Wykorzystanie zmętnienia i tromboelastografii do charakterystyki skrzepów komplementarnych

Summary

Fibryna jest odpowiedzialna za tworzenie skrzepów podczas hemostazy i zakrzepicy. Testy zmętnienia i małozakrzepowości (TEG) mogą być wykorzystywane jako narzędzia synergiczne, które zapewniają komplementarną ocenę skrzepu. Te dwie techniki razem mogą dać lepszy wgląd w to, jak warunki krzepnięcia wpływają na tworzenie skrzepów fibryny.

Abstract

Zakrzepica jest główną przyczyną zgonów na całym świecie. Fibryna (ogen) jest białkiem odpowiedzialnym przede wszystkim za tworzenie się skrzepów lub zakrzepicę. Dlatego scharakteryzowanie tworzenia się skrzepów fibryny jest korzystne dla badania zakrzepicy. Zmętnienie i tromboelastografia (TEG) są szeroko stosowane w testach in vitro do monitorowania tworzenia się skrzepów. Zmętnienie dynamicznie mierzy przepuszczalność światła przez strukturę skrzepu fibryny za pomocą spektrometru i jest często stosowane w laboratoriach badawczych. TEG to specjalistyczna technika lepkosprężysta, która bezpośrednio mierzy siłę skrzepów krwi i jest stosowana głównie w warunkach klinicznych do oceny hemostazy pacjentów. Za pomocą tych dwóch narzędzi w badaniu tym opisano metodę charakteryzowania skrzepu fibryny in vitro przy użyciu uproszczonego modelu skrzepu fibrynogenu/trombiny. Trendy danych w obu technikach porównano w różnych warunkach krzepnięcia. Skrzepy fibryny ludzkiej i bydlęcej powstawały w tym badaniu równolegle, ponieważ czynniki krzepnięcia bydła są często stosowane jako substytuty ludzkich czynników krzepnięcia w warunkach klinicznych i badawczych. Wyniki pokazują, że TEG i zmętnienie śledzą tworzenie się skrzepów za pomocą dwóch różnych metod, a gdy są stosowane razem, dostarczają uzupełniających się informacji o sile skrzepu i strukturze włókien w różnych warunkach krzepnięcia.

Introduction

Zakrzepica to patologiczne tworzenie się skrzepu krwi w organizmie, który blokuje krążenie krwi, prowadząc do wysokiej zachorowalności i śmiertelności na całym świecie. Rocznie na 1000 osób przypada od 1 do 2 przypadków żylnej choroby zakrzepowo-zatorowej i od 2 do 3 przypadków chorób naczyniowych wywołanych zakrzepicą^1,2. Przedstawiono metodę wykorzystującą tromboelastografię (TEG) i zmętnienie do monitorowania tworzenia się skrzepów w różnych warunkach krzepnięcia. Fibryna (ogen) jest podstawowym białkiem odpowiedzialnym za tworzenie się skrzepów w organizmie. W końcowych etapach kaskady krzepnięcia fibrynopeptydy są oddzielane od fibrynogenu przez trombinę, inicjując polimeryzację nierozpuszczalnych monomerów fibryny w miarę rozwoju skrzepu^3,4. Aby zrozumieć tworzenie się skrzepów w patologicznej zakrzepicy, konieczne jest scharakteryzowanie powstawania fibryny w różnych warunkach krzepnięcia. Do zbadania tworzenia się skrzepów fibryny in vitro wykorzystano wiele testów monitorowania skrzepów. Czas protrombinowy (PT/INR) i czas częściowej tromboplastyny po aktywacji (aPTT) to dwa powszechne testy kliniczne, które mierzą integralność określonego szlaku krzepnięcia. Jednak używają czasu jako jedynej zmiennej, która nie daje żadnych wskazówek co do fizycznych właściwości skrzepu⁵. Mikroskopia elektronowa umożliwia wizualizację mikrostruktury całkowicie uformowanego skrzepu fibrynowego, ale nie dostarcza żadnych informacji o samym procesie tworzenia skrzepu⁶. Spośród wszystkich testów, testy zmętnienia i TEG oferują możliwość dynamicznego śledzenia charakterystyki skrzepu w czasie. Techniki te umożliwiają pomiar kompleksowych profili krzepnięcia, a tym samym zapewniają pewne korzyści w porównaniu z innymi narzędziami do charakteryzowania skrzepów fibryny.

