Uzyskiwanie pierwotnych osteocytów poprzez mysie frakcjonowanie kalwaryjne osteocytów eksprymujących GFP

Podsumowanie

Ten protokół opisuje rozbiór kalwarii myszy dmp1-topaz u noworodków i izolację osteocytów wyrażających białko zielonej fluorescencji poprzez trawienie i frakcjonowanie komórek, a także przygotowanie osteocytów do sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS).

Streszczenie

Osteocyt, kiedyś uważany za pasywnego mieszkańca kości, ze względu na funkcję wykrywania obciążenia mechanicznego za kulisami, teraz znalazł się w centrum uwagi i wykazano, że pełni wiele głównych funkcji, takich jak aktywne modyfikowanie macierzy zewnątrzkomórkowej i tworzenie narządu endokrynnego z systemem lacunocanalicular system, który go otacza, wysyłając wiadomości do odległych miejsc. Dzięki metodom, które umożliwiły badanie osteocytów in vitro od wyizolowania pierwotnych osteocytów do linii komórkowych podobnych do osteocytów, osteocyty cieszą się obecnie ogromnym zainteresowaniem i gwałtownym wzrostem wiedzy na temat budowy i funkcji. Wiele aspektów biologii osteocytów i interakcji z innymi składnikami molekularnymi nie zostało jeszcze odkrytych. W tym protokole szczegółowo opisujemy skuteczną izolację pierwotnych osteocytów z kalwarii noworodków myszy dmp1-topaz, które wyrażają zielone białko fluorescencyjne w osteocytach, poprzez frakcjonowanie komórek, a następnie pozyskiwanie kultur pierwotnych osteocytów przez FACS.

Wprowadzenie

Osteocyty to ostatecznie zróżnicowane komórki z komórek progenitorowych osteoblastów, które zostały osadzone w ich wydzielanej macierzy¹. Są to najliczniejsze i najdłużej żyjące komórki wśród populacji komórek kostnych. Znajdują się w lukach i mają charakterystyczną morfologię gwiaździstą z dendrytami, które rozciągają się przez kanały zwane kanalikami, tworząc rozległą sieć komunikacji i wymiany metabolicznej z otaczającym je środowiskiem i powierzchnią kości². Osteocyty odgrywają zarówno rolę osteoblastów, jak i osteoklastów w przebudowie kości, są podstawowymi komórkami mechanosensorycznymi nadającymi adaptację do obciążenia mechanicznego³, biorą udział w homeostazie fosforanów⁴ i mineralizacji macierzy kostnej⁵, a wraz z układem lacunokanicznym działają jako narząd dokrewny sygnalizujący odległe tkanki⁶.

Osteocyty znajdują się w zmineralizowanej matrycy, co ogranicza dostępność i utrudnia ich izolację, utrudniając tym samym badania in vitro. Jedna z pierwszych metod izolacji opisywała izolowane osteocyty z kalwarii kurczaka przy użyciu przeciwciała monoklonalnego specyficznego dla osteocytów (OB7.3)⁷, które później okazało się być ptasim wariantem PHEX (gen regulujący PHosphate, z homologią do endopeptydaz na chromosomie X)⁸. Inni badacze zastosowali sekwencyjne trawienie szczurów⁹ lub mouse¹⁰ długich kości, aby uzyskać frakcje bogate w osteocyty, w których czystość osteocytów wynosiła około 70%⁹. Ograniczenia tej procedury obejmują nieoptymalną czystość kultur zanieczyszczonych innymi typami komórek poza osteocytami oraz to, że osteocyty mogą być potencjalnie przerastane przez inne komórki w hodowli, ponieważ osteocyty utraciły zdolność do podziału. Wyzwania te ograniczają użyteczność kultur długoterminowych.

Aby przezwyciężyć te ograniczenia, stworzono różne linie komórkowe osteocytów. MLO-Y4 cell line¹¹ i MLO-A5 cell line¹² są w szczególności najczęściej badanymi liniami komórkowymi, które są przydatne do badania osteocytów we wczesnym stadium; jednak są one mniej przydatne do badania sygnalizacji dojrzałych osteocytów, ponieważ wyrażają niskie poziomy sklerostyny i FGF23¹³, z których oba są dojrzałymi markerami osteocytów. Inne linie komórkowe, w tym IDG-SW3¹⁴ i Ocy454¹⁵, wyrażają wysoki poziom sklerostyny i FGF23 i są przydatne w badaniu późnego stadium osteocytów. Linie komórkowe okazują się użytecznymi narzędziami badawczymi; Niemniej jednak nie są one pozbawione ograniczeń, ponieważ nie reprezentują w pełni biologii komórki pierwotnej. Różne linie komórkowe reprezentują różne etapy rozwoju spektrum dojrzałości osteocytów, a linie komórkowe nie reprezentują heterogeniczności pierwotnych osteocytów^16,17.

