Pokazujemy automatyzację indukowanych przez człowieka hodowli pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) i różnicowanie neuronów zgodne z automatycznym obrazowaniem i analizą.
Artykuł metodologiczny
Zautomatyzowana produkcja indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych neuronów korowych i dopaminergicznych pochodzących z komórek macierzystych ze zintegrowanym monitorowaniem żywych komórek
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Protokoły ręcznej hodowli i różnicowania dla ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) są trudne do standaryzacji, wykazują dużą zmienność i są podatne na spontaniczne różnicowanie się w niechciane typy komórek. Metody te są pracochłonne i nie są łatwe do przeprowadzenia w eksperymentach na dużą skalę. Aby przezwyciężyć te ograniczenia, opracowaliśmy zautomatyzowany system hodowli komórkowej sprzężony z wysokoprzepustowym systemem obrazowania i wdrożyliśmy protokoły utrzymywania wielu linii hiPSC równolegle i różnicowania neuronów. Opisujemy automatyzację krótkoterminowego protokołu różnicowania wykorzystującego nadekspresję neurogeniny-2 (NGN2) w celu wytworzenia neuronów korowych pochodzących z hiPSC w ciągu 6-8 dni oraz wdrożenie długoterminowego protokołu różnicowania w celu wygenerowania neuronów dopaminergicznych śródmózgowia pochodzących z hiPSC w ciągu 65 dni. Zastosowaliśmy również podejście NGN2 do małocząsteczkowych nerwowych komórek prekursorowych (smNPC) transdukowanych lentiwirusem GFP i ustaliliśmy test wzrostu neurytów na żywych komórkach. Przedstawiamy zautomatyzowany system z protokołami odpowiednimi do rutynowej hodowli hiPSC i różnicowania w neurony korowe i dopaminergiczne. Nasza platforma nadaje się do długoterminowych hodowli bez użycia rąk oraz badań przesiewowych na bazie związków hiPSC, RNAi i CRISPR/Cas9 o wysokiej zawartości/wysokiej przepustowości w celu identyfikacji nowych mechanizmów chorobowych i celów leków.
Wprowadzenie
Ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (hiPSC) są samoodnawiające się i mogą różnicować się w prawie każdym typie dorosłego komórki. Te cechy sprawiają, że hiPSC jest użytecznym narzędziem do modelowania chorób w badaniach podstawowych i odkrywaniu leków1. Ludzki iPSC zachowuje tło genetyczne dawcy, co pozwala na wyprowadzenie typów komórek istotnych dla choroby, które są najbardziej dotknięte/zaangażowane w przebieg choroby, na przykład różne podtypy neuronów dla chorób neurodegeneracyjnych2,3. Ponadto hiPSC pokonuje niektóre ograniczenia zwierzęcych i komórkowych modeli nadekspresji poprzez modelowanie chorób w kontekście człowieka i fizjologicznych poziomów ekspresji białek, a także okazał się cennym atutem w modelowaniu chorób od zaburzeń monogenowych, złożonych i epigenetycznych, a także chorób o późnym początku4.
Pomimo tych korzyści i możliwości, kilka ograniczeń hiPSC nadal wymaga rozwiązania. Obecne protokoły hodowli i różnicowania hiPSC nie są opłacalne, trudne do standaryzacji i są pracochłonne. Ręczne etapy hodowli mogą skutkować dużą zmiennością plonów i fenotypów ze względu na różnice we wzroście i spontaniczne różnicowanie hiPSC. W związku z tym należy zmniejszyć zmienność zależną od eksperymentatora poprzez wdrożenie bardziej ustandaryzowanych technik obsługi i uproszczenie protokołów, co można osiągnąć za pomocą automation5. Ustanowienie zautomatyzowanych protokołów hodowli i różnicowania hiPSC ustanowi wspólne standardy zarówno dla akademickich, jak i przemysłowych projektów badawczych, a także umożliwi tworzenie biologicznie istotnych modeli chorób i bardziej odtwarzalnych wyników.
Poprzednie prace próbowały automatyzacji kultur hiPSC6,7,8, ale ich protokoły były ograniczone do określonych formatów płytek do hodowli komórkowych zależnych od systemu i pozbawionych możliwości adaptacji do różnych formatów testów. Takie systemy są przydatne w łączeniu komórek, ale mogą nie być odpowiednie do automatycznego różnicowania w pożądane typy komórek, fenotypowania chorób i celów przesiewowych. Dodatkowo, opisana została zautomatyzowana platforma na dużą skalę do wyprowadzania, generowania i różnicowania hiPSC9, ale na skalę, którą można osiągnąć tylko przez wysokowydajne laboratoria zajmujące się produkcją linii, co wydaje się atrakcyjne, ale może być nieosiągalne dla wielu laboratoriów akademickich.
Opracowaliśmy w pełni zautomatyzowany system hodowli komórkowych oparty na stacji obsługi cieczy w środowisku filtrowanym przez HEPA (High-Efficiency Particulate Air) w połączeniu z inkubatorem CO2 o dużej pojemności, cytometrem obrazującym w jasnym polu i ramieniem robota do transportu płytek. Składniki te stanowią podstawę stabilnej i powtarzalnej hodowli i różnicowania hiPSC. Uzupełniliśmy system o zautomatyzowany system przechowywania w temperaturze -20 °C do przechowywania związków lub wirusów oraz szybki konfokalny obrazownik żywych komórek z wirującym dyskiem. Wygenerowano niestandardowe protokoły umożliwiające automatyczne wysiewanie komórek, zmiany pożywki, kontrole konfluencji, rozszerzanie komórek i generowanie płytek testowych z obróbką próbki i obrazowaniem płytek, dzięki czemu system jest kompatybilny z badaniami przesiewowymi o wysokiej zawartości i przepustowości. Zautomatyzowany system hodowli komórkowych i obrazowania jest obsługiwany za pomocą oprogramowania sterującego i dostosowanego do potrzeb użytkownika graficznego interfejsu użytkownika (GUI). Graficzny interfejs użytkownika umożliwia użytkownikom importowanie plików CSV zawierających parametry specyficzne dla linii komórkowej potrzebne do wykonania metody. Dodatkowo GUI umożliwia zaplanowanie wielu eksperymentów w dowolnej sekwencji za pomocą wbudowanego widoku kalendarza, co pozwala na pełną kontrolę nad czasem, w którym każda metoda się uruchamia.
Nasz zautomatyzowany system hodowli komórkowej wykorzystuje standardowe prędkości pipetowania, czasy przejścia, progi konfluencji, gęstości wysiewu i średnie objętości z elastycznością do hodowli komórek w różnych formatach płytek (format płytek 96-, 48-, 24-, 12-, 6- lub 1-dołkowych). Dostosowaliśmy niedawno opublikowany protokół krótkoterminowego różnicowania do przekształcania hiPSC w neurony, które mogą dać neurony TUBB3 dodatnie w ciągu 6 dni10,11. Ustaliliśmy również automatyczne różnicowanie i obrazowanie małocząsteczkowych neuronalnych komórek prekursorowych (smNPC) w neuronach konstytutywnie wyrażających GFP w ramach EF1a promotor12 i iPSC w neuronach dopaminergicznych śródmózgowia (mDA), adaptując wcześniej opublikowany protokół hamowania podwójnego SMAD13, który daje neurony mDA w ciągu 65 dni.
Protokół
1. Podstawowe procedury automatyzacji hodowli komórkowych i obrazowania
- Załaduj nowe płytki i końcówki do hodowli
- Otwórz GUI i kliknij przycisk Widok procesu Zasób/Instrument. Aby uruchomić dowolny proces zasobu/instrumentu, wybierz proces zasobu/instrumentu i kliknij przycisk Uruchom proces instrumentu.
- Uruchom proces zasobu RunHepaHood i ponowne ładowanie (patrz krok 1.1.1). Otwórz drzwiczki, załaduj płytki do hodowli komórkowych i jednorazowe końcówki w odpowiedniej pozycji, jak pokazano na wyskakującym obrazie na komputerze sterującym.
- Przetrzyj drzwi 70% etanolem w celu odkażenia i zamknij je. Uruchom proces dekontaminacji urządzenia z graficznego interfejsu użytkownika (patrz krok 1.1.1). System jest sterylizowany promieniowaniem UV przez 30 minut.
- Uzupełnić pożywkę hodowlaną i/lub odczynnik dysocjacyjny
- Wykonaj krok instrumentu RunHepahood (patrz krok 1.1.1). Otwórz przednie drzwiczki stacji obsługi cieczy. Odkazić zbiorniki (zawierające pożywkę, PBS i/lub odczynnik dysocjacyjny) 70% etanolem i umieścić je na pokładzie w przypisanym miejscu (zgodnie z definicją w cfg.csv pliku). Odkręć zbiorniki.
- Odkaż drzwi 70% etanolem i zamknij je. Wyłącz osłonę HEPA, uruchamiając proces zasobu/instrumentu "InitHepaHood" z graficznego interfejsu użytkownika.
- Utwórz nową "Linię komórkową" i projekt w GUI
- Twórz/modyfikuj zdefiniowane przez użytkownika pliki "Cell line" składające się z plików Config (*.cfg.csv), importu (*.imp.csv), zasobów (*.rsv.csv) i przepływu pracy (*.wfl.csv).
- Otwórz GUI i utwórz nową "Linię komórkową", klikając przycisk Dodaj linię komórkową w widoku "Edytor linii komórkowych". Otwiera się kreator, w którym należy wybrać plik konfiguracyjny i wprowadzić nazwę projektu wraz z krótkim opisem.
- Przejdź przez tego kreatora za pomocą zielonego grotu strzałki i potwierdź ustawienia, klikając zielony znacznik wyboru. Utwórz nowy projekt dla wygenerowanej "Linii komórkowej", klikając przycisk Dodaj projekt.
- Wprowadź nazwę i opis projektu oraz zdefiniuj kolor projektu, który będzie widoczny w widoku kalendarza w graficznym interfejsie użytkownika. Przejdź do następnej strony kreatora, klikając grot strzałki.
- Utwórz nową partię, klikając przycisk Dodaj partię i podając krótką nazwę oraz opis w wyskakującym okienku. Wybierz wszystkie kroki procesu i zaplanuj czas rozpoczęcia dla każdego z nich etapu procesu. Zamknij okno, klikając OK.
- Wykonaj zautomatyzowaną metodę za pomocą graficznego interfejsu użytkownika
- Przejdź do widoku kalendarza w graficznym interfejsie użytkownika i kliknij przycisk Dodaj krok procesu.
- Zaznacz linię Komórka i po przejściu do następnej strony kreatora wybierz projekt. Zaznacz partię, która ma zostać użyta i kliknij grot strzałki skierowany w prawo. W zależności od zastosowanej metody, partie muszą być albo puste (w celu otrzymania nowych płytek), albo zawierać płytki hodowlane lub płytki testowe (wszystkie inne procesy).
- Przejdź do następnej strony kreatora i wybierz krok procesu, który ma zostać wykonany. Przejdź do ostatniej strony tego kreatora i zaplanuj eksperyment. W sekcji "Szczegóły parametru" można modyfikować zmienne, które są potrzebne do uruchomienia metody. Potwierdź, klikając OK.
- Ładowanie płytek do hodowli i testów do inkubatora CO2
UWAGA: Płytki 1-dołkowe są definiowane jako płytki hodowlane, ponieważ są powszechnie używane do masowania komórek. Wszystkie płytki wielodołkowe definiuje się jako płytki do oznaczania.- Wykonaj proces przyrządu "RunHepaHood" z graficznego interfejsu użytkownika zgodnie z opisem w kroku 1.1.1. i otwórz drzwi przed ramieniem robota.
