypadku testów bezpośredniego kontaktu biomateriał umieszcza się bezpośrednio na kulturach komórkowych, a w przypadku kontaktu pośredniego przeprowadza się inkubację z komórkami oddzielonymi barierą, taką jak żel agarozowy11. Odpowiednie kontrole są obowiązkowe i należy przeprowadzić co najmniej trzy niezależne eksperymenty5,8,10,11,14.

Kluczowe jest symulowanie lub wyolbrzymianie warunków klinicznych w celu określenia potencjału cytotoksycznego. W przypadku badania ekstraktów, pole powierzchni materiału; średnia objętość; pożywka i pH materiału; rozpuszczalność w materiale, osmolarność i współczynnik dyfuzji; a warunki ekstrakcji, takie jak mieszanie, temperatura i czas, wpływają na wzbogacanie mediów5.

Metodologia pozwala na ilościową i jakościową ocenę cytotoksyczności kilku preparatów farmaceutycznych, zarówno stałych, jak i płynnych. Można wykonać kilka testów, takich jak test wychwytu czerwieni obojętnej, test tworzenia kolonii, test MTT i test XTT5,10,14.

Większość opublikowanych badań oceniających cytotoksyczność używa prostszych testów, a mianowicie MTT i XTT, które dostarczają ograniczonych informacji. Ocena biokompatybilności powinna obejmować nie tylko ocenę cytotoksyczności, ale także bioaktywności danego badanego materiału2, jak zatwierdzono w niniejszym protokole. W uzasadnionych i udokumentowanych przypadkach należy stosować dodatkowe kryteria oceny. W związku z tym protokół ten ma na celu zapewnienie kompleksowego przewodnika, szczegółowo opisującego zestaw metod oceny cytotoksyczności biomateriałów. Ponadto opisano ocenę różnych procesów komórkowych, a mianowicie rodzaju śmierci komórki, morfologii komórki, funkcji komórki w syntezie określonych białek oraz specyficznej produkcji tkankowej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie pelletów

  1. Przygotować formy z polichlorku winylu (PVC), wykonując w płytkach PVC otwory o kształcie koła o znanych wymiarach.
    UWAGA: Formy z PVC mogą mieć różne rozmiary. Obliczyć powierzchnię styku form z PVC, korzystając ze wzoru A= h(2πr)+2πr2 (r: promień walca; h: wysokość walca).
  2. Przygotować biomateriał do badania zgodnie z instrukcjami producenta i jak najbliżej rozpoczęcia eksperymentu.
    UWAGA: W przypadku przygotowania biomateriałów w formie pasty/formułacji pastowych, odpowiednią ilość pasty bazowej i katalizatora miesza się ręcznie szpatułką do mieszania. Dla innych materiałów opartych na formułacjach płynnych i proszkowych należy przeprowadzić ręczne szpatułowanie lub mieszanie mechaniczne z wibracjami, zgodnie z instrukcjami producenta lub wytycznymi dla nowych materiałów. W przypadku materiałów płynnych ten krok nie jest konieczny. Rozpocząć protokół od kroku 2.
  3. Nałożyć biomateriał do form za pomocą szpatułki i pozostawić do utwardzenia przez odpowiedni czas.
    UWAGA: Czas i warunki utwardzania biomateriałów muszą być zgodne z instrukcjami producenta lub wytycznymi dla nowych materiałów.
  4. Po utwardzeniu wyjąć pellety biomateriału z form z PVC i umieścić je w pojemniku (można użyć płytki 6-dołkowej lub szalki Petriego).
  5. Zisterylizować pellety, umieszczając je pod lampą ultrafioletową (UV) przez 20 minut z każdej strony.

2. Pozyskiwanie ekstraktów z biomateriałów

UWAGA: Wszystkie procedury powinny być wykonywane w ścisłych warunkach sterylnych.

  1. Wyznacz niezbędną liczbę peletów, obliczając powierzchnię peletu na podstawie wzoru opisanego w punkcie 1.1.
    UWAGA: Jako wartość odniesienia przyjęto powierzchnię styku wynoszącą 250 mm2/ml11,15 osiąga się poprzez dodanie 9 peletów (r 3 mm x h 1,5 mm) na ml pożywki.
  2. Przygotować ekstrakty rozpuszczalne (ekstrakt wzbogacony biomateriałem).
    1. Umieść pellety w probówce o pojemności 50 ml i dodaj odpowiednią ilość pożywki hodowlanej. Inkubuj probówki przez 24 godziny w inkubatorze przy 37°w stałej rotacji.
      UWAGA: Należy użyć pożywki do hodowli komórek odpowiedniej dla danego typu hodowli komórkowych.
    2. Po 24 godzinach wyjąć probówki z inkubatora. W tym punkcie ekstrakty odpowiadają stężeniu 1/1 lub 10%.
    3. Przygotować rozcieńczenia ekstraktu poprzez sekwencyjne dodawanie równych objętości medium warunkującego do medium hodowlanego.
      UWAGA: Nie należy korygować pH pożywki.
      1. Dodaj 1 ml pożywki do 1 ml 10% ekstraktu, aby otrzymać ekstrakt 50%. Dodaj 1 ml pożywki do 1 ml ekstraktu 50%, aby otrzymać ekstrakt 25%, i tak dalej (Rycina 1).
        UWAGA: Należy stosować stężenia uznane za odpowiednie dla każdego związku.

