Method Article

Sekwencjonowanie RNA z mikrodysekcją laserową do przestrzennej i czasowej analizy ekspresji genów specyficznych dla tkanek u roślin

DOI:

10.3791/61517

⸱

August 5th, 2020

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Animal, Plant and Soil Science, AgriBio Building, La Trobe University, 2Australian Research Council Centre of Excellence in Plant Energy Biology, La Trobe University, 3Australian Research Council Research Hub for Medicinal Agriculture, AgriBio Building, La Trobe University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prezentowany tutaj jest protokół do laserowego mikrodyparowania (LCM) tkanek roślinnych. LCM to mikroskopowa technika izolowania obszarów tkanki w sposób wolny od zanieczyszczeń. Procedura obejmuje utrwalenie tkanek, zatopienie parafiny, cięcie, ekstrakcję LCM i RNA. RNA jest wykorzystywane w dalszej, specyficznej tkankowo, czasowo rozdzielczej analizie transkryptomów.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rozwój złożonego organizmu wielokomórkowego jest regulowany przez różne typy komórek, które mają różne profile transkrypcyjne. Aby zidentyfikować transkrypcyjne sieci regulacyjne, które zarządzają procesami rozwojowymi, konieczne jest zmierzenie przestrzennych i czasowych profili ekspresji genów tych indywidualnych typów komórek. Dlatego wgląd w czasoprzestrzenną kontrolę ekspresji genów jest niezbędny do zrozumienia, w jaki sposób regulowane są procesy biologiczne i rozwojowe. W tym miejscu opisujemy metodę mikrodysekcji laserowej (LCM) w celu wyizolowania niewielkiej liczby komórek z trzech narządów zarodka jęczmienia w czasie podczas kiełkowania, po którym następuje profilowanie transkryptu. Metoda składa się z utrwalenia tkanki, przetwarzania tkanek, zatapiania parafiny, cięcia, ekstrakcji LCM i RNA, a następnie PCR w czasie rzeczywistym lub sekwencji RNA. Metoda ta umożliwiła nam uzyskanie profili przestrzennych i czasowych transkryptomów narządów nasiennych z różnej liczby komórek (od dziesiątek do setek), zapewniając znacznie większą swoistość tkankową niż typowe analizy tkanek masowych. Na podstawie tych danych byliśmy w stanie zdefiniować i porównać transkrypcyjne sieci regulacyjne, a także przewidzieć potencjalne regulacyjne czynniki transkrypcyjne dla poszczególnych tkanek. Metoda powinna mieć zastosowanie do innych tkanek roślinnych przy minimalnej optymalizacji.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rozwój i wzrost roślin obejmuje skoordynowane działanie transkrypcyjnych sieci regulacyjnych w różnych komórkach, które istnieją w złożonym środowisku komórkowym. Aby zrozumieć aktywność tych sieci regulacyjnych, potrzebujemy wiedzy na temat przestrzennej i czasowej ekspresji genów w różnych typach komórek na różnych etapach rozwoju. Jednak analizy ekspresji genów są częściej przeprowadzane w całych narządach lub dużych próbkach tkanek ze względu na wyzwanie techniczne, jakim jest izolowanie i analizowanie niewielkiej liczby komórek. Opisana przez nas metoda pozwoliła na uzyskanie przestrzennej i czasowej analizy transkryptomu specyficznego dla tkanki poprzez sprzężenie LCM z sekwencją RNA.