- Przetrzyj spód płytek testowych 70% etanolem i niestrzępiącą się chusteczką, jeśli płytki są załadowane do automatycznego obrazowania. Umieść płytki hodowlane lub testowe na lewej półce. Upewnij się, że orientacja płyty jest prawidłowa. W przypadku płytek testowych studzienka A1 musi być skierowana w stronę ramienia robota, podczas gdy krawędzie płytek hodowlanych muszą być skierowane w prawo.
- Przetrzyj drzwi 70% etanolem w celu odkażenia i zamknij je.
- Wykonaj metodę "Ładowanie płytek hodowlanych" w celu importowania płytek 1-dołkowych lub "Ładowanie płytek testowych" w celu importowania płytek wielodołkowych, jak opisano w kroku 1.4. Użyj pustej partii, aby uruchomić obie metody. Jeśli kody kreskowe płyt są już obecne w tej partii, odznacz je, klikając pola wyboru.
- Transport pojedynczych płytek z półki na platformę inkubatora CO2 za pomocą ramienia robota. Wbudowana stacja wahadłowa do płytek pobiera płytki i przechowuje je w jednym ze stojaków inkubatoraCO2. Komórki są utrzymywane w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
- Rozładunek płytek z inkubatoraCO2
- Wykonaj metodę "Rozładuj płyty" (patrz krok 1.4). Wybierz partię zawierającą płyty, które mają zostać wyeksportowane. Poszczególne tabliczki można wybierać na podstawie ich kodów kreskowych.
- Przetransportuj płytki z inkubatora CO2 na lewą półkę za pomocą ramienia robota.
- Uruchom okap HEPA, korzystając z procesu przyrządu "RunHepaHood" zgodnie z opisem w kroku 1.1.1. i otwórz drzwi przed ramieniem robota. Usuń płytki, odkaż drzwi 70% etanolem przed ich zamknięciem i wyłącz maskę HEPA.
2. Protokoły automatyzacji
- Siew talerzy z rur
- Uruchom osłonę HEPA, wykonując proces przyrządu RunHepaHood (patrz krok 1.1.1). Otwórz drzwi przed stacją obsługi cieczy. Wprowadzić probówkę o pojemności 50 ml zawierającą zawiesinę komórek i zdjąć pokrywkę z probówki.
- Otwórz drzwi przed ramieniem robota i załaduj powlekane płytki hodowlane do odbioru komórek na półce. Odkaż i zamknij obie drzwi. Wykonać metodę "Wysiew płytek z rur" (patrz krok 1.4).
- Policz komórki w cytometrze obrazowania w jasnym polu za pomocą funkcji bezpośredniego zliczania komórek. Do zliczania komórek należy użyć 16 dołków jako powtórzeń w formacie płytki 384-dołkowej.
- Przetransportuj 384-dołkową płytkę zliczającą z pokładu do cytometru obrazowania w jasnym polu za pomocą stołu obrotowego za pomocą ramienia robota i rozpocznij proces obrazowania. Cytometr automatycznie określa liczbę komórek na mililitr. Przywróć płytkę liczącą do pierwotnej pozycji za pomocą ramienia robota.
- Za pomocą ramienia robota należy przetransportować powlekaną kulturę lub płytkę testową z półki na stanowisko pipetujące. Usunąć otoczkę i komórki nasienne w liczbie i objętości odpowiedniej dla formatu płytki (patrz Tabela 1). Przenieść płytkę do wytrząsarki pokładowej na 10 s przy 500 obr./min w celu rozprowadzenia komórek i przenieść do inkubatora CO2 .
- Zautomatyzowana ocena zbieżności
- Wykonaj metodę "Sprawdź zbieganie się" zgodnie z opisem w kroku 1.4. Wybierz partię, która zawiera co najmniej jedną płytkę hodowlaną i nie zawiera płytek testowych. W sekcji "Szczegóły parametrów" wprowadź "iPSCf_2020" do ustawień akwizycji obrazu i analizy obrazowania.
- Przetransportuj pierwszą płytkę z inkubatora CO2 do cytometru obrazowania w jasnym polu za pomocą stołu obrotowego za pomocą ramienia robota.
- Wykonaj obrazowanie komórek w cytometrze do obrazowania w jasnym polu w celu sprawdzenia konfluencji kolonii hiPSC. Użyj aplikacji "confluence" i zobrazuj 13 pól pasztetu 1-dołkowego i automatycznie oblicz średnią powierzchnię zajmowaną przez komórki.
- Przetransportować płytkę z powrotem do inkubatora CO2 za pomocą ramienia robota. Powtórz kroki 2.2.2. zgodnie z pkt 2.2.4. dla pozostałych płyt.
- Zmiana podłoża na płytkach hodowlanych lub płytkach do oznaczania
- Wykonaj metodę "Zmiana podłoża płytek hodowlanych" zgodnie z opisem w kroku 1.4. i wybierz partię zawierającą tylko płytki hodowlane. Ustaw zmienną wskazującą, czy na etapach pipetowania używane są końcówki, czy igły, w sekcji "Szczegóły parametrów". W celu wymiany podłoża na dowolnej płytce wielodołkowej należy wykonać metodę "Zmiana podłoża płytek testowych" i wybrać partię zawierającą płytki do oznaczania.
- Transportować poszczególne płytki z inkubatora CO2 na pokład za pomocą ramienia robota i zdejmować pokrywę z płytek. Automatycznie przechyl płytki i odessaj stare media, a następnie wyrzuć je do modułu zbiórki odpadów. Dodaj 12 ml świeżej pożywki. Ponownie przykryj płytkę i przetransportuj płytki z powrotem do inkubatora CO2 za pomocą ramienia robota.
- Uprawa poduprawa
UWAGA: Wykonaj proces instrumentu "RunHepaHood" z graficznego interfejsu użytkownika zgodnie z opisem w 1.1.1. i otwórz przednie drzwiczki stacji obsługi cieczy. Załadować pożywkę i odczynnik dysocjacyjny w wymaganych pozycjach (patrz krok 1.2). Jeśli konieczne jest uzupełnienie końcówek, użyj opcji "Ponowne ładowanie" zgodnie z opisem w kroku 1.1. Wprowadzić probówkę o pojemności 50 ml w celu otrzymania zawiesiny komórek i zdjąć pokrywkę z probówki.- Wykonać metodę "Hodowla komórek przylegających" (patrz krok 1.4). Wybierz partię zawierającą płytki hodowlane, które wymagają poduprawy.
- Przetransportować płytki z inkubatora CO2 na pokład za pomocą ramienia robota i zdjąć pokrywę z płytek. Automatycznie przechyl talerze i wyjmij stare nośniki, a następnie wyrzuć je do modułu zbiórki odpadów. Umyj komórki raz 8 ml PBS. Dodaj 8 ml 0,5 mM EDTA do pasażowania na podstawie grudek. Inkubować na pokładzie przez 8 minut.
- Usunąć roztwór EDTA z płytek i wyrzucić go do modułu zbiórki odpadów. Dodać 12 ml świeżej pożywki i przetransportować płytki do shakera. Wstrząsaj z prędkością 2000 obr./min przez 1 minutę, aby usunąć kolonie.
- Zawiesinę komórek należy rozcierać przez pięć cykli pipetowania, aby rozbić kolonie iPSC na mniejszy rozmiar (~50\u201280 μm). Przenieść zawiesinę komórek do probówki o pojemności 50 ml na pokładzie. Komórki nasienne automatycznie zgodnie z opisem w kroku 2.1.5 przy użyciu proporcji podziału 1 do 7.
UWAGA: Opcjonalne, jednokomórkowe pasażowanie. Wygeneruj zawiesinę pojedynczej komórki za pomocą odczynnika do dysocjacji pojedynczych komórek (patrz Tabela materiałów). Zamiast 0,5 mM EDTA w kroku 2.4.2, należy użyć 8 ml odczynnika do dysocjacji pojedynczych komórek i inkubować przez 20 minut w temperaturze 37 °C. Zebrać zawiesinę komórek do probówki o pojemności 50 ml i dodać równą objętość pożywki. Dysocjacja przy użyciu odczynnika do dysocjacji pojedynczych komórek wymaga ręcznego etapu osadzania komórek. Odwirować komórki przy 300 x g przez 3 min. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 12 ml wymaganej pożywki i przystąpić do "Wysiewu płytek z probówek" (patrz krok 2.1). Uzupełnij pożywkę o 2 μM tiazowiwinę w dniu wysiewu, jeśli stosuje się jednokomórkową zawiesinę hiPSC.
- Zautomatyzowane obrazowanie o wysokiej zawartości i wysokiej przepustowości
UWAGA: Ustawienia pomiaru muszą być dostępne (patrz Plik uzupełniający 1: krok 1.1). Płytki testowe do obrazowania są dostępne w inkubatorze.- Wykonaj metodę "Obrazowanie" (patrz krok 1.4). Należy wybrać partię, która zawiera co najmniej jedną płytkę do oznaczania i nie zawiera płytki hodowlanej. W sekcji "Szczegóły parametru" wprowadź typ płytki, definicje płytki (dla standardowych 96-dołkowych płytek obrazowych: "Plate-96-20170918113842") oraz nazwę ustawienia pomiaru.
- Przenieś płytkę testową za pomocą stołu obrotowego do automatycznego mikroskopu konfokalnego za pomocą ramienia robota, aby rozpocząć proces obrazowania. Odzyskać płytkę pod koniec obrazowania z mikroskopu i przetransportować ją z powrotem do inkubatora CO2 . Powtórz proces pozostałych płytek w partii.
3. Zautomatyzowana konserwacja i rozbudowa hiPSC
- Sekwencja zautomatyzowanych kontroli konfluencji, zmian pożywki i uprawy
- Komórki nasienne na płytkach 1-dołkowych metodą "Wysiew płytek z probówek" (patrz krok 2.1). Alternatywnie, można zaimportować ręcznie wysiewane płytki 1-dołkowe za pomocą metody "Ładowanie płytki hodowlanej" (patrz krok 1.5).
- Zaplanuj codzienne automatyczne kontrole konfluencji, aby monitorować wzrost kolonii od 1 do 6 dnia hodowli pod kątem iPSC (patrz krok 2.2).
- Odświeżać pożywkę co drugi dzień przy użyciu metody "Zmiana pożywki na płytkach hodowlanych" (patrz krok 2.3). Na jedną płytkę stosuje się 12 ml pożywki.
- W dniu 6 rozpocznij proces "Uprawa podkuluarowa" (patrz krok 2.4.).
4. Automatyczne różnicowanie
- Ludzkie neurony iPSC do korowych neuronów NGN2
UWAGA: Ręczne przygotowanie hiPSC. Protokół obejmuje nadmierną ekspresję NGN2 przy użyciu wektorów lentiwirusowych do dostarczania. Transdukuj hiPSC lentiwirusem NGN2 do rTTA3 w stosunku 1:2 (> ~107 TU/mL). Komórki są następnie wybierane do jednego pasażu z 0,5 μg/ml puromycyny. Szczegółowy protokół generowania stabilnych linii hiPSC-NGN2 znajduje się w Pliku Uzupełniającym 1: krok 2.- Postępuj zgodnie z opisem procesu "subhodowli" przy użyciu odczynnika do dysocjacji pojedynczych komórek opisanego w uwadze do kroku 2.4.4, gdy hiPSC osiągną zbieżność 70-80%
- Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 12 ml pożywki NGN2 (tabela materiałów) zawierającej 2,5 μg/ml doksycykliny (doks) i 2 μM tiazowiwiny.
