Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Izolacja jąder ze świeżo zamrożonych guzów mózgu dla sekwencji RNA pojedynczego jądra i sekwencji ATAC

12.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61542

⸱

25 sierpnia 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Neurology Clinic and National Center for Tumor Diseases, University Hospital Heidelberg, 2Bioinformatics and Omics Data Analytics, German Cancer Research Center (DKFZ), 3Clinical Cooperation Unit Neurooncology, German Cancer Research Center (DKFZ), 4Division of Experimental Neurosurgery, Department of Neurosurgery, University of Heidelberg, INF 400, Heidelberg, Germany

W tym artykule

Podsumowanie

Niejednorodność wewnątrznowotworowa jest nieodłączną cechą nowotworów, w tym glejaków. Opracowaliśmy prosty i wydajny protokół, który wykorzystuje kombinację i wirowania gradientowego do izolowania pojedynczych jąder ze świeżo mrożonych tkanek glejaka do badań sekwencjonowania RNA pojedynczego jądra i ATAC.

Streszczenie

Dorosłe glejaki rozlane wykazują niejednorodność między- i wewnątrznowotworową. Do niedawna większość wysiłków związanych z profilowaniem molekularnym na dużą skalę koncentrowała się na masowych podejściach, które doprowadziły do klasyfikacji molekularnej guzów mózgu. W ciągu ostatnich pięciu lat sekwencjonowanie pojedynczych komórek uwypukliło kilka ważnych cech glejaków. W większości tych badań wykorzystano świeże próbki guza mózgu do izolacji pojedynczych komórek przy użyciu cytometrii przepływowej lub metod separacji opartych na przeciwciałach. Idąc dalej, wykorzystanie świeżo mrożonych próbek tkanek z biobanków zapewni większą elastyczność w zastosowaniach jednokomórkowych. Co więcej, wraz z postępem w dziedzinie pojedynczych komórek, kolejnym wyzwaniem będzie wygenerowanie danych multiomicznych z pojedynczej komórki lub tego samego przygotowania próbki, aby lepiej rozwikłać złożoność guza. Dlatego ważne dla tej dziedziny będą proste i elastyczne protokoły, które umożliwiają generowanie danych dla różnych metod, takich jak sekwencjonowanie RNA pojedynczego jądra (snRNA-seq) i test pojedynczego jądra dla chromatyny dostępnej dla transpozazy z sekwencjonowaniem o wysokiej przepustowości (snATAC-seq).

Ostatnie osiągnięcia w dziedzinie pojedynczych komórek w połączeniu z dostępnymi instrumentami mikroprzepływowymi, takimi jak platforma genomiczna 10x, ułatwiły zastosowanie pojedynczych komórek w laboratoriach badawczych. Aby zbadać heterogeniczność guza mózgu, opracowaliśmy ulepszony protokół izolacji pojedynczych jąder ze świeżo mrożonych glejaków. Protokół ten łączy istniejące protokoły jednokomórkowe i łączy etap homogenizacji, po którym następuje filtracja i wirowanie gradientowe za pośrednictwem buforu. Otrzymane próbki są czystymi zawiesinami pojedynczych jąder, które można wykorzystać do wygenerowania danych dotyczących ekspresji genów pojedynczego jądra i dostępności chromatyny z tego samego preparatu jąder.

Wprowadzenie

Rozlane glejaki niższego stopnia (LGG), najczęstszy pierwotny guz mózgu u dorosłych, to nowotwory naciekowe, które często pojawiają się w półkuli mózgowej. LGG wykazują zarówno niejednorodność między-, jak i wewnątrzguzową, która jest napędzana nie tylko przez populację guza, ale także przez niezłośliwe komórki misternie zaangażowane w rozwój i progresję guza1,2,3,4,5.

W ciągu ostatniej dekady nastąpiła lawina danych genomicznych zebranych w dziedzinie glejaków. Dane te pochodzą głównie z badań sekwencjonowania guzów masowych i w ogromnym stopniu przyczyniły się do charakterystyki molekularnej oraz obecnej klasyfikacji guzów mózgu5,6,7,8,9,10,11. Jednak, mimo że badania te ujawniły szeroki krajobraz molekularny związany z glejakami, nadal istnieje rozczarowujący brak postępów w zakresie interwencji terapeutycznej. Jedną z przeszkód w oporności na leczenie w guzach mózgu jest niejednorodność wewnątrz guza. Aby rozwiązać ten problem, różne badania koncentrują się na heterogeniczności genomicznej, transkryptomicznej, proteomicznej i epigenetycznej obecnej w guzie na poziomie pojedynczej komórki12,13,14,15,16,17.