Schemat rozcieńczeń seryjnych, ekstrakty rozpuszczalne w DMEM, stopnie stężeń od 100% do 6,25%.
Rysunek 1: Schemat przygotowania i rozcieńczania ekstraktów rozpuszczalnych. Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.

3. Inkubacja komórek z ekstraktami z biomateriałów

  1. Przygotować zawiesinę komórkową i wysiać ją do odpowiedniego naczynia hodowlanego, takiego jak płytka wielodołkowa, zgodnie z liczbą komórek wymaganą do eksperymentów.
    1. Zacząć od kolby z pożądanymi komórkami o stopniu konfluencji od 80% do 90%.
    2. Odpiąć pożywkę hodowlaną, przemyć roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) i odseparować komórki za pomocą trypsyny-EDTA (1 do 2 mL dla kolby hodowlanej o powierzchni 75 cm2).
    3. Dodać pożywkę hodowlaną (2 do 4 mL dla kolby hodowlanej o powierzchni 75 cm2), przenieść zawiesinę komórkową do probówki i odwirować przy 20 x g przez 5 min.
    4. Resuspender osad w znanej objętości pożywki hodowlanej.
      UWAGA: Protokół ten jest przeznaczony do stosowania w hodowlach komórek adherentnych; można jednak wprowadzić proste modyfikacje, aby pracować z hodowlami komórek w zawiesinie.
    5. Policzyć komórki za pomocą hemocytometru i obliczyć stężenie komórek w zawiesinie.
    6. Przygotować odpowiednią ilość zawiesiny komórkowej w pożywce hodowlanej i przenieść ją na płytki wielodołkowe. Jako wartość referencyjną dla gęstości siewu przyjąć 5 – 20 x 105 komórek/cm2.
      UWAGA: Odpowiednią liczbę komórek należy obliczyć w zależności od typu komórek i ich charakterystyki, w szczególności czasu podwojenia komórek.
  2. Inkubować komórki przez 24 godziny, aby umożliwić ich adhezję.
  3. Po tym czasie dodać rozpuszczalne ekstrakty do płytek hodowlanych.
    1. Odssać pożywkę hodowlaną.
    2. Dodać ekstrakty z biomateriałów do każdego dołka, zgodnie z sekwencją stężeń opisaną wcześniej. Do dołków kontrolnych dodać świeżą pożywkę hodowlaną.
    3. Inkubować płytki przez 24 h lub dłużej.
      UWAGA: W każdym teście należy wykonać kontrole negatywne, odpowiadające nieleczonym komórkom utrzymywanym w pożywce hodowlanej. Czas inkubacji można dobrać w zależności od celów badania.

4. Ocena aktywności metabolicznej

  1. Po inkubacji komórek z ekstraktami biomateriałów odessać medium z płytek i przemyć każdą studnię PBS.
  2. Do każdej studni wlać odpowiednią objętość 0,5 mg/mL bromku 3-(4,5-dimetyltiazol-2-yl)-2,5-difenylotetrazolu (MTT) przygotowanego w PBS, pH 7,4.
  3. Inkubować płytki przez 4 h lub przez noc w ciemności w temperaturze 37 °C.
  4. Aby rozpuścić powstałe kryształy formazanu, dodać do każdej studni odpowiednią objętość 0,04 M roztworu kwasu solnego w izopropanolu i mieszać płytki przez 30 minut.
    UWAGA: Dostosować ilość MTT i izopropanolu do wielkości studni.
  5. W razie potrzeby wymieszać i zhomogenizować zawartość każdej studni, pipetując ciecz w górę i w dół, aż do całkowitego znikania kryształów.
  6. Zmierzyć absorbancję przy długości fali 570 nm z filtrem referencyjnym 620 nm w spektrofotometrze.
  7. Aby obliczyć aktywność metaboliczną, podzielić absorbancję komórek traktowanych przez absorbancję kultur kontrolnych. Aby uzyskać wartości procentowe, pomnożyć wynik przez 10.

5. Ocena śmierci komórek

UWAGA: Aby przeprowadzić tę ocenę, należy użyć minimum 106 komórek na warunki.

  1. Należy użyć probówek do wirowania odpowiednio oznakowanych, zgodnie z ocenianymi warunkami.
  2. Po inkubacji komórek z ekstraktami z biomateriałów należy zebrać pożywkę hodowlaną do odpowiedniej probówki.
  3. Należy odczepić komórki i dodać zawiesinę komórkową do odpowiednich probówek.
  4. Zawiesiny komórkowe należy skoncentrować poprzez wirowanie przy 120 x g przez 5 minut.
  5. Osady należy przemyć PBS. PBS usuwa się przez wirowanie przy 1,0 x g przez 5 minut.
  6. Należy dodać 1 mL PBS i przenieść osady komórkowe do oznakowanych probówek do cytometrii.
  7. PBS należy usunąć przez wirowanie przy 1,00 x g przez 5 minut.
  8. Próbki należy inkubować z 10 µL buforu wiążącego (0.01 M HEPES, 0.14 mM NaCl i 0.25 mM CaCl2)16, a następnie pozostawić komórki na około 15 minut w celu regeneracji błony komórkowej.
  9. Należy dodać 2,5 μL znakowanej fluorescencyjnie Aneksyny-V oraz 1 μL jodku propidynyum i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
  10. Po inkubacji należy dodać 40 μL PBS i przeanalizować próbki na cytometrze. Do analizy i kwantyfikacji danych należy użyć odpowiedniego oprogramowania.
  11. Wyniki należy przedstawić jako procent żywych komórek, apoptozy, późnej apoptozy/nekrozy oraz nekrozy.