W szczególności, testy mętności (lub mętność skrzepów) są szeroko stosowane do zastosowań badawczych i klinicznych ze względu na ich prostotę implementacji i szeroką dostępność spektrometrów w laboratoriach badawczych. Test ten umożliwia dynamiczny pomiar przepuszczalności światła przez tworzący się skrzep poprzez wykonywanie indywidualnych powtarzalnych odczytów na określonej długości fali (najczęściej na długości fali w zakresie 350 – 700 nm)7. Temperaturę w komorze odczytu można również regulować. Gdy tworzy się żel fibrynowy, ilość światła przepływającego przez sieć białkową jest zmniejszana, powodując wzrost absorbancji w czasie. Podobnie, absorbancja zmniejsza się, gdy sieć skrzepów ulega degradacji. Testy zmętnienia można łatwo multipleksować przy użyciu formatu płytki wielodołkowej, co pozwala na wysokoprzepustowe badanie przesiewowe próbek zarówno na płytkach 96-, jak i 384-dołkowych. Na podstawie krzywej śledzenia zmętnienia (pomiar absorbancji w czasie) można wyprowadzić kilka cech skrzepu, które obejmują: maksymalne zmętnienie, czas do maksymalnego zmętnienia, czas do wystąpienia krzepnięcia i szybkość tworzenia się skrzepów (Vmax). Stosunek masy do długości włókien fibryny można również wyprowadzić z surowych danych dotyczących zmętnienia, aby oszacować grubość włókna fibryny^8,9,10.

TEG jest głównie używany w warunkach klinicznych do oceny hemostazy i lizy skrzepów u pacjentów. Jest również powszechnie stosowany w zastosowaniach chirurgicznych do określania, kiedy należy podawać leki przeciwfibrynolityczne lub hemostatyczne produkty krwiopochodne^11,12. Tworzenie się skrzepów zachodzi wewnątrz kubka TEG, a wszystkie składniki krzepnięcia są dodawane do kubka przed rozpoczęciem testu. Miseczka z rozwijającym się skrzepem fizycznie obraca się względem kołka, który jest włożony do jego środka, a elektromechaniczny czujnik skręcania mierzy rosnącą wytrzymałość lepkosprężystą skrzepu. Test ten przeprowadza się zazwyczaj w temperaturze fizjologicznej 37 °C; Jednak temperaturę można regulować ręcznie na instrumencie. Maksymalna amplituda (MA), szybkość reakcji (R), czas kinetyki (K), kąt α (kąt) i czas do maksymalnej amplitudy (TMA) są pobierane przez oprogramowanie TEG z dynamicznego śledzenia TEG. Wartości te są zwykle porównywane z normalnymi zakresami klinicznymi w celu oceny stanu krzepnięcia pacjenta. Chociaż TEG nie jest dokładnie lepkościomierzem, ponieważ mierzy siłę skrzepu w jednostkach milimetrowych, dostarcza ważnych danych dotyczących lepkosprężystego skrzepu i funkcjonuje jako cenne narzędzie do podejmowania decyzji klinicznych dla lekarzy, którzy decydują o podawaniu określonych produktów krwiopochodnych i dostosowywaniu dawkowania terapeutycznego¹³. Gdy zarówno testy TEG, jak i zmętnienia są wykorzystywane razem, dostarczają uzupełniających się informacji o charakterystyce skrzepów, ponieważ siła skrzepu i kinetyka są łatwo ekstrahowane z TEG, a grubość włókien fibrynowych można uzyskać za pomocą optycznych pomiarów zmętnienia.