- Rozpocznij różnicowanie metodą "Wysiew płytek z rur" (patrz krok 2.1). Ustaw żądaną gęstość wysiewu iPSC na 30 000/cm2 (patrz tabela 1). iPSC są siane na wstępnie powlekanych płytkach z 0,1 mg/ml poli-L-ornityny (PLO) i 5 μg/ml lamininy.
UWAGA: Płytki 1-dołkowe są preferowane do badań opartych na RNA i proteomice, podczas gdy format płytki 96-dołkowej jest preferowany do eksperymentów obrazowych. Można również stosować inne formaty płytek testowych, takie jak płytki 48-, 24-, 12- lub 6-dołkowe. - W 1. dniu różnicowania odświeżyć pożywkę za pomocą "Zmiany pożywki na płytkach do oznaczania (patrz krok 2.3) przy użyciu pożywki NGN2, uzupełnionej 2,5 μg/ml dox i 10 μM N-[2S-(3,5-difluorofenylo)acetylo]-L-alanylo-2-fenylo-glicyny, estru 1,1-dimetyloetylowego (DAPT). Kontynuuj zmianę pożywek co 2-3 dni, aż do pożądanego dnia różnicowania (patrz krok 2.3).
- W 4 dniu różnicowania przeprowadzić kolejną zmianę pożywki (patrz krok 2.3.) przy użyciu pożywki NGN2 uzupełnionej 10 ng/ml neurotroficznego czynnika neurotroficznego pochodzenia mózgowego (BDNF), 10 ng/ml neurotroficznego czynnika pochodzącego z komórek glejowych (GDNF) i 10 ng/ml czynnika neurotroficznego 3 (NT-3) w celu przyspieszenia dojrzewania. Na zakończenie eksperymentu należy wyeksportować płytki hodowlane z systemu do dalszych eksperymentów (patrz krok 1.6).
- Małocząsteczkowe neuronalne komórki prekursorowe (smNPC) do neuronów NGN2
UWAGA: Proszę wyprowadzić smNPC zgodnie z zaadaptowaną wersją opublikowanego protocol12 (patrz Plik uzupełniający 1: krok 5). Zmodyfikuj smNPC za pomocą wirusa NGN2 i rTTA3 (patrz Plik uzupełniający 1: krok 2). Jedna runda transdukcji NGN2 i rTTA wystarcza do wygenerowania stabilnej populacji. Dalsza modyfikacja smNPC za pomocą lentiwirusa pLVX-EF1a-AcGFP1-N1, co pozwala na monitorowanie żywych komórek. Wielokrotność infekcji (MOI) wynosząca 10 jest stosowana do transdukcji lentiwirusa GFP.- Pasaż smNPC po osiągnięciu konfluencji przy użyciu odczynnika do dysocjacji pojedynczych komórek, jak opisano w kroku 2.4. Nuta.
- Komórki nasienne przy użyciu zautomatyzowanego systemu hodowli komórkowej o gęstości komórek 50 000/cm2 przy użyciu metody "Wysiew płytek z probówek" (patrz krok 2.1.) na wstępnie powlekane płytki z 0,1 mg/ml PLO i 5 μg/ml lamininy w pożywce NGN2 uzupełnionej 2,5 μg/ml dox.
- W dniu 3 należy przeprowadzić zmianę pożywki (patrz krok 1.3) przy użyciu świeżej pożywki NGN2 zawierającej 2,5 μg/ml dox i 10 μM DAPT. Po 3 dniu wykonuj zmiany pożywki co trzeci dzień ze świeżą pożywką NGN2 zawierającą 2,5 μg/ml dox, BDNF, GDNF i NT-3 w stężeniu 10 ng/ml każdy.
- Codzienne obrazowanie komórek przy użyciu metody "Zautomatyzowane obrazowanie o wysokiej zawartości i wysokiej przepustowości" (patrz krok 2.5) w celu monitorowania stanu różnicowania przy użyciu GFP jako odczytu dla wzrostu neurytów. Ustaw moc lasera na 80% i użyj czasu naświetlania 30 ms. Zdobądź dużą liczbę pól (np. 25 pól) za pomocą celu 20x.
- Analiza obrazu wsadowego
- Przeprowadź analizę obrazu za pomocą oprogramowania do analizy obrazu 1, korzystając z szablonu wzrostu neurytów.
- Otwórz oprogramowanie. Wybierz opcję "Dane" i przejdź do folderu danych obrazowania, kliknij OK, aby załadować dane do analizy. Kliknij otwórz i z górnego paska menu wybierz protokół i z menu aplikacji wybierz przerost neurytu. Przejdź do "algorytmów" i użyj kanału "488", aby zdefiniować jądro, ciało komórki i neuryt. Dostosuj parametry progowe dla każdego z nich.
- Wybierz dołki, które mają być używane do analizy obrazu. W prawym dolnym rogu kliknij link i wybierz cechy do analizy, takie jak średnia liczba komórek, całkowita długość szkieletu. Kontynuuj "wstępną analizę", a następnie "podgląd".
- Sprawdź, czy ustawienia podglądu są akceptowalne i rozpocznij analizę w trybie wsadowym. Wyniki są dostępne w folderze nadrzędnym w sekcji "raporty" w .csv formacie pliku, który można otworzyć w excel.
UWAGA: Skrypt do analizy obrazu jest dostępny na żądanie. - Wykreśl średnią długość neurytów uzyskaną przez całkowitą długość neurytów znormalizowaną do liczby komórek.
5. Automatyczne różnicowanie hiPSC na neurony dopaminergiczne (mDA) śródmózgowia
- Ręczne przygotowanie hiPSC
- Dysocjuj 70-80% zlewającego się hiPSC na pojedyncze komórki za pomocą odczynnika do dysocjacji pojedynczych komórek. Krótko mówiąc, inkubować komórki odczynnikiem do dysocjacji pojedynczych komórek (100 μl/cm2) przez 30 minut w temperaturze 37 °C, zebrać zawiesinę komórek do stożkowej probówki, odwirować przy 200 x g przez 5 minut i ponownie zawiesić osad komórkowy w pożywce hodowlanej iPSC.
- Wysiew 200 000 komórek/cm2 na płytkach 1-dołkowych pokrytych macierzą zewnątrzkomórkową i pożywce hodowlanej iPSC uzupełnionej 10 μM Y-27632. Hodować komórki przez noc w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
- Automatyczne różnicowanie: Faza 1
- Przygotuj zautomatyzowany system hodowli zgodnie z opisem w krokach 1.1\u20121.2.
- Załadować płytki hodowlane zawierające komórki do inkubatora CO2 automatycznego systemu hodowli (patrz krok 1.5).
- Przygotować pożywkę KSR (patrz tabela materiałów) i uzupełnić małymi cząsteczkami (patrz tabela 2) wymaganymi do rozpoczęcia 0. dnia różnicowania. Używaj tylko świeżo przygotowanych pożywek z małymi cząsteczkami i czynnikami wzrostu.
- Zmiany pożywki na płytkach hodowlanych należy przeprowadzać zgodnie z opisem w kroku 2.3 w dniach 0 i 1 różnicowania, a następnie co drugi dzień do 25. dnia.
- Od 5 dnia należy stopniowo zmieniać skład podłoża, jak opisano szczegółowo w Tabeli 3.
- W dniu 11 dodaj pożywkę różnicującą neurony mDA uzupełnioną CHIR (do 13 dnia), BDNF, AA1, GDNF, db-cAMP, TGFß3 i DAPT (patrz Tabela Materiałów).
- W 25 dniu rozładuj płyty (patrz krok 1.6).
- Ręczne powlekanie 1
- Dysocjuj prekursory mDA dnia 25 na pojedyncze komórki za pomocą odczynnika do dysocjacji pojedynczych komórek. Krótko mówiąc, inkubować komórki z odczynnikiem do dysocjacji pojedynczych komórek (100 μl/cm2) przez 40 minut w temperaturze 37 °C, zebrać zawiesinę komórek do stożkowej probówki, odwirować przy 200 x g przez 5 minut i ponownie zawiesić osad komórkowy w pożywce do różnicowania neuronów mDA.
- Wysiewaj 400 000 komórek/cm2 w 1-dołkowych płytkach hodowlanych wstępnie pokrytych 0,1 mg / ml PLO, 10 μg / ml lamininy i 2 μg / ml fibronektyny w pożywce do różnicowania neuronów mDA uzupełnionej 10 μM Y-27632 (do 26 dnia) oraz małymi cząsteczkami i czynnikami wzrostu opisanymi w tabeli 2. Hodować komórki przez noc w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
- Automatyczne różnicowanie: Faza 2
- Załadować płytki hodowlane zawierające neurony mDA do inkubatora CO2 automatycznego systemu hodowli, jak opisano w kroku 1.5
- Przygotować pożywkę do różnicowania neuronów mDA (patrz tabela materiałów) i uzupełnić małymi cząsteczkami i czynnikami wzrostu wymaganymi do ostatecznego różnicowania od 26 dnia (patrz tabela 2).
- Zmiany pożywki na płytkach hodowlanych należy przeprowadzić zgodnie z opisem w kroku 2.3 w 26 dniu różnicowania, a następnie co 3–4 dni do dnia 65,
UWAGA: Do celów obrazowania wysokoprzepustowego zaleca się ponowne umieszczenie neuronów mDA na 96-dołkowych płytkach o niskiej gęstości w 32 dniu różnicowania, jak opisano w kroku 5.5.
- Ręczne odnawianie powłok 2
- Rozładuj płytki hodowlane zgodnie z opisem w kroku 1.6. Dysocjacja neuronów mDA dnia 32 na pojedyncze komórki, jak opisano w kroku 5.3.1.
- Wysiewaj 100 000 komórek/cm2 na 96-dołkowych płytkach wstępnie pokrytych 0,1 mg/ml PLO, 10 μg/ml lamininy i 2 μg/ml fibronektyny w pożywce do różnicowania neuronów mDA uzupełnionej 10 μM Y-27632 (do 33 dnia) oraz małymi cząsteczkami i czynnikami wzrostu (patrz Tabela 2). Hodować komórki przez noc w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
- W 33 dniu zastąp pożywkę świeżo przygotowaną pożywką różnicującą neurony DA uzupełnioną małymi cząsteczkami i czynnikami wzrostu (bez Y-27632). Zmieniaj podłoże ręcznie co 3\u20124 dni aż do 65 dnia.
6. Barwienie immunologiczne, zautomatyzowana akwizycja i analiza obrazów o wysokiej przepustowości
- Barwienie fluorescencyjne
- Wykonać fluorescencyjne barwienie immunologiczne zgodnie z opisem w pliku uzupełniającym 1: krok 4.
- Komórki obrazu zgodnie z opisem w pliku uzupełniającym 1: krok 1.2.
- Prześlij pliki obrazowania wygenerowane przez system obrazowania do oprogramowania do analizy obrazu 2 (patrz tabela materiałów) w celu dalszej analizy obrazu, zgodnie z opisem w kroku 6.2.
- Analiza obrazu za pomocą oprogramowania do analizy obrazu 2
- Po przesłaniu plików obrazowych do oprogramowania do analizy obrazu 2 przejdź do funkcji "analiza obrazu" i zbuduj algorytm analizy za pomocą menu rozwijanego.
- Wybierz jądra za pomocą zadania "znajdź jądra", które wykrywa obszary na obrazie należące do jąder komórkowych (tutaj barwionych Hoechstem). Wyklucz jądra z martwych komórek (jądra piknotyczne), ustawiając próg dla powierzchni lub średnicy jądra.