6. Ocena morfologii

  1. Wybrać odpowiedniego rozmiaru sterylizowane szkiełka podstawowe, które mieszczą się w płytce wielodołkowej.
  2. Umieścić każde szkiełko w dołku za pomocą sterylnej pęsety.
  3. Rozdzielić zawiesinę komórkową o odpowiednim stężeniu dołków i pozostawić na noc w inkubatorze w temperaturze 37 °C w nawilżonej atmosferze z 95% powietrza i 5% CO2.
  4. Poddać kultury komórkowe działaniu ekstraktów, zgodnie z wcześniejszym opisem.
  5. Odssać medium i przemyć PBS.
  6. Pozostawić szkiełka do wyschnięcia w temperaturze pokojowej, a następnie dodać wystarczającą objętość roztworu May-Grünwalda, aby pokryć szkiełka; inkubować przez 3 minuty.
  7. Usunąć barwnik i przemyć wodą destylowaną przez 1 minutę.
  8. Usunąć wodę i dodać wystarczającą objętość roztworu Giemsy, aby pokryć szkiełka; inkubować przez 15 minut.
  9. Przemyć szkiełka pod bieżącą wodą.
  10. Przenieść szkiełka podstawowe na preparat.
  11. Obejrzeć pod mikroskopem. Wykonać zdjęcia z wybranym powiększeniem.

7. Ocena funkcji komórek za pomocą reakcji polimerazy łańcuchowej z odwrotną transkrypcją (RT-PCR)

UWAGA: Aby przeprowadzić tę ocenę, należy użyć minimum 2x106 komórek na każdą warunkę. Jako przykład genu zainteresowania do oceny aktywności odontoblastów przedstawiono fosfatazę alkaliczną. Inne geny zainteresowania wymieniono w Tabeli 1.

  1. wysiać komórki zgodnie z powyższym opisem.
    UWAGA: Koncentrację wysiewanych komórek może być konieczne dostosować w zależności od rodzaju komórek oraz cytotoksyczności badanych biomateriałów.
  2. inkubować z ekstraktami rozpuszczalnymi, zgodnie z powyższym opisem.
  3. odczepić komórki w celu uzyskania zawiesiny, jak opisano wcześniej.
  4. przemyć komórki dwukrotnie buforem PBS; w tym celu wirować przy 20 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  5. zlizować komórki poprzez zawieszenie osadu w 1 mL roztworu do oczyszczania RNA (np. NZYol), intensywne mieszanie i sukcesywne pipetowanie.
  6. inkubować próbki przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  7. dodać 20 µL chloroformu i wstrząsać probówkami ręcznie przez 15 sekund.
  8. inkubować przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.
  9. wirować lizaty w temperaturze 4 ° C przez 15 min przy 12,0 x g. Podczas tego wirowania w próbce powstają dwie fazy, a RNA pozostaje w fazie wodnej (górnej).
  10. przenieść fazę wodną do nowej probówki i dodać 50 µL zimnego izopropanolu w celu wytrącenia RNA.
  11. inkubować próbki w temperaturze pokojowej przez 10 minut i wirować przy 12,0 x g przez 10 minut w temperaturze 4 ° C.
  12. odlać supernatant i przemyć osad 1 mL 75% etanolu poprzez wirowanie przy 7,50 x g przez 5 minut w temperaturze 4 ° C.
  13. wysuszyć osad w temperaturze pokojowej do czasu odparowania etanolu.
  14. zawiesić w wodzie wolnej od RNaz.
  15. ilościowo oznaczyć i określić stopień czystości próbek za pomocą spektrofotometrii absorpcyjnej przy długościach fal 260 nm i 280 nm. Określić czystość RNA i użyć próbek o stosunku czystości (A260/280) wynoszącym około 2,0.
  16. przechowywać próbki w temperaturze -80 ° C.
  17. przeprowadzić reakcję RT-PCR zgodnie z protokołem producenta17.
    UWAGA: W zależności od celu badania należy wybrać odpowiednie markery do oceny.

8. Ocena funkcji komórek poprzez identyfikację białek

UWAGA: W zależności od celu badania należy wybrać konkretne białka do oceny. Jako przykład przedstawiono sjaloproteinę dentynową (DSP) jako białko istotne dla oceny aktywności odontoblastów. Inne istotne białka zostały wymienione w Tabeli 1.

