Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wykorzystanie zmętnienia i tromboelastografii do charakterystyki skrzepów komplementarnych

6.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61519

⸱

4 czerwca 2020

 ,  , 
1Emergency Medicine Department, Indiana University School of Medicine, 2Weldon School of Biomedical Engineering, Purdue University

W tym artykule

Podsumowanie

Fibryna jest odpowiedzialna za tworzenie skrzepów podczas hemostazy i zakrzepicy. Testy zmętnienia i małozakrzepowości (TEG) mogą być wykorzystywane jako narzędzia synergiczne, które zapewniają komplementarną ocenę skrzepu. Te dwie techniki razem mogą dać lepszy wgląd w to, jak warunki krzepnięcia wpływają na tworzenie skrzepów fibryny.

Streszczenie

Zakrzepica jest główną przyczyną zgonów na całym świecie. Fibryna (ogen) jest białkiem odpowiedzialnym przede wszystkim za tworzenie się skrzepów lub zakrzepicę. Dlatego scharakteryzowanie tworzenia się skrzepów fibryny jest korzystne dla badania zakrzepicy. Zmętnienie i tromboelastografia (TEG) są szeroko stosowane w testach in vitro do monitorowania tworzenia się skrzepów. Zmętnienie dynamicznie mierzy przepuszczalność światła przez strukturę skrzepu fibryny za pomocą spektrometru i jest często stosowane w laboratoriach badawczych. TEG to specjalistyczna technika lepkosprężysta, która bezpośrednio mierzy siłę skrzepów krwi i jest stosowana głównie w warunkach klinicznych do oceny hemostazy pacjentów. Za pomocą tych dwóch narzędzi w badaniu tym opisano metodę charakteryzowania skrzepu fibryny in vitro przy użyciu uproszczonego modelu skrzepu fibrynogenu/trombiny. Trendy danych w obu technikach porównano w różnych warunkach krzepnięcia. Skrzepy fibryny ludzkiej i bydlęcej powstawały w tym badaniu równolegle, ponieważ czynniki krzepnięcia bydła są często stosowane jako substytuty ludzkich czynników krzepnięcia w warunkach klinicznych i badawczych. Wyniki pokazują, że TEG i zmętnienie śledzą tworzenie się skrzepów za pomocą dwóch różnych metod, a gdy są stosowane razem, dostarczają uzupełniających się informacji o sile skrzepu i strukturze włókien w różnych warunkach krzepnięcia.

Wprowadzenie

Zakrzepica to patologiczne tworzenie się skrzepu krwi w organizmie, który blokuje krążenie krwi, prowadząc do wysokiej zachorowalności i śmiertelności na całym świecie. Rocznie na 1000 osób przypada od 1 do 2 przypadków żylnej choroby zakrzepowo-zatorowej i od 2 do 3 przypadków chorób naczyniowych wywołanych zakrzepicą1,2. Przedstawiono metodę wykorzystującą tromboelastografię (TEG) i zmętnienie do monitorowania tworzenia się skrzepów w różnych warunkach krzepnięcia. Fibryna (ogen) jest podstawowym białkiem odpowiedzialnym za tworzenie się skrzepów w organizmie. W końcowych etapach kaskady krzepnięcia fibrynopeptydy są oddzielane od fibrynogenu przez trombinę, inicjując polimeryzację nierozpuszczalnych monomerów fibryny w miarę rozwoju skrzepu3,4. Aby zrozumieć tworzenie się skrzepów w patologicznej zakrzepicy, konieczne jest scharakteryzowanie powstawania fibryny w różnych warunkach krzepnięcia. Do zbadania tworzenia się skrzepów fibryny in vitro wykorzystano wiele testów monitorowania skrzepów. Czas protrombinowy (PT/INR) i czas częściowej tromboplastyny po aktywacji (aPTT) to dwa powszechne testy kliniczne, które mierzą integralność określonego szlaku krzepnięcia. Jednak używają czasu jako jedynej zmiennej, która nie daje żadnych wskazówek co do fizycznych właściwości skrzepu5. Mikroskopia elektronowa umożliwia wizualizację mikrostruktury całkowicie uformowanego skrzepu fibrynowego, ale nie dostarcza żadnych informacji o samym procesie tworzenia skrzepu6. Spośród wszystkich testów, testy zmętnienia i TEG oferują możliwość dynamicznego śledzenia charakterystyki skrzepu w czasie. Techniki te umożliwiają pomiar kompleksowych profili krzepnięcia, a tym samym zapewniają pewne korzyści w porównaniu z innymi narzędziami do charakteryzowania skrzepów fibryny.