LCM został opracowany dwie dekady temu przez Emmert-Bucka i współpracowników1. Technika ta umożliwiła naukowcom precyzyjne odizolowanie pojedynczych komórek lub klastrów komórek od ich otoczenia za pomocą bezpośredniej wizualizacji mikroskopowej i manipulacji za pomocą lasera o wąskiej wiązce1. Od tego czasu metoda ta jest szeroko stosowana w biologii i patologii nowotworów2,3. Wiele grup badawczych zajmujących się roślinami dostosowało również LCM do stosowania z różnymi gatunkami roślin i różnymi typami tkanek4,5,6,7,8,9,10,11. Ostatnio w kilku artykułach wykorzystano również LCM na nasionach dwuliściennych i jednoliściennych do badania zarodków, bielma i innych struktur nasiennych podczas rozwoju i kiełkowania nasion10,12,13. Większość innych powszechnie stosowanych metod izolacji pojedynczych komórek, takich jak mikropipetowanie, sortowanie komórek, separacja magnetyczna i platformy mikroprzepływowe, opiera się na trawieniu enzymatycznym lub homogenizacji mechanicznej w celu dysocjacji komórek. Może to zaburzać ekspresję genów, wprowadzając artefakty techniczne, które zakłócają interpretację danych14,15. Metody te wymagają również wcześniejszej wiedzy na temat genów markerowych dla każdego typu komórki, aby powiązać zdysocjowane komórki z ich lokalizacją przestrzenną i prawdziwym typem komórki. Kolejna grupa technik opiera się na izolacji struktur subkomórkowych opartych na powinowactwie, a nie całych komórek, na przykład INTACT (Izolacja jąder oznaczonych w typach komórek) i TRAP (Translating Ribosome Affinity Purification)16,17. Jednak znakowanie powinowactwa i oczyszczanie jąder lub rybosomów jest technicznie trudne w przypadku gatunków roślin, które nie mają dobrze ugruntowanych protokołów transformacji. LCM wykorzystuje szybkie utrwalanie tkanek w celu zachowania poziomów transkryptów i konwencjonalnej identyfikacji histologicznej poprzez bezpośrednią wizualizację komórek w ich normalnym kontekście tkankowym/narządowym, co pozwala na wyizolowanie dyskretnych komórek w krótkim czasie18,19.

Przedstawiony tutaj protokół jest zoptymalizowaną metodą izolacji określonych komórek lub typów komórek z odcinków tkanek nasion zbóż, która może być zastosowana do większości komórek, które można zidentyfikować histologicznie. LCM zapewnia bezkontaktową metodę izolacji komórek, znacznie zmniejszając zanieczyszczenie i zwiększając integralność odzyskanego RNA. Co więcej, metoda ta ilustruje moc LCM w badaniach całego genomu na dużą skalę, zaczynając od małych ilości materiałów biologicznych. Opisujemy również liniową amplifikację RNA w celu wygenerowania wystarczającego materiału wejściowego do dalszych analiz transkryptu/transkryptomu.

W tym protokole sekwencyjnym LCM RNA jest dziesięć głównych etapów dla przestrzennych i czasowych transkryptomów specyficznych dla tkanki, w tym utrwalanie próbek tkanek, odwodnienie, infiltracja parafiny, osadzanie, cięcie, LCM, ekstrakcja RNA, amplifikacja RNA, kwantyfikacja RNA oraz qRT-PCR i/lub sekwencjonowanie RNA (Rysunek 1).

figure-introduction-1
Rysunek 1: Schemat blokowy LCM, a następnie sekwencja RNA lub qRT-PCR. LCM to przestrzennie precyzyjna i bezkontaktowa technika pobierania komórek z nieruchomych wycinków tkanek za pomocą wiązki laserowej pod mikroskopową wizualizacją. Proces rozpoczyna się od utrwalenia próbek tkanek, następnie odwadniania za pomocą gradientowej serii etanolu i ksylenu, a kończy się infiltracją parafiny. Proces ten można w pełni zautomatyzować za pomocą procesora tkanek. Po infiltracji parafiny tkanka jest osadzana w formie ze stopioną parafiną za pomocą stacji zatapiania. Cięcie odbywa się za pomocą mikrotomu ustawionego na żądaną grubość. Preparaty są przygotowywane, a LCM przeprowadzany bezpośrednio przed ekstrakcją RNA z wychwyconych komórek. Po ekstrakcji RNA bezpośrednio następują dwie rundy amplifikacji RNA przed qRT-PCR i/lub sekwencją RNA. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ponieważ produktem końcowym jest RNA, uważaj, aby nie zanieczyścić pracy RNazami. Noszenie rękawiczek jest koniecznością. Używaj wody uzdatnionej pirowęglanem dietylu (DEPC), itp. Autoklaw buforuje i piecz szklane naczynia przed użyciem.

