Artykuł metodologiczny

Izolacja i hodowla mezenchymalnych komórek macierzystych szpiku kostnego żuchwy u szczurów

DOI:

10.3791/61532

⸱

25 sierpnia 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center of Craniofacial Orthodontics, Department of Oral and Cranio-maxillofacial Science, Ninth People's Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Shanghai Key Laboratory of Stomatology & Shanghai Research Institute of Stomatology, National Clinical Research center of Stomatology, 2The 2nd Dental Center, Ninth People's Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Shanghai Key Laboratory of Stomatology & Shanghai Research Institute of Stomatology, National Clinical Research center of Stomatology

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten artykuł przedstawia metodę, która łączy przyleganie całego szpiku kostnego i sortowanie cytometrią przepływową do izolacji, hodowli, sortowania i identyfikacji mezenchymalnych komórek macierzystych szpiku kostnego z żuchwy szczura.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy efektywną metodę izolacji i hodowli mezenchymalnych komórek macierzystych szpiku kostnego żuchwy (mBMSC) in vitro, aby szybko uzyskać wiele wysokiej jakości komórek do celów eksperymentalnych. mBMSC mogą być szeroko stosowane w zastosowaniach terapeutycznych jako komórki inżynierii tkankowej w przypadku chorób twarzoczaszki i regeneracji czaszkowo-szczękowo-twarzowej w przyszłości ze względu na doskonałą zdolność do samoodnawiania się i potencjał różnicowania wieloliniowego. Dlatego ważne jest, aby uzyskać mBMSC w dużych ilościach.

W tym badaniu, szpik kostny został wypłukany z żuchwy, a pierwotne mBMSC zostały wyizolowane poprzez hodowlę przylegającą do całego szpiku kostnego. Ponadto mBMSC CD29 + CD90 + CD45− oczyszczono poprzez sortowanie komórek fluorescencyjnych. Do dalszych badań wykorzystano drugą generację oczyszczonych mBMSC, które wykazały potencjał w różnicowaniu się w osteoblasty, adipocyty i chondrocyty. Wykorzystując ten model in vitro, można uzyskać dużą liczbę proliferacyjnych mBMSC, co może ułatwić badanie cech biologicznych, późniejszą reakcję na mikrośrodowisko i inne zastosowania mBMSC.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mezenchymalne komórki macierzyste szpiku kostnego (BMSC) to niehematopoetyczne komórki macierzyste pochodzące ze szpiku kostnego, które wykazują silną zdolność do proliferacji i potencjał różnicowania wielu linii1,2,3,4. Rzeczywiście, BMSC są uważane za idealnego kandydata do inżynierii i regeneracji tkanki kostnej od momentu ich odkrycia. Przez lata grzebień biodrowy lub kości długie, takie jak kość piszczelowa i udowa, były najczęstszym źródłem BMSC do regeneracji twarzoczaszki. Jednak BMSC ustno-twarzowe, takie jak BMSC żuchwy (mBMSC), wykazują pewne różnice w stosunku do BMSC kości długich, takie jak inne pochodzenie embrionalne i wzorzec rozwoju. Żuchwy powstają z komórek grzebienia nerwowego listka rozrodczego neuroektodermy i ulegają kostnieniu śródbłoniastemu, podczas gdy szkielety osiowe i wyrostka robaczkowego pochodzą z mezodermy i ulegają kostnieniu śródchrzęstnemu. Co więcej, obserwacje kliniczne i eksperymentalne badania na zwierzętach konsekwentnie wskazują, że istnieją różnice funkcjonalne między grzebieniem ustno-twarzowym a biodrowym BMSCs5,6,7,8. Raporty wykazały, że BMSC pochodzące z kości twarzoczaszki, takiej jak żuchwa, kość szczęki i kość wyrostka zębodołowego, wykazywały lepszą proliferację, długość życia i zdolność różnicowania niż te z kości osiowych i wyrostka robaczkowego9. W związku z tym mBMSC są uważane za preferowane zasoby dla przyszłych zastosowań terapeutycznych chorób twarzoczaszki, takich jak cherubinki, guz szczęki, osteoporoza kości szczęki i ubytek tkanki przyzębia10,11,12. Aby zrozumieć potencjał terapeutyczny w eksperymentach przedklinicznych, konieczne jest opracowanie metody szybkiej izolacji i hodowli mBMSC in vitro.