W szczególności, testy mętności (lub mętność skrzepów) są szeroko stosowane do zastosowań badawczych i klinicznych ze względu na ich prostotę implementacji i szeroką dostępność spektrometrów w laboratoriach badawczych. Test ten umożliwia dynamiczny pomiar przepuszczalności światła przez tworzący się skrzep poprzez wykonywanie indywidualnych powtarzalnych odczytów na określonej długości fali (najczęściej na długości fali w zakresie 350 – 700 nm)7. Temperaturę w komorze odczytu można również regulować. Gdy tworzy się żel fibrynowy, ilość światła przepływającego przez sieć białkową jest zmniejszana, powodując wzrost absorbancji w czasie. Podobnie, absorbancja zmniejsza się, gdy sieć skrzepów ulega degradacji. Testy zmętnienia można łatwo multipleksować przy użyciu formatu płytki wielodołkowej, co pozwala na wysokoprzepustowe badanie przesiewowe próbek zarówno na płytkach 96-, jak i 384-dołkowych. Na podstawie krzywej śledzenia zmętnienia (pomiar absorbancji w czasie) można wyprowadzić kilka cech skrzepu, które obejmują: maksymalne zmętnienie, czas do maksymalnego zmętnienia, czas do wystąpienia krzepnięcia i szybkość tworzenia się skrzepów (Vmax). Stosunek masy do długości włókien fibryny można również wyprowadzić z surowych danych dotyczących zmętnienia, aby oszacować grubość włókna fibryny8,9,10.

TEG jest głównie używany w warunkach klinicznych do oceny hemostazy i lizy skrzepów u pacjentów. Jest również powszechnie stosowany w zastosowaniach chirurgicznych do określania, kiedy należy podawać leki przeciwfibrynolityczne lub hemostatyczne produkty krwiopochodne11,12. Tworzenie się skrzepów zachodzi wewnątrz kubka TEG, a wszystkie składniki krzepnięcia są dodawane do kubka przed rozpoczęciem testu. Miseczka z rozwijającym się skrzepem fizycznie obraca się względem kołka, który jest włożony do jego środka, a elektromechaniczny czujnik skręcania mierzy rosnącą wytrzymałość lepkosprężystą skrzepu. Test ten przeprowadza się zazwyczaj w temperaturze fizjologicznej 37 °C; Jednak temperaturę można regulować ręcznie na instrumencie. Maksymalna amplituda (MA), szybkość reakcji (R), czas kinetyki (K), kąt α (kąt) i czas do maksymalnej amplitudy (TMA) są pobierane przez oprogramowanie TEG z dynamicznego śledzenia TEG. Wartości te są zwykle porównywane z normalnymi zakresami klinicznymi w celu oceny stanu krzepnięcia pacjenta. Chociaż TEG nie jest dokładnie lepkościomierzem, ponieważ mierzy siłę skrzepu w jednostkach milimetrowych, dostarcza ważnych danych dotyczących lepkosprężystego skrzepu i funkcjonuje jako cenne narzędzie do podejmowania decyzji klinicznych dla lekarzy, którzy decydują o podawaniu określonych produktów krwiopochodnych i dostosowywaniu dawkowania terapeutycznego13. Gdy zarówno testy TEG, jak i zmętnienia są wykorzystywane razem, dostarczają uzupełniających się informacji o charakterystyce skrzepów, ponieważ siła skrzepu i kinetyka są łatwo ekstrahowane z TEG, a grubość włókien fibrynowych można uzyskać za pomocą optycznych pomiarów zmętnienia.

