Wykrywanie gołym okiem rzadkich mutacji punktowych w DNA

Podsumowanie

Ten protokół pozwala na identyfikację gołym okiem punktowo zmutowanego DNA w 200-krotnym nadmiarze molekuł DNA typu dzikiego, wykorzystując nanocząstki złota i mikrocząstki paramagnetyczne.

Streszczenie

Protokół opisuje test kolorymetryczny gołym okiem do wykrywania mutacji punktów somatycznych w nadmiarze DNA typu dzikiego. Przewiduje się w przyszłości zastosowanie tej metody w identyfikacji rzadkich mutacji w krążącym bezkomórkowym DNA z płynnych biopsji, co ma znaczenie w diagnostyce nowotworów i stratyfikacji pacjentów onkologicznych w celu spersonalizowanej terapii. Jako dowód słuszności koncepcji, test został zaprojektowany w celu wykrycia mutacji^{BRAF V600E} w genie BRAF, co jest ważne dla identyfikacji podgrupy pacjentów z czerniakiem, którzy mogą odnieść korzyści z terapii celowanych inhibitorami BRAF. Jednak ten test kolorymetryczny można łatwo uogólnić na inne mutacje somatyczne o znaczeniu klinicznym ze względu na zastosowanie uniwersalnych sond detekcyjnych, zapewniając tym samym duży potencjał w diagnostyce onkologicznej.

Test wykrywa 0,5% BRAF^V600E w nadmiarze BRAF^WT DNA, co odpowiada czułości niektórych komercyjnych testów instrumentalnych. Taka czułość jest klinicznie istotna dla celów diagnostycznych, umożliwiając wczesną identyfikację pacjentów wrażliwych na leki. W przeciwieństwie do komercyjnych testów opartych na PCR w czasie rzeczywistym, test ten wymaga minimalnego oprzyrządowania i przetwarzania, ponieważ można go wykonać na DNA amplifikowanym za pomocą standardowego PCR (lub technik izotermicznych) i zapewnia odczyt gołym okiem z reakcją jednoprobówkową składającą się z kilku kroków w ciągu zaledwie jednej godziny. Obecnie test jest stosowany tylko na syntetycznych próbkach DNA. Jednak te ostatnie zostały zaprojektowane tak, aby naśladować prawdziwą próbkę amplifikowaną z krążącego DNA wolnego od komórek, aby sprzyjać przełożeniu testu na diagnostykę kliniczną.

Wprowadzenie

Celem metody jest wykrycie niedostatecznie reprezentowanych mutacji punktowych w próbce DNA za pomocą minimalnie oprzyrządowanej metodologii i odczytu gołym okiem. Ostatecznym celem jest uzyskanie testu potwierdzającego słuszność zasady, odpowiedniego do przyszłych zastosowań w szybkich testach do wykrywania mutacji somatycznych w krążącym wolnym od komórek DNA (ccf-DNA) (np. z próbek biopsji krwi) do wczesnej diagnostyki i monitorowania raka¹. Mutacje somatyczne związane z rakiem stanowią ważny biomarker raka² i są obecne w niewielkiej (ale bardzo zmiennej)^{3 frakcji} ccf-DNA, co sprawia, że ich identyfikacja jest trudna⁴. Jako cel modelowy wybraliśmy mutację onkogenną BRAF^V600E, która powoduje konstytutywną aktywację kinazy BRAF. Mutacja ta jest obecna w 80% wszystkich nowotworów z mutacją BRAF ⁵ i jest ogólnie reprezentowana tylko w <1% krążącego DNA nowotworu⁶. Identyfikacja pacjentów z tą mutacją jest ważna, ponieważ pozwala przewidzieć odpowiedź terapeutyczną na inhibitory BRAF. W związku z tym opracowano kilka metod ^7,8,9,10 do oceny statusu mutacji BRAF, o czułości w zakresie od 0,01% do 2%.

Główną przewagą tej metody nad najnowocześniejszymi metodami jest to, że jej wykrywanie odbywa się bez użycia narzędzi (gołym okiem), w przeciwieństwie do instrumentalnego wykrywania cząsteczek fluorescencyjnych za pomocą PCR w czasie rzeczywistym. Kolejną zaletą jest jego skuteczność w rozróżnianiu jednej zmutowanej cząsteczki DNA w nadmiarze 200 cząsteczek DNA typu dzikiego. Ten współczynnik dyskryminacji wynoszący 0,5% jest lepszy¹¹ lub pasuje¹² niektórych zestawów laboratoryjnych lub dostępnych na rynku, opartych na wykrywaniu instrumentalnym, a zatem jest odpowiedni dla klinicznych zastosowań diagnostycznych. Z drugiej strony, jako test prototypu laboratoryjnego, metoda ta opiera się na ręcznym sterowaniu krokami wrażliwymi na temperaturę. Jednak liczba etapów i całkowity czas trwania testu są ograniczone, co sprawia, że możliwe jest jego przyszłe zastosowanie w zautomatyzowanych systemach mikroprzepływowych.