Ponieważ fibryna jest kluczowym składnikiem skrzepu krwi, charakterystyka skrzepu fibryny w różnych warunkach tworzenia skrzepów może dostarczyć cennych informacji na temat tego, jak konkretna zmienna przyczynia się do procesu tworzenia skrzepów i ostatecznych właściwości skrzepu. Zrozumienie tego może dostarczyć wskazówek dotyczących diagnozowania zakrzepicy i opracowywania środków terapeutycznych. Aby uzyskać bardziej reprezentatywną charakterystykę skrzepów fibryny, osocze można podstawić w celu monitorowania tworzenia się skrzepów, ponieważ bardziej przypomina warunki krzepnięcia in vivo niż uproszczony system modelowy fibrynogenu/trombiny. Jednak ze względu na skomplikowany charakter kaskady krzepnięcia, tworzenie się skrzepów za pomocą osocza zwiększa złożoność, utrudniając wyizolowanie wpływu poszczególnych czynników. Wykorzystanie uproszczonego modelu fibrynogenu/trombiny zapobiega konieczności inicjowania całej kaskady krzepnięcia, co pozwala na wyizolowanie końcowego etapu tworzenia fibryny. Poprzez włączenie dwóch głównych składników tworzących fibrynę (fibrynogenu i trombiny), konfiguracja ta tworzy wysoce kontrolowane warunki tworzenia skrzepów. Ważne jest również, aby pamiętać, że chociaż stosowany jest tutaj uproszczony model skrzepu, protokół ten może być również wykorzystany do scharakteryzowania bardziej złożonych skrzepów poprzez uwzględnienie dodatkowych czynników krzepnięcia. W tym badaniu charakterystyka skrzepów fibryny za pomocą zmętnienia i TEG jest przeprowadzana poprzez różnicowanie stężeń fibrynogenu i trombiny, siły jonowej, pH i całkowitego stężenia białka w roztworze krzepnięcia, aby naśladować różne warunki krzepnięcia in vivo¹⁴. Szczegółowe informacje na temat tych zmian w protokole zostały zawarte w sekcji 5.

Protocol

1. Przygotowanie soli fizjologicznej buforu fosforanowego (PBS)

UWAGA: PBS był używany w tym badaniu, ponieważ opisane testy nie wymagały dodawania wapnia. Ważne jest, aby pamiętać, że podczas dodawania wapnia, często wykorzystywanego do ponownego zwapnienia produktów z krwi cytrynowej, należy unikać PBS, ponieważ wiadomo, że wapń wytrąca się w fosforanowych.

1. Sporządzić bufor o 0,01 M i pH 7,4 PBS, mieszając 137 mM chlorku sodu, 1,8 mM jednozasadowego fosforanu potasu, 10 mM dwuzasadowego fosforanu sodu i 2,7 mM chlorku potasu w wodzie DI.
2. Sprawdź pH buforu za pomocą sondy pH i dostosuj pH za pomocą wodorotlenku sodu lub kwasu solnego w razie potrzeby.
3. Użyj tego PBS do przygotowania testów fibrynogenu i krzepnięcia (o ile nie określono inaczej).
   UWAGA: Zaleca się, aby bufor rozpuścił fibrynogen w proszku, ponieważ ponowne uwodnienie w wodzie DI może spowodować wytrącenie się fibrynogenu nawet w temperaturze 37 °C.

2. Przygotowanie i przechowywanie białek

UWAGA: W całym protokole stężenia białka są przygotowywane w różnych stężeniach dla mętności i TEG, aby umożliwić stały stosunek soli, wody DI, PBS i innych pozostałych czynników w końcowych roztworach krzepnięcia.