Chociaż w ciągu ostatnich kilku lat nastąpił niezwykły postęp technologiczny w dziedzinie pojedynczych komórek, jednym z głównych czynników ograniczających jest dostępność świeżych próbek potrzebnych do izolacji komórek i przeprowadzenia tych eksperymentów. Aby przezwyciężyć to ograniczenie, podjęto kilka udanych prób przeprowadzenia testów, takich jak snRNA-seq i snATAC-seq z zamrożonych tkanek, przy użyciu jąder, a nie komórek18,19. Większość z tych metod opiera się na sortowaniu komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) lub strategiach filtracji. Zarówno podejścia oparte na pojedynczych komórkach, jak i pojedynczych jądrach mają swoje mocne i słabe strony. Podejścia jednokomórkowe utrzymują transkrypty mitochondrialne, które, choć mogą być pouczające, mogą również zmniejszać pokrycie transkryptomu ze względu na ich dużą obfitość. Metody izolacji pojedynczych jąder eliminują wysoki procent frakcji mitochondrialnej, umożliwiając w ten sposób bardziej dogłębne pokrycie transkryptów jądrowych20.

Istnieją różne komercyjnie dostępne platformy, które były używane w ostatnich latach do testowania danych genomicznych pojedynczych komórek, w tym sekwencja RNA i sekwencja ATAC. Jedną z najbardziej znanych platform jest platforma 10x Genomics Chromium do ekspresji genów pojedynczych komórek i profilowania ATAC pojedynczej komórki. Ponieważ platforma działa za pomocą komór mikroprzepływowych, wszelkie zanieczyszczenia lub agregaty mogą zatkać system, prowadząc do utraty danych, odczynników i cennych próbek klinicznych. Dlatego powodzenie badań pojedynczych komórek zależy w dużej mierze od dokładnej izolacji pojedynczych komórek/jąder.

Protokół, który tutaj zademonstrujemy, jest nieco zmodyfikowaną kombinacją protokołów DroNc-seq i Omni-ATAC-seq i wykorzystuje podobne podejście do ostatnich badań, które wykorzystują sekwencję snRNA do zrozumienia zaburzeń neurologicznych i typów komórek neuronalnych w ludzkim mózgu18,19,21,22,23,24. Protokół wykorzystuje kombinację enzymatyczno-mechanicznej dysocjacji zamrożonych próbek, a następnie filtracji i wirowania gradientowego, co pozwala na szybką i dokładną izolację pojedynczych jąder ze świeżo zamrożonych tkanek glejaka. Z powodzeniem wykorzystaliśmy ten protokół do wygenerowania danych snRNA-seq i snATAC-seq z tego samego preparatu jąder z próbek guza mózgu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Świeżo mrożone próbki glejaka zostały pobrane z banku tkanek Narodowego Centrum Chorób Nowotworowych (NCT) w Heidelbergu, Niemcy. Wykorzystanie materiału pacjenta zostało zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję Rewizyjną na Wydziale Medycznym w Heidelbergu i uzyskano świadomą zgodę od wszystkich pacjentów włączonych do badania.

1. Przygotowanie eksperymentalne

  1. Wszystkie czynności należy wykonywać na lodzie lub w temperaturze 4 °C.
  2. Wstępnie schłodzić probówki, naczynia, żyletki, leżaczki i tłuczki do temperatury 4 °C.
  3. Przygotuj wszystkie z wyprzedzeniem. te są stabilne w temperaturze pokojowej. Zalecana jest filtracja sterylna, szczególnie w przypadku sacharozy. Preparaty wyjściowe są modyfikowane z Corces et al.19. Patrz tabele 1-7.
  4. Wyjąć próbki z zamrażarki w ciekłym azocie lub temperaturze -80 °C i przechowywać na suchym lodzie do etapu 2.1.