- Wybierz cytoplazmę komórkową za pomocą zadania "znajdź cytoplazmę". Zadanie to wykrywa obszary wokół jąder należących do cytoplazmy komórki. Uwzględnij tylko komórki dobrze podzielone na segmenty. Wyklucz komórki mitotyczne, apoptotyczne i źle podzielone na segmenty. Usuń komórki stykające się z krawędzią obrazu.
- Dodaj zadania "oblicz właściwości morfologii" i "oblicz właściwości intensywności". Parametry morfologii obejmują obliczanie właściwości morfologicznych, takich jak obszar dla obszaru zainteresowania. Parametry intensywności obejmują obliczanie właściwości intensywności, takich jak średnia intensywność dla obszaru zainteresowania (np. cytoplazmy neuronów).
- Wybierz subpopulację (np. neurony TH dodatnie) populacji wejściowej (wybrano wszystkie cytoplazmy) przy użyciu jednego lub więcej warunków, morfologii i/lub intensywności.
UWAGA: Zazwyczaj intensywność jest wybierana dla neuronów. Na podstawie kontroli ujemnych możliwe jest określenie, powyżej którego progu intensywności neurony są uważane za dodatnie dla TH. - Zdefiniuj wyniki wyjściowe. Jest to ostatni element składowy każdej analizy. Określa ona wartości odczytu testu dla każdego dołka płytki hodowlanej (wyniki na studzienkę).
- Uruchom analizę wsadową i wyeksportuj wyniki. Znormalizuj liczbę komórek dodatnich do całkowitej liczby jąder i przedstaw dane jako procent komórek dodatnich.
7. Ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy w czasie rzeczywistym (qRT-PCR)
- Wykonaj protokół qRT-PCR zgodnie z opisem w pliku uzupełniającym 1: krok 3.
Wyniki
Nasz zautomatyzowany system hodowli komórkowych i obrazowania został zaprojektowany w celu zminimalizowania interwencji ludzkiej, co pozwala na standaryzację hodowli hiPSC oraz ich różnicowania w różne typy komórek, takie jak neurony korowe lub dopaminergiczne neuronów śródmózgowia (mDA). Schematyczny przegląd naszego zautomatyzowanego systemu hodowli komórkowych z zintegrowanymi urządzeniami obrazującymi przedstawiono na Ryc. 1. Wstępne wprowadzenie kultur komórkowych do tego zautomatyzowanego systemu może odbywać się poprzez automatyczne wysiewanie komórek z probówki 50 mL lub przy użyciu metody „Loading Of Culture Plates” (ładowanie płytek hodowlanych) lub „Loading Of Assay Plates” (ładowanie płytek testowych) w celu importu płytek hodowlanych lub testowych. Centralnym elementem naszego systemu jest stacja manipulacji cieczami, w której odbywają się wszystkie etapy przenoszenia cieczy, takie jak wymiana mediów czy pasażowanie. Niestandardowy układ pokładu manipulatora cieczy przedstawiono na Ryc. 2. Stacja manipulacji cieczami jest wyposażona w cztery stanowiska. Z inkubatora na pokład może zostać przeniesionych do czterech płytek, co umożliwia równoległą wymianę mediów. Ponieważ w metodzie pasażowania na pokładzie muszą zmieścić się zarówno płytki z kulturą wyjściową, jak i docelową, maksymalna liczba płytek hodowlanych przetwarzanych równolegle jest ograniczona do dwóch. Ważną funkcją stacji manipulacji cieczami jest możliwość przechylania płytek podczas wymiany mediów w celu całkowitego usunięcia supernatantu z hodowli komórkowej. Ponadto stacja manipulacji cieczami jest wyposażona w wytrząsarki ułatwiające enzymatyczną dysocjację komórek podczas wykonywania protokołu pasażowania. Nasz zautomatyzowany system hodowli jest również wyposażony w dwa systemy obrazowania: cytometr obrazujący w jasnym polu do liczenia komórek i sprawdzania konfluencji, a tym samym monitorowania wzrostu komórek w czasie, oraz dwukierunkowy konfokalny mikroskop z dyskiem obrotowym do szybkiego obrazowania komórek o wysokiej rozdzielczości i wysokiej zawartości danych.
Kultury hiPSC są monitorowane codziennie pod kątem wzrostu przy użyciu cytometru z obrazowaniem w jasnym polu i analizowane pod kątem procentowego stopnia zrastania (konfluencji). Na lewym panelu znajduje się obraz w jasnym polu, a na prawym maska zielona powstała z analizy obrazu w jasnym polu uzyskanego za pomocą cytometru (Rycina 3A). W czasie obserwuje się homogeniczny wzrost hiPSC, co wykazują procenty konfluencji dwóch linii hiPSC (n = 4 płytki) hodowanych równolegle i poddanych do kontroli konfluencji od dnia 1 do dnia 6 (Rysunek 3B). Po osiągnięciu ustalonego progu hiPSC poddawane są pasażowaniu. Linie komórkowe hodowano manualnie (m) lub za pomocą systemu automatycznego (a), obserwując utrzymanie typowej morfologii komórek macierzystych przez co najmniej dwa pasażowania; przedstawiono reprezentatywne obrazy w świetle przechodzącym (Rysunek 4A). hiPSC hodowane manualnie (nie pokazano) lub w systemie zautomatyzowanym wykazywały typowe markery komórek macierzystych OCT4 (czerwony) i SSEA4 (zielony), co przedstawiono w badaniu immunofluorescencyjnym (Rycina 4B). Ekspresja markerów pluripotencji OCT4, NANOG i REX1 oceniono również na poziomie mRNA za pomocą qRT-PCR (Rycina 4C). Ilościowe analizy względne przeprowadzono na próbkach pobranych z jednej linii komórkowej hodowanej ręcznie (m) oraz w zautomatyzowanym systemie hodowli (a) w dubletach (powtórzenia 1 i 2). Poziomy ekspresji wszystkich trzech markerów pluripotencji w powtórzeniach hodowanych w zautomatyzowanym systemie hodowli są zbliżone do ekspresji markerów po hodowli ręcznej. W 8. dniu (D8) ekspresja markerów pluripotencji nie występowała w neuronach korowych zróżnicowanych (Diff) z hiPSC.
Jednym z istotnych zastosowań zautomatyzowanego systemu hodowli jest różnicowanie hiPSC w różne typy komórek, w tym neurony. Tutaj przedstawiamy różnicowanie hiPSC w neurony z wykorzystaniem strategii NGN2, która pozwala na uzyskanie czystej hodowli neuronów korowych w bardzo krótkim czasie (około 6 dni). Neurony różnicowane w zautomatyzowanym systemie hodowli (a) wykazywały podobną morfologię i organizację sieci neuronalnej jak neurony hodowane ręcznie (m) (Rysunek 5A). Zautomatyzowane różnicowane neurony korowe były pozytywne pod kątem TUBB3 (neuronowa β-tubulina klasy III, kolor czerwony) oraz BRN2 (marker górnej warstwy kory, kolor zielony) (Rysunek 5B), co było porównywalne z neuronami różnicowanymi ręcznie (dane niepokazane). Ekspresja markerów neuronalnych, w tym białka MAP2 (MAP2), cząsteczki adhezyjnej komórek neuronalnych (NCAM1) i Synapsyny-1 (SYN1), a także markerów neuronów korowych BRN2 i CUX1 (górna warstwa kory), była zwiększona w neuronach w 8. dniu (D8) różnicowania (Rysunek 5C). W hiPSC zaobserwowano bardzo niską lub brak ekspresji tych markerów. Ilościowe analizy względne przeprowadzono na próbkach pobranych z jednej linii komórkowej hodowanej ręcznie (m) oraz w zautomatyzowanym systemie hodowli (a) w dwóch powtórzeniach (replikaty 1 i 2). Poziomy ekspresji w replikatach wykazują podobne zmienności pomiędzy różnicowaniem ręcznym a zautomatyzowanym.
Zintegrowane możliwości obrazowania zautomatyzowanego systemu hodowli pozwalają na bezobsługowe gromadzenie danych o kondycji kultur, co umożliwia długoterminową, zautomatyzowaną akwizycję odczytów fenotypowych. Wykorzystując podejście NGN2 w odniesieniu do linii prekursorów neuronalnych pochodzenia małocząsteczkowego (smNPC) transdukowanych lentiwirusem GFP, opracowaliśmy zautomatyzowany test wzrostu neurytów w żywych komórkach, w którym długość neurytów była mierzona przez 11 dni różnicowania bez żadnej manualnej interwencji. Złożoność neurytów wzrastała w czasie, co wykazano poprzez analizę powierzchni zajętej przez neuryty w dniu 1, 3 i 11, ekspresję GFP oraz obrazy z maskowaniem z analizy (Ryc. 6A, B). Przyrost długości neurytów od 1. do 11. dnia różnicowania został ilościowo określony i wykazał podobny przebieg rozwoju w różnych studzienkach. Dla uproszczenia, na reprezentatywnym wykresie przedstawiono dane z zaledwie 3 kolumn po 6 studzienek każda z płytki 96-dołkowej, mimo że przeanalizowano wszystkie 60 studzienek wewnętrznych (Ryc. 6C).
Kolejnym zastosowaniem przedstawionego tutaj zautomatyzowanego systemu hodowli jest różnicowanie hiPSC w neurony mDA. Różnicowanie opiera się na zmianach pożywki zgodnie z wcześniej ustalonym protokołem i było przeprowadzane w zautomatyzowanym systemie hodowli od dnia 0 do 65. Zautomatyzowane wymiany pożywek nie spowodowały odrywania się komórek ani żadnych innych wizualnie wykrywalnych zmian w procesie różnicowania. Po zakończeniu różnicowania, w 65. dniu, neurony mDA wykazują organizację komórkową i morfologię (sferyczny soma, długie i kolczaste dendryty) porównywalną z różnicowaniem manualnym (Rycina 7A, B). Na poziomie mRNA neurony mDA różnicowane w zautomatyzowanym systemie hodowli wykazują ekspresję markerów neuronalnych i mDA, odpowiednio MAP2 oraz TH (tyrozynowa hydroksylaza) (Rycyna 7C). Obie metody różnicowania pozwoliły na uzyskanie znacznej liczby neuronów pozytywnych pod kątem TH i MAP2 (Rycina 7D).
Rycina 1: Schematyczny przegląd zautomatyzowanej platformy do hodowli komórek i obrazowania.
System został zaprojektowany z obudową z poliwęglanu i dwiema komorami z filtrami HEPA (A i B), wyposażonymi w cztery lampy UV, co zapewnia sterylne środowisko dla aplikacji hodowli komórkowych. Płytki do hodowli komórek są umieszczone na półkach przed ramieniem robotycznym, do których dostęp odbywa się przez przednie drzwi (C). Płytki są ładowane do inkubatora CO2 (D) o pojemności 456 płytek. Cytometr komórkowy w jasnym polu (E) jest wykorzystywany do kontroli konfluencji i liczenia komórek podczas rutynowych pasażowań. Stacja do obsługi cieczy znajduje się pod jedną z komór HEPA (B). Układ pokładu urządzenia do obsługi cieczy opisano na Rycini 2. Ramię pipetujące stacji obsługi cieczy posiada 96-kanałową głowicę pipetującą, osiem kanałów pipetujących 1 mL i cztery kanały pipetujące 5 mL. W przypadku kanałów 1 mL do przenoszenia cieczy można używać końcówek lub igieł. W celach przesiewowych komórki wysiane na płytkach testowych mogą być traktowane próbkami przechowywanymi w -20 °C w zautomatyzowanym systemie przechowywania w -20 °C (F), po uprzednim rozmrożeniu tych próbek w drugim inkubatorze (G). Obrazowanie wysokoprzepustowe jest realizowane w zautomatyzowanym mikroskopie konfokalnym (H), który umożliwia pozyskiwanie obrazów w trybie konfokalnym z wykorzystaniem dwóch dysków obrotowych lub w trybie epifluorescencyjnym. Zintegrowana z mikroskopem komora do żywych komórek pozwala na długoterminowe obrazowanie hodowlanych komórek. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 2: Układ platformy stacji do obsługi cieczy.