1. Przygotowanie i przechowywanie fibrynogenu
   UWAGA: Zanieczyszczenia w komercyjnie dostępnym fibrynogenie obejmują znaczną ilość czynnika XIII, resztkowe ilości innych czynników krzepnięcia, bufor spichrzowy i sole. Wiadomo, że w obecności wapnia czynnik XIII sieciuje sieć skrzepów fibryny. Efekt ten przyczynia się do zaciśnięcia struktury skrzepu i zwiększenia siły skrzepu, wpływając na charakterystykę fibryny. Dostępne na rynku zestawy ćwiczeń mogą być używane do oznaczania poziomów aktywnego czynnika XIIIa. W celu zminimalizowania zmienności spowodowanej przez czynnik XIIIa, doświadczenia powinny być zaprojektowane z wyłączeniem wapnia lub dodatkowe kroki w celu usunięcia czynnika XIIIa powinny zostać włączone do niniejszego protokołu. Ponadto należy ocenić sól magazynującą białko i rodzaj bufora, a w razie potrzeby można przeprowadzić dializę w celu przeniesienia do preferowanego buforu roboczego testu.
   1. Zważyć i podsycić liofilizowany fibrynogen w proszku (bydlęcy lub ludzki) w probówkach o pojemności 2 ml po 20 mg białka na probówkę i przechowywać podwielokrotności w temperaturze -20 °C przez okres do 6 miesięcy.
   2. Pozwól podwielokrotności fibrynogenu zaaklimatyzować się do temperatury pokojowej (RT) przez 10 minut w dniu eksperymentu. Rozpuścić fibrynogen przez dodanie 600 μl PBS do podwielokrotności 20 minut przed użyciem.
   3. Weź 10 μl fibrynogenu i rozcieńcz go 190 μl PBS w przezroczystej dla promieniowania UV 96-dołkowej płytce lub kuwecie. Określ stężenie fibrynogenu, mierząc absorbancję przy 280 nm za pomocą komercyjnego spektrometru i jego oprogramowania.
   4. Oblicz stężenie fibrynogenu (mg/ml) za pomocą prawa Beera. Przygotować roztwory podstawowe fibrynogenu o stężeniu 12 mg/ml (do oznaczania zmętnienia) i 3,2 mg/ml (do TEG) przez dalsze rozcieńczenie PBS (o ile nie określono inaczej).
      UWAGA: Oznaczanie stężenia fibrynogenu (mg / ml) według prawa Beera:
      
      Molowy współczynnik ekstynkcji: ɛ = 513,400 L ^{mol-1 cm-1} przy 280 nm; Długość ścieżki (L); współczynnik rozcieńczenia (D); Masa cząsteczkowa (MW) = 340 000 Da. ɛ otrzymuje się przez pomnożenie E^0,1% = 1,51 (280 nm) (współczynnik ekstynkcji podany przez dostawcę) przez MW.
2. Przygotowanie i przechowywanie trombiny
   1. Rozpuścić liofilizowaną trombinę (bydlęcą lub ludzką, 1000 j.) w 200 μl wody dejonizowanej (DI) w celu uzyskania 200 μl 5000 U/ml roztworu podstawowego trombiny.
   2. Przygotować 5 μl (20 j./probówkę) podwielokrotności roztworu i przechowywać podwielokrotności zamrożone w temperaturze -20 °C.
   3. Rozmrażać podwielokrotności trombiny w temperaturze pokojowej przez 15 minut w dniu doświadczenia i przygotować roztwór roboczy trombiny, rozcieńczając go do 20 U/ml w przypadku testów mętności i 18 U/ml w przypadku TEG wodą demineralizowaną (o ile nie określono inaczej).
      UWAGA: Należy podjąć środki ostrożności w celu utrzymania aktywności enzymów, którą można osiągnąć poprzez utrzymywanie enzymów na lodzie podczas rozmrażania i stosowania; jednak nie zaobserwowano zmniejszenia aktywności trombiny po zastosowaniu bezpośrednio po rozmrożeniu w RT.