Ponieważ fibryna jest kluczowym składnikiem skrzepu krwi, charakterystyka skrzepu fibryny w różnych warunkach tworzenia skrzepów może dostarczyć cennych informacji na temat tego, jak konkretna zmienna przyczynia się do procesu tworzenia skrzepów i ostatecznych właściwości skrzepu. Zrozumienie tego może dostarczyć wskazówek dotyczących diagnozowania zakrzepicy i opracowywania środków terapeutycznych. Aby uzyskać bardziej reprezentatywną charakterystykę skrzepów fibryny, osocze można podstawić w celu monitorowania tworzenia się skrzepów, ponieważ bardziej przypomina warunki krzepnięcia in vivo niż uproszczony system modelowy fibrynogenu/trombiny. Jednak ze względu na skomplikowany charakter kaskady krzepnięcia, tworzenie się skrzepów za pomocą osocza zwiększa złożoność, utrudniając wyizolowanie wpływu poszczególnych czynników. Wykorzystanie uproszczonego modelu fibrynogenu/trombiny zapobiega konieczności inicjowania całej kaskady krzepnięcia, co pozwala na wyizolowanie końcowego etapu tworzenia fibryny. Poprzez włączenie dwóch głównych składników tworzących fibrynę (fibrynogenu i trombiny), konfiguracja ta tworzy wysoce kontrolowane warunki tworzenia skrzepów. Ważne jest również, aby pamiętać, że chociaż stosowany jest tutaj uproszczony model skrzepu, protokół ten może być również wykorzystany do scharakteryzowania bardziej złożonych skrzepów poprzez uwzględnienie dodatkowych czynników krzepnięcia. W tym badaniu charakterystyka skrzepów fibryny za pomocą zmętnienia i TEG jest przeprowadzana poprzez różnicowanie stężeń fibrynogenu i trombiny, siły jonowej, pH i całkowitego stężenia białka w roztworze krzepnięcia, aby naśladować różne warunki krzepnięcia in vivo14. Szczegółowe informacje na temat tych zmian w protokole zostały zawarte w sekcji 5.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie buforu fosforanowego (PBS)

UWAGA: W całym badaniu używano PBS, ponieważ opisane testy nie wymagały dodania wapnia. Należy pamiętać, że w przypadku dodawania wapnia, często stosowanego w celu ponownego zwapnienia produktów krwi cytrynianowej, należy unikać stosowania PBS, ponieważ wapń ma tendencję do wytrącania się w buforach fosforanowych.

  1. Przygotuj bufor PBS o stężeniu 0,01 M i pH 7,4, mieszając 137 mM chlorku sodu, 1,8 mM monohydrogenofosforanu potasu, 10 mM dwuhydrogenofosforanu sodu oraz 2,7 mM chlorku potasu w wodzie dejonizowanej.
  2. Sprawdź pH buforu za pomocą elektrody pH i w razie potrzeby skoryguj pH, używając wodorotlenku sodu lub kwasu solnego.
  3. Używaj tego buforu PBS do przygotowywania fibrynogenu i testów krzepnięcia (chyba że określono inaczej).
    UWAGA: Bufor ten zaleca się do rekonstytucji proszku fibrynogenu, ponieważ hydratacja w wodzie dejonizowanej może prowadzić do wytrącania się fibrynogenu nawet w temperaturze 37 °C.

2. Przygotowanie i przechowywanie białek

UWAGA: W całym protokole stężenia roztworów zapasowych białka przygotowuje się w różnych stężeniach dla pomiaru mętności i TEG, aby zapewnić stały stosunek soli, wody zdejonizowanej, buforu PBS oraz innych pozostałości w końcowych roztworach krzepnięcia.