W tym badaniu, celem było uzyskanie oczyszczonych mBMSC poprzez przyleganie całego szpiku kostnego i sortowanie metodą cytometrii przepływowej. Anatomiczna morfologia żuchwy szczura, wyraźnie obserwowana za pomocą mikrotomografii komputerowej (Micro-CT) i wycinków histologicznych, wykazała, że kość beleczkowa żuchwy znajdowała się między siekaczem przestrzeni szpikowej a kością wyrostka zębodołowego. Szpik kostny z kości beleczkowej został przepłukany w celu uzyskania komórek szpiku żuchwy, ale komórki hodowane w ten sposób nie były czystymi mBMSC i prawdopodobnie składały się z wielu typów komórek o niepewnej potencji i różnych liniach, takich jak komórki z komórek kostnych, tłuszczowych i śródbłonka13,14. Kolejny etap oczyszczania komórek był szczególnie ważny. Cytometria przepływowa filtruje komórki poprzez rozpoznawanie kombinacji białek powierzchniowych komórek i jest szeroko stosowana we wzbogacaniu mezenchymalnych komórek macierzystych. Homogeniczność komórek jest główną zaletą cytometrii przepływowej, ale proces ten nie określa żywotności komórek i może skutkować ograniczoną wydajnością komórek. W tym badaniu mBMSC P0 uzyskane z przylegania całego szpiku kostnego posortowano za pomocą cytometrii przepływowej w celu uzyskania mBMSC o wysokiej czystości i silnej zdolności proliferacji.

To badanie wprowadza powtarzalny i niezawodny protokół izolacji, hodowli i różnicowania BMSC żuchwy szczura przy użyciu kombinacji przylegania całego szpiku kostnego i sortowania cytometrią przepływową. Jest to niezawodna i wygodna metoda do stosowania dla badaczy z pokrewnych dziedzin.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury eksperymentalne na zwierzętach opisane w tym artykule zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami Dziewiątego Szpitala Ludowego w Szanghaju, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine.

1. Przygotowanie

  1. Do eksperymentu wykorzystano dwa 5-tygodniowe samce szczurów rasy Sprague Dawley.
  2. Wysterylizuj wszystkie narzędzia, w tym uchwyty na igły, pęsetę i nożyczki w wysokiej temperaturze lub zanurzone w 75% etanolu na 10 minut
    UWAGA: Zanurzenie w etanolu nie powinno być zbyt długie, aby uniknąć uszkodzenia ogniw.
  3. Należy wcześniej przygotować pożywki hodowlane, których skład przedstawiono w tabeli 1. Uzupełnij każdą pożywkę zgodnie z poniższym opisem.
    1. Przygotowanie pożywki hodowlanej α-MEM (z 10% FBS): Uzupełnij minimalną niezbędną pożywkę alfa (α-MEM) 10% płodową surowicą bydlęcą oraz 1% penicyliną i streptomycyną.
    2. Przygotowanie pożywki do różnicowania osteogennego: Uzupełnij podstawową pożywkę różnicowania osteogennego 10% płodową surowicą bydlęcą, 1% glutaminą, 1% penicyliną-streptomycyną, 0,20% kwasem askorbinowym, 1% β-glicerofosforanem i 0,01% deksametazonem.
    3. Przygotowanie pożywki do indukcji osteogennej: Zmieszać 70% pożywki hodowlanej α-MEM (z 10% FBS) i 30% pożywki do różnicowania osteogennego.
    4. Przygotowanie pożywki do różnicowania adipogennego A: Uzupełnij podłoże bazowe różnicowania adipogennego 10% płodową surowicą bydlęcą, 1% glutaminą, 1% penicyliną-streptomycyną, 0,20% insuliną, 0,10% IBMX, 0,10% rozyglitazonem i 0,01% deksametazonem.
    5. Preparat pożywki do różnicowania adipogennego B: uzupełnij podłoże bazowe różnicowania adipogennego 10% płodowej surowicy bydlęcej, 1% glutaminy, 1% penicyliny-streptomycyny i 0,20% insuliny.
    6. Przygotowanie pożywki do różnicowania chondrogennego: Uzupełnij podstawową pożywkę różnicowania chondrogennego 0,01% deksametazonem, 0,30% kwasem askorbinowym, 1% ITS, 0,10% pirogronianem sodu, 0,10% proliną i 1% TGF-β3,
      UWAGA: Pożywka do różnicowania osteogennego musi zostać zużyta w ciągu miesiąca od konfiguracji. Efektywny okres skonfigurowanego podłoża do różnicowania chondrogennego wynosi 12 godzin.