Pozycje końcówek są oznaczone jako „50 µL” dla końcówek 50 µL, „standard” dla końcówek 300 µL, „high” dla końcówek 1 mL oraz „5 mL” dla końcówek 5 mL. Elementy platformy: (A) Cztery grzane pozycje wstrząsarek (maksymalna prędkość: 2500 rpm), które mogą być wykorzystane dla dowolnego formatu płytek hodowlanych lub analitycznych. Pozycje wstrząsarek są wyposażone w zaciskane chwytaki, które służą również do wyrównywania płytek po ich przetransportowaniu na platformę. Ponadto pozycje wstrząsarek pełnią funkcję miejsca odkładania pokrywek płytek podczas etapów transferu cieczy. W celach reprezentacyjnych wszystkie pozycje wstrząsarek są zajęte przez analityczne płytki 96-dołkowe. (B) Na górze znajdują się cztery moduły przechylne do jednoczesnego przetwarzania czterech płytek dowolnego formatu. Najniższa pozycja oznacza komorę zbiórki odpadów dla płytek hodowlanych i analitycznych oraz 96-kanałową głowicę pipetującą. W celach reprezentacyjnych wszystkie moduły przechylne są zajęte przez analityczne płytki 96-dołkowe. (C) W najwyższej pozycji znajduje się płytka 384-dołkowa do liczenia komórek. Poniżej znajdują się dwie pozycje na płytki, które w celach reprezentacyjnych są zajęte przez płytki 96-dołkowe, oraz statyw na cztery probówki 50 mL i cztery probówki 15 mL. Najniższa pozycja jest zajęta przez końcówki 5 mL. (D) Trzy linie mediów z miejscami na zbiorniki z mediami. Linie mediów posiadają czujniki poziomu cieczy, które umożliwiają automatyczne napełnianie zbiornika z mediami ilością do 250 mL mediów. (E) Na górze znajdują się dwa moduły odpływu cieczy z aktywnym drenażem, poniżej znajduje się moduł z kontrolą temperatury z miejscem na jeden pojemnik (biały) oraz statyw na końcówki 5 mL . (F) Pięć pozycji dla końcówek 1 mL. (G) Na dole znajdują się dwa moduły z kontrolą temperatury oraz pozycja do odkładania jednej z ich pokrywek na górze. (H) Pozycje dla dwóch zagnieżdżonych statywów na końcówki (NTR) 50 µL na górze, a następnie dwie pozycje do pobierania końcówek 300 µL jednokanałowych i 96-kanałowych oraz statyw na końcówki 5 mL na dole. (I) Stacker dla płytek do liczenia 384-dołkowych na górze, a następnie trzy NTR 300 µL i statyw na końcówki 5 mL na dole. (J) Stacja przechowywania i mycia dla trzech zestawów po osiem wielorazowych metalowych igieł 1 mL. (K) Pozycja na odpady dla kanałów pipetujących 1 mL i 5 mL oraz puste NTR (szary), a także blok chwytaka dla kanałów 1 i 5 mL (biały) używany do etapów transportu na platformie. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 3: Zautomatyczna ocena konfluencji hiPSC.
(A) Reprezentatywne obrazy w jasnym polu (BF) hiPSC wykonane przez cytometr komórkowy (po lewej) oraz po zautomatyzowanej analizie konfluencji (po prawej), wskazująca na proporcjonalny obszar zajęty przez komórki zaznaczony kolorem zielonym; (B) Procenty konfluencji zarejestrowane dla dwóch linii hiPSC (iPS #1 i #2) od 1. do 6. dnia hodowli, n = 4 płytki 1-dołkowe na linię komórkową. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 4: Pasyżowanie hiPSC.
(A) Obraz BF jednej linii hiPSC hodowanej manualnie (lewo) oraz przy użyciu zautomatyzowanego systemu hodowli (prawo). Obrazy wykonano 6 dni po drugim pasyżowaniu; (B) Reprezentatywne obrazy hiPSC barwionych na markery pluripotencji OCT4 i SSEA4, z przeciwbarwieniem Hoechst 33342 (jądra komórkowe); (C) Wyniki qRT-PCR dla markerów pluripotencji OCT4, NANOG i REX1 w jednej linii hiPSC hodowanej w duplikatach (1 i 2) manualnie (m) oraz w zautomatyzowanym systemie hodowli (a), a także w odpowiadających im neuronach korowych pochodzenia hiPSC (Diff) w 8. dniu (D8) różnicowania. Dane przedstawiono jako ilość relatywną (RQ), przyjmując iPS_a_1 jako próbkę referencyjną. Słupki błędu reprezentują odchylenie standardowe (SD) z 3 powtórzeń technicznych reakcji qRT-PCR. Jako geny referencyjne (housekeeping) wykorzystano GAPDH, RPL13A1 i RPLPO. Pasek skali: 100 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 5: Neurony korowe pochodzące z ludzkich iPSC.
(A) Obrazy w polu jasnym neuronów korowych w 6. dniu różnicowania, otrzymanych metodą manualną (m) oraz zautomatyzowaną (a), wykazujące podobne sieci neuronalne; (B) Reprezentatywne obrazy komórek barwionych na TUBB3 (pan-neuronalny), BRN2 (neurony korowe) oraz Hoechst 33342 (jądra) w 8. dniu różnicowania; (C) Wyniki qRT-PCR dla genów markerowych neuronów korowych (MAP2, BRN2, CUX2, NCAM1 oraz SYN1) wzbogaconych w 8. dniu (D8) różnicowania. Dane przedstawiono jako względną ilość (RQ), przyjmując iPS_a_1 jako próbkę referencyjną. Słupki błędów reprezentują SD z 3 powtórzeń technicznych reakcji qRT-PCR. GAPDH, RPL13A1 oraz RPLPO zastosowano jako geny housekeepingowe. Pasek skali: 50 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 6: Wysokoprzepustowy test wzrostu neurytów.
(A) Reprezentatywne obrazy komórek wykazujących ekspresję GFP w 1., 3. i 11. dniu różnicowania; (B) Reprezentatywne obrazy binarne neurytów w 1., 3. i 11. dniu różnicowania. Wzrost neurytów ilościowano przy użyciu oprogramowania do wysokotreściowej analizy obrazów 1 i przedstawiono jako długość neurytów; (B) Wykres przedstawia wzrost długości neurytów w neuronach NGN2 pochodzenia NPC oraz formowanie gęstej sieci. Wykonano obrazy trzech płytek 96-dołkowych z komórkami w wewnętrznych 60 dołkach. Dla uproszczenia przedstawiono jedynie trzy kolumny dołków na płytkę 96-dołkową jako przykład, gdzie n = 6 dołków na kolumnę. Analizie poddano średnio 1308 komórek na dołek. Słupki błędów reprezentują standardowy błąd średniej (S.E.M.). Pasek skali = 50 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 7: Neurony mDA pochodzące z ludzkich iPSC.
Neurony dopaminergiczne (DA) śródmózgowia zróżnicowane manualnie (m) oraz w zautomatyzowanym systemie hodowli (a).A, B) Reprezentatywne obrazy fluorescencyjne neuronów mDA barwionych pod kątem hydroksylazy tyrozynowej (TH, marker neuronów mDA; zielony), MAP2 (marker neuronalny; czerwony) i Hoechst 33342 (jądra komórkowe; niebieski); (C) Reprezentatywne wyniki qRT-PCR dla genów markerowych neuronów mDA różnicowanych ręcznie oraz w zautomatyzowanym systemie hodowli. TH i MAP2 poziomy ekspresji przedstawiono jako względną ilość (RQ) znormalizowaną do genów pomocniczych (OAZ1 i GAPDH); (D) Procenty neuronów wykazujących pozytywną reakcję na TH i MAP2 uzyskane w wyniku różnicowania manualnego i zautomatyzowanego. Słupki błędu przedstawiają odchylenie standardowe (SD) z dwóch niezależnych procesów różnicowania przeprowadzonych z użyciem dwóch odrębnych linii iPSC (#1 i #2). Pasek skali = 50 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
| Typ komórki | Cel | Krok protokołu | Gęstość komórek | Format płytki | Liczba komórek na dołek |
| dyferencjacjonowanie NGN2 | |||||
| iPSC (indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste) | Generowanie stabilnej linii NGN2 | S.2.3. | 30 000 komórek/cm²2 | 12-dołkowa | 1,17,000 |
| iPSC | dyferencjacja neuronów NGN2 | 3.1.3. | 30 000 komórek/cm²2 | 1-dołkowy | 25,20,000 |
| iPSC (indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste) | Różnicowanie neuronów NGN2 | 3.1.3. | 30 000 komórek/cm²2 | 96-dołkowe | 9,600 |
| generowanie smNPC | |||||
| smNPC | Przesiewanie w 12. i 16. dniu | S5.9. i S5.11. | 70 000 komórek/cm2 | 6-dołkowa | 6,72,000 |
| smNPC | Przesadzanie z pasażu 5 | 5.11. | 50 000 komórek/cm2 | 6-dołkowa | 4,80,000 |
| smNPC | neurony smNPC do NGN2 | 3.2.2 | 50 000 komórek/cm2 | 96-dołkowy | 16,000 |
| różnicowanie mDA | |||||
| iPSC | różnicowanie neuronów dopaminergicznych średniego mózgu | 4.1.2. | 200 000 komórek/cm2 | 1-dołkowy | 1,68,00,000 |
| neurony dopaminergiczne | Przesiewanie w 25. dniu | 4.3.2. | 400 000 komórek/cm2 | 1-dołkowy | 3,36,00,000 |
| neurony dopaminergiczne | Przesiewanie w 25. dniu | 4.5.2. | 100 000 komórek/cm2 | 96-dołkowe | 32,000 |
| Powlekanie | Cel | Krok protokołu | Stężenie/ Rozcieńczanie | Format płytki | Szczegóły powlekania |
| hodowla iPS | |||||
| Macierz zewnątrzkomórkowa | iPSC, linia NGN2, neurony dopaminergiczne w istocie czarnej (mDA) | 1.5.7. oraz S2.3. | 1 aliquota*; 25 ml DMEM/F-12 | 1-/12-dołkowa | 8/0,5 ml/dołek; 1 h w temp. pokojowej |
| różnicowanie NGN2 | |||||
| Poli-L-ornityna | różnicowanie neuronów NGN2 | 3.1.3. oraz 3.2.2. | 0,1 mg/ml; PBS | 1-/96-dołkowy | 8/0,1 ml/studzienkę; 12 h w temp. 37°C; trzykrotne płukanie w PBS |
| Laminina | różnicowanie neuronów NGN2 | 3.1.3. i 3.2.2. | 5 μg/mL; PBS | 1-/96-dołkowy | 8/0,1 ml/dołek; 4 h w temp. 37°C |
| generowanie smNPC | |||||
| Macierz zewnątrzkomórkowa | generowanie i hodowla smNPC | S5.6., S5.9., S5.11. | 1 alikwot*; 25 ml DMEM/F-12 | 6-dołkowa | 1 ml; 2 h w temp. pokojowej |
| różnicowanie mDA | |||||
| Macierz pozakomórkowa | różnicowanie mDA | 4.1.2. | 1 alikwot*; 25 ml DMEM/F-12 | 1-dołkowa | 12 ml; 12 h w temp. 37°C |
| Poli-L-ornityna | różnicowanie mDA | 4.3.2. oraz 4.5.2. | 0,1 mg/mL; PBS | 1/płytka 96-dołkowa | 12/0,1 ml/dołek; 12 h w temp. 37°C; 3x płukanie w PBS |
| Laminina | różnicowanie mDA | 4.3.2. oraz 4.5.2. | 10 μg/mL; PBS | 1-/96-dołkowe | 12/0,1 ml/dołek; 12 h w 37°C |
| Fibronektyna | różnicowanie w mDA | 4.3.2. oraz 4.5.2. | 2 μg/mL; PBS | 1-/96-dołkowe | 12/0,1 ml/dołek; 12 h w 37°C |
| Alikwot macierzy zewnątrzkomórkowej definiuje się jako czynnik rozcieńczenia (w µL) zawarte w Certyfikacie Analizy tego produktu. | |||||
Tabela 1: Gęstość wysiewu komórek i powlekanie w zależności od formatu płytki.