Ta metoda weryfikacji koncepcji została opracowana przy użyciu syntetycznych cząsteczek DNA. Aby można go było skutecznie przełożyć na kliniki, powinien zostać zwalidowany przy użyciu rzeczywistych próbek amplifikowanych z biopsji krwi pacjentów. Zwracamy uwagę, że przyszły obszar zastosowania tej metody nie ma na celu bezpośredniej analizy nieprzetworzonych złożonych matryc biologicznych, takich jak płyny ustrojowe. Z tego ostatniego DNA musi zostać wyekstrahowane przy użyciu standardowych metodologii, a następnie amplifikowane i oczyszczone. W związku z tym materiałem wyjściowym do analizy będzie zawsze oczyszczony i amplifikowany DNA, który jest racjonalnie porównywalny, pod względem możliwych substancji zakłócających, z syntetyczną próbką DNA, taką jak próbka wykorzystana do opracowania niniejszej metody.

Protokół

1. Synteza sond nanocząstek złota

1. Zsyntetyzuj nanocząstki złota pokryte cytrynianem o długości 40 nm, stosując dwuetapową standardową metodę wzrostu wysiewu, jak opisano poniżej.
   1. Zsyntetyzuj nanocząstki złota pokryte cytrynianem 15 nm (nasiona AuNPs) przy użyciu klasycznej metody Turkevicha-Frensa^13,14.
      1. Umyj wszystkie naczynia szklane wodą królewską (HCl:HNO₃ w stosunku 3:1 v/v).
      2. Podgrzej 250 ml 0,25 mM HAuCl₄ do wrzenia, równomiernie mieszając.
         UWAGA: HAuCl₄ jest i toksyczny.
      3. Natychmiast dodaj 25 ml 3∙citrynianu 38,8 mM Na.
      4. Kontynuuj gotowanie i mieszanie przez 30 minut, aż roztwór zmieni kolor na czerwony rubinowy.
      5. Zdejmij roztwór z ognia i pozostaw do ostygnięcia do temperatury pokojowej, mieszając.
      6. Filtrować za pomocą filtrów strzykawkowych z membraną PTFE 0,22 μm.
      7. Przechowywać w temperaturze 4 °C w szklanej butelce.
         UWAGA: W tym miejscu eksperyment można wstrzymać.
   2. Zsyntetyzuj nanocząstki złota o długości 40 nm pokryte cytrynianem (AuNPs 40 nm) poprzez wysiewanie growth¹⁵.
      1. Przygotować roztwór A: 390 μl świeżo przygotowanego 0,1 M siarczanu hydroksyloaminy z 13 ml nasion AuNP w całkowitej objętości 120 ml w H₂O.
         UWAGA: Ilość nasion AuNP potrzebna do uzyskania pożądanej wielkości może się różnić; musi być miareczkowany dla każdego nowego materiału siewnego AuNPs.
         UWAGA: Siarczan hydroksyloaminy jest, toksyczny, mutagenny i niebezpieczny dla środowiska. Do przenoszenia: Po użyciu dokładnie umyć. Zdjąć zanieczyszczoną odzież i wyprać przed ponownym użyciem. Stosować przy odpowiedniej wentylacji. Zminimalizuj wytwarzanie i gromadzenie się kurzu. Unikaj kontaktu z oczami, skórą i odzieżą. Przechowywać pojemnik szczelnie zamknięty. Unikaj wdychania pyłu. Nie używać z metalową szpatułką ani innymi metalowymi przedmiotami. Przechowywanie: Przechowywać w szczelnie zamkniętym opakowaniu. Przechowywać w chłodnym, suchym i dobrze wentylowanym miejscu, z dala od niekompatybilnych substancji. Trzymać z dala od metali.