2. Izolacja i hodowla szczurzych mBMSC

UWAGA: Wszystkie operacje eksperymentalne powinny być wykonywane na lodzie w jak największym stopniu, aby utrzymać żywotność komórek.

  1. Zbieranie żuchw szczurów
    1. Eutanazja dwóch 5-tygodniowych samców szczurów Sprague Dawley przez uduszenie CO2. Upewnij się, że oddychanie zwierzęcia zostało zatrzymane przed przystąpieniem do eksperymentu.
    2. Opłucz te szczury w zlewce zawierającej 75% etanolu przez 3 minuty.
    3. Umieść szczura w czystym dygestorium, aby zebrać żuchwy.
      UWAGA: Przed użyciem wysterylizuj wyciąg promieniowaniem ultrafioletowym przez 30 minut.
    4. Ułóż szczura w pozycji leżącej. Naciąć skórę i mięśnie buccinatora od obustronnego angulus oris do tylnej części żuchwy, która jest jedyną ruchomą kością z dolnym siekaczem.
      UWAGA: Zaleca się wykonanie 2 cm nacięcia z każdej strony irysa angulus, aby uzyskać czyste pole operacyjne.
    5. Otwórz pysk szczura, popychając siekacze szczęki i żuchwy w przeciwnym kierunku obydwoma kciukami, aby odsłonić zęby żuchwy, które są przymocowane do żuchwy.
    6. Całkowicie odłącz mięśnie policzkowe i ścięgna przyczepione do kruków i dolnej granicy żuchwy.
      UWAGA: Podczas tego kroku obserwuje się zwiększoną ruchomość żuchwy ze względu na brak napięcia mięśniowego.
    7. Naciśnij tylne zęby żuchwy i obracaj do tyłu i w dół, aż kłykcie po obu stronach będą wyraźnie odsłonięte.
      UWAGA: Ten krok jest wykonywany w celu sztucznego otwarcia pyska szczura w maksymalnym możliwym stopniu, aby zwichnąć kłykcie. Żuchwa jest połączona z czaszką za pomocą obustronnych kłykci, więc odsłonięcie kłykci prowadzi do rozłączenia między czaszką a żuchwą.
    8. Oddziel korpus żuchwy od czaszki.
    9. Oczyść przylegającą tkankę miękką na powierzchni kości za pomocą mokrej gazy.
    10. Umieścić kość w sterylnym szklanym naczyniu o średnicy 10 cm, wypełnionym wstępnie schłodzonym minimum niezbędnym roztworem α (α-MEM) lub soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) na lodzie, aby zachować żywotność.
  2. Izolacja i hodowla mBMSC
    1. Odetnij kość przednią wzdłuż mezjalnej krawędzi pierwszego zęba trzonowego od trzonu żuchwy. Usuń ramus żuchwy, w tym kruczek i kłykcie, wzdłuż dystalnej krawędzi trzeciego trzonowca, aby odsłonić jamę szpiku.
    2. Napełnij 10 cm sterylne szklane naczynie 10 ml α-MEM (z 10% FBS).
    3. Użyć strzykawki o pojemności 1 ml do odessania pożywki hodowlanej α-MEM. Po wprowadzeniu igły strzykawki do jamy szpiku kostnego, należy kilkakrotnie przepłukać szpik kostny do naczynia. Przepłukać jamę kostną co najmniej 3 razy odpowiednio z mezjalnej i dystalnej strony kości, aż kość stanie się biała.
      UWAGA: Jest to najbardziej krytyczny krok, ponieważ jama szpiku kostnego żuchwy szczura nie jest tak oczywista jak w kości długiej, a właściwy punkt do wprowadzenia igły musi zostać określony empirycznie. Wszystkie powyższe próbki doświadczalne powinny być przechowywane na lodzie w celu utrzymania żywotności komórek, a zatem czas operacji nie może być dłuższy niż 2 godziny.
    4. Przenieść pożywkę zawierającą przepłukane komórki do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i odwirować w temperaturze 800 x g w 4 °C przez 5 minut. Odrzucić supernatant.
    5. Ponownie zawiesić komórki za pomocą 3 ml α-MEM (z 10% FBS). Umieścić komórki w nowym naczyniu hodowlanym o średnicy 10 cm i inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% stężeniemCO2
      6. .
    6. Sprawdź zmiany morfologiczne i wzrost tych komórek w 3 dniu hodowli. Usunąć pożywkę hodowlaną z nieprzylegającymi komórkami i fragmentami tkanek. Delikatnie dodaj 10 ml świeżego α-MEM (z 10% FBS).
    7. Po 7 dniach hodowli MBMSC P0 osiągnęły konfluencję od 70% do 80%.
  3. Sortowanie w komorze przepływowej
    UWAGA: MBMSC P0 zostały zidentyfikowane fenotypowo i pierwotnie oczyszczone poprzez sortowanie komórek przepływowych.
    1. Odessać i wyrzucić pożywkę hodowlaną, a następnie umyć naczynie PBS. Wyrzuć PBS.
    2. Dodaj do naczynia 1 ml 0,25% trypsyny z 0,02% EDTA. Trawić komórki w temperaturze 37 °C przez 5 minut, a następnie dodać 2 ml α-MEM (z 10% FBS), aby zatrzymać reakcję.
    3. Przenieść zawiesinę komórek do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i odwirować przy 800 x g przez 5 minut.
    4. Ponownie zawiesić komórki w 120 μl PBS (z 10% FBS) po odwirowaniu.
    5. Zablokować te zawiesiny komórkowe za pomocą 1 μl przeciwciała przeciwko CD16/CD32 w temperaturze 4 °C przez 15 minut.
    6. Przenieść 100 μl zawiesiny komórkowej do nowej probówki do mikrowirówki, wybarwić komórki przeciwciałem sprzężonym z fikoerytryną (PE) przeciwko CD45, przeciwciałem sprzężonym z izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC) przeciwko CD90 i przeciwciałem allofikocyjaninowym (APC) przeciwko CD29 w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę w ciemności13,15. Stężenie przeciwciał użytych w tym doświadczeniu przedstawiono w tabeli 2. Pozostałe 20 μl zawiesiny komórkowej należy użyć jako niebarwionej kontroli ujemnej.
    7. Następnie odwirować probówki o sile 800 x g przez 5 minut, wyrzucić zawiesinę i ponownie zawiesić komórki w 0,5 ml PBS (z 10% FBS).
    8. Dodać 10 μl 0,01 mg/ml DAPI na 10 minut przed analizą.
    9. Użyj filtrów 40 nm umieszczonych na probówkach wirówkowych, aby przefiltrować komórki.
    10. Przeanalizuj komórki w sortowniku komórek aktywowanym fluorescencją. Ustaw panele w następujący sposób. Po pierwsze, usuń martwe komórki z całkowitej liczby komórek poprzez bramkowanie komórek DAPI, a następnie bramkowanie CD29 + CD90 + CD45- w wybranych komórkach jako docelowe mBMSC.
    11. Zebrać posortowane komórki CD29 + CD90 + CD45- do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml z 3 ml wstępnie przygotowanej α-MEM (z 10% FBS).
    12. Odwirować probówki o masie 800 x g przez 5 minut. Usunąć bufor zbiorczy i dodać 1 ml świeżego α-MEM (z 10% FBS) w celu ponownego zawieszenia komórek. Następnie umieść je w naczyniu hodowlanym o średnicy 6 cm.