  1. Hodować komórki na szkiełkach nakrywkowych i poddać działaniu ekstraktów zgodnie z wcześniejszym opisem.
  2. Przemyć hodowle komórkowe PBS.
  3. Utrwalić 3,7% paraformaldehydem przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
  4. Przemyć dwukrotnie PBS.
  5. Permeabilizować 0,5% Tritonem w PBS przez 15 minut.
  6. Zablokować peroksydazę 0,3% nadtlenkiem wodoru w PBS przez 5 minut.
  7. Przemyć dwukrotnie PBS.
  8. Przemyć dwukrotnie 0,5% albuminą surowicy bydlęcej (BSA).
  9. Zablokować hodowle komórkowe 2% BSA przez 45 minut.
  10. Przemyć 0,5% BSA w PBS.
  11. Inkubować hodowle z przeciwciałem pierwszorzędowym odpowiednim dla wybranego białka przez 60 minut w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: W tym protokole zastosowano przeciwciało pierwszorzędowe DSP(M20) Antibody (1:10) oraz przeciwciało wtórne Polyclonal Rabbit Anti-goat immunoglobulins/HRP (1:10).
  12. Przemyć pięciokrotnie 0,5% BSA w PBS.
  13. Inkubować z przeciwciałem wtórnym przez 90 minut w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Rozcieńczenia przeciwciał należy przygotować w 0,5% BSA w PBS.
  14. Przemyć pięciokrotnie 0,5% BSA w PBS, poświęcając 1 minutę na każde płukanie.
  15. Inkubować hodowle z mieszaniną substratu i chromogenu w stężeniu 20 µL chromogenu/mL substratu przez 25 minut.
  16. Przemyć dwukrotnie 0,5% BSA w PBS.
  17. Przeciwbarwić hematoksyliną przez 15 minut.
  18. Przemyć kolejno 0,037 mol/L amoniakiem i wodą destylowaną przez 5 minut w celu usunięcia nadmiaru barwnika.
  19. Zamontować szkiełka nakrywkowe na preparatach. Jako medium montażowe zastosować glicerol.
  20. Pozostawić do wyschnięcia przez noc.
  21. Obejrzeć pod mikroskopem. Wykonać fotografie przy wybranym powiększeniu.

9. Ocena mineralizacji za pomocą testu Alizarin Red S

  1. Przygotować roztwór Alizarin Red S o stężeniu 40 mM18. Mieszać roztwór w celu homogenizacji przez 12 godzin w ciemności.
    UWAGA: Aby przygotować 10 mL roztworu Alizarin Red S, rozpuścić 1,4 g proszku alizaryny (masa cząsteczkowa: 360 g/mol) w wodzie ultrapurej, chroniąc przed światłem. W przypadku tego roztworu wartość pH jest krytyczna i powinna wynosić od 4,1 do 4,3.
  2. Inkubować hodowlę komórkową z ekstraktami rozpuszczalnymi, zgodnie z powyższym opisem.
  3. Przemyć hodowle komórkowe trzykrotnie buforem PBS.
  4. Utrwalić 4% paraformaldehydem przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
  5. Przemyć trzykrotnie buforem PBS.
  6. Barwić roztworem barwiącym Alizarin Red przez 20 minut w temperaturze 37 °C w ciemności.
  7. Po barwieniu przemyć płytki buforem PBS, aby usunąć nadmiar barwnika.
  8. Obejrzeć pod mikroskopem. Wykonać fotografie z wybranym powiększeniem.
  9. Do każdej studzienki dodać roztwór ekstrakcyjny, składający się z 10% (w/v) kwasu octowego i 20% (w/v) metanolu, i mieszać przez 40 minut w temperaturze pokojowej.
  10. Zmierzyć absorbancję przy długości fali 490 nm za pomocą spektrofotometru19.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Przedstawione wyniki odnoszą się do badań materiałów stomatologicznych. Opisana metoda pozwala na uzyskanie profilu cytotoksyczności oraz ocenę funkcji komórkowych po ekspozycji na materiały stomatologiczne, w tym wpływu na aktywność metaboliczną (Rycina 2), żywotność komórek, profil śmierci komórkowej i morfologię komórek (Rycina 3) oraz ekspresję określonych białek (Rycina 4).

Test MTT służy do szybkieg...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Protokół ten został opracowany z uwzględnieniem normy ISO 10993-5, która odnosi się do oceny cytotoksyczności in vitro biomateriałów, które mają kontakt z tkankami, w celu oceny biokompatybilności i wniesienia wkładu w badania odtwarzalności21. Jest to coraz większy problem w nauce i wielu autorów już stosuje się do tych zaleceń w eksperymentalnym projekcie swoich badań in vitro 15,22,23,24,25,26,27,28.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych ani innych konfliktów interesów.