2. Sekcja i dysocjacja tkanek

  1. Przenieść świeżo zamrożoną próbkę tkanki (10–60 mg) na wstępnie schłodzoną szalkę Petriego. Świeżo zamrożoną tkankę zmielić/posiekać żyletką na małe kawałki na lodzie.
  2. Dodać 500 μl schłodzonego buforu do lizy jąder do wstępnie schłodzonej probówki o pojemności 1,5 ml. Umieść kawałki tkanki w probówce o pojemności 1,5 ml zawierającej bufor do lizy jąder i przenieś do Douncer (tabela materiałów).
    UWAGA: Istnieją dwa tłuczki homogenizatora Dounce: tłuczek "luźny" lub "A" do wstępnej redukcji próbki oraz tłuczek "ciasny" lub "B" do pełnej homogenizacji próbki.
  3. Odbijaj kawałki tkanki "luźnym" tłuczkiem przez około 20 uderzeń, aż tarcie zostanie zmniejszone. Jeżeli obecne są zanieczyszczenia, próbkę można wstępnie oczyścić przez filtrację za pomocą sitka o średnicy 100 mm.
  4. Odbijaj "ciasnym" tłuczkiem przez 20 uderzeń, aby uzyskać pełną homogenizację tkanek.
  5. Przenieść homogenat (około 500 μl) do wstępnie schłodzonej probówki o pojemności 2 ml. Dodać 1 ml schłodzonego buforu do lizy. Delikatnie wymieszaj i inkubuj na lodzie przez 5 minut. Delikatnie wymieszać końcówką pipety o szerokim otworze i powtórzyć 1-2 razy podczas inkubacji.
  6. Przefiltrować cały homogenat za pomocą siatki sitowej o wielkości 30 μm, zebrać do probówki Falcon o pojemności 15 ml i przenieść z powrotem do nowej, wstępnie schłodzonej probówki o pojemności 2 ml. Pojedyncze sitko jest zazwyczaj wystarczające dla całego homogenatu.
  7. Sprawdź pod mikroskopem świetlnym, aby zweryfikować usunięcie dużych zanieczyszczeń i nienaruszoną membranę jądrową. Jądra muszą być okrągłe, a błona jądrowa nie powinna być zniekształcona. Jeśli szczątki są obecne, jądra mogą być ponownie filtrowane.
  8. Odwirować jądra przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C na wirówce stołowej. Usunąć supernatant, pozostawiając ~50 μL z osadem zawierającym jądra. Delikatnie zawiesić osad w kolejnym 1 ml buforu do lizy jąder i inkubować przez 5 minut na lodzie.
  9. Odwirować jądra przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4°C. Usunąć supernatant bez naruszania osadu, dodać 500 ml 1x buforu homogenizacyjnego (HB) (Tabela 4) i inkubować przez 5 minut bez ponownego zawieszania. Następnie ponownie zawieś jądra w kolejnym 1,0 ml 1x HB.
  10. Odwirować jądra przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant i delikatnie zawiesić jądra w 200 μl 1x HB w nowej probówce o pojemności 2,0 ml.

3. Wirowanie gradientowe

  1. Dodać 200 μl 50% roztworu jodiksanolu (Tabela 5), aby uzyskać końcowe stężenie 25% jodiksanolu. Dobrze wymieszać 10 razy pipetą ustawioną na 300 ml.
  2. Dodać 300 μl 29% roztworu jodiksanolu (Tabela 6) pod 25% mieszaninę. Użyj cienkiej końcówki P1000, aby uniknąć mieszania się warstw.
  3. Dodać 300 μl 35% roztworu jodiksanolu (tabela 7) pod 29% mieszaninę. Użyj cienkiej końcówki P1000, aby uniknąć mieszania się warstw.
    Przestroga: Ten krok wymaga stopniowego zdejmowania końcówki pipety podczas pipetowania, aby uniknąć nadmiernego przemieszczania objętości.
  4. Umieścić próbki w wirówce z odchylanym wiadrem, wirować przez 20 minut w temperaturze 3 500 x g w temperaturze 4°C przy wyłączonym hamulcu.
  5. Delikatnie usunąć próbki bez wstrząsania i obserwować pod światłem. Pomiędzy drugą a trzecią warstwą powinien być widoczny wyraźny biały pas jąder o czystości 95% (Rysunek 1).