Aby uzyskać czyste kultury pierwotnych osteocytów, badacze wykorzystali mysi model cre, w którym 8-kb promotor dmp1 jest używany do napędzania ekspresji białka zielonej fluorescencji (GFP) w osteocytach^18,19. Podwójne myszy transgeniczne (pOB-Col 2.3-GFP-cyjan i DMP1-GFP-topaz) autorstwa Paic et al.¹⁹ i transgeniczne myszy dmp1-topaz autorstwa Nakashima et al.²⁰ zostały wykorzystane do uzyskania populacji osteocytów. W którym zastosowali sekwencyjne trawienie i FACS osteocytów eksprymujących GFP, aby uzyskać kultury pierwotnych osteocytów^19,20. Wykazano, że kierunek cre w 10-kb myszy reporterowej dmp1 Ai9, która aktywuje białko tdTomato, jest obecny w osteocytach, osteoblastach, mięśniach i komórkach szpiku kostnego. Promotor dmp1 8 kb miał ten sam wzorzec ekspresji, ale tylko część osteoblastów i komórek szpiku kostnego wyrażała białko, co wskazuje, że promotor dmp1 8 kb jest bardziej specyficzny²¹. Mimo to wyniki uzyskane przy użyciu promotora dmp1 8 kb powinny być interpretowane z ostrożnością, a profile ekspresji genów powinny być rutynowo przeprowadzane przy użyciu markerów specyficznych dla osteocytów i osteoblastów, aby zapewnić, że uzyskana populacja ma wystarczająco wysoką czystość.

Markery osteoklastów OSCAR i Dcstamp zostały znalezione w populacjach hematopoetycznych osteocytów niezubożonych i zubożonych, to odkrycie doprowadziło autorów do wniosku, że trawy uzyskane z frakcjonowania kalwarii noworodkowej 8-kb DMP1-Topaz i sortowania GFP są zanieczyszczone komórkami hematopoetycznymi. Zanieczyszczenie komórkami hematopoetycznymi można było złagodzić, zacieśniając bramkę sortowania GFP, ponieważ komórki krwiotwórcze GFP-dodatnie miały znacznie niższą intensywność GFP niż komórki mezenchymalne (osteocyty) GFP-dodatnie²².

Metody badania osteocytów in vitro przyczyniły się do powstania ostatnio bogatej informacji na temat biologii osteocytów. Jednak izolacja osteocytów pozostaje pracochłonną i długotrwałą procedurą o niskiej wydajności komórek. Opisana metoda trawienia kości z użyciem kolagenazy i EDTA, często do frakcji 8²³, zajmuje kilka godzin, w których żywotność osteocytów jest obciążona. Naukowcy poinformowali o użyciu frakcji (2\u20125) do sortowania komórek²⁰ i wykazali, że profil ekspresji genów związanych z osteocytami w porównaniu z profilami osteoblastów potwierdza sukces izolacji populacji czystych osteocytów²⁰. W artykule opisano proces otrzymywania frakcji (2\u20125) oraz porównano wydajność osteocytów z każdej frakcji począwszy od frakcji 1 do 8, aby określić zwrot osteocytów w każdej frakcji. Opisano również preparację nowonarodzonej kalwarii myszy dmp1-topaz i trawienie kalwaryczne za pomocą kolagenazy i kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA), a także przygotowanie komórek do FACS.

Protokół

Wszystkie procedury i opieka nad zwierzętami zostały przeprowadzone zgodnie z zasadami i przepisami Uniwersytetu Tohoku.

1. Sekcja nowonarodzonej kalwarii myszy dmp1-topaz

1. Do tego protokołu użyj 6\u20127-dniowych szczeniąt myszy C57BL/6-Tg(Dmp1-Topaz)1Ikal/J. Poddaj myszy eutanazji za pomocą 5% inhalacji izofluranu, a następnie przenieś młode do 70% etanolu.
2. Przenieś uśpione szczenię do niepoddanego działaniu substancji miski hodowlanej.
3. Za pomocą nożyczek i pęsety chwyć skórę u podstawy czaszki i wykonaj nacięcie.
4. Używając pierwszego nacięcia jako punktu wyjścia, naciąć po obu bocznych stronach czaszki przed uszami, usunąć skórę i odsłonić kalwarię.
5. Przytrzymaj głowę od grzbietu nosa i przetnij kalwarię wzdłuż szwu lambdoidalnego. Wytnij wzdłuż bocznych krawędzi kości ciemieniowych i przedłuż go, aby objął część czołową.
6. Oddziel kalwarię od leżącej pod nią tkanki mózgowej.
   UWAGA: Aby zapewnić czystą kalwarię kostną z minimalnym przyczepem tkanek miękkich, nie należy wcinać się głęboko w kość; Dla porównania, powinno być w stanie zobaczyć cień nożyczek pod kością.
7. Przenieś kalwarię do soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS, pH 7,4 w całym protokole). Upewnij się, że wklęsła część jest skierowana do góry.