  1. Przygotowanie i przechowywanie fibrynogenu
    OSTRZEŻENIE: Zanieczyszczenia występujące w fibrynogenie dostępnym komercyjnie obejmują znaczną ilość czynnika XIII, śladowe ilości innych czynników krzepnięcia, bufor przechowywania oraz sole. W obecności jonów wapnia czynnik XIII może powodować sieciowanie siatki skrzepu fibryny. Ten efekt prowadzi do zwartego struktury skrzepu oraz zwiększonej wytrzymałości, co wpływa na charakterystykę fibryny. Komercyjnie dostępne zestawy aktywnościowe mogą być wykorzystane do określenia poziomu aktywnego czynnika XIIIa. Aby zminimalizować zmienność spowodowaną przez czynnik XIIIa, należy projektować eksperymenty bez obecności wapnia lub włączyć dodatkowe kroki usuwania czynnika XIIIa do niniejszego protokołu. Ponadto należy ocenić rodzaj soli i buforu stosowanego do przechowywania białka, a w razie potrzeby przeprowadzić dializę w celu przeniesienia do preferowanego buforu roboczego dla testu.
    1. Odważ i przenieś liofilizowany proszek fibrynogenu (wołowego lub ludzkiego) do probówek o pojemności 2 mL, po 20 mg białka na probówkę, a następnie przechowuj porcje w temperaturze -20 °C do 6 miesięcy.
    2. W dniu eksperymentu pozostaw porcję fibrynogenu do osiągnięcia temperatury pokojowej (RT) przez 10 minut. Odtwórz fibrynogen, dodając 600 µL buforu PBS do porcji 20 minut przed użyciem.
    3. Przenieś 10 µL fibrynogenu i rozcieńcz go 190 µL buforu PBS w 96- dołkowej płytce przezroczystej dla promieni UV lub kuwecie. Oznacz stężenie fibrynogenu poprzez pomiar absorbancji przy 280 nm za pomocą komercyjnego spektrometru i odpowiedniego oprogramowania.
    4. Oblicz stężenie fibrynogenu (mg/mL) zgodnie z prawem Beera. Przygotuj roztwory podstawowe fibrynogenu o stężeniu 12 mg/mL (dla testów mętności) i 3,2 mg/mL (dla TEG), dodatkowo rozcieńczając buforem PBS (chyba że określono inaczej).
      OSTRZEŻENIE: Oznaczanie stężenia fibrynogenu (mg/mL) zgodnie z prawem Beera:
      Wzór na obliczanie stężenia, równanie C=D*(A/εL)*(Mw/1000), analiza chemiczna.
      Molowy współczynnik ekstynkcji: ɛ = 513 400 L mol-1 cm-1 przy 280 nm; Długość drogi optycznej (L); Czynnik rozcieńczenia (D); Masa cząsteczkowa (MW) = 340 000 Da. ɛ uzyskuje się poprzez pomnożenie wartości E0,1% = 1,51 (280 nm) (współczynnik ekstynkcji podany przez dostawcę) przez MW.
  2. Przygotowanie i przechowywanie trombiny
    1. Odtwórz liofilizowaną trombinę (wołową lub ludzką, roztwór o stężeniu 1000 U) w 200 µL wody zdejonizowanej (DI), aby uzyskać 200 µL roztworu podstawowego trombiny o stężeniu 5000 U/mL.
    2. Przygotuj porcje po 5 µL (20 U/probówka) roztworu i przechowuj je w temperaturze −20 °C w stanie zamrożonym.
    3. W dniu eksperymentu odmroź porcje trombiny w temperaturze pokojowej (RT) przez 15 minut, a następnie przygotuj roztwór roboczy trombiny poprzez rozcieńczenie do stężenia 20 U/mL (dla testów mętności) i 18 U/mL (dla TEG) wodą zdejonizowaną (chyba że określono inaczej).
      OSTRZEŻENIE: Należy zachować ostrożność w celu zachowania aktywności enzymatycznej, co można osiągnąć poprzez przechowywanie enzymów na lodzie podczas odmrażania i użytkowania; jednak nie zaobserwowano zmniejszenia aktywności trombiny przy bezpośrednim użyciu po odmrożeniu w temperaturze pokojowej.