      2. Przygotować roztwór B: 12,25 ml_H2O+ 0,25 ml 0,1 M HAuCl₄.
      3. Załadować roztwór B do strzykawki i załadować strzykawkę do pompy strzykawkowej.
      4. Ustaw parametry pompy strzykawkowej: średnica strzykawki w mm; przepływ: 90 ml/h; objętość całkowita: 10,80 ml (z czego 0,8 ml to nadmiar potrzebny do zrównoważenia systemu, tj. napełnienia probówki).
      5. Uruchomić pompę strzykawkową. Po napełnieniu rurki początkowym 0,8 ml roztworu B i przelaniu go do pojemnika na odpady, umieścić probówkę na kolbie reakcyjnej zawierającej roztwór A (utrzymywanej w umiarkowanym i równomiernym mieszaniu) i wpuścić roztwór B kroplami.
      6. Zakryj nakrętką, dodając 2,65 ml świeżo przygotowanego 0,1 M Na₃∙citrate i mieszaj przez 5 minut.
      7. Zagęścić otrzymane 40 nm AuNP przez odwirowanie w temperaturze 2,460 x g przez 18 minut w temperaturze 10 °C.
      8. Usunąć supernatant przez delikatne zasysanie. Delikatnie zawiesić w pozostałej objętości.
      9. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
         UWAGA: W tym miejscu eksperyment można wstrzymać.
2. Funkcjonalizacja nanocząstek złota pokrytych cytrynianem 40 nm za pomocą standardowej chemii tiolowej¹⁶.
   1. Trawienie wiązania dwusiarczkowego przez inkubację tiolowanych oligonukleotydów sondy (5′ T(30)–(O–CH₂–CH₂)₃–SH 3′) z 10 mM tris(2-karboksyethil)fosfiną (TCEP) w temperaturze pokojowej przez 3 godziny przy łagodnym wstrząsaniu (400 obr./min).
   2. Inkubować duży nadmiar strawionych oligonukleotydów przez noc z 10 nM AuNPs, w temperaturze pokojowej przy łagodnym wstrząsaniu (400 obr./min).
   3. Doprowadzić mieszaninę AuNPs-DNA do 0,3 M NaCl w 10 mM buforze fosforanowym o pH 7,4, 0,01% SDS, dodając sól stopniowo przez 10 godzin, pod łagodnym wstrząsaniem (400 obr./min).
   4. Inkubować przez noc w temperaturze pokojowej przy łagodnym wstrząsaniu (400 obr./min).
   5. Przemyć sprzężone z DNA AuNP 3 razy 0,25 M NaCl w 10 mM buforze fosforanowym plus 0,01% SDS, aby usunąć nadmiar niezwiązanych oligonukleotydów.
   6. Otrzymane sondy uniwersalne-AuNPs należy przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu użycia.
      UWAGA: W tym miejscu eksperyment można wstrzymać.
   7. Określ gęstość sond DNA na AuNP za pomocą komercyjnego testu opartego na fluorescencji
   8. Zmierzyć stężenie AuNP za pomocą spektroskopii UV-vis. W celu wyprowadzenia stężenia AuNPs na podstawie danych absorbancji można zastosować prawo Lamberta i Beera (A=εbc) oraz opublikowane współczynniki ekstynkcji dla 40 nm AuNPs¹⁶.
   9. Scharakteryzuj sondy AuNPs za pomocą dynamicznego rozpraszania światła (DLS) i transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM).
      UWAGA: W tym miejscu eksperyment można wstrzymać.