1. Utrwalenie tkanek

  1. Przygotuj utrwalacz według wyboru w zależności od gatunku i rodzaju tkanki; w przypadku nasion jęczmienia użyj utrwalacza Farmera (75% etanol, 25% lodowaty kwas octowy (v/v)).
  2. Schłodzić utrwalacz na lodzie przed pobraniem tkanek.
  3. Zbierz interesujący Cię materiał roślinny i, jeśli to konieczne, pokrój go na kawałki o odpowiedniej wielkości, aby zmieściły się w wybranej formie do zatapiania. W przypadku nasion jęczmienia należy przeciąć nasiona na pół wzdłużnie, aby ułatwić penetrację roztworu utrwalającego i dopasować się do formy do zatapiania.
  4. Zanurz tkankę w co najmniej 10-krotnie większej objętości lodowatego utrwalacza. W przypadku nasion jęczmienia zanurz nasiona pokrojone na pół w utrwalaczu.
  5. Użyj infiltracji próżniowej, aby przyspieszyć penetrację utrwalacza. Tkanki powinny opaść po infiltracji próżniowej utrwalacza. W przypadku nasion jęczmienia należy zastosować 30-minutową infiltrację próżniową.
  6. Wymienić utrwalacz i inkubować w temperaturze 4 °C, aby utrwalacz mógł w pełni wniknąć w tkankę. W przypadku nasion jęczmienia próbki inkubować przez noc (~12-16 h).
    UWAGA: Cieńsze lub małe tkanki będą wymagały krótszego czasu utrwalania ze względu na większą szybkość dyfuzji utrwalacza w tkance.
  7. Usuń tkankę z utrwalacza i przenieś tkankę do kaset, a następnie rozpocznij przetwarzanie tkanki.
    UWAGA: Małe lub delikatne tkanki, takie jak tkanka liścia, można umieścić w kasetach w celu zamocowania, aby upewnić się, że nie zostanie uszkodzona podczas mocowania. Worki biopsyjne, podkładki lub owijki mogą być używane do bezpiecznego utrzymywania tkanki wewnątrz kaset podczas etapów utrwalania tkanek i przetwarzania tkanek.

2. Przetwarzanie tkanek

  1. W kroku 2 należy użyć automatycznego procesora tkanek z co najmniej 10 komorami roztworu i 2 podgrzewanymi komorami parafinowymi (patrz tabela materiałów).
  2. Sprawdzić, czy w każdej komorze znajduje się odpowiednia ilość roztworu; wymieniać roztwory po każdych kilku użyciach procesora tkankowego.
  3. Umieść kasety z chusteczką w metalowym koszu. Przymocuj metalowy kosz do uchwytu nad komorą 1. Uchwyt obróci się i "zanurzy i zanurzy" kasety w komorach, zgodnie z wyznaczonym programem.
  4. Ustaw program, wykonując kliknięcia przyciskami na panelach sterowania procesora tkankowego, które obejmują ustawienie czasu dla każdej komory.
  5. Naciśnij przycisk "Start", aby uruchomić program przetwarzania. Poniższy program jest przeznaczony do nasion jęczmienia i działa przez noc (~18 h)
    1. Przeprowadzić odwadnianie, zanurzając kasetę na 1 godzinę 30 minut w serii gradientowej etanolu (etanol 75%, 85%, 100%, 100% i 100% (v/v)).
    2. Oczyszczanie należy przeprowadzić przy użyciu gradientu etanol: ksylen przez 1 h 30 min każdy o 75:25, 50:50, 25:75 (etanol: ksylen, v/v). Następnie zanurz kasetę na 1 godzinę 30 minut w 100% ksylenie, a następnie w 100% ksylenie.
    3. Przeprowadzić infiltrację parafiny w temperaturze 55-60 °C przez 1 h 30 min dwukrotnie w stopionej parafinie.
      UWAGA: Temperaturę komór podgrzewacza parafiny można ustawić z tyłu procesora tkanek.
  6. Następnego ranka wyjmij kasety z procesora tkanek i przystąp do zatapiania parafiny.
    UWAGA: Czas programu może się różnić w zależności od typu tkanki. Próżnia i/lub mieszanie mogą być stosowane podczas przetwarzania tkanek w celu przyspieszenia infiltracji wybranych roztworów poprzez naciśnięcie przycisków "V" i/lub "mieszanie" na panelu sterowania procesora tkanek.