Podziękowania

Dziękujemy za wsparcie: GAI 2013 (Faculdade de Medicina da Universidade de Coimbra); CIBB jest finansowany z Funduszy Krajowych za pośrednictwem FCT (Foundation for Science and Technology) w ramach Projektu Strategicznego UIDB/04539/2020 i UIDP/04539/2020 (CIBB). Dziękujemy Jacques'owi Nörowi z University of Michigan Dental School za dostarczenie linii komórkowej MDPC-23.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Absolutny etanolMerck Millipore100983
AccutaseGibcoA1110501StemPro Accutas Odczynnik do dysocjacji komórek
Przeciwciało ALDHCruz BiotechnologySC166362
Annexin V FITCBD Biosciences556547
Antybiotyk przeciwgrzybiczySigmaA5955
Test BCAThermo Scientific23225Pierce BCA Zestaw do oznaczania białek
Albumina surowicy bydlęcejSigmaA9418
CaCl2Sigma10035-04-8
Przeciwciało CD133Miteny Biotec293C3-APCPrzeciwciało allofikocyjaniny (APC)
CD24BD Biosciences658331Allofikocyjanina-H7 (APC-H7)
CD44 przeciwciałoBiolegend103020Pacific Blue (PB)
Sitko do komórekBD Falcon35234040 µ M
Kolagenaza, typ IVGibco17104-019
cOmplete MiniRoche118 361 700 0
DAB + ChromogenDakoK3468
DithiothreitolSigma43815
DMEM-F12SigmaD8900
DNAse IRoche11284932001
DSP (M-20) Przeciwciało, 1: 100Santa Cruz BiotechnologyLS-C20939
ECC-1ATCCCRL-2923Ludzka linia komórkowa gruczolakoraka endometrium
Naskórkowy czynnik wzrostuSigmaE9644
Hepes 0,01 MSigmaMFCD00006158
Czynnik wzrostu fibroblastów podstawowySigmaF0291
Giemsa Stain, zmodyfikowany GS-500SigmaMFCD00081642
GlycerolDakoC0563
HemocytometrVWRHERE1080339
HCC1806ATCCCRL-2335Ludzka linia komórkowa raka płaskonabłonkowego sutka
Insulina, transferyna, roztwór selenuGibco41400045
May-Grü nwald Stain MG500SigmaMFCD00131580
MCF7ATCCHTB-22Ludzka linia komórkowa gruczolakoraka sutka
MetylocelulozaAlfaAesar45490
NaClJMGS37040005002212
Poliklonalne króliki Immunoglobuliny przeciwkozie / HRP, 1: 100DakoG-21234
Poli(2-hydroksyetylometakrylanSigmaP3932
PutrescynaSigmaP7505
RL95-2ATCCCRL-1671Linia komórkowa ludzkiego raka endometrium
Kwas deoksycholowy soduJMSEINECS 206-132-7
Dodecylosiarczan soduSigma436143
Bufor substratowyDako926605
TrisJMGS20360000BP152112
Triton-X 100Merck108603
Trypan niebieskiSigmaT8154
Trypsyna-EDTASigmaT4049
β -aktynaprzeciwciało SigmaA5316
Santa