3. Zdolność do tworzenia kolonii

UWAGA: Ten krok został wykonany w celu sprawdzenia zdolności podziału mBMSC. 15

  1. Wybierz mBMSC drugiego przejścia (P2) dla tego eksperymentu. Gdy zbieg komórek osiągnie 80% do 90%, ponownie zasiaj komórki w szeregowym gradiencie na płytce 6-dołkowej, aby ocenić ich zdolność do proliferacji klonalnej.
    UWAGA: Zaleca się ustawienie gradientu od 1 x 102 do 1 x 103 komórek na studzienkę, ale ostateczne rozcieńczenia różnych linii komórkowych pochodzenia ludzkiego lub zwierzęcego zostały określone empirycznie.
  2. Hoduj komórki w α-MEM (z 10% FBS) przez około dwa tygodnie, aż będzie można zobaczyć dużą liczbę jednostek tworzących kolonie pod mikroskopem świetlnym. Odświeżaj pożywkę co 3 dni.
  3. Odessać i wyrzucić pożywkę hodowlaną, przemyć studzienki PBS dwa razy przez 5 minut na raz. Następnie dodaj 4% roztwór paraformaldehydu do każdej studzienki i utrwalaj przez co najmniej 10 minut.
  4. Usuń paraformaldehyd i dwukrotnie przepłucz studzienki PBS.
  5. Zabarwić komórki roztworem barwiącym fioletu krystalicznego i inkubować w temperaturze 37 °C przez około 10 min.
    UWAGA: Czas barwienia należy odpowiednio dostosować, aż do uzyskania pożądanego odcienia.
  6. Usuń roztwór barwiący i umyj próbki wodą destylowaną, aby zatrzymać reakcję.
  7. Obraz pod mikroskopem stereoskopowym i policz rozproszone kolonie komórek, które składały się z co najmniej 50 komórek.