3. Osadzanie parafiny

  1. Na tym etapie użyj maszyny do zatapiania (patrz Tabela materiałów).
  2. Ustaw maszynę do zatapiania tak, aby włączała się co najmniej kilka godzin przed osadzaniem, aby dać czas na całkowite stopienie parafiny w zbiornikach.
  3. Przed rozpoczęciem włącz zimną płytę.
  4. Osadź próbki w formach, przytrzymując je w odpowiedniej pozycji za pomocą drobnych kleszczy i dozując stopioną parafinę do formy. Należy zapewnić właściwą orientację próbek dla każdego celu doświadczalnego. W przypadku nasion jęczmienia należy ustawić nasiona wzdłużnie w kierunku cięcia, aby uzyskać przekroje wzdłużne.
    UWAGA: Formy do zatapiania są dostępne w różnych rozmiarach. Wybierz odpowiedni rozmiar, aby umożliwić prawidłowe ustawienie i osadzenie próbki. Orientację próbek należy rozważyć w zależności od potrzeb doświadczalnych. Jeżeli wymagane są przekroje wzdłużne, próbka powinna być zorientowana wzdłużnie w kierunku cięcia, natomiast w przypadku przekrojów poprzecznych próbka powinna być zorientowana równolegle do kierunku cięcia.
  5. Umieść czystą kasetę na formie i upewnij się, że wystarczająca ilość parafiny całkowicie pokrywa całą kasetę, aby utrzymać próbkę na kasecie.
  6. Umieść formę na zimnej płycie i pozwól parafinie całkowicie związać (10-20 min) przed wyjęciem bloku z formy.
  7. Przystąpić do dzielenia na sekcje lub przenieść bloki do temperatury 4 °C w celu przechowywania.
    UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać. Osadzone bloki mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C przez okres do trzech miesięcy.

4. Przygotowanie szkiełek membranowych z polietylenowo-naftalanowego (PEN)

  1. Zanurz szkiełka membranowe PEN w roztworze dezaktywującym RNazę na 3 sekundy, a następnie wykonaj dwa krótkie płukania w wodzie uzdatnionej przez DEPC, aby usunąć RNazy ze szkiełek. Wysuszyć szkiełka w inkubatorze o temperaturze 37 °C, aby usunąć resztki roztworu.
  2. Szkiełka należy poddać działaniu promieni UV za pomocą lampy UV w komorze z przepływem laminarnym przez 30 minut, aby poprawić właściwości hydrofilowe i poprawić przyczepność parafiny.

5. Podział na sekcje

  1. Na etapie cięcia należy użyć mikrotomu (patrz Tabela materiałów).
  2. Umieść nowe ostrze w uchwycie noża i zawsze trzymaj osłonę noża w górze, gdy nie jest aktywnie cięty
    UWAGA: Ostrza mikrotomu są niezwykle ostre i mogą spowodować znaczne szkody w przypadku niewłaściwego obchodzenia się z nimi.
    UWAGA: Na mikrotomie znajdują się dwa mechanizmy blokujące, jeden z boku maszyny, a drugi na uchwycie koła. Oba mają być zaangażowane, gdy nie są aktywnie sekcjonowane.
  3. Wyreguluj blok noża tak, aby znajdował się jak najbliżej próbki bez dotykania. Upewnij się, że ramię mikrotomu nigdy nie styka się w pełni z blokiem noża, ponieważ spowoduje to katastrofalne uszkodzenie strukturalne mikrotomu.
  4. Przed rozpoczęciem włącz zimną płytę. Trzymaj bloki parafiny na zimnej płycie przed cięciem i w razie potrzeby ponownie schładzaj bloki podczas cięcia, aby zapobiec zmiękczeniu bloków.
  5. Przed rozpoczęciem napełnić łaźnię wodną wodą uzdatnioną metodą DEPC i podgrzać do 42 °C.
  6. Przytnij bloki na żądaną głębokość (gdzie znajduje się przekrój, który Cię interesuje) i przekrój bloki parafiny o żądanej grubości (6-10 μm) za pomocą mikrotomu; dobrze pocięty blok utworzy "wstęgę" na krawędzi ostrza. Do nasion jęczmienia, sekcja o grubości 8 μm.
  7. Delikatnie przenieś wstążki z mikrotomu do łaźni wodnej za pomocą cienkiego pędzla lub cienkich kleszczyków, upewniając się, że wstążka leży płasko na powierzchni wody.
  8. Przytrzymaj szkiełko pod kątem 45°, wykonując ruchy w górę, wyjmij wstążkę z wody na zjeżdżalnię i ostrożnie usuń nadmiar wody niestrzępiącą się chusteczką.
  9. Suszyć szkiełka przez 30 minut w temperaturze 37 °C, aby usunąć resztki wody pod parafiną.
  10. Przystąpić do usuwania parafiny lub przechowywać w temperaturze 4 °C w zamkniętym pudełku w warunkach odwadniania (do wykorzystania w ciągu kilku dni).
  11. Usuń parafinę, myjąc szkiełka 3x przez 20 s w ksylenie, a następnie 2x pranie 30 s w 100% (v/v) etanolu i 2x płukanie 30 s w 70% (v/v) etanolu.
  12. Po usunięciu parafiny natychmiast przystąp do mikrodysekcji laserowej.
    UWAGA: Kriosekcja jest alternatywną metodą, która została z powodzeniem połączona z LCM. Przygotowanie próbki do kriosekcji będzie się różnić.