Bibliografia

  1. Williams, D. F. On the mechanisms of biocompatibility. Biomaterials. 29 (20), 2941-2953 (2008).
  2. Bruinink, A., Luginbuehl, R. Evaluation of biocompatibility using in vitro methods: interpretation and limitations. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 126, 117-152 (2012).
  3. Wataha, J. C. Principles of biocompatibility for dental practitioners. The Journal of Prosthetic Dentistry. 86 (2), 203-209 (2001).
  4. Mishra, S. F. D. A. CE mark or something else?-Thinking fast and slow. Indian Heart Journal. 69 (1), 1-5 (2016).
  5. Barbeck, M., et al. Balancing Purification and Ultrastructure of Naturally Derived Bone Blocks for Bone Regeneration: Report of the Purification Effort of Two Bone Blocks. Materials. 12 (19), 3234(2019).
  6. Ruzza, P., et al. H-Content Is Not Predictive of Perfluorocarbon Ocular Endotamponade Cytotoxicity in Vitro. ACS Omega. 4 (8), 13481-13487 (2019).
  7. Coelho, C. C., Araújo, R., Quadros, P. A., Sousa, S. R., Monteiro, F. J. Antibacterial bone substitute of hydroxyapatite and magnesium oxide to prevent dental and orthopaedic infections. Materials Science and Engineering: C. 97, 529-538 (2019).
  8. Jung, O., et al. Improved In Vitro Test Procedure for Full Assessment of the Cytocompatibility of Degradable Magnesium Based on ISO 10993-5/-12. International Journal of Molecular Sciences. 20 (2), 255(2019).
  9. Ruzza, P., et al. H-Content Is Not Predictive of Perfluorocarbon Ocular Endotamponade Cytotoxicity in Vitro. ACS Omega. 4 (8), 13481-13487 (2019).
  10. ISO. I.O. for S. ISO 10993-12:2012 - part 12: Sample preparation and reference materials. ISO. , (2012).
  11. ISO. I.O. for S. ISO 10993-5:2009 Biological evaluation of medical devices - part 5: Tests for in vitro cytotoxicity. ISO. , (2009).
  12. Srivastava, G. K., et al. Comparison between direct contact and extract exposure methods for PFO cytotoxicity evaluation. Scientific Reports. 8 (1), 1425(2018).
  13. Pusnik, M., Imeri, M., Deppierraz, G., Bruinink, A., Zinn, M. The agar diffusion scratch assay--A novel method to assess the bioactive and cytotoxic potential of new materials and compounds. Scientific Reports. 6, 20854(2016).
  14. Spiller, K. L., et al. The role of macrophage phenotype in vascularization of tissue engineering scaffolds. Biomaterials. 35 (15), 4477-4488 (2014).
  15. Zhou, H., et al. In Vitro Cytotoxicity Evaluation of a Novel Root Repair Material. Journal of Endodontics. 39 (4), 478-483 (2013).
  16. Bordron, A., et al. The binding of some human antiendothelial cell antibodies induces endothelial cell apoptosis. Journal of Clinical Investigation. 101 (10), 2029-2035 (1998).
  17. Palmini, G., et al. Establishment of Cancer Stem Cell Cultures from Human Conventional Osteosarcoma. Journal of Visualized Experiments. (116), e53884(2016).
  18. Gregory, C. A., Grady Gunn, W., Peister, A., Prockop, D. J. An Alizarin red-based assay of mineralization by adherent cells in culture: comparison with cetylpyridinium chloride extraction. Analytical Biochemistry. 329 (1), 77-84 (2004).
  19. Cai, S., Zhang, W., Chen, W. PDGFRβ+/c-kit+ pulp cells are odontoblastic progenitors capable of producing dentin-like structure in vitro and in vivo. BMC Oral Health. 16 (1), 113(2016).
  20. Paula, A., et al. Biodentine Boosts, WhiteProRoot MTA Increases and Life Suppresses Odontoblast Activity. Materials. 12 (7), 1184(2019).
  21. Chander, N. G. Standardization of in vitro studies. Journal of Indian Prosthodontic Society. 16 (3), 227-228 (2016).
  22. Cavalcanti, B. N., Rode de M, S., França, C. M., Marques, M. M. Pulp capping materials exert an effect on the secretion of IL-1β and IL-8 by migrating human neutrophils. Brazilian Oral Research. 25 (1), 13-18 (2011).
  23. Chang, S., Lee, S. Y., Ann, H. J., Kum, K. Y., Kim, E. C. Effects of calcium silicate endodontic cements on biocompatibility and mineralization-inducing potentials in human dental pulp cells. Journal of Endodontics. 40 (8), 1194-1200 (2014).
  24. Daltoé, M. O., Paula-Silva, F. W. G., Faccioli, L. H., Gatón-Hernández, P. M., De Rossi, A., Bezerra Silva, L. A. Expression of Mineralization Markers during Pulp Response to Biodentine and Mineral Trioxide Aggregate. Journal of Endodontics. 42 (4), 596-603 (2016).
  25. Elias, R. V., Demarco, F. F., Tarquinio, S. B. C., Piva, E. Pulp responses to the application of a self-etching adhesive in human pulps after controlling bleeding with sodium hypochlorite. Quintessence International. 38 (2), 67-77 (2007).
  26. Huang, G. T. J., Shagramanova, K., Chan, S. W. Formation of odontoblast-like cells from cultured human dental pulp cells on dentin in vitro. Journal of endodontics. 32 (11), 1066-1073 (2006).
  27. Jafarnia, B., et al. Evaluation of cytotoxicity of MTA employing various additives. Oral Surgery, Oral Medicine, Oral Pathology, Oral Radiology, and Endodontology. 107 (5), 739-744 (2009).
  28. Paranjpe, A., Smoot, T., Zhang, H., Johnson, J. D. Direct contact with mineral trioxide aggregate activates and differentiates human dental pulp cells. Journal of Endodontics. 37 (12), 1691-1695 (2011).
  29. Spagnuolo, G., et al. In vitro cellular detoxification of triethylene glycol dimethacrylate by adduct formation with N-acetylcysteine. Dental Materials. 29 (8), 153-160 (2013).