2. Frakcjonowanie nowonarodzonej kalwarii myszy

1. Przenieść do 5 kalwarii do stożkowej probówki o pojemności 50 ml zawierającej 5 ml roztworu kolagenazy o stężeniu 2 mg/ml. Użyj świeżego roztworu kolagenazy przygotowanego tuż przed użyciem.
   1. Aby przygotować świeży roztwór kolagenazy, dodaj proszek kolagenazy do buforu izolacyjnego (70 mM NaCl, 10 mM NaHCO₃, 60 mM sorbitolu, 3 mM K₂HPO₄, 1 mM CaCl₂, 1 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej (BSA), 5 mg/ml glukozy i 25 mM HEPES) w stężeniu 2 mg/ml. Rozpuść proszek kolagenazy na mieszadle magnetycznym.
   2. Przepuść roztwór kolagenazy przez sterylny filtr 0,22 μm do probówki o pojemności 50 ml i utrzymuj go na lodzie przez cały czas trwania protokołu.
2. Inkubować kalwarię w temperaturze 37 °C przez 20 minut na wytrząsarce z prędkością 300 obr./min, aby uzyskać frakcję 1.
3. Odrzucić wytrawienie frakcji 1, przemyć kalwarię 5 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i wyrzucić płukanie.
4. Inkubować kalwarię w 5 ml 5 ml kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) zawierającego 1 mg/ml BSA w PBS, pH 7,4 w temperaturze 37 °C przez 15 minut na wytrząsarce przy 300 obr./min.
5. Zebrać trawienie w stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Umyj kalwarię 5 ml PBS i dodaj roztwór do płukania do roztworu do trawienia.
   UWAGA: Na każdym etapie zbierania trawienia i płukania należy pipetować kości w roztworze, aby oddzielić komórki od kości i zapobiec powstawaniu dubletów i agregacji komórek.
6. Aby uzyskać frakcję 2, odwirować trawienie przy 300 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut. Wyrzucić supernatant, ponownie zawiesić osad w 8 ml α-Minimum Essential Medium (MEM) zawierającego 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 100 j.m./ml penicyliny G i 100 μg/ml streptomycyny. Nasiona na 10 cm naczyniu hodowlanym. Inkubować frakcję 2 w temperaturze 37 °C w temperaturze 5% CO_{2 .}
7. Inkubować kalwarię w 5 ml roztworu kolagenazy w temperaturze 37 °C przez 20 minut na wytrząsarce z prędkością 300 obr./min.
8. Aby zebrać ułamek 3, powtórz kroki 2.5\u20122.6. Inkubować frakcję 3 w temperaturze 37 °C w temperaturze poniżej 5% CO₂,
   UWAGA: W tym momencie kości staną się mniejsze i zostaną zredukowane do fragmentów. Aby upewnić się, że żadne kości nie zostaną przypadkowo zassane do trawien, co prowadzi do utraty komórek w tym procesie, użyj pipety z małą końcówką do zbierania trawionych składników (końcówki do pipet 1000\2012200 μl).
9. Inkubować kalwarię w 5 ml roztworu kolagenazy w temperaturze 37 °C przez 20 minut na wytrząsarce z prędkością 300 obr./min.
10. Aby zebrać ułamek 4, powtórz kroki 2.5\u20122.6. Inkubować frakcję 4 w temperaturze 37 °C w temperaturze 5% CO₂ .
11. Inkubować kalwarię w 5 ml 5 mM EDTA zawierającego 1 mg/ml BSA w PBS (pH 7,4) w temperaturze 37 °C przez 15 minut na wytrząsarce przy 300 obr./min.
12. Aby zebrać ułamek 5, powtórz kroki 2.5\u20122.6. Inkubować frakcję 5 w temperaturze 37 °C w temperaturze 5% CO_{2 .} Osteocyty można przygotować do sortowania tego samego dnia lub hodować do 24 godzin przed sortowaniem.