| Dzień | Odczynnik | ||
| Dzień 0 - 1 | 100 nM LDN193189, 10 µM SB431542 | ||
| Dzień 1 - 3 | 100 nM LDN193189, 10 µM SB431542, 1 mM SHH, 2 mM Purmorphamine, 100ng/mL FGF-8b | ||
| Dzień 3 - 5 | 100 nM LDN193189, 10 µM SB431542, 1 mM SHH, 2 mM Purmorphamine, 100ng/mL FGF-8b, 3 µM CHIR99021 | ||
| Dzień 5 - 7 | 100 nM LDN193189, 1 mM SHH, 2 mM Purmorphamine, 100ng/mLFGF-8b, 3 µM CHIR99021 | ||
| Dzień 7 - 9 | 100 nM LDN193189, 1 mM SHH, 3 µM CHIR99021 | ||
| Dzień 9 - 11 | 100 nM LDN193189, 1 mM SHH, 3 µM CHIR99021 | ||
| Dzień 11 - 13 | 3 µM CHIR99021, 20 ng/mL BDNF, 0.2 mM L-ascorbic acid (AA1), 20 ng/mL GDNF, 1 mM db-cAMP, 1 ng/mL TGFß3, 10 µM DAPT | ||
| Dzień 13 - 65 | 20 ng/mL BDNF, 0.2 mM L-ascorbic acid (AA1), 20 ng/mL GDNF, 1 mM db-cAMP, 1 ng/mL TGFß3, 10 µM DAPT | ||
Tabela 2: Dodawanie małych cząsteczek w celu różnicowania neuronów dopaminergicznych.
| Dzień | pożywka KSR | pożywka N2 | Pożywka różnicująca |
| Dzień 0 – 1 | 100% | 0 | 0 |
| Dzień 1–3 | 100% | 0 | 0 |
| Dzień 3–5 | 100% | 0 | 0 |
| Dzień 5–7 | 75% | 25% | 0 |
| Dzień 7–9 | 50% | 50% | 0 |
| Dzień 9–11 | 25% | 75% | 0 |
| Dzień 11–13 | 0 | 0 | 100% |
| Dzień 13 – 65 | 0 | 0 | 100% |
Tabela 3: Gradient pośrodków dla różnicowania neuronów dopaminergicznych.
Plik uzupełniający 1. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.
Dyskusja
Wprowadzamy zautomatyzowany system hodowli komórkowych ze zintegrowanymi możliwościami obrazowania w celu standaryzacji hodowli hiPSC i różnicowania neuronów. Ze względu na minimalną interwencję użytkownika, zmienność eksperymentalna jest niska, co zapewnia odtwarzalność fenotypów komórkowych podczas różnicowania. Harmonogram oparty na kalendarzu wspiera organizację i równoległość eksperymentów oraz zapewnia wysoki stopień elastyczności w czasie przeprowadzania eksperymentów. Istniejące metody można łatwo dostosować, a spektrum dostępnych metod można zwiększyć. Dodatkowo można zastosować dużą liczbę formatów płytek testowych, co zwiększa elastyczność tego systemu. Minimalny system składający się z inkubatora CO2 , ramienia robota, cytometru komórkowego w jasnym polu i stacji obsługi cieczy stanowi podstawową jednostkę potrzebną do hodowli i różnicowania hiPSC, przy przystępnych kosztach dla akademickich laboratoriów badawczych. Połączenie zautomatyzowanego systemu hodowli komórkowych ze zautomatyzowanym systemem przechowywania w temperaturze -20 °C do przechowywania związków, bibliotekami RNAi lub bibliotekami CRISPR/Cas9 oraz integracja mikroskopu o wysokiej zawartości i wysokiej przepustowości umożliwiają przeprowadzanie badań przesiewowych fenotypów.
W obecnym badaniu zautomatyzowany system hodowli komórkowej wykorzystywał jednorazowe końcówki, a pożywka hodowlana była ponownie napełniana ręcznie do zbiornika, ograniczając w ten sposób użycie stacji obsługi cieczy do zmiany pożywki i innych procesów hodowlanych, zwłaszcza w nocy. Aby obejść to ograniczenie, metody można dostosować do użycia igieł zamiast jednorazowych końcówek, a po zainstalowaniu połączeń rurowych między przewodami mediów a workami na nośniki przechowywanymi w lodówce, zbiorniki na media mogą być automatycznie napełniane świeżymi mediami wstępnie podgrzanymi przez elementy grzejne. Zmniejszyłoby to ingerencję użytkownika spowodowaną ręcznym napełnianiem końcówek, pożywek hodowlanych i wymiany zbiorników.
Nasz zautomatyzowany system hodowli komórkowych ma kilka zalet. Jednym z nich jest system śledzenia kodów kreskowych. Płytki załadowane do systemu są identyfikowane za pomocą unikalnego kodu kreskowego, który jest odczytywany i zapisywany przez system, co pozwala na śledzenie próbek w trakcie i po wykonaniu metody. Kolejną zaletą jest możliwość tworzenia projektów dostosowanych do potrzeb użytkownika. Tutaj wgrane do systemu płytki hodowlane mogą być przypisane do konkretnego projektu i pogrupowane w partie. Strukturyzacja w partiach upraszcza wykonanie tej samej procedury dla wszystkich płyt z danej partii, ponieważ nie trzeba wybierać pojedynczych płytek. Dodatkowo edytor klas cieczy pozwala dostosować prędkość i wysokość pipetowania, a także parametry zasysania i dozowania dla każdego etapu transferu cieczy. Każdy proces jest dokumentowany w plikach dziennika, co pozwala prześledzić, jakie zadania zostały wykonane dla danej kultury lub płytki testowej.
Neurony i inne typy komórek pochodzące z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) są użytecznymi narzędziami in vitro do badania mechanizmów chorób neurodegeneracyjnych w określonych populacjach pacjentów (np. neurony dopaminergiczne w chorobie Parkinsona), oferując możliwość spersonalizowanych badań przesiewowych leków. Hodowla hiPSC jest bardzo czasochłonna i wymaga przeszkolonych osób do wykonywania złożonych protokołów różnicowania, zwykle ograniczonych do produkcji na małą skalę. Dostosowaliśmy hodowlę hiPSC bez karmienia do zautomatyzowanej hodowli i wdrożyliśmy dwa protokoły różnicowania neuronów, protokół szybkiego różnicowania neuronów korowych oparty na nadekspresji NGN2 pod promotorem tet-on10,11 oraz długoterminowy protokół oparty na małych cząsteczkach do generowania neuronów dopaminergicznych śródmózgowia (mDA)13. Prosty transfer i odtwarzalność ręcznych protokołów hodowli i różnicowania sprawia, że zautomatyzowany system hodowli jest bardzo przydatny. Ludzkie iPSC hodowane w zautomatyzowanym systemie hodowli komórek wykazywały spójną morfologię komórek macierzystych i wykazywały ekspresję ważnych markerów pluripotencji, odtwarzalnych między niezależnymi eksperymentami. Ponadto automatyzacja protokołu hodowli hiPSC sprzyjała hodowli i równoległej ekspansji większej liczby linii komórkowych. Zautomatyzowane kontrole zbieżności, które miały być przeprowadzane w nocy, pozwoliły zaoszczędzić czas, pozostawiając system wolny w ciągu dnia na dalsze etapy procesu przeprowadzane, gdy użytkownik był w laboratorium (np. pobieranie komórek lub ręczne ponowne powlekanie w celu rozróżnienia). Po osiągnięciu zdefiniowanego przez użytkownika progu konfluencji, komórki są pasażowane i ponownie powlekane płytkami pokrytymi macierzą zewnątrzkomórkową dostępnymi na układarce automatycznego systemu hodowli komórek. Każda runda pasażu trwa około 70 minut i generuje cztery płytki 1-dołkowe z jednej płytki macierzystej, co przekłada się na wydajność 20 pasaży w ciągu dnia.
Automatyzacja protokołu różnicowania NGN2 zakończyła się sukcesem i pozwoliła na wygenerowanie jednorodnej populacji komórek neuronalnych w różnych kanałach i porównywalnej z różnicowaniem ręcznym. Co więcej, koszty eksperymentalne badań przesiewowych na dużą skalę obejmujących wiele linii komórkowych lub eksperymentów przesiewowych z tysiącami warunków/związków testowych zostałyby zmniejszone ze względu na szybkie różnicowanie. Opłacalne i wysokoprzepustowe odczyty, w tym pomiary wzrostu neurytów w żywych komórkach, można łatwo opracować, wdrożyć i wykorzystać jako odczyty fenotypowe do modelowania choroby, jak pokazano wcześniej 14,15,16. W związku z tym dostosowaliśmy protokół NGN2 za pomocą komórek prekursorowych neuronów pochodzących z małych cząsteczek (smNPC), które konstytutywnie wykazują nadmierną ekspresję GFP. Komórki smNPC oferują dalsze korzyści, w tym niższe koszty pożywek hodowlanych (jedna trzecia kosztów hodowli iPSC) oraz czas potrzebny na zwiększenie skali eksperymentów. Wydajność komórek z smNPC jest od 7 do 10 razy wyższa niż w przypadku iPSC. Różnicujące się neurony były z powodzeniem monitorowane i obrazowane przez kilka dni przy użyciu w pełni zautomatyzowanego procesu obrazowania bez konieczności ręcznego barwienia przeciwciał lub znakowania chemicznego, co pozwoliło zaoszczędzić koszty i czas potrzebny na ręczne procedury, w tym samo obrazowanie. Obecne obrazowanie wewnętrznych 60 dołków 96-dołkowej płytki zajmuje około 16 minut na płytkę, gdy obrazowanych jest 25 pól na dołek, co oznacza, że dane do badań przesiewowych opartych na obrazowaniu dla 1000 związków można uzyskać i przeanalizować w ciągu jednego dnia. W przyszłości odczyt ten może zostać wykorzystany w złożonych badaniach przesiewowych w celu ratowania defektów wzrostu neurytów.