4. Wieloliniowe różnicowanie mBMSC

UWAGA: MBMSC P2 były używane do kolejnych eksperymentów, chyba że opisano inaczej.

  1. Osteogenna indukcja mBMSC
    1. Przetrawić mBMSC zgodnie z powyższym opisem. Komórki nasienne o gęstości 2,5 x 105/cm2 na płytce 12-dołkowej uzupełnionej 1 ml α-MEM (z 10% FBS).
    2. Gdy zbieg komórek osiągnie 60-70%, zmień pożywkę na 30% osteogenną pożywkę indukcyjną. Hoduj komórki za pomocą α-MEM (z 10% FBS) jako kontroli ujemnej i zmieniaj pożywkę co 2 dni.
      UWAGA: Po pojawieniu się dużej liczby guzków wapnia podczas osteogenezy, zaleca się zmianę wzorca wymiany pożywki na wymianę pożywki o połowie objętości co 2 dni, aby zapobiec unoszeniu się osteoblastów.
    3. Po siedmiu dniach hodowli oceń zwapnienie tych komórek za pomocą barwienia fosfatazą alkaliczną16,17.
    4. Usunąć pożywkę hodowlaną i utrwalić komórki 4% paraformaldehydem przez 10 minut. Przepłukać komórki za pomocą 1 ml PBS na studzienkę przez 3 minuty dwa razy.
    5. Następnie wybarwić komórki roztworem barwiącym fosfatazę alkaliczną i inkubować w temperaturze 37 °C przez 10-30 min.
      UWAGA: Inkubację można przeprowadzić przez noc w temperaturze pokojowej w celu uzyskania wymaganego koloru.
    6. Umyj studzienki wodą destylowaną, aby zatrzymać reakcję. Rób zdjęcia pod mikroskopem świetlnym. Czerwone pigmentowane granulki reprezentują aktywność fosfatazy alkalicznej (ALP).
    7. Po hodowli pozostałych komórek przez kolejne 7 dni należy wykonać barwienie czerwienią alizarynową, aby ocenić zdolność mineralizacji komórek.
    8. Wybarwić komórki 0,5% roztworem do barwienia czerwienią alizarynową po utrwaleniu komórek przez 10 min16,18. Reakcję chromogenną z wodą destylowaną zatrzymać po 3-5 min.
      UWAGA: Czas reakcji może się wydłużyć w zależności od opracowanego koloru.
    9. Na koniec umieść płytkę hodowlaną pod mikroskopem świetlnym, aby zaobserwować efekt barwienia osteogennego; czerwone guzki wskazują na złogi wapnia w tych komórkach.
  2. Indukcja adipogenna mBMSC
    1. Wysiewaj P2 mBMSC w 12-dołkowej płytce, jak opisano powyżej.
    2. Po tym, jak studzienka stanie się w 90% zlewająca, hoduj komórki za pomocą pożywki różnicującej adipogennej A. Użyj komórek hodowanych w pożywce hodowlanej α-MEM (z 10% FBS) jako kontroli negatywnej.
    3. Po 2 dniach indukcji odessać pożywkę A z dołka i dodać 1 ml pożywki B do różnicowania adipogennego do każdej studzienki.
    4. Po jednym dniu usuń pożywkę B i ponownie rozpocznij cykl z pożywką A dodaną z powrotem do studzienki. Hodować komórki na przemian przy użyciu pożywki A i B.
    5. Stosować pożywkę różnicującą A i B naprzemiennie przez trzy cykle i wykrywać adipogenezę tych komórek za pomocą barwienia czerwienią olejową O16,18.
      UWAGA: Wiele okrągłych i dużych kropelek lipidowych można zaobserwować, hodując te komórki z pożywką różnicującą B przez dodatkowe 2 do 3 dni.
    6. Usuń pożywkę i utrwal komórki 4% paraformaldehydem przez 10 minut. Umyj komórki PBS.
    7. Zabarwić komórki roztworem barwiącym czerwień olejową O i inkubować w temperaturze 37 °C przez około 3 minuty.
    8. Usuń roztwór barwiący i umyj studzienki wodą destylowaną.
    9. Obserwuj adipogenezę pod mikroskopem świetlnym.
  3. Indukcja chondrogenezy mBMSC
    1. Wysiewać P2 mBMSC w 15 ml probówce wirówkowej o gęstości 5 x 105/cm2.
    2. Odwirować probówki o stężeniu 300 x g przez 5 minut. Odrzucić supernatant.
    3. Ponownie zawiesić komórki za pomocą 0,5 ml chondrogennej pożywki różnicującej. Odwirować komórki przy sile 300 x g przez 5 minut.
    4. Poluzować nakrętkę probówki wirówkowej i inkubować ją w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5%CO2. Wymieniaj podłoże co 2 dni.
      UWAGA: Ogniwa rozpoczynają granulowanie po 24 godzinach. Zaleca się, aby nie przesuwać probówki wirówkowej przez 48 godzin. Uważaj, aby nie zassać osadu komórkowego podczas zmiany podłoża.
    5. Po 21 dniach od indukcji utrwalić granulki komórkowe za pomocą 4% paraformaldehydu, a następnie odwodnić, zatopić parafinę i podzielić na sekcje.
    6. Po odparafinowaniu i uwodnieniu zabarwić szkiełka w roztworze błękitu alcian przez co najmniej 15 min18,19,20,21, a następnie przemyć wodą destylowaną, aby zatrzymać reakcję. Uchwyć zdjęcia pod mikroskopem świetlnym.
    7. W przypadku barwienia immunofluorescencyjnego kolagenu typu II wykonaj poniższe czynności.
      1. Inkubować szkiełka z 5 μg/ml proteinazy K przez 15 minut w temperaturze 37 °C po etapie deparafinowania i hydratacji.
      2. Inkubować szkiełka w buforze blokującym przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
      3. Nałożyć 1 μl przeciwciała kolagenu typu II w 200 μl buforu blokującego na szkiełka i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
      4. Następnego dnia przemyć szkiełka dwukrotnie PBS i inkubować z przeciwciałami drugorzędowymi w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
      5. Inkubować plastry z 40,6-diamidyno-2-fenyloindolem (DAPI) przez 10 minut.
    8. Zrób zdjęcia każdego preparatu pod mikroskopią fluorescencyjną.