3. Przygotowanie osteocytów do sortowania komórek aktywowanych fluorescencją

1. Odessać pożywkę z każdej frakcji komórkowej i delikatnie przemyć dwukrotnie 10 ml PBS.
2. Dodać 5 ml 0,5% trypsyny-EDTA do PBS i inkubować komórki przez 5 minut w temperaturze 37 °C. Dodać 5 ml 10% FBS α-MEM i delikatnie odpipetować, aby delikatnie odłączyć komórki. Połącz komórki w każdej frakcji, przesiewając przez sitko o wielkości 40 μm do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.
3. Umyj komórki 10 ml PBS i zbierz, przesiewając przez sitko o wielkości 40 μm do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Odwirować komórki w temperaturze 300 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut.
4. Odessać supernatant i dodać 10% FBS α-MEM do osadu. Dostosuj stężenie komórek do około 1 x 10⁷ komórek/ml.
5. Przefiltruj komórki w tubie z nylonową siatką o grubości 35 μm. Ogniwa są teraz gotowe do FACS.
6. W przypadku tego protokołu użyj dyszy o rozmiarze 100 μm. Płyn zbierający powinien składać się w 10% z FBS α-MEM. Sortowaną próbkę należy utrzymywać po wymieszaniu i w temperaturze 4 °C przez cały czas sortowania, jeśli to możliwe.
7. Przed sortowaniem zoptymalizuj bramkowanie w celu usunięcia artefaktów i komórek, dostosowując obszar rozproszenia bocznego (SSC) i obszar rozproszenia do przodu (FSC). Wyeliminuj dublety, dostosowując szerokość SSC do wysokości SSC i obszar FSC do szerokości FSC. Osteocyty GFP-ujemne powinny być używane jako kontrola w celu dostosowania parametrów przyrządu sortującego.
8. Po zakończeniu pobierania komórek odwirować komórki w temperaturze 300 x g w temperaturze 4 °C przez 10 minut. Umyć komórki PBS. Odwirować komórki w temperaturze 300 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut.
9. Ponownie zawieś komórki i dostosuj ich liczbę zgodnie z potrzebami, używając 10% FBS α-MEM.

Wyniki

Celem niniejszego protokołu jest zaprezentowanie procesu pozyskiwania kultur pierwotnych osteocytów z czaszki noworodka myszy dmp1-topaz poprzez proces frakcjonowania z wykorzystaniem kolagenazy do degradacji macierzy kolagenowej oraz EDTA do chelatacji wapnia, po czym komórki są przygotowywane do analizy FACS w celu odseparowania osteocytów od innych populacji komórkowych.

Metody pozyskiwania pierwotnych osteocytów z czaszek noworodków myszy często opisują zastosowanie frakcji (1‒8) do sortow...

Dyskusja

Pierwszy wyizolowany osteocyt pochodził z kalwarii^{kurczaka 7} wyizolowanej przy użyciu (OB7.3) lub wariantu ptasiego PHEX; Jednak metoda ta jest ograniczona dostępnością zdolnych do działania przeciwciał, ponieważ konieczne jest wyprodukowanie przeciwciał specyficznych dla osteocytów, które są również specyficzne dla danego gatunku. Naukowcy zastosowali inną modyfikację sekwencyjnego procesu enzymatycznego w celu uzyskania osteocytów z kości długich myszy i szczurów; Deklarowaną czystość tych kultu...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Oprogramowanie BD FACSDiva	BD Biosciences		Akwizycja i analiza danych
BD Falcon Tube	BD Biosciences	352235	12 x 75 mm Probówka z nasadką sitka komórkowego, 35 μ m nylonowa siatka.
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)	Sigma-Aldrich, MO, USA
Collagenase	Wako, Osaka, Japonia	034-22363	0,2% (w/v), surowa mieszanka kolagenazy pozyskiwana z C. histolyticum.
EDTA	Dojindo, Kumamoto, Japonia		5mM EDTA przygotowany z 0,1% BSA
FACSAriaTM II	BD Biosciences
Płodowa surowica bydlęca (FBS)	Biowest, Nuaillé, Francja
Bufor			70mM NaCl, 10mM NaHCO, 60mM sorbitol, 3mM K2HPO4, 1mM CaCl2, 0,1% (w/v) BSA, 0,5% (w/v) glukozy i 25 mM HEPES
Millex Sterylny filtr	Merck Millipore, Irlandia	SLGV033RS	0,22 mln euro; m
Nylonowy sitko komórkowe	FALCON, NY, USA		40μ m
Trypsin-EDTA	Life Technologies, NY, USA		0,5% x10. rozcieńczony do x1 w PBS
α-MEM	Wako, Osaka, Japonia		Zawierający 10% płodowej surowicy bydlęcej, 100 j.m./ml penicyliny G i 100 μ g/ml streptomycyny

izolacyjny