3. Zawiesistość

  1. Użyj dowolnego dostępnego komercyjnie spektrometru o zakresie absorbancji 350–700 nm oraz odpowiedniego oprogramowania do monitorowania zawirowania skrzepu w czasie (zobacz Tabela materiałów).
  2. Włącz spektrometr i otwórz odpowiednie oprogramowanie analityczne.
  3. Wybierz płytkę 1 i otwórz kartę ustawień płytki. Kliknij tryb ABS i opcję Kinetyczny, aby monitorować dynamiczne odczyty absorbancji w czasie.
  4. Wybierz 550 nm (lub dowolną wartość w zakresie 350–700 nm) na karcie długości fali oraz ustaw całkowity czas trwania pomiaru na 60 min z odstępem 30 s na karcie czasu. Wybierz interesujące studziosłki, zaznaczając je. Dostosuj inne ustawienia, jeśli to konieczne.
    UWAGA: Wybranie długości fali na niższym końcu zakresu (około 350 nm) zapewnia lepszą czułość, ale absorbancja może przekroczyć limit wykrywalności spektrometru. W literaturze najczęściej stosowaną długością fali do pomiaru zawirowania jest 405 nm; jednak niniejszy protokół wykorzystuje 550 nm, aby zagwarantować, że wartości dynamicznego zawirowania mieszczą się w granicach wykrywalności we wszystkich eksperymentach. Wybrany odstęp pomiarowy powinien być jak najkrótszy, aby osiągnąć najwyższy poziom czułości testu. Długość odstępu zależy od spektrometru oraz liczby studziołek odczytywanych w trakcie danego testu.
  5. Weź przezroczystą dla UV 96-studzienkową płytkę. Do studziosłki wybranej do pomiaru pipetuj 140 µL roztworu PBS. Dodaj i wymieszaj 10 µL trombiny (20 U/mL) w studziosłce.
    UWAGA: Nie należy używać plytek o wysokim powinowactwie, aby zminimalizować nieswoiste wiązanie białek z powierzchni studziosłki. Może to wpłynąć na rozprzestrzenianie się białek w roztworze i prowadzić do dużej zmienności wyników testu.
  6. Natychmiast zainicjuj krzepnięcie, dodając 50 µL fibrynogenu (12 mg/mL) do studziosłki, aby uzyskać 200 µL roztworu krzepnięcia o końcowych stężeniach 3 mg/mL fibrynogenu i 1 U/mL trombiny. Wymieszaj zawartość studziosłki, pipetując pięciokrotnie w górę i w dół, dbając o uniknięcie powstawania pęcherzyków powietrza, które mogą wpływać na absorbancję poprzez rozpraszanie światła.
    UWAGA: W przypadku jednoczesnego przeprowadzania wielu próbek krzepnięcia na tej samej płytce użyj pipety wielokanałowej. Zanotuj różnice czasowe między studziosłkami oraz czas przed pierwszym odczytem przez urządzenie, aby skorygować czasy krzepnięcia.
  7. Umieść płytkę 96-studzienkową w uchwycie i kliknij Rozpocznij w oprogramowaniu, aby rozpocząć pomiar zawirowania w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Jeśli test jest wykonywany w podwyższonej temperaturze, spektrometr, płytkę oraz odczynniki należy utrzymywać w pożądanej temperaturze przed rozpoczęciem krzepnięcia.
  8. Po zakończeniu pobierz dane dotyczące zawirowania i uzyskaj krzywą zawirowania, tworząc wykres zmian absorbancji w czasie w programie do tworzenia wykresów.
  9. Wyznacz wartość TurbMax (maksymalne zawirowanie wskazujące grubość włókien fibryny i gęstość sieci fibrynowej), biorąc maksymalną wartość absorbancji krzywej w czasie.
    UWAGA: Stosunek masy do długości włókien fibryny można obliczyć z wartości zawirowania, korzystając z równania podanego w następującym artykule8.
  10. Oblicz 90% maksymalnego zawirowania, mnożąc wartość TurbMax przez 90%. Wyznacz wartość TurbTime, obliczając czas od rozpoczęcia krzepnięcia do osiągnięcia 90% maksymalnego zawirowania.
    UWAGA: Czas osiągnięcia 90% maksymalnego zawirowania jest bardziej wiarygodnym wskaźnikiem niż czas osiągnięcia absolutnego maksimum, ponieważ lepiej odzwierciedla czas krzepnięcia, eliminując wysoce zmienny końcowy etap formowania skrzepu. Z krzywych zawirowania można również wyznaczyć dodatkowe parametry krzepnięcia, takie jak czas rozpoczęcia krzepnięcia (czas od rozpoczęcia testu do momentu, w którym absorbancja zaczyna wzrastać) oraz szybkość formowania skrzepu (Vmax, największy nachylenie liniowego obszaru na krzywej zawirowania).

4. Tromboelastografia (TEG)

  1. Włącz analizator tromboelastografu i odczekaj, aż temperatura ustabilizuje się na poziomie 37 °C.
  2. Otwórz oprogramowanie TEG. Po zalogowaniu się utwórz nazwę eksperymentu w sekcji ID.
  3. Przeprowadź test e-test na wszystkich kanałach, postępując zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na ekranie. Po zakończeniu wszystkich czynności ustaw dźwignię z powrotem w pozycji ładowania.
    UWAGA: Test e-test TEG jest wymagany i należy go przeprowadzać za każdym razem, gdy korzysta się z urządzenia. Testy kontrolne krzepnięcia TEG (z wykorzystaniem kontroli poziomu 1 i 2) są wymagane w regularnych odstępach sugerowanych przez producenta, gdy urządzenie jest używane do próbek klinicznych.
  4. Kliknij kartę TEG, wprowadź informacje o próbce dla kanałów, które będą używane. Umieść przezroczysty, niepowlekany kubek TEG w odpowiednim kanale. Przesuń noszący element w górę i naciśnij dno kubka pięciokrotnie, aby przymocować sztyft do pręta skrętnego. Opuszczając noszący element, naciśnij kubek w dół, aż do usłyszenia „kliknięcia”.
  5. Pipetuj 20 µL roztworu trombiny (18 U/mL) do kubka TEG. Natychmiast zainicjuj krzepnięcie poprzez dodanie 340 µL fibrynogenu (3,2 mg/mL) do kubka TEG, aby uzyskać 360 µL roztwór krzepnięcia o końcowym stężeniu 3 mg/mL fibrynogenu i 1 U/mL trombiny w kubku. Wymieszaj zawartość poprzez pięciokrotne aspirację i wydmuchanie za pomocą pipety.
    UWAGA: Potencjalne czynniki krzepnięcia lub inne składniki interesujące należy dodać w tym etapie, dbając o zachowanie stałej końcowej objętości 360 µL w kubku TEG.
  6. Przesuń noszący element z załadowanym kubkiem w górę, przestaw dźwignię w pozycję odczytu i kliknij Start w oprogramowaniu, aby rozpocząć odczyt TEG.
  7. Po zakończeniu analizy TEG (po około godzinie) pobierz parametry TEG i uzyskaj krzywą TEG poprzez wykreślenie amplitudy w funkcji czasu w programie do tworzenia wykresów.
  8. Pobierz MA jako TEGMax (maksymalna amplituda wskazująca wytrzymałość skrzepu) oraz TMA jako TEGTime (czas do osiągnięcia maksymalnej amplitudy) z oprogramowania.
    UWAGA: MA jest obliczane przez oprogramowanie jako maksymalna amplituda w momencie, gdy odchylenie amplitudy nie przekracza 5% w ciągu 3 minut. TMA określa się jako czas od momentu maksymalnej szybkości generowania skrzepu (w pobliżu punktu rozgałęzienia) do osiągnięcia MA. Inne parametry mogą również być przydatne przy analizie krzepnięcia. Przykładowo: czas R (czas od rozpoczęcia testu do chwili, gdy amplituda osiągnie 2 mm), K (czas od końca R do chwili, gdy amplituda osiągnie 20 mm), alfa (nachylenie linii między R a K) oraz CLT (czas lizy skrzepu).