5. PCR w czasie rzeczywistym

  1. Ekstrahować całkowite RNA z mBMSC za pomocą dostępnego w handlu odczynnika na bazie izotiocyjanianu guanidu.
  2. Wykonaj odwrotną transkrypcję RNA do komplementarnego DNA za pomocą dostępnego na rynku zestawu. Warunki reakcji odwrotnej transkrypcji były następujące: 65 °C przez 5 min, 37 °C przez 15 min, 85 °C przez 15 s.
  3. Wykonaj PCR w czasie rzeczywistym w celu wykrycia genów specyficznych dla osteogenezy i adipogenezy przy użyciu starterów wymienionych w tabeli 3. Procedura amplifikacji PCR była następująca: 95 °C przez 5 minut. 95 °C przez 5 s, 60 °C przez 30 s przez 40 cykli.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Korzystając z tego protokołu, duża część komórek przylgnęła do płytki trzeciego dnia po początkowej hodowli. Zazwyczaj po dodatkowych 3-4 dniach hodowli zbieg komórek osiągał od 70 do 80% (Ryc. 1B). Dzięki sortowaniu komórek fluorescencyjnych, mBMSC DAPI-CD29+CD90+CD45− zostały oczyszczone18,22, co stanowiło około 81,1% w komórkach P0 (Rysunek 1C).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten opisuje metodę izolowania BMSC od żuchw szczurów in vitro poprzez połączenie adherencji całego szpiku kostnego i sortowania komórek fluorescencyjnych, co jest prostym i niezawodnym sposobem uzyskania proliferacyjnych mBMSC o silnej zdolności różnicowania. Metoda ta może wstępnie oczyścić mBMSC poprzez sortowanie komórek przepływowych, ale jeśli istnieją wyższe wymagania dotyczące jednorodności komórek, mogą być wymagane bardziej precyzyjne metody oczyszczania.