Ponadto demonstrujemy również transfer protokołu ręcznego różnicowania do generowania neuronów dopaminergicznych śródmózgowia (mDA) z iPSC. Ten protokół różnicowania oparty na małych cząsteczkach trwa 65 dni i jest pracochłonny ze względu na wiele etapów powlekania i częste zmiany podłoża, zwykle co 2 dni, co ogranicza produkcję neuronów mDA do kilku linii iPSC w tym samym czasie. Zautomatyzowany protokół różnicowania mDA ma tę wielką zaletę, że umożliwia skalowanie różnicowania do dziesiątek linii iPSC. Równolegle można różnicować do 30 linii komórkowych. Ponieważ różnicowanie opiera się głównie na zmianach mediów, prawie cały proces różnicowania może być przeprowadzony bez ingerencji człowieka. Korzystając z harmonogramu opartego na kalendarzu zautomatyzowanego systemu, mogliśmy zaplanować zmiany mediów zgodnie z krokami różnicowania. Jednym z ograniczeń pracy z tak dużą liczbą linii komórkowych i płytek hodowlanych był brak możliwości przeprowadzenia nocnych zmian pożywki. Głównym powodem jest fakt, że nasz system jest przystosowany do używania jednorazowych końcówek i ręcznego napełniania pożywek hodowlanych, co wymaga od użytkownika w laboratorium wykonania tego ręcznego kroku. Aby ułatwić proces wymiany nośników, płyty załadowane do systemu zostały przypisane do projektu i pogrupowane w partie. Wielkość partii została następnie dostosowana do liczby jednorazowych końcówek i objętości dostępnych pożywek hodowlanych. Jak wspomniano powyżej, ograniczenie to można łatwo przezwyciężyć poprzez wdrożenie igieł wielokrotnego użytku/zmywalnych i automatyczne uzupełnianie pożywki. Zautomatyzowane pasażowanie/ponowne powlekanie komórek, jak pokazano w przypadku iPSC, jest jednym z udogodnień oferowanych przez nasz zautomatyzowany system hodowli komórkowych. Przetestowaliśmy automatyczne ponowne powlekanie neuronów mDA w 25 dniu różnicowania. Jednak dysocjacja neuronów mDA wymaga dłuższej (40 min) inkubacji z enzymem dysocjacyjnym niż iPSC (8 min), wydłużając automatyczny proces ponownego powlekania do ponad 1 godziny na linię komórkową. W konsekwencji zautomatyzowane ponowne powlekanie 30 linii komórkowych w ciągu jednego dnia stało się niemożliwe. Przyspieszenie innych etapów automatycznego powlekania (transport płytek, pipetowanie) oraz dostosowanie systemu do użycia igieł i linii pożywki, która umożliwia pracę w ciągu jednej nocy, rozwiązałoby to ograniczenie. Pomimo wad, udało nam się przenieść protokół manualny do automatycznego różnicowania neuronów mDA produkujących kultury ze znacznymi ilościami komórek dodatnich MAP2 (neuron) i TH (neurony mDA).
Równoległe różnicowanie kilkudziesięciu linii komórkowych iPSC cieszy się dużym zainteresowaniem w projektach zajmujących się badaniem mechanizmów molekularnych chorób neurodegeneracyjnych, w tym choroby Parkinsona. Jednak szybsze wykonywanie zadań, przy mniejszej liczbie błędów i przy niższych kosztach jest dużym wyzwaniem. Dzięki automatyzacji prezentowanych tu protokołów (iPSC, smNPC i neuron mDA) mogliśmy przyspieszyć, obniżyć koszty i zwiększyć odtwarzalność w naszych projektach. Rozwój projektów takich jak FOUNDIN-PD (https://www.foundinpd.org/wp/) obejmujących setki linii komórkowych pacjentów wskazuje na potrzebę zautomatyzowanych protokołów hodowli i różnicowania. Nasze perspektywy na przyszłość obejmują transfer ręcznych trójwymiarowych (3D) modeli hodowli komórkowych do zautomatyzowanego systemu. Drobne modyfikacje w ustawieniach definicji płytki i użycie adapterów pozwolą na użycie komercyjnych lub niestandardowych płytek i komór mikroprzepływowych wymaganych do hodowli 3D. Co więcej, wdrożenie zautomatyzowanego modelu obrazowania bez znaczników pozwoli nam śledzić wzrost neuronów w czasie rzeczywistym i przełożyć zmiany w przeroscie neurytów, organizacji neuronów i śmierci komórek na lepsze zrozumienie mechanizmów choroby.
Oświadczenia
Nie mamy nic do ujawnienia.
Podziękowania
Autorzy dziękują pacjentom i ich rodzinom, którzy dostarczyli biomateriał do tego badania. Linie komórkowe użyte w badaniu pochodziły z kolekcji NINDS z Rutgers (ND41865 jako iPS#1) i laboratorium dr Tilo Kunatha (iPS#2). Prace te są częściowo wspierane przez Fundację NOMIS (PH), RiMod-FTD, wspólny program UE - Badania nad chorobami neurodegeneracyjnymi (JPND) (PH); Inicjatywa DZNE I2A (AD); PD-Strat, projekt finansowany przez ERA-Net ERACoSysMed (PH) oraz Foundational Data Initiative for Parkinson's Disease (FOUNDIN-PD) (PH, EB). FOUNDIN-PD jest częścią programu PATH to PD Fundacji Michaela J. Foxa. Autorzy dziękują Stevenowi Finkbeinerowi i Melanie Cobb (Gladstone Institutes) za wkład w ustanowienie ręcznego protokołu różnicowania neuronów mDA oraz Mahomi Suzuki (Yokogawa Electric Corporation) za pomoc w konfiguracji analizy wzrostu neurytów.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Przeciwciała< | silny>Dystrybutor | Numer katalogowy | Rozcieńczenie |
| marker pluripotencji iPSC | |||
| mysz anty-SSEA4 | Abcam | ab16287 | 1 do 33 |
| Królik anty-Oct3/4 | Abcam | ab19857 | od 1 do 200 |
| markery neuronów NGN2 | |||
| Mysz anty-TUBB3 | R & D | MAB1195 | 1 do 500 |
| Królik anty-BRN2 | NEB | 12137 | 1 do 1,000 |
| mDA markery neuronów | |||
| Chicken anty-TH | Pel-Freez Biologicals | 12137 | 1 do 750 |
| Mysie przeciwciała anty-MAP2 | Santa Cruz | sc-74421 | 1 do 750 |
| Przeciwciała drugorzędowe | |||
| Koza anty-kurczak IgY, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11039 | 1 do 2,000 |
| Kozia anty-mysie IgG, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11029 | 1 do 2,000 |
| Kozia anty-mysia IgG, Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11032 | 1 do 2,000 |
| Kozia anty-królicza IgG, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11008 | 1 do 2,000 |
| Kozia anty-królik IgG, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11008 | 1 do 2,000 |
| Kozia anty-królicza IgG, Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11012 | 1 do 2,000 |
| Przeciwbarwienie jąder | |||
| Hoechest 33342 | Invitrogen | H3570 | 1 do 8,000 |
| Instrumenty | Distributor< | strong>Numer katalogowy | Opis/Zastosowanie |
| Agilent System TapeStation | Agilent technologies | 4200 | Automatyczna elektroforeza dla próbek DNA i RNA |
| Zautomatyzowane -20 ° System przechowywania C | Hamilton Storage Technologies | Sample Access Manager (SAM -20C, seria 3200) | Przechowywanie odczynników |
| Czytnik kodów kreskowych | Czytnik kodów kreskowych | Honeywell | Skaner kodów kreskowych |
| Cytomat komórkowy Brightfield Zliczanie komórek CellVoyagem | Celigo | Confluence i | |
| CellVoyager 7000 | Yokogawa | CellVoyager 7000 | Zautomatyzowany mikroskop konfokalny |
| Cytomat do hodowli komórkowych | Thermo Fisher Scientific | Cytomat 24 C, CU | 12 wózków widłowych o rozstawie 28 mm, 12 wózków widłowych o rozstawie 23 mm (łącznie 456 płytek) |
| Cytomat do rozmrażania próbek | Thermo Fisher Scientific | Cytomat 2-LIN, 60 DU (Jednostka susząca) | 2 wózki widłowe o rozstawie 28 mm (łącznie 42 płyty) |
| Filtry HEPA | Hamilton Robotics | Hood Flow Star UV | Zmodyfikowany przez Hamilton Robotics |
| Stacja obsługi cieczy | Hamilton Robotics | Microlab | Star Kanały: 8x 1-ml, 4x 5 ml i 96-kanałowy |
| MPH Zbiornik mediów | Hamilton Robotics | 188211APE | Zbiornik mediów/odczynników |
| System czystej wody | Veolia Water | ELGA PURELAB Classic | Dostarcza czystą wodę do stacji mycia igieł |
| System PCR QuantStudio 12K Flex w czasie rzeczywistym | Thermo Fisher Scientific | QSTUDIO12KOA | Maszyna do PCR w czasie rzeczywistym |
| Ramię robota | Hamilton Robotics | Rackrunner | Transport płyt |
| Stół obrotowy | Hamilton Robotics | Dostosuj orientację płyty | |
| Zasilacz bezprzerwowy | APC | Smart UPS RT, Moc 10000 VA zasilanie | Zasilanie |
| awaryjne VIAFLO-pipety | Integra | 4500 | Pipeta elektroniczna |
| ViiA 7 System Real-Time PCR | Applied Biosystems | 4453545 | Maszyna |
| Materiały | Dystrybutor | Numer katalogowy | < strong>Notes |
| 1-dołkowa płytka hodowlana (84 cm2) | Thermo Fischer Scientific | 165218 | Nunc OmniTray |
| (9,6 cm2) | Greiner Bio-One | 657160 | TC z pokrywką |
| 12-dołkowa płytka hodowlana (3,9 cm2) | Greiner Bio-One | 665180 | TC traktowana pokrywką |
| 96-dołkowa płytka hodowlana (0,32 cm2) | Perkin Elmer | 6005558 | CellCarrier-96 |
| płytka Końcówki, 50-&mikro; L | Hamilton Robotics | 235987 | 50-uL końcówki |
| Końcówki, 300-&mikro; L | Hamilton Robotics | 235985 | 300-&mikro; L |
| końcówki Końcówki, 1000-&mikro; L | Hamilton Robotics | 235939 | 1000-&mikro; Końcówki L |
| , 5 ml | Hamilton Robotics | 184022 | Końcówki 5 ml |
| Probówki, 15 ml | Greiner Bio-One | 188271 | Probówki 15 ml |
| Probówki, 50 ml | Greiner Bio-One | 227261 | 50 ml |
| Fiolki kriogeniczne 2,0 ml | Nalgene Sigma Aldrich | V5007 | Kriowialiki |
| Plazmidy | Distributor< | strong>Numer katalogowy | Notes |
| pLV_hEF1a_rtTA3 | Addgene | 61472 | Miły prezent od Rona Weissa |
| pLV_TRET_hNgn2_UBC_Puro | Addgene | 61474 | Uprzejmy prezent od Rona Weissa |
| pLVX-EF1a-AcGFP1-N1 lentivirus | Takara Bio | 631983 | |
| Startery | >Sekwencja (naprzód) | Sekwencja (odwrotna) | Źródło |