5. Charakterystyka fibryny w różnych warunkach krzepnięcia

UWAGA: Przeprowadź eksperymenty charakteryzujące fibrynę, modyfikując konkretną zmienną w roztworach krzepnięcia, taką jak: stężenia fibrynogenu i trombiny, siła jonowa, pH oraz całkowite stężenia białka. W tej sekcji opisano przykładowe przygotowania eksperymentalne obejmujące te zmienne; można jednak zastosować również inne czynniki i warunki krzepnięcia, które są przedmiotem zainteresowania. Starannie dobież odpowiedni system buforowy, biorąc pod uwagę specyficzne wymagania każdego oznaczenia. W przypadku oznaczeń metodą zmętnienia i TEG uwzględnij kontrolę zawierającą wyłącznie bufor, aby zapewnić dokładne odjęcie tła podczas analizy wpływu tych zmiennych.

  1. Zmienne stężenie fibrynogenu (1, 2, 3, 4, 5 mg/mL)
    1. Dostosuj krok 2.1.4, aby przygotować roztwór zapasowy fibrynogenu w różnych stężeniach (4, 8, 12, 16, 20 mg/mL dla testów zmętnienia i 1,1, 2,1, 3,2, 4,2, 5,3 mg/mL dla TEG).
    2. Dostosuj krok 3.6, aby „dodać 50 µL fibrynogenu (4, 8, 12, 16, 20 mg/mL) do wielu dołków płytki 96-dołkowej” w przypadku testów zmętnienia.
    3. Dostosuj krok 4.5, aby „dodać 340 µL fibrynogenu (1,1, 2,1, 3,2, 4,2, 5,3 mg/mL) do przezroczystych naczyń TEG” w przypadku TEG.
  2. Zmienne stężenie trombiny (0,1, 0,3, 0,6, 0,8, 1, 2,5, 5, 10 U/mL)
    1. Dostosuj krok 2.2.3, aby przygotować roztwór zapasowy trombiny w różnych stężeniach (2, 6, 12, 16, 20, 50, 100, 200 U/mL dla testów zmętnienia i 1,8, 5,4, 10,8, 14,4, 18, 45, 90, 180 U/mL dla TEG).
    2. Dostosuj krok 3.5, aby „dodać 10 µL trombiny (2, 6, 12, 16, 20, 50, 100, 200 U/mL) do wielu dołków płytki 96-dołkowej” w przypadku testów zmętnienia.
    3. Dostosuj krok 4.5, aby „pobrać pipetą 20 µL trombiny (1,8, 5,4, 10,8, 14,4, 18, 45, 90, 180 U/mL) do przezroczystych naczyń TEG” w przypadku TEG.
  3. Zmienna siła jonowa (0,05, 0,13, 0,14, 0,15, 0,16, 0,17 i 0,3 M)
    1. Rozpuść chlorek sodu (21, 101, 111, 121, 131, 141 i 271 mM) wraz z 1,8 mM monopodstawowego fosforanu potasu, 10 mM dwupodstawowego fosforanu sodu i 2,7 mM chlorku potasu w wodzie dejonizowanej, aby otrzymać roztwory PBS o stężeniu 0,01 M o zmiennej sile jonowej.
    2. Dostosuj krok 1.3, aby użyć PBS o różnej sile jonowej do przygotowania roztworów fibrynogenu i krzepnięcia dla testów zmętnienia i TEG.
  4. Zmienny pH (5,8, 6,6, 7,3, 7,4, 7,5 i 8,0)
    1. Rozpuść dwupodstawowy fosforan sodu (0,7, 3,2, 7,7, 8,1, 8,4, 9,5 mM) i monopodstawowy fosforan potasu (8,2, 6,0, 2,0, 1,7, 1,4, 0,5 mM) wraz z 2,7 mM chlorkiem potasu i chlorkiem sodu (153, 147, 138, 137, 136, 134 mM), aby otrzymać roztwory PBS o stężeniu 0,01 M o różnym pH i końcowej sile jonowej 0,165 M.
    2. Sprawdź wartość pH buforu za pomocą sondy pH i w razie potrzeby skoryguj pH.
    3. Dostosuj krok 1.3, aby użyć PBS o różnym pH do przygotowania roztworów fibrynogenu i krzepnięcia dla testów zmętnienia i TEG.
  5. Zmienne stężenie albuminy (0, 20, 40, 50, 60, 80, 100 mg/mL)
    1. Rozpuść 2 g liofilizowanej albuminy w 500 µL PBS w temperaturze pokojowej przez 20 minut w dniu eksperymentu.
    2. Określ stężenie albuminy, stosując tę samą procedurę, jak opisano w krokach 2.1.3 i 2.1.4, z współczynnikiem molarnego wygaszania albuminy wynoszącym 43 800 L mol−1 cm−1 (przy 280 nm).