2. Kolorymetryczna dyskryminacja rzadkiej mutacji BRAF^V600E

1. Przygotowanie próbek docelowych do analizy: mieszaniny syntetycznego DNA BRAF^V600E i BRAF^WT DNA w różnych proporcjach (BRAF^V600E:BRAF^WT 1:10, 1:100, 1:200, BRAF^V600E 100%, BRAF^wt 100%).
2. Zrównoważyć mikrocząstki paramagnetyczne poprzez dwukrotne przemycie ich buforem hybrydyzacyjnym (HB) (1x PBS pH 7,4, 5% w/v PEG 600) i ponownie zawiesić je w objętości HB równej objętości wyjściowej. Do przemywania umieścić porcję paramagnetycznych mikrocząstek w probówce o pojemności 1,5 ml (maksymalnie 50 μl/probówkę), dodać 500 μl HB i trzykrotnie wymieszać delikatnie pipetując, nałożyć magnes, oddzielić przezroczysty supernatant, natychmiast dodać 500 μl HB i powtórzyć procedurę dla drugiego etapu płukania. Po usunięciu supernatantu należy natychmiast dodać HB, aby uniknąć wysychania kulek, zgodnie z zaleceniami producenta.
3. Dla każdej próbki, która ma być badana, należy przygotować probówkę zawierającą 2,5 μl przemytych mikrocząstek paramagnetycznych w HB.
4. Funkcjonalizacja mikrocząstek paramagnetycznych poprzez inkubację 2,5 μl mikrocząstek paramagnetycznych z 10 μl roztworu 10 μM biotynylowanej pierwszej sondy dyskryminującej (DP1), zawierającej mutację^{BRAF V600E}, przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
5. Magnetycznie oddzielić mikrocząstki od zakłócających niezwiązanych sond i ponownie je zawiesić w 12,5 μl HB. W tym celu przyłóż magnes do boku rurki i poczekaj, aż roztwór stanie się przezroczysty. Ostrożnie odpipetować roztwór, natychmiast dodać HB i delikatnie pipetować, aż kulki zostaną równomiernie ponownie zawieszone.
6. Dodać do zawiesiny 10 μl mieszaniny 10 μM docelowych próbek DNA opisanych w kroku 2.1.
7. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
8. Podczas inkubacji należy wstrząsać próbkami co 3 minuty, aby uniknąć sedymentacji mikrocząstek paramagnetycznych.
9. Dodać do zawiesiny 10 μl roztworu 2 μM drugiej sondy dyskryminującej (DP2), zaprojektowanej tak, aby zawierała porcję uzupełniającą cel i ogon poli-A.
10. Inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
11. Podczas inkubacji należy wstrząsać próbkami co 3 minuty, aby uniknąć sedymentacji mikrocząstek paramagnetycznych.
12. Magnetycznie oddzielić nadmiar DP2 po inkubacji.
13. Natychmiast dodać 300 fmol AuNP sprzężonych z sondami detencyjnymi i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
14. Oddzielić magnetycznie supernatant zawierający nadmiar AuNP i przeprowadzić 1. etap płukania, dodając 100 μl HB w temperaturze pokojowej.
15. Magnetycznie oddzielić supernatant i wykonać drugi etap płukania, dodając 100 μl HB.
16. Inkubować w temperaturze 52 °C przez 5 minut.
17. Magnetycznie oddzielony supernatant w temperaturze 52 °C.
18. Natychmiast zawiesić w 12,5 μl HB w celu odczytania wyniku kolorymetrycznego.
19. Sfotografować wyniki i przechowywać próbki w temperaturze 4 °C.

Wyniki

Ta metoda została użyta do wykrycia mutacji^{BRAF V600E} w nadmiarze syntetycznego DNA BRAF^wt. Rysunek 1 pokazuje szczegóły strategii wykrywania. Test daje wynik kolorymetryczny TAK/NIE^17,18, gdzie czerwony odpowiada wynikowi dodatniemu (TAK), a żółty negatywnemu (NO).

Krótko mówiąc, paramagnetyczne mikrocząstki streptawidynowe zostały pokryte biotynylowanymi sondami dyskryminacyjnymi (D...

Dyskusja

Kluczowym aspektem metody jest zdolność do rozróżniania docelowego DNA w kontekście nadmiaru interferującego DNA niedocelowego, gdzie DNA docelowe i niedocelowe różnią się tylko dla jednego pojedynczego nukleotydu. W związku z tym konstrukcja sond i warunki hybrydyzacji mają kluczowe znaczenie dla osiągnięcia czułej dyskryminacji. Test został zaprojektowany tak, aby wykorzystywał uniwersalne sondy kolorymetryczne, które mają być przystosowane do wykrywania dowolnych mutacji punktowych będących przedmiotem zainteresowania...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Wirówka stołowa - Allegra X 30	Beckman Coulter	A99473
DL-Dithiothreitol	Sigma-Aldrich/ Merck KGaA, Darmstadt, Niemcy	D0632-25G
Dynabeads M-280 paramagnetyczne mikrocząstki streptawidyny	Invitrogen	11205D
Siarczan hydroksyloaminy	Sigma-Aldrich/ Merck KGaA, Darmstadt, Niemcy	379913-25G
Pompa strzykawkowa KDS 100 Legacy	kdScientific	789100
Spektrofotometr NanoDrop OneC	Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA)
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami	Sigma-Aldrich/ Merck KGaA, Darmstadt, Niemcy	806552-500ML
Pierce™ TCEP-HCl, bez ważenia i handlu; Format	Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA)	A35349
Glikol polietylenowy 600	Sigma-Aldrich/ Merck KGaA, Darmstadt, Niemcy	202401
PTFE 0,22 &mikro; m filtry, Fluoropore	Millipore	FGLP04700
Quant-iT™ OliGreen&handel; Zestaw do oznaczania ssDNA	Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA)	O11492
Cytrynian sodu dwuwodny	Sigma-Aldrich / Merck KGaA, Darmstadt, Niemcy	W302600
Syntetyczne oligonukleotydy	Integrated DNA Technologies, Inc. (IDT DNA)
Kwas tetrachloroauryczny(III)	Sigma-Aldrich / Merck KGaA, Darmstadt, Niemcy	520918
Tiolowane sondy DNA z poliT	Integrated DNA Technologies, Inc. (IDT DNA)
Transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM)	Mikroskop
Zetasizer Nano S - Dynamiczny system rozpraszania światła	Malvern Panalytical

JEOL JEM 1011