6. Mikrodysekcja laserowa

  1. Użyj mikroskopu mikrodyparacyjnego z wychwytem laserowym (patrz Tabela materiałów) do mikropreparacji komórek z odparafinowanych i wysuszonych skrawków tkanek.
  2. Załaduj suwaki na trzy dostępne gniazda.
  3. Użyj specjalnych nasadek samoprzylepnych probówek zbiorczych, aby pobrać pobrane próbki. Przechwytywanie bez zbierania cieczy ("na sucho") minimalizuje aktywność RNazy. Załaduj probówki zbiorcze do dostępnych szczelin.
  4. Przesuń stolik, aby zlokalizować obszar próbki, który należy wyciąć. Można to zrobić za pomocą myszy lub joysticka maszyny LCM lub strzałek na klawiaturze.
  5. Aby zoptymalizować prędkość cięcia, energię cięcia i ostrość, energię katapultowania laserowego pod ciśnieniem (LPC) i ostrość, najpierw wytnij nieskrojony segment wolny od tkanki na szkiełku membranowym. Dla nasion jęczmienia, prędkość cięcia = 18, CutEnergy = 52, CutFocus = 63, LPCEnergy = 78, Ostrość LPC = 61 przy 10-krotnym powiększeniu.
    UWAGA: Ostrość i energia cięcia muszą być dostosowane do różnych slajdów, różnych tkanek i uchwyconego obszaru, ale ogólne zasady mówią, że moc katapultowania jest wyższa niż moc cięcia, a laser musi być rozogniskowany w celu katapultowania. Im większe powiększenie soczewki obiektywu, tym mniejsze ognisko lasera i tym wyższa energia.
  6. Użyj narzędzi do rysowania, aby zaznaczyć komórki, obrysowując obszar zainteresowania.
  7. Wybierz funkcję RoboLPC z paska narzędzi funkcji, aby katapultować komórki do nasadek samoprzylepnych w oparciu o zoptymalizowane parametry uzyskane przez cięcie na czarnym segmencie powyżej.
    UWAGA: Parametry LCM różnią się w zależności od rodzaju tkanki, a także grubości przekroju, twardości tkanki i soczewek obiektywowych. Dlatego najlepiej jest zoptymalizować każdy szkiełko na gładkim obszarze błony bez próbki tkanki przed przecięciem właściwej próbki.
  8. Użyj narzędzi Flaga, aby oznaczyć interesujące obszary, aby natychmiast je zlokalizować, wybierając tę flagę z listy elementów.
  9. Sprawdź za pomocą przycisku "CapCheck", aby sprawdzić nasadkę samoprzylepną i potwierdzić, że próbki zostały pobrane. Zazwyczaj do ekstrakcji RNA wymagany jest LCM 10-15 sekcji (~ 200 komórek) na czapkę.
  10. Pobrane próbki należy przechowywać na lodzie. Natychmiast przystąp do ekstrakcji RNA, aby uniknąć degradacji RNA.
    UWAGA: Niektóre mikroskopy LCM są wyposażone w światło fluorescencyjne, które umożliwia uchwycenie komórek znakowanych markerami fluorescencyjnymi.