    3. Przygotuj roztwór zapasowy albuminy w różnych stężeniach.
    4. Dostosuj krok 3.5, aby „pobrać pipetą 40 µL PBS do dołka wybranego do pomiaru i dodać 10 µL trombiny (20 U/mL)”. Dostosuj krok 3.6, aby „natychmiast zainicjować krzepnięcie, dodając 50 µL fibrynogenu (12 mg/mL) wraz z 100 µL albuminy (0, 40, 80, 100, 120, 160, 200 mg/mL) do wielu dołków, aby uzyskać końcowe stężenie 3 mg/mL fibrynogenu, 1 U/mL trombiny oraz 0, 20, 40, 50, 60, 80, 100 mg/mL albuminy w dołkach.”
    5. Dostosuj krok 4.5, aby „natychmiast zainicjować krzepnięcie, dodając mieszaninę 200 µL albuminy (36, 72, 90, 108, 144, 180 mg/mL) i 140 µL fibrynogenu o stężeniu 7,7 mg/mL do naczyń TEG, aby uzyskać 360 µL roztworu krzepnięcia o końcowym stężeniu 3 mg/mL fibrynogenu, 1 U/mL trombiny oraz 0, 20, 40, 50, 60, 80, 100 mg/mL albuminy w naczyniach TEG.”

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Eksperymenty przedstawione na Rysunku 1 są reprezentatywnymi krzywymi pomiaru mętności skrzepów fibrynowych ludzkich i bydlęcych przy różnych poziomach fibrynogenu. Reprezentatywne krzywe pomiaru TEG dla tworzenia skrzepu fibrynowego przy różnych poziomach fibrynogenu przedstawiono na Rysunku 2. Obie krzywe wykazują, że po okresie utajenia następującym po zainicjowaniu krzepnięcia, mętność skrzepu lub amplituda skrzepu wzrasta w czasie i stabilizuje się pod koni...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Protokół ten demonstruje wykorzystanie dwóch różnych narzędzi do charakterystyki skrzepów, testując uproszczony model skrzepu fibrynogenu/trombiny przy użyciu dostępnych na rynku komponentów. Zarówno testy TEG, jak i zmętnienia są łatwe do przeprowadzenia. Zapewniają one nie tylko badania skrzepów w punkcie końcowym, takie jak maksymalne tworzenie skrzepów (TurbMax i TEGMax) i czasy tworzenia skrzepów (czas Turbai czas TEG), ale także oceniają dynamiczny proces tworzenia skrzep...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
96-dołkowa, przezroczysta, płaska, przezroczysta mikropłytka z płaskim dnemCorning3635Nieobrobiony kopolimer akrylowy, niesterylny
albumina z ludzkiej surowicyMillipore SigmaA1653≥ 96%, liofilizowany proszek
Arium Mini Plus Ultrapure Water SystemSartoriusNADI źródło wody
Albumina surowicy bydlęcejMillipore SigmaA2153≥ 96%, liofilizowany proszek
Jednorazowe kubki i szpilki do TEG 5000 (Clear)HaemoneticsREF 6211
Fibrinogen, Osocze bydlęceMillipore Sigma 341573zawiera ponad 95% białka krzepliwego
Fibrynogen, zubożone w plazmingogen, ludzkie osoczeMillipore Sigma 341578Zawiera ≥ 95% białek krzepnięcia.
Solanka fizjologiczna buforowana fosforanamiMillipore SigmaP3813Proszek, pH 7,4, do przygotowania 1 L roztworów
Chlorek potasuMillipore Sigma60130≥ 99,5% czystości
Fosforan potasu jednozasadowyMillipore SigmaP9791≥
pH-metr SevenEasy98% Mettler ToledoS20
Chlorek soduMillipore Sigma71378≥ Czystość 99,5%
Fosforan sodu dwuzasadowyMillipore Sigma71636≥ 99,5% czystości
System czytnika mikropłytek z wieloma detekcjami SpectraMax M5Urządzenia molekularneM5
TEG 5000 Trombelastograf System analizatora hemostazyHaemonetics07-022
Trombina,milipor bydlęcy Sigma605157
trombina, osocze ludzkie, miliporSigma o605195
o czystości wysokiej aktywności