Obecnie istnieją czt...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszyscy autorzy oświadczają, że nie mają konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy za pomoc Laboratorium Cyfrowej Stomatologii i Centrum Badań nad Anomaliami Twarzoczaszki w Szanghaju Dziewiątego Szpitala Ludowego. Prace nad tym manuskryptem są wspierane przez granty z Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (NSFC) [81570950,81870740,81800949], Shanghai Summit & Plateau Disciplines, funduszu SHIPM-mu z Shanghai Institute of Precision Medicine, Shanghai Ninth People's Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine [JC201809], Projektu Motywacyjnego Zespołu ds. Innowacji Wysokiego Szczebla dla Shanghai Jiao Tong University School of Medicine. L.J. jest stypendystą Outstanding Youth Medical Talents, Programu Rozwoju Młodzieży "Rising Stars of Medical Talent" w Szanghaju oraz projektu "Chen Xing" na Uniwersytecie Jiaotong w Szanghaju.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,25% Trypsyna-EDTA(1X)Gibco25200072
10 cm naczynie hodowlaneCorning
acutenaculum
Pożywka do różnicowania adipogennegoCyagen biosciences inc.MUBMX-90031
Alcian BlueBeyotime Biotechnology
Alizarin redSigma-AldrichA5533
Zestaw do rozwoju koloru fosfatazy alkalicznejBeyotime BiotechnologyC3206
alfa-Minimum niezbędne podłożeGE Healthcare HyClone Cell CultureSH30265.01B
Anti -CollagenII Rabbit pAbAbcamab34712
Przeciwciała przeciwko pożywce montażowej zapobiegającej blaknięciu CD16 / CD32
z DAPIBeyotime BiotechnologyP0131
APC anty-mysie / szczurzo CD29 Przeciwciałobiolegend inc102215
Szafa bezpieczeństwa biologicznegoEscoAC2-4S8-CN
CD45 Przeciwciało monoklonalne (OX1), PE, eBioscienceInvitrogen12-0461-82
CD90.1 (Thy-1.1) Przeciwciało monoklonalne (HIS51), FITC, eBioscienceInvitrogen11-0900-85
WirówkaCenceL500
Podłoże różnicujące chondrogenezęcyagen biosciences inc.
Konfokalny laserowy mikroskop skaningowyZeissLSM880
Countess II FL Automatyczny licznik komórekInvitrogenAMQAF1000
Roztwór do barwienia fioletu krystalicznegoBeyotime BiotechnologyC0121
Płodowa surowica bydlęcaGE Healthcare Hodowla komórek hyklonowychSH30084.03
Kozia anty-królicza IgG H& L (Alexa Fluor 488)abcamab150077
InkubatorEscoCCL-170B-8
Mikroskop odwróconyolympusCKX53
Odczynnik Magzol (odczynnik Trizol)Mikropipet Magen
Eppendorf
Oil Red O
Pożywka do różnicowania osteogennegoCyagen Biosciences Inc.MUBMX-90021
Penicylina-StreptomycynaGibco15070063
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (1X)Gibco20012027
Zestaw główny PrimeScript RTTakaRa Bio IncRR036A
Proteinaza KSigma-AldrichP6556
Bufor blokujący QuickBlockBeyotime BiotechnologyP0260
Nożyczki
SYBR1 PremixTakaRa Bio Inc
Toluidyna NiebieskiBeyotime Biotechnology
Trypan Blue Solution, 0,4%Gibco15250061