3. Zmętnienie

1. Do monitorowania zmętnienia skrzepów w czasie należy użyć dowolnego dostępnego na rynku spektrometru o zakresie absorbancji 350 - 700 nm oraz odpowiedniego oprogramowania (patrz Tabela materiałów).
2. Włącz spektrometr i otwórz odpowiednie oprogramowanie analityczne.
3. Wybierz płytę 1 i otwórz zakładkę Ustawienia płyty. Kliknij Tryb ABS i Kinetyczny, aby monitorować odczyt absorbancji dynamicznej w czasie.
4. Wybierz 550 nm (lub dowolną wartość z zakresu 350 – 700 nm) w zakładce długości fali i ustaw całkowity czas pracy na 60 minut w odstępie 30 s w zakładce pomiaru czasu. Wybierz interesujące Cię studnie do odczytania, podświetlając dołki. W razie potrzeby dostosuj inne ustawienia.
   UWAGA: Wybór długości fali na dolnym końcu zakresu (około 350 nm) zapewnia lepszą czułość, ale absorbancja może również przekroczyć granicę wykrywalności spektrometru. Najczęściej wykorzystywaną długością fali do pomiaru zmętnienia jest 405 nm w literaturze; Jednak protokół ten wykorzystuje 550 nm, aby zapewnić, że dynamiczne wartości zmętnienia mieszczą się w granicy wykrywalności dla wszystkich eksperymentów. Wybrany interwał odczytu powinien być jak najkrótszy, aby osiągnąć najwyższy poziom czułości testu. Będzie to zależało od spektrometru i liczby studzienek odczytywanych podczas danego testu.
5. Weź przezroczystą dla promieni UV 96-dołkową płytkę. Odpipetować 140 μl PBS do studzienki wybranej do odczytu. Dodać i wymieszać 10 μl trombiny (20 U/ml) w studzience.
   UWAGA: Nie należy używać płytek testowych o wysokim poziomie wiązania, aby zminimalizować niespecyficzne wiązanie białka z powierzchnią studzienki. Może to wpływać na dyspersję białek w roztworze i powodować dużą zmienność testu.
6. Natychmiast rozpocząć krzepnięcie, dodając 50 μl fibrynogenu (12 mg/ml) do studzienki w celu uzyskania 200 μl roztworu krzepnięcia o końcowym stężeniu 3 mg/ml fibrynogenu i 1 U/ml trombiny. Wymieszaj zawartość w studzience, pipetując pięć razy w górę i w dół, uważając, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków w roztworze, ponieważ będą one wpływać na absorbancję poprzez rozpraszanie światła.
   UWAGA: Pipety wielokanałowej należy używać w przypadku jednoczesnego umieszczania wielu próbek skrzepów na tej samej płytce. Rejestruj różnice czasu między studzienkami i okres czasu przed pierwszym odczytem przez urządzenie, aby zrównoważyć czas krzepnięcia.
7. Umieść 96-dołkową płytkę w uchwycie i kliknij Start w oprogramowaniu, aby rozpocząć odczyt zmętnienia w RT.
   UWAGA: Jeśli przeprowadzasz test w podwyższonej temperaturze, spektrometr, płytka i odczynniki muszą być utrzymywane w żądanej temperaturze przed inicjacją skrzepu.
8. Po zakończeniu pobierz dane dotyczące zmętnienia i uzyskaj krzywą śledzenia zmętnienia, wykreślając zmiany absorbancji w czasie w oprogramowaniu do kreślenia.
9. Wyznacz^{Turb Max} (maksymalne zmętnienie wskazujące na grubość włókien fibryny i gęstość sieci fibryny), biorąc maksymalną wartość absorbancji krzywej w czasie.
   UWAGA: Stosunek masy do długości włókien fibrynowych można obliczyć na podstawie wartości zmętnienia za pomocą równania podanego w poniższym manuskrypcie⁸.
10. Oblicz 90% maksymalnego zmętnienia, mnożąc Turb^Max przez 90%. Wyznacz^czas turbowania, obliczając czas od zainicjowania skrzepu do 90% maksymalnego zmętnienia.
    UWAGA: Czas do osiągnięcia 90% maksymalnego zmętnienia jest bardziej wiarygodnym wskaźnikiem niż czas do bezwzględnego maksymalnego zmętnienia, ponieważ lepiej odzwierciedla czas krzepnięcia, eliminując bardzo zmienny końcowy okres tworzenia się skrzepu. Dodatkowe parametry krzepnięcia, takie jak czas powstania skrzepu (czas od rozpoczęcia badania do momentu, gdy absorbancja zaczyna wzrastać) oraz szybkość tworzenia się skrzepów (Vmax, największe nachylenie obszaru liniowego na krzywej śledzenia zmętnienia) można również uzyskać ze śladów zmętnienia.