Bibliografia

  1. Beckman, M. G., Hooper, W. C., Critchley, S. E., Ortel, T. L. Venous Thromboembolism. A Public Health Concern. American Journal of Preventive Medicine. 38, 4 Suppl 495-501 (2010).
  2. Goldhaber, S. Z., Bounameaux, H. Pulmonary embolism and deep vein thrombosis. The Lancet. 379 (9828), 1835-1846 (2012).
  3. Weisel, J. W., Litvinov, R. I. Mechanisms of fibrin polymerization and clinical implications. Blood. 121 (10), 1712-1719 (2013).
  4. Weisel, J. W. Fibrin assembly. Lateral aggregation and the role of the two pairs of fibrinopeptides. Biophysical Journal. 50 (6), 1079-1093 (1986).
  5. Tripathi, M. M., et al. Clinical evaluation of whole blood prothrombin time (PT) and international normalized ratio (INR) using a Laser Speckle Rheology sensor. Scientific Reports. 7 (1), 1-8 (2017).
  6. Ryan, E. A., Mockros, L. F., Weisel, J. W., Lorand, L. Structural origins of fibrin clot rheology. Biophysical Journal. 77 (5), 2813-2826 (1999).
  7. Carr, M. E., Hermans, J. Size and Density of Fibrin Fibers from Turbidity. Macromolecules. 11 (1), 46-50 (1978).
  8. Carr, M. E., Shen, L. L., Hermans, J. A. N., Chapel, H. Mass-Length Ratio of Fibrin Fibers from Gel Permeation and Light Scattering. 16, 1-15 (1977).
  9. Gabriel, D. A., Muga, K., Boothroyd, E. M. The Effect of Fibrin Structure on Fibrinolysis. , 24259-24263 (1992).
  10. Wolberg, A. S., Gabriel, D. A., Hoffman, M. Analyzing fibrin clot structure using a microplate reader. Blood Coagulation and Fibrinolysis. 13 (6), 533-539 (2002).
  11. da Luz, L. T., Nascimento, B., Rizoli, S. Thrombelastography (TEG): practical considerations on its clinical use in trauma resuscitation. Scandinavian Journal of Trauma, Resuscitation and Emergency Medicine. 21 (1), 29(2013).
  12. Whitten, C. W., Greilich, P. E. Thromboelastography: past, present, and future . Anesthesiology: The Journal of the American Society of Anesthesiologists. 92 (5), 1223-1225 (2000).
  13. Ranucci, M., Laddomada, T., Ranucci, M., Baryshnikova, E. Blood viscosity during coagulation at different shear rates. Physiological Reports. 2 (7), 1-7 (2014).
  14. Zeng, Z., Fagnon, M., Nallan Chakravarthula, T., Alves, N. J. Fibrin clot formation under diverse clotting conditions: Comparing turbidimetry and thromboelastography. Thrombosis Research. 187, 48-55 (2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Analiza m tno citworzenie skrzepu fibrynowegoanaliza spektrometrycznaanaliza TEGpomiar wytrzyma o ci skrzepuanaliza struktury w kienpor wnanie warunk w krzepni ciaskrzepy ludzkie i bydl ce
Wykorzystanie zmętnienia i tromboelastografii do charakterystyki skrzepów komplementarnych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.