7. Ekstrakcja RNA

  1. Użyj zestawu do izolacji RNA o niskim wejściu (patrz Tabela materiałów) do ekstrakcji RNA po LCM. Takie zestawy są zaprojektowane do konsekwentnego odzyskiwania wysokiej jakości całkowitego RNA z mniej niż dziesięciu komórek.
  2. Wyizolować całkowite RNA z wychwyconych typów komórek zgodnie z instrukcjami producenta, w tym z zastosowaniem leczenia DNazą na kolumnie.
    UWAGA: Pierwszy etap ekstrakcji RNA, w którym probówka jest odwracana i przesuwana, ma kluczowe znaczenie dla zapewnienia, że wychwycone próbki na pokrywie stykają się z dodanym buforem ekstrakcyjnym.

8. Amplifikacja RNA

  1. Użyj zestawu do amplifikacji antysensownego RNA (aRNA) (patrz tabela materiałów) do amplifikacji aRNA z RNA wyekstrahowanego przez transkrypcję in vitro, aby wytworzyć wystarczającą ilość aRNA do syntezy biblioteki sekwencyjnej RNA.
  2. Wykonaj dwie rundy amplifikacji za pomocą zestawu do amplifikacji aRNA zgodnie z instrukcjami producenta.
    UWAGA: Ważne jest, aby podgrzać termocykler i pokrywę do temperatury zalecanej przez producenta zestawu (patrz tabela materiałów). Alternatywnym podejściem zamiast amplifikacji RNA jest użycie zestawu do przygotowania biblioteki o niskim nakładzie wejściowym do syntezy biblioteki bezpośrednio z wyekstrahowanego RNA.

9. Kwantyfikacja RNA

  1. Określ ilościowo i zakwalifikuj aRNA za pomocą zautomatyzowanego systemu elektroforezy (patrz tabela materiałów).
    UWAGA: Preferowany jest zautomatyzowany system elektroforezy, ponieważ wymaga mniejszej próbki (1-2 μl) i zapewnia obraz przypominający żel i elektroferogram dla każdej pojedynczej próbki.

10. qRT-PCR i/lub sekwencja RNA

  1. Zsyntetyzuj cDNA z aRNA do qRT-PCR lub do tworzenia bibliotek sekwencyjnych RNA przy użyciu standardowych zestawów bibliotek sekwencyjnych RNA.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wygenerowani przestrzennych i czasowych transkryptomów tkankowych z nasion jęczmienia podczas kiełkowania, korzystając z naszego protokołu sekwencyjnego RNA LCM10. Badanie przeprowadzono poprzez zastosowanie sekwencji RNA LCM do niewielkiej liczby komórek z trzech narządów zarodka (pióropusz, wierzchołek korzonka, tarczka) co 8 godzin w ciągu 48 godzin podczas kiełkowania (0-48 godzin, 7 punktów czasowych) (Rysunek 2A,B).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wiele badań nad ekspresją genów specyficznych dla tkanek zostało ograniczonych przez ręczne preparowanie próbek, które jest czasochłonne, pracochłonne, wiąże się z wysokim ryzykiem zanieczyszczenia i może wykorzystywać tylko te próbki, które człowiek jest wystarczająco zręczny do pobrania. LCM to precyzyjna i bezkontaktowa technika pobierania komórek z nieruchomych skrawków tkanek za pomocą mechanicznie obsługiwanej wiązki laserowej pod mikroskopową wizualizacją.