4. Tromboelastografia (TEG)

1. Włączyć analizator tromboelastografu i poczekać, aż temperatura ustabilizuje się na poziomie 37 °C.
2. Otwórz oprogramowanie TEG. Po zalogowaniu utwórz nazwę eksperymentu w sekcji Identyfikator.
3. Przeprowadź e-test dla wszystkich kanałów, postępując zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na ekranie. Ustaw dźwignię z powrotem w pozycji obciążenia po zakończeniu wszystkich kontroli.
   UWAGA: Wymagany jest e-test TEG, który należy przeprowadzać za każdym razem podczas korzystania z przyrządu. Testy kontroli krzepnięcia TEG (przy użyciu kontroli poziomu TEG 1 i poziomu 2) są wymagane w regularnych odstępach czasu sugerowanych przez producenta, gdy są stosowane do próbek klinicznych.
4. Kliknij zakładkę TEG, wprowadź przykładowe informacje dla kanałów, które będą używane. Umieść przezroczysty, niepowlekany kubek TEG w odpowiednim kanale. Przesuń nośnik do góry i naciśnij dno kubka 5 razy, aby przymocować kołek do pręta skrętnego. Opuść nosidełko i dociśnij kubek w dół do podstawy nosidełka, aż "usłyszysz kliknięcie".
5. Pobrać pipetą 20 μl roztworu trombiny (18 j/ml) do kubka TEG. Natychmiast rozpocząć krzepnięcie, dodając 340 μl fibrynogenu (3,2 mg/ml) do kubka TEG, aby uzyskać 360 μl roztworu krzepnięcia o końcowym stężeniu 3 mg/ml fibrynogenu i 1 U/ml trombiny w kubku. Wymieszaj zawartość, pipetując pięć razy w górę i w dół.
   UWAGA: Na tym etapie należy dodać potencjalne czynniki krzepnięcia lub inne interesujące składniki, uważając, aby zawsze utrzymywać końcową objętość 360 μl w kubku TEG.
6. Przesuń pojemnik załadowany kubkiem do góry, przesuń dźwignię do pozycji odczytu i kliknij Start w oprogramowaniu, aby rozpocząć odczyt TEG.
7. Po zakończeniu TEG (po około godzinie) pobierz parametry TEG i uzyskaj krzywą śledzenia TEG, wykreślając amplitudę w czasie w oprogramowaniu do kreślenia.
8. Zbierz MA jako TEG^Max (maksymalna amplituda wskazuje na siłę skrzepu) i TMA jako^{TEG Time} (czas do maksymalnej amplitudy) z oprogramowania.
   UWAGA: MA jest obliczana przez oprogramowanie jako maksymalna amplituda w czasie, w którym amplituda ma mniej niż 5% odchylenia w okresie 3 minut. TMA określa się jako czas od maksymalnej szybkości wytwarzania skrzepliny (w pobliżu punktu podziału) do MA. Inne parametry mogą być również przydatne do oceny podczas wykonywania analizy skrzepu. Niektóre przykłady tych parametrów obejmują: czas R (czas od rozpoczęcia badania do momentu, gdy amplituda osiągnie 2 mm), K (czas od końca R do momentu, gdy amplituda osiągnie 20 mm), alfa (nachylenie linii między R i K) i CLT (czas lizy skrzepu).

5. Charakterystyka fibryny w różnych warunkach krzepnięcia

UWAGA: Przeprowadzaj eksperymenty charakterystyki fibryny, modulując określoną zmienną w roztworach krzepnięcia, taką jak: stężenie fibrynogenu i trombiny, siła jonowa, pH i całkowite stężenie białka. Preparaty doświadczalne z tymi przykładowymi zmiennymi są opisane w tym rozdziale; Jednak inne czynniki krzepnięcia i warunki zainteresowania również mogą zostać zastąpione. Starannie wybierz odpowiedni system buforowy, biorąc pod uwagę każde unikalne wymagania testu. W przypadku testów zmętnienia i TEG należy uwzględnić kontrolę tylko bufora, aby zapewnić dokładne odejmowanie tła podczas analizy wpływu tych zmiennych.