  30. Murray, P. E., García Godoy, C., García Godoy C, F. How is the biocompatibilty of dental biomaterials evaluated. Medicina Oral, Patologia Oral y Cirugia Bucal. 12 (3), 258-266 (2007).
  31. Hanks, C. T., Wataha, J. C., Sun, Z. In vitro models of biocompatibility: a review. Dental Materials. 12 (3), 186-193 (1996).
  32. Eid, A. A., et al. In Vitro Biocompatibility and Oxidative Stress Profiles of Different Hydraulic Calcium Silicate Cements. Journal of Endodontics. 40 (2), 255-260 (2014).
  33. Nocca, G., et al. Effects of ethanol and dimethyl sulfoxide on solubility and cytotoxicity of the resin monomer triethylene glycol dimethacrylate. Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 100 (6), 1500-1506 (2012).
  34. Abuarqoub, D., Aslam, N., Jafar, H., Abu Harfil, Z., Awidi, A. Biocompatibility of Biodentine with Periodontal Ligament Stem Cells: In Vitro Study. Dentistry Journal. 8 (1), 17(2020).
  35. Coelho, A. S., et al. Cytotoxic effects of a chlorhexidine mouthwash and of an enzymatic mouthwash on human gingival fibroblasts. Odontology. 108 (2), 260-270 (2020).
  36. Wang, M. O., et al. Evaluation of the In Vitro Cytotoxicity of Cross-Linked Biomaterials. Biomacromolecules. 14 (5), 1321-1329 (2013).
  37. Tyliszczak, B., Drabczyk, A., Kudłacik-Kramarczyk, S., Bialik-Wąs, K., Sobczak-Kupiec, A. In vitro cytotoxicity of hydrogels based on chitosan and modified with gold nanoparticles. Journal of Polymer Research. 24 (10), 153(2017).
  38. Widbiller, M., et al. Three-dimensional culture of dental pulp stem cells in direct contact to tricalcium silicate cements. Clinical Oral Investigations. 20 (2), 237-246 (2016).
  39. Pintor, A. V. B., et al. In Vitro and In Vivo Biocompatibility of ReOss in Powder and Putty Configurations. Brazilian Dental Journal. 29 (2), 117-127 (2018).
  40. Pellissari, C. V. G., et al. In Vitro Toxic Effect of Biomaterials Coated with Silver Tungstate or Silver Molybdate Microcrystals. Journal of Nanomaterials. 2020, 1-9 (2020).
  41. Collado-González, M., et al. Cytotoxicity and bioactivity of various pulpotomy materials on stem cells from human exfoliated primary teeth. International Endodontic Journal. 50, 19-30 (2017).
  42. Paula, A., et al. Direct Pulp Capping: Which is the Most Effective Biomaterial? A Retrospective Clinical Study. Materials. 12 (20), 3382(2019).
  43. Williams, D. F. There is no such thing as a biocompatible material. Biomaterials. 35 (38), 10009-10014 (2014).
  44. Schuh, J. C. L. Medical device regulations and testing for toxicologic pathologists. Toxicologic Pathology. 36 (1), 63-69 (2008).
  45. Pizzoferrato, A., et al. Cell culture methods for testing Biocompatibility. Clinical Materials. 15 (3), (1994).
  46. Pereira Paula, A. B., et al. Direct pulp capping: what is the most effective therapy? - review and meta-analysis. Journal of Evidence Based Dental Practice. , (2018).
  47. Caiaffa, K. S., et al. Effect of analogues of cationic peptides on dentin mineralization markers in odontoblast-like cells. Archives of Oral Biology. 103, 19-25 (2019).
  48. Fujiwara, S., Kumabe, S., Iwai, Y. Isolated rat dental pulp cell culture and transplantation with an alginate scaffold. Okajimas Folia Anatomica Japonica. 83 (1), 15-24 (2006).
  49. Nakashima, M., et al. Stimulation of Reparative Dentin Formation by Ex Vivo Gene Therapy Using Dental Pulp Stem Cells Electrotransfected with Growth/differentiation factor 11 (Gdf11). Human Gene Therapy. 15 (11), 1045-1053 (2004).
  50. Narayanan, K., et al. Differentiation of embryonic mesenchymal cells to odontoblast-like cells by overexpression of dentin matrix protein 1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (8), 4516-4521 (2001).
  51. Kim, H. J., Yoo, J. H., Choi, Y., Joo, J. Y., Lee, J. Y., Kim, H. J. Assessing the effects of cyclosporine A on the osteoblastogenesis, osteoclastogenesis, and angiogenesis mediated by the human periodontal ligament stem cells. Journal of Periodontology. , (2019).
  52. Bou Assaf, R., et al. Healing of Bone Defects in Pig's Femur Using Mesenchymal Cells Originated from the Sinus Membrane with Different Scaffolds. Stem Cells International. , (2019).
  53. He, W., et al. Lipopolysaccharide enhances decorin expression through the toll-like receptor 4, myeloid differentiating factor 88, nuclear factor-kappa B, and mitogen-activated protein kinase pathways in odontoblast cells. Journal of Endodontics. 38 (4), 464-469 (2012).
  54. Xiong, Y., et al. Wnt Production in Dental Epithelium Is Crucial for Tooth Differentiation. Journal of Dental Research. 98 (5), 580-588 (2019).
  55. Haruyama, N., et al. Genetic evidence for key roles of decorin and biglycan in dentin mineralization. Matrix Biology. 28 (3), 129-136 (2009).
  56. Sreenath, T., et al. Dentin Sialophosphoprotein Knockout Mouse Teeth Display Widened Predentin Zone and Develop Defective Dentin Mineralization Similar to Human Dentinogenesis Imperfecta Type III. Journal of Biological Chemistry. 278 (27), 24874-24880 (2003).
  57. Yang, Y., Zhao, Y., Liu, X., Chen, Y., Liu, P., Zhao, L. Effect of SOX2 on odontoblast differentiation of dental pulp stem cells. Molecular Medicine Reports. 16 (6), 9659-9663 (2017).