Dobre przygotowanie próbki ma ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Centrum Doskonałości w Biologii Energii Roślin (CE140100008) przez Australijską Radę ds. Badań Naukowych () dla JW. M.G.L otrzymał wsparcie od La Trobe University Starting Grant. Dziękujemy La Trobe Genomics Platform za wsparcie w zakresie wysokoprzepustowego sekwencjonowania i analizy danych. Dziękujemy profesorowi nadzwyczajnemu Matthew Tuckerowi za fachowe porady dotyczące ustanowienia LCM w naszym laboratorium.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Kwas octowy 100 % ACS/R.AnalaR NORMAPUR (BioStrategies)VWRC20104.323
AdhesiveCap 200 nieprzezroczystyZeiss415190-9181-000
Przezroczyste formy bazowe 8 X 10Leica3803015
Pirowęglan dietyluSigma-Aldrich40718-25ML
Taśma ekranowa RNA o wysokiej czułościAgilent5067-5579
Niska i nieśmiała; Profile Disp.Blades DB80LSLeica14035843489
MembraneSlide 1.0 PENZeiss415190-9041-000
MessageAmp II aRNA AmpAmpon (ThermoFisher)AMB17515
Zestaw do mineralizacji na kolumnie DNazy ISigma-AldrichDNASE70
Ovation RNA-Seq System V2NuGen (Integrated Science)7102-08
Parafina (Surgipath Paraplast)Zestaw
PicoPureABI (ThermoFisher)KIT0214
Roztwór do dekontaminacji RNaseZap Ambion(ThermoFisher)AM9780
XyleneAnalaR NORMAPUR (BioStrategies)VWRC28975.360
Stacjonarny procesor tkanek LeicaLeica BiosystemsTP1020
Podgrzewany moduł osadzania parafiny LeicaEG1150H
Leica Biosystems Leica Cold PlateLeica BiosystemsEG1150C
Safemate Class 2 LAFTechnologies Pty LtdSafemate 1.5
Leica - w pełni zautomatyzowany mikrotom obrotowyLeica BiosystemsRM2265z oprogramowaniem PALMRobo v 4.6
System Zeiss PALM MicroBeam LCMZeiss Miscroscopy
TapeStationAgilentTapeStation 2200
II do izolacji RNA Leica 39601006 Szafy bezpieczeństwa biologicznego