| iPSC pluripotencja | |||
| OCT4 (ID 4505967a1) | CTTGAATCCCGAATGGAAAGGG | GTGTATATCCCAGGGTGTTCTC | PrimerBank |
| NANOG (ID 153945815c3) | CCCCAGCCTTTACTCTTCCTA | CCAGGTTGAATTGTTCCAGGTC | PrimerBank |
| REX1 (ID 89179322c1) | AGAAACGGGCAAAGACAACACGTCTATTTCCGC | PrimerBank | |
| NGN2 neurons | |||
| MAP2 (ID 87578393c1) | CTCAGCACCGCTAACAGAGG | CATTGGCCTTCGGACAAG | PrimerBank |
| BRN2 (ID 380254475c1) | CGGCGGATCAAACTGGGATTT | TTGCCTGCGATCTTGTCTAT | PrimerBank |
| CUX2 (ID 291045458c2) | CGAGACCTCCACACTTCGTG | TGTTTTTCCGCCTCATTTCTCTG | PrimerBank |
| NCAM1 (ID 336285437c3) | TGTCCGATTCATAGTCCTGTCC | CTCACAGCGATAAGTGCCCTC | PrimerBank |
| SYNAPSIN1 (ID 91984783c3) | TGCTCAGCAGTACACGTACC | GACACTTGCGATGTCCTGGAA | PrimerBank |
| mDA neurony | |||
| TH | CGGGCTTCTCGGACCAGAGGTA | CTCCTCGGGGGTGTACCACA | NCBI primer-BLAST |
| MAP2 | GGATCAACGGAGAGCTGAC | TCAGGACTGTACAGCCTCA | NCBI primer-BLAST |
| strong>Housekeeping genes | |||
| GAPDH | GAAATCCCATCACCATCTTCCAGG | GAGCCCCAGCCCTCTCCATG | NCBI primer-BLAST |
| OAZ1 | AGCAAGGACAGCTTTGCAGTT | ATGAAGACATGGTCGGCTCTCG | NCBI primer-BLAST |
| RPLPO | CCTCATATCCGGGGGAATGTG | GCAGCAGCTGGCACCTTATTG | NCBI primer-BLAST |
| RPL13A | GCCTACAAGAAAGTTTGCCTATC | TGGCTCTCTCTTCTCTCTCTCTC | NCBI starter-BLAST |
| Pożywki i odczynniki< | strong>Dystrybutor | Numer katalogowy | Użyj stężenia |
| Coating matrix | |||
| Extracellular matrix (Matrigel) | Corning | 354277 | 10 μ g/ml |
| Fibronektyna | Corning | 356008 | 2 &m; g/ml |
| Laminin | Sigma | L2020 | 5 - 10 μ g / ml |
| Poli-L-ornityna (PLO) | Sigma | P3655 | 0,1 mg / ml |
| < strong>Pożywka hodowlana | |||
| br/> (pożywka Essential 8 Flex) | Neurony Gibco | A2858501 | |
| NGN2 - NGN2 medium | |||
| 2-merkaptoetanol | Gibco | 21985023 | 0,909 ml (50 &mikro; M) |
| B27 suplement | Gibco | 12587010 | 10 ml (1%) |
| DMEM/F-12, GlutaMAX | Gibco | 31331093 | 484,75 mL |
| GlutaMAX | Gibco | 35050038 | 5 ml (2 mM) |
| Insulina | Sigma | I9278 | 0,25 ml (2,5 &mikro; g/ml) |
| MEM Aminokwasy endogenne | Gibco | 11140050 | 5 ml (0,5%) |
| Suplement N2 | Gibco | 17502048 | 5 ml (0,5%) |
| Pożywka neurobazalna | Gibco | 21103049 | 485 mL |
| mDA neurony - SRM medium | |||
| 2-merkaptoetanol | Gibco | 21985023 | 0,5 ml (55 &mikro; M) |
| GlutaMAX | Gibco | 35050038 | 5 ml (2 mM) |
| Knockout DMEM/F-12 | Gibco | 12660012 | 409,5 ml |
| Zamiennik surowicy do nokautu (wymiana surowicy) | Gibco | 10828028 | 75 ml (15%) |
| MEM Aminokwasy endogenne | Gibco | 11140050 | 5 ml (1%) |
| Penicylina-Streptomycyna | Gibco | 15140122 | 5 ml (1%) |
| mDA neurons - N2 medium | |||
| B27 suplement | Gibco | 12587010 | 10 ml (2%) |
| GlutaMAX | Gibco | 35050038 | 5 ml (2 mM) |
| Suplement N2 | Gibco | 17502048 | 5 ml (1%) |
| Podłoże neuropodstawowe | Gibco | 21103049 | 475 ml |
| Penicylina-Streptomycyna | Gibco | 15140122 | 5 ml(1%) |
| mDA neurony - Pożywka różnicująca | |||
| B27 suplement | Gibco | 12587010 | 10 ml (2%) |
| Pożywka neurobazalna | Gibco | 21103049 | 485 ml |
| Penicylina-Streptomycyna | Gibco | 15140122 | 5 ml (1%) |
| neurony NGN2 - Suplementy | |||
| czynnik neurotroficzny pochodzenia mózgowego (BDNF) | Peprotech | 450-02 | 10 ng / ml |
| CHIR99021 (CHIR) | R& D | 4423/10 | 2 μ M |
| Doksycylina (dox) | Sigma | D9891 | 2.5 μ g / ml |
| Czynnik neurotroficzny pochodzenia glejowego (GDNF) | Peprotech | 450-10 | 10 ng/ml |
| 2-fosforan kwasu L-askorbinowego magnez (AA2) | Sigma | A8960 | 64 mg/L |
| Czynnik neurotroficzny-3 (NT-3) | Peprotech | 450-10 | 10 ng/ml |
| Purmorphamine (PMA) | Cayman | 10009634 | 0,5 μ M |
| Puromycin | Sigma | P8833-10MG | 0,5 μ g/ml |
| Tiazovivin | Merk Millipore | 420220-10MG | 2 μ Neurony M |
| mDA - Suplementy | |||
| Czynnik neurotroficzny pochodzenia mózgowego (BDNF) | Peprotech | 450-02 | 20 ng/mL |
| CHIR99021 (CHIR) | R& D | 4423/10 | 3 & mu; M |
| DAPT | Kajman | 13197 | 10 &mikro; M |
| Dibutyryl-cAMP (db-cAMP) | Sigma | D0627 | 1 mM |
| Czynnik wzrostu fibroblastów 8B (FGF-8b) | Peprotech | 100-25 | 100 ng / mL |
| Czynnik neurotroficzny pochodzenia glejowego (GDNF) | Peprotech | 450-10 | 20 ng / ml |
| Kwas L-askorbinowy (AA1) | Sigma | A4403 | 0,2 mM |
| LDN193189 (LDN) | Kajman | 11802 | 100 nM |
| Purmorphamine (Purm) | Kajmany | 10009634 | 2 μ M |
| Sonic Hedgehog/Shh (C24II) N-Terminus (SHH) | R& D | 1845-SH | 100 ng / ml |
| SB431542 (SB) | Kajmany | 13031 | 10 μ M |
| Transformujący współczynnik wzrostu typu ß 3 (TGFß 3) | R & D | 243-B3 | 1 ng / ml |
| Y-27632 | Kajmany | 10005583 | 10 i mikro; Odczynniki do |
| dysocjacji M | |||
| Odczynnik do dysocjacji pojedynczych komórek (StemPro Accutase) | Gibco | A1110501 | 1x |
| UltraPure 0,5M EDTA, pH 8,0 | Gibco | 11575020 | 0,5 mM |
| zestaw do izolacji RNA i cDNA | |||
| RNA zestaw do izolacji | Qiagen | 74106 | Rneasy MiniKit |
| Bufor do lizy RNA | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | Bufor do lizy Trizol (RNA bufor do lizy |
| Odwrotna transkryptaza (zestaw) | Thermo Fisher Scientific | 18080-085 | SuperScript III Reverse Transkryptaza |
| Software | Company | Numer katalogowy | Opis/Zastosowanie |
| Cell Culture Framework (CCF) (Graficzny interfejs użytkownika, GUI) | Hamilton Robotics | Dedykowany | interfejs użytkownika dla zautomatyzowanego systemu |
| Oprogramowanie CellPathFinder (oprogramowanie do analizy obrazu 1) | Oprogramowanie Yokogawa | CellPathfinder HCS | Narzędzie do analizy obrazu |
| System pomiarowy CellVoyager | Yokogawa | W zestawie Oprogramowanie sterujące mikroskopem CellVoyager 7000 | |
| Oprogramowanie Columbus (oprogramowanie do analizy obrazu 2) | Perkin Elmer | Columbus | Narzędzie do analizy obrazu |
| qPCR oparta na chmurze | Thermo Fisher Scientific | Themo Fisher | dla danych qRT-PCR |
| Wenus oprogramowanie | Hamilton Robotics | VENUS Two Dynamic Schedular 5.1 Software | Oprogramowanie sterujące dla zautomatyzowanego systemu |
Bibliografia
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Payne, N. L., Sylvain, A., O'Brien, C., Herszfeld, D., Sun, G., Bernard, C. C. A. Application of human induced pluripotent stem cells for modeling and treating neurodegenerative diseases. New biotechnology. 32 (1), 212-228 (2015).
- Wu, Y. Y., Chiu, F. L., Yeh, C. S., Kuo, H. C. Opportunities and challenges for the use of induced pluripotent stem cells in modelling neurodegenerative disease. Open Biology. 9 (1), 180177(2019).
- Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery. Nature Reviews Molecular cell biology. 17 (3), 170-182 (2016).
- Jain, S., Heutink, P. From single genes to gene networks: high-throughput-high-content screening for neurological disease. Neuron. 68 (2), 207-217 (2010).
- Soares, F. A. C., Chandra, A., Thomas, R. J., Pedersen, R. A., Vallier, L., Williams, D. J. Investigating the feasibility of scale up and automation of human induced pluripotent stem cells cultured in aggregates in feeder free conditions. Journal of biotechnology. 173, 53-58 (2014).
- Konagaya, S., Ando, T., Yamauchi, T., Suemori, H., Iwata, H. Long-term maintenance of human induced pluripotent stem cells by automated cell culture system. Scientific reports. 5, 16647(2015).
- Conway, M. K., et al. Scalable 96-well Plate Based iPSC Culture and Production Using a Robotic Liquid Handling System. Journal of visualized experiments: JoVE. (99), e52755(2015).
- Paull, D., et al. high-throughput derivation, characterization and differentiation of induced pluripotent stem cells. Nature methods. 12 (9), 885-892 (2015).
- Busskamp, V., et al. Rapid neurogenesis through transcriptional activation in human stem cells. Molecular systems biology. 10, 760(2014).
- Zhang, Y., et al. Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells. Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).
- Reinhardt, P., et al. Derivation and expansion using only small molecules of human neural progenitors for neurodegenerative disease modeling. PloS one. 8 (3), 59252(2013).
- Kriks, S., et al. Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson's disease. Nature. 480 (7378), 547-551 (2011).
- Koch, J. C., et al. Alpha-Synuclein affects neurite morphology, autophagy, vesicle transport and axonal degeneration in CNS neurons. Cell death & disease. 6, 1811(2015).
- Korecka, J. A., et al. Neurite Collapse and Altered ER Ca2+ Control in Human Parkinson Disease Patient iPSC-Derived Neurons with LRRK2 G2019S Mutation. Stem cell reports. 12 (1), 29-41 (2019).
- Mehta, S. R., et al. Human Huntington's Disease iPSC-Derived Cortical Neurons Display Altered Transcriptomics, Morphology, and Maturation. Cell reports. 25 (4), 1081-1096 (2018).
- Ye, J., Coulouris, G., Zaretskaya, I., Cutcutache, I., Rozen, S., Madden, T. L. Primer-BLAST: a tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction. BMC bioinformatics. 13, 134(2012).
- Spandidos, A., Wang, X., Wang, H., Seed, B. PrimerBank: a resource of human and mouse PCR primer pairs for gene expression detection and quantification. Nucleic acids research. 38, Database issue 792(2010).
Przedruki i uprawnienia
Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE
Poproś o pozwolenie