  58. Tao, H., et al. Klf4 Promotes Dentinogenesis and Odontoblastic Differentiation via Modulation of TGF-β Signaling Pathway and Interaction With Histone Acetylation. Journal of Bone and Mineral Research. 34 (8), 1502-1516 (2019).
  59. Massa, L. F., Ramachandran, A., George, A., Arana-Chavez, V. E. Developmental appearance of dentin matrix protein 1 during the early dentinogenesis in rat molars as identified by high-resolution immunocytochemistry. Histochemistry and Cell Biology. 124 (3-4), 197-205 (2005).
  60. Hao, J., Zou, B., Narayanan, K., George, A. Differential expression patterns of the dentin matrix proteins during mineralized tissue formation. Bone. 34 (6), 921-932 (2004).
  61. Tompkins, K., Alvares, K., George, A., Veis, A. Two related low molecular mass polypeptide isoforms of amelogenin have distinct activities in mouse tooth germ differentiation in vitro. Journal of Bone and Mineral Research. 20 (2), 341-349 (2005).
  62. Zhai, Y., et al. Activation and Biological Properties of Human β Defensin 4 in Stem Cells Derived From Human Exfoliated Deciduous Teeth. Frontiers in Physiology. 10, (2019).
  63. Bègue-Kirn, C., Ruch, J. V., Ridall, A. L., Butler, W. T. Comparative analysis of mouse DSP and DPP expression in odontoblasts, preameloblasts, and experimentally induced odontoblast-like cells. European Journal of Oral Sciences. 106, 254-259 (1998).
  64. Kikuchi, H., Suzuki, K., Sakai, N., Yamada, S. Odontoblasts induced from mesenchymal cells of murine dental papillae in three-dimensional cell culture. Cell and Tissue Research. 317 (2), 173-185 (2004).
  65. Li, X., Yang, G., Fan, M. Effects of homeobox gene distal-less 3 on proliferation and odontoblastic differentiation of human dental pulp cells. Journal of Endodontics. 38 (11), 1504-1510 (2012).
  66. Chen, S., et al. Differential regulation of dentin sialophosphoprotein expression by Runx2 during odontoblast cytodifferentiation. Journal of Biological Chemistry. 280 (33), 29717-29727 (2005).
  67. Narayanan, K., Gajjeraman, S., Ramachandran, A., Hao, J., George, A. Dentin matrix protein 1 regulates dentin sialophosphoprotein gene transcription during early odontoblast differentiation. Journal of Biological Chemistry. 281 (28), 19064-19071 (2006).
  68. Buchaille, R., Couble, M. L., Magloire, H., Bleicher, F. A substractive PCR-based cDNA library from human odontoblast cells: identification of novel genes expressed in tooth forming cells. Matrix Biology. 19 (5), 421-430 (2000).
  69. Miyazaki, T., Baba, T., Mori, T., Komori, T. Collapsin Response Mediator Protein 1, a Novel Marker Protein for Differentiated Odontoblasts. Acta Histochemica et Cytochemica. 51 (6), 185-190 (2018).
  70. Yokoi, M., Kuremoto, K., Okada, S., Sasaki, M., Tsuga, K. Effect of attenuation of fibroblast growth factor receptor 2b signaling on odontoblast differentiation and dentin formation. In Vitro Cellular and Developmental Biology - Animal. 55 (3), 211-219 (2019).
  71. Tohma, A., et al. Glucose Transporter 2 and 4 Are Involved in Glucose Supply during Pulpal Wound Healing after Pulpotomy with Mineral Trioxide Aggregate in Rat Molars. Journal of Endodontics. , (2019).
  72. Sueyama, Y., Kaneko, T., Ito, T., Kaneko, R., Okiji, T. Implantation of Endothelial Cells with Mesenchymal Stem Cells Accelerates Dental Pulp Tissue Regeneration/Healing in Pulpotomized Rat Molars. Journal of Endodontics. 43 (6), 943-948 (2017).
  73. Petersson, U., Hultenby, K., Wendel, M. Identification, distribution and expression of osteoadherin during tooth formation. European Journal of Oral Sciences. 111 (2), 128-136 (2003).
  74. Couble, M. L., et al. Immunodetection of osteoadherin in murine tooth extracellular matrices. Histochemistry and Cell Biology. 121 (1), 47-53 (2004).
  75. Buchaille, R., Couble, M. L., Magloire, H., Bleicher, F. Expression of the small leucine-rich proteoglycan osteoadherin/osteomodulin in human dental pulp and developing rat teeth. Bone. 27 (2), 265-270 (2000).
  76. Salmon, B., et al. Abnormal osteopontin and matrix extracellular phosphoglycoprotein localization, and odontoblast differentiation, in X-linked hypophosphatemic teeth. Connective Tissue Research. 55, SUPPL. 1 79-82 (2014).
  77. Liao, C., Ou, Y., Wu, Y., Zhou, Y., Liang, S., Wang, Y. Sclerostin inhibits odontogenic differentiation of human pulp-derived odontoblast-like cells under mechanical stress. Journal of Cellular Physiology. 234 (11), 20779-20789 (2019).
  78. Deng, X., et al. The combined effect of oleonuezhenide and wedelolactone on proliferation and osteoblastogenesis of bone marrow mesenchymal stem cells. Phytomedicine. 153103, (2019).
  79. Choi, H., Kim, T. H., Yun, C. Y., Kim, J. W., Cho, E. S. Testicular acid phosphatase induces odontoblast differentiation and mineralization. Cell and Tissue Research. 364 (1), 95-103 (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Cytotoksyczno biomateria wtest MTTtest sulforodaminy Bcytometria przep ywowabarwienie metod May Gr nwalda Giemsyimmunocytochemiaanaliza PCRbarwienie alicynow czerwienimorfologia kom rkowaekspresja bia ek
Dostęp do cytotoksyczności i odpowiedzi komórek na biomateriały
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.