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Emmert-Buck, M. R., et al. Laser capture microdissection. Science. 274 (5289), 998-1001 (1996).
  2. Alevizos, I., et al. Oral cancer in vivo gene expression profiling assisted by laser capture microdissection and microarray analysis. Oncogene. 20 (43), 6196-6204 (2001).
  3. Cong, P., et al. In situ localization of follicular lymphoma: description and analysis by laser capture microdissection. Blood, The Journal of the American Society of Hematology. 99 (9), 3376-3382 (2002).
  4. Blokhina, O., et al. Laser capture microdissection protocol for xylem tissues of woody plants. Frontiers in Plant Science. 7, 1965(2017).
  5. Casson, S., Spencer, M., Walker, K., Lindsey, K. Laser capture microdissection for the analysis of gene expression during embryogenesis of Arabidopsis. The Plant Journal. 42 (1), 111-123 (2005).
  6. Chen, Z., et al. LCM-seq reveals the crucial role of LsSOC1 in heat-promoted bolting of lettuce (Lactuca sativa L.). The Plant Journal. 95 (3), 516-528 (2018).
  7. Jiao, Y., et al. A transcriptome atlas of rice cell types uncovers cellular, functional and developmental hierarchies. Nature Genetics. 41 (2), 258-263 (2009).
  8. Kivivirta, K., et al. A protocol for laser microdissection (LMD) followed by transcriptome analysis of plant reproductive tissue in phylogenetically distant angiosperms. Plant Methods. 15 (1), 1-11 (2019).
  9. Li, P., et al. The developmental dynamics of the maize leaf transcriptome. Nature Genetics. 42 (12), 1060-1067 (2010).
  10. Liew, L. C., et al. Temporal tissue-specific regulation of transcriptomes during barley (Hordeum vulgare) seed germination. The Plant Journal. 101 (3), 700-715 (2020).
  11. Matas, A. J., et al. Tissue-and cell-type specific transcriptome profiling of expanding tomato fruit provides insights into metabolic and regulatory specialization and cuticle formation. The Plant Cell. 23 (11), 3893-3910 (2011).
  12. Sakai, K., et al. Combining laser-assisted microdissection (LAM) and RNA-seq allows to perform a comprehensive transcriptomic analysis of epidermal cells of Arabidopsis embryo. Plant Methods. 14 (1), 10(2018).
  13. Zhan, J., et al. RNA Sequencing of Laser-Capture Microdissected compartments of the maize kernel identifies regulatory modules associated with endosperm cell differentiation. The Plant Cell. 27 (3), 513-531 (2015).
  14. Hwang, B., Lee, J. H., Bang, D. Single-cell RNA sequencing technologies and bioinformatics pipelines. Experimental & Molecular Medicine. 50 (8), 1-14 (2018).
  15. Zeb, Q., Wang, C., Shafiq, S., Liu, L. Single-Cell Omics. , Elsevier. 101-135 (2019).
  16. Deal, R. B., Henikoff, S. The INTACT method for cell type-specific gene expression and chromatin profiling in Arabidopsis thaliana. Nature Protocols. 6 (1), 56(2011).
  17. Heiman, M., Kulicke, R., Fenster, R. J., Greengard, P., Heintz, N. Cell type-specific mRNA purification by translating ribosome affinity purification (TRAP). Nature Protocols. 9 (6), 1282(2014).
  18. Bevilacqua, C., Ducos, B. Laser microdissection: A powerful tool for genomics at cell level. Molecular Aspects of Medicine. 59, 5-27 (2018).
  19. Nelson, T., Tausta, S. L., Gandotra, N., Liu, T. Laser microdissection of plant tissue: what you see is what you get. Annual Reviews in Plant Biology. 57, 181-201 (2006).
  20. Day, R. C., Grossniklaus, U., Macknight, R. C. Be more specific! Laser-assisted microdissection of plant cells. Trends in Plant Science. 10 (8), 397-406 (2005).
  21. Takahashi, H., et al. A method for obtaining high quality RNA from paraffin sections of plant tissues by laser microdissection. Journal of Plant Research. 123 (6), 807-813 (2010).
  22. Schroeder, A., et al. The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Molecular Biology. 7 (1), 3(2006).
  23. Ferreira, E. N., et al. Linear mRNA amplification approach for RNAseq from limited amount of RNA. Gene. 564 (2), 220-227 (2015).
  24. Schneider, J., et al. Systematic analysis of T7 RNA polymerase based in vitro linear RNA amplification for use in microarray experiments. BMC Genomics. 5 (1), 29(2004).
  25. Shanker, S., et al. Evaluation of commercially available RNA amplification kits for RNA sequencing using very low input amounts of total RNA. Journal of Biomolecular Techniques. 26 (1), 4(2015).
  26. Bhattacherjee, V., et al. Laser capture microdissection of fluorescently labeled embryonic cranial neural crest cells. Genesis. 39 (1), 58-64 (2004).
  27. Clément-Ziza, M., Munnich, A., Lyonnet, S., Jaubert, F., Besmond, C. Stabilization of RNA during laser capture microdissection by performing experiments under argon atmosphere or using ethanol as a solvent in staining solutions. RNA. 14 (12), 2698-2704 (2008).
  28. Blokhina, O., et al. Parenchymal Cells Contribute to Lignification of Tracheids in Developing Xylem of Norway Spruce. Plant Physiology. 181 (4), 1552-1572 (2019).
  29. Schad, M., Lipton, M. S., Giavalisco, P., Smith, R. D., Kehr, J. Evaluation of two-dimensional electrophoresis and liquid chromatography-tandem mass spectrometry for tissue-specific protein profiling of laser-microdissected plant samples. Electrophoresis. 26 (14), 2729-2738 (2005).
  30. Schad, M., Mungur, R., Fiehn, O., Kehr, J. Metabolic profiling of laser microdissected vascular bundles of Arabidopsis thaliana. Plant Methods. 1 (1), 2(2005).
  31. Latrasse, D., et al. The quest for epigenetic regulation underlying unisexual flower development in Cucumis melo. Epigenetics & Chromatin. 10 (1), 22(2017).
  32. Turco, G. M., et al. DNA methylation and gene expression regulation associated with vascularization in Sorghum bicolor. The New Phytologist. 214 (3), 1213-1229 (2017).
  33. Gomez, S. K., Harrison, M. J. Laser microdissection and its application to analyze gene expression in arbuscular mycorrhizal symbiosis. Pest Management Science: Formerly Pesticide Science. 65 (5), 504-511 (2009).
  34. Roux, B., et al. An integrated analysis of plant and bacterial gene expression in symbiotic root nodules using laser-capture microdissection coupled to RNA sequencing. The Plant Journal. 77 (6), 817-837 (2014).
  35. Tang, W., Coughlan, S., Crane, E., Beatty, M., Duvick, J. The application of laser microdissection to in planta gene expression profiling of the maize anthracnose stalk rot fungus Colletotrichum graminicola. Molecular Plant-Microbe Interactions. 19 (11), 1240-1250 (2006).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Laser Capture MicrodissectionRNA SequencingSpatial Gene ExpressionTemporal Gene ExpressionTissue FixationParaffin EmbeddingTissue SectioningRNA ExtractionProfilingBarley Embryo

Related Articles