4. Izolacja jąder

  1. Zasysaj górne warstwy aż do powstania białego pasma jąder na interfazie 29%-35%.
  2. Zebrać pasmo jąder w objętości 200 ml, przenieść do świeżej probówki i przefiltrować filtrem 20 μm (tabela materiałów).
    UWAGA: Jądra nie muszą być ponownie zawieszane przed filtracją.
  3. Sprawdź pod mikroskopem świetlnym, aby zweryfikować usunięcie dużych zanieczyszczeń i nienaruszoną membranę jądrową. Jądra muszą być okrągłe, a błona jądrowa nie powinna być zniekształcona.
  4. Policz jądra za pomocą barwienia błękitem trypanowym na hemocytometrze i podwielokrotne jądra dla snRNA-seq/snATAC-seq.

5. Pojedyncze jądra RNA i sekwencja ATAC

  1. Natychmiast przetworzyć jądra za pomocą ekspresji genów jednokomórkowych i zestawów odczynników ATAC dla jednej komórki (tabela materiałów).
    UWAGA: Stężenia próbek jąder dla systemu 10x Genomics wynoszą 1500-3000 jąder na μL dla snRNA-seq i 3500-7000 jąder na m μL dla snATAC-seq. Jądra można rozcieńczać za pomocą 1x PBS.
  2. Sekwencjonowanie powstałych bibliotek w ośrodku Genomics Core Facility.
  3. Wykonaj analizę kontroli jakości danych. Jądra są włączane do dalszej analizy, jeśli zawierają unikalny identyfikator molekularny (UMI) >1000, liczbę genów >500 i procent genów mitochondrialnych <5% i mieszczą się w zakresie średnich + trzech odchyleń standardowych UMI i genów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Genomika pojedynczych jąder jest rozwijającą się dziedziną z ograniczoną liczbą dostępnych danych i protokołów. Krytycznym czynnikiem wpływającym na wynik analiz pojedynczych jąder jest izolacja czystych i nienaruszonych jąder. Połączyliśmy dwa opublikowane protokoły (protokoły DroNc-seq oraz Omni-ATAC-seq), aby w stosunkowo krótkim czasie wyizolować wysokiej jakości i czyste jądra z mrożonych bloków tkanki glejaka, zachowując tym samym stabilność transkryptów (Rysunek 1).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Dziedzina heterogeniczności wewnątrznowotworowej znajduje się na ekscytującym etapie, a nowe testy i platformy są opracowywane w celu rzucenia wyzwania i poszerzenia istniejącej wiedzy. Heterogeniczność wewnątrz guza jest kluczowym czynnikiem, który przyczynia się do progresji choroby i oporności na obecne metody leczenia glejaków28. Ostatnie badania nad guzami mózgu skupiły się na tym ważnym aspekcie, wykorzystując testy transkryptomiczne i epigenomiczne pojedynczych komórek, aby lepiej scharakte...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy Single Cell Open Lab (scOpenLab) przy Niemieckim Centrum Onkologii (DKFZ) za pomocne dyskusje. Badania te były wspierane przez German Cancer Aid, grant Max-Eder Program nr 70111964 (S.T.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
2-merkaptoetanolSigmaM6250
CaCl2Sigma21115-100ML
Homogenizator DounceAktywny motyw40401
EDTA (0,5 M)Thermo ScientificR1021
Stożkowe probówki wirówkowe Falcon 15 mlFisher Scientific352096
Jodixanol (aka Optiprep)Technologie komórek macierzystych07820
MAC Inteligentne filtry siatkowe (30 i mikro; m)Miltenyi Biotec130-098-458
Inteligentne filtry siatkowe MACS (100 &mikro; m)Miltenyi Biotec130-098-463
Mg(Ac)2Sigma63052-100ML
NP-40Abcamab142227
Zestaw do izolacji jąder: Nuclei EZ PrepSigmaNUC101-1KT
Fluorek fenylometanosulfonylu (PMSF)SigmaP7626
Filtry do wstępnej separacji (20 i mikro; m)Miltenyi Biotec130-