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jin, C., et al. Stem cell education for medical students at Tongji University: Primary cell culture and directional differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells. Biochemistry and Molecular Biology Education. 46 (2), 151-154 (2018).
  2. Chu, D. T., et al. An Update on the Progress of Isolation, Culture, Storage, and Clinical Application of Human Bone Marrow Mesenchymal Stem/Stromal Cells. International Journal of Molecular Sciences. 21 (3), 708(2020).
  3. Jin, Z., Chen, J., Shu, B., Xiao, Y., Tang, D. Bone mesenchymal stem cell therapy for ovariectomized osteoporotic rats: a systematic review and meta-analysis. BMC Musculoskeleton Disorder. 20 (1), 556(2019).
  4. Jiang, Y., et al. Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow. Nature. 418 (6893), 41-49 (2002).
  5. Musina, R. A., Bekchanova, E. S., Belyavskii, A. V., Sukhikh, G. T. Differentiation potential of mesenchymal stem cells of different origin. Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 141 (1), 147-151 (2006).
  6. Lloyd, B., et al. Similarities and differences between porcine mandibular and limb bone marrow mesenchymal stem cells. Archives in Oral Biology. 77, 1-11 (2017).
  7. Zhang, W., et al. Comparison of the use of adipose tissue-derived and bone marrow-derived stem cells for rapid bone regeneration. Journal of Dental Research. 92 (12), 1136-1141 (2013).
  8. Stefanik, D., et al. Disparate osteogenic response of mandible and iliac crest bone marrow stromal cells to pamidronate. Oral Disorders. 14 (5), 465-471 (2008).
  9. Aghaloo, T. L., et al. Osteogenic potential of mandibular vs. long-bone marrow stromal cells. Journal of Dental Research. 89 (11), 1293-1298 (2010).
  10. Kaigler, D., et al. Stem cell therapy for craniofacial bone regeneration: a randomized, controlled feasibility trial. Cell Transplantation. 22 (5), 767-777 (2013).
  11. Li, C., Wang, F., Zhang, R., Qiao, P., Liu, H. Comparison of proliferation and osteogenic differentiation potential of rat mandibular and femoral bone marrow mesenchymal stem cells in vitro. Stem Cells Development. 2020, 1941629(2020).
  12. Matsubara, T., et al. Alveolar bone marrow as a cell source for regenerative medicine: differences between alveolar and iliac bone marrow stromal cells. Journal of Bone and Mineral Research. 20 (3), 399-409 (2005).
  13. Chan, C. K. F., et al. Identification of the Human Skeletal Stem Cell. Cell. 175 (1), 43-56 (2018).
  14. Bianco, P., Riminucci, M., Gronthos, S., Robey, P. G. Bone marrow stromal stem cells: nature, biology, and potential applications. Stem Cells. 19 (3), 180-192 (2001).
  15. Franken, N. A., Rodermond, H. M., Stap, J., Haveman, J., van Bree, C. Clonogenic assay of cells in vitro. Nature Protocol. 1 (5), 2315-2319 (2006).
  16. Xu, H., et al. Icariin prevents oestrogen deficiency-induced alveolar bone loss through promoting osteogenesis via STAT3. Cell Proliferation. 53 (2), 12743(2020).
  17. Zhang, P., Wu, Y., Jiang, Z., Jiang, L., Fang, B. Osteogenic response of mesenchymal stem cells to continuous mechanical strain is dependent on ERK1/2-Runx2 signaling. Internation Journal of Molecular Medicine. 29 (6), 1083-1089 (2012).
  18. Zhu, H., et al. A protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse compact bone. Nature Protocol. 5 (3), 550-560 (2010).
  19. Lach, M. S., et al. Chondrogenic Differentiation of Pluripotent Stem Cells under Controllable Serum-Free Conditions. International Journal of Molecular Sciences. 20 (11), 2711(2019).
  20. Huang, X., Zhong, L., Hendriks, J., Post, J. N., Karperien, M. The Effects of the WNT-Signaling Modulators BIO and PKF118-310 on the Chondrogenic Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells. International Journal of Molecular Sciences. 19 (2), 561(2018).
  21. Gale, A. L., Linardi, R. L., McClung, G., Mammone, R. M., Ortved, K. F. Comparison of the Chondrogenic Differentiation Potential of Equine Synovial Membrane-Derived and Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells. Frontiers in Veterinary Sciences. 6, 178(2019).
  22. Li, X., Zhang, Y., Qi, G. Evaluation of isolation methods and culture conditions for rat bone marrow mesenchymal stem cells. Cytotechnology. 65 (3), 323-334 (2013).
  23. Kagami, H., Agata, H., Tojo, A. Bone marrow stromal cells (bone marrow-derived multipotent mesenchymal stromal cells) for bone tissue engineering: basic science to clinical translation. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 43 (3), 286-289 (2011).
  24. Chamberlain, G., Fox, J., Ashton, B., Middleton, J. Concise review: mesenchymal stem cells: their phenotype, differentiation capacity, immunological features, and potential for homing. Stem Cells. 25 (11), 2739-2749 (2007).
  25. Abdallah, B. M., Alzahrani, A. M., Abdel-Moneim, A. M., Ditzel, N., Kassem, M. A simple and reliable protocol for long-term culture of murine bone marrow stromal(mesenchymal) stem cells that retained their in vitro and in vivo stemness in long-term culture. Biology Proceedings Online. 21, 3(2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Przep ukiwanie szpiku kostnegofluorescencyjne sortowanie kom rekmarkery CD29 CD90 CD45r nicowanie osteogeniczner nicowanie adipogeniczner nicowanie chondrogeniczneanaliza cytometrii przep ywowejprotok hodowli kom rkowej

Powiązane artykuły