1. Zmienne stężenie fibrynogenu (1, 2, 3, 4, 5 mg/ml)
   1. Dostosuj krok 2.1.4, aby przygotować zapas fibrynogenu w różnych stężeniach (4, 8, 12, 16, 20 mg/ml dla testów mętności i 1,1, 2.1, 3.2, 4.2, 5,3 mg/ml dla TEG).
   2. Dostosuj krok 3.6, aby "dodać 50 μl fibrynogenu (4, 8, 12, 16, 20 mg / ml) do wielu dołków płytki 96-dołkowej" w celu przeprowadzenia testów zmętnienia.
   3. Dostosuj krok 4.5, aby "dodać 340 μl fibrynogenu (1.1, 2.1, 3.2, 4.2, 5.3 mg/ml) do przezroczystych kubków TEG" dla TEG.
2. Zmienne stężenie trombiny (0,1, 0,3, 0,6, 0,8, 1, 2,5, 5, 10 U/ml)
   1. Dostosować krok 2.2.3, aby przygotować trombinę o różnych stężeniach (2, 6, 12, 16, 20, 50, 100, 200 U/ml dla testów mętności i 1,8, 5,4, 10,8, 14,4, 18, 45, 90, 180 U/ml dla TEG).
   2. Dostosuj krok 3.5, aby "dodać 10 μl trombiny (2, 6, 12, 16, 20, 50, 100, 200 U/ml) do wielu dołków płytki 96-dołkowej" do testów zmętnienia.
   3. Ustaw krok 4.5 do "odpipetuj 20 μl trombiny (1.8, 5.4, 10.8, 14.4, 18, 45, 90, 180 U/ml) do przezroczystych kubków TEG" dla TEG.
3. Zmienna siła jonowa (0,05, 0,13, 0,14, 0,15, 0,16, 0,17 i 0,3 M)
   1. Rozpuścić chlorek sodu (21, 101, 111, 121, 131, 141 i 271 mM) wraz z 1,8 mM jednozasadowego fosforanu potasu, 10 mM dwuzasadowego fosforanu sodu i 2,7 mM chlorku potasu w wodzie DI, aby uzyskać 0,01 M roztwory PBS o różnej sile jonowej.
   2. Dostosuj krok 1.3, aby użyć PBS wykonanego o różnej sile jonowej do przygotowania roztworów fibrynogenu i krzepnięcia zarówno do testów zmętnienia, jak i TEG.
4. Różne pH (5,8, 6,6, 7,3, 7,4, 7,5 i 8,0)
   1. Rozpuścić fosforan sodu dwuzasadowy (0,7, 3,2, 7,7, 8,1, 8,4, 9,5 mM) i fosforan potasu jednozasadowy (8,2, 6,0, 2,0, 1,7, 1,4, 0,5 mM) wraz z 2,7 mM chlorku potasu i chlorkiem sodu (153, 147, 138, 137, 136, 134 mM) w celu uzyskania 0,01 M roztworów PBS o zmiennym pH i końcowej sile jonowej w 0,165 M.
   2. Sprawdź wartość pH buforu za pomocą sondy pH i w razie potrzeby dostosuj pH.
   3. Dostosuj krok 1.3, aby użyć PBS wykonanego o różnym pH do przygotowania fibrynogenu i roztworu krzepnięcia zarówno do testów zmętnienia, jak i TEG.
5. Zmienne stężenie albuminy (0, 20, 40, 50, 60, 80, 100 mg/ml)
   1. Rozpuścić 2 g liofilizowanej albuminy w 500 μl PBS w temperaturze pokojowej przez 20 minut w dniu doświadczenia.
   2. Oznaczyć stężenie albuminy przy użyciu tej samej procedury, co w krokach 2.1.3 i 2.1.4 przy współczynniku ekstynkcji molowej wynoszącym 43 800 L mol⁻¹ cm⁻¹ (przy 280 nm) dla albuminy.
   3. Przygotuj bulion albuminowy w różnych stężeniach.
   4. Dostosuj krok 3.5 do "Odpipetuj 40 μl PBS do studzienki wybranej do odczytu i dodaj 10 μl trombiny (20 U/ml)". Dostosuj krok 3.6 do "Natychmiast rozpocznij krzepnięcie, dodając 50 μl fibrynogenu (12 mg / ml) ze 100 μl albuminy (0, 40, 80, 100, 120, 160, 200 mg / ml) do wielu studzienek do końcowego stężenia 3 mg / ml fibrynogenu, 1 U / ml trombiny i 0, 20, 40, 50, 60, 80, 100 mg / ml albuminy w studzienkach".
   5. Dostosuj krok 4.5 do "Natychmiast rozpocznij krzepnięcie, dodając mieszaninę 200 μl albuminy (36, 72, 90, 108, 144, 180 mg/ml) i 140 μl 7,7 mg/ml fibrynogenu do kubków TEG, aby uzyskać 360 μl roztworu krzepnięcia o końcowym stężeniu 3 mg / ml fibrynogenu, 1 U / ml trombiny i 0, 20, 40, 50, 60, 80, 100 mg/ml albuminy w kubkach TEG."

Results

Eksperymenty pokazane w Rysunek 1 to reprezentatywne krzywe śledzenia mętności ludzkich i bydlęcych skrzepów fibryny na różnych poziomach fibrynogenu. Reprezentatywne krzywe śledzenia TEG dla tworzenia skrzepów fibryny przy różnych poziomach fibrynogenu są pokazane na Rysunek 2. Obie krzywe śledzenia pokazują, że po okresie opóźnienia po zainicjowaniu skrzepu, zmętnienie skrzepu lub amplituda skrzepu wzrasta z czasem i wyrównuje się pod koniec tworzenia skrzepu. Wartość k...

Discussion

Protokół ten demonstruje wykorzystanie dwóch różnych narzędzi do charakterystyki skrzepów, testując uproszczony model skrzepu fibrynogenu/trombiny przy użyciu dostępnych na rynku komponentów. Zarówno testy TEG, jak i zmętnienia są łatwe do przeprowadzenia. Zapewniają one nie tylko badania skrzepów w punkcie końcowym, takie jak maksymalne tworzenie skrzepów (Turb^Max i TEG^Max) i czasy tworzenia skrzepów (czas Turba^{i czas} TEG), ale także oceniają dynamiczny proces tworzenia skrzep...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-dołkowa, przezroczysta, płaska, przezroczysta mikropłytka z płaskim dnem	Corning	3635	Nieobrobiony kopolimer akrylowy, niesterylny
albumina z ludzkiej surowicy	Millipore Sigma	A1653	≥ 96%, liofilizowany proszek
Arium Mini Plus Ultrapure Water System	Sartorius	NA	DI źródło wody
Albumina surowicy bydlęcej	Millipore Sigma	A2153	≥ 96%, liofilizowany proszek
Jednorazowe kubki i szpilki do TEG 5000 (Clear)	Haemonetics	REF 6211
Fibrinogen, Osocze bydlęce	Millipore Sigma 341573		zawiera ponad 95% białka krzepliwego
Fibrynogen, zubożone w plazmingogen, ludzkie osocze	Millipore Sigma 341578		Zawiera ≥ 95% białek krzepnięcia.
Solanka fizjologiczna buforowana fosforanami	Millipore Sigma	P3813	Proszek, pH 7,4, do przygotowania 1 L roztworów
Chlorek potasu	Millipore Sigma	60130	≥ 99,5% czystości
Fosforan potasu jednozasadowy	Millipore Sigma	P9791	≥
pH-metr SevenEasy	98% Mettler Toledo	S20
Chlorek sodu	Millipore Sigma	71378	≥ Czystość 99,5%
Fosforan sodu dwuzasadowy	Millipore Sigma	71636	≥ 99,5% czystości
System czytnika mikropłytek z wieloma detekcjami SpectraMax M5	Urządzenia molekularne	M5
TEG 5000 Trombelastograf System analizatora hemostazy	Haemonetics	07-022
Trombina,	milipor bydlęcy Sigma	605157
trombina, osocze ludzkie, milipor	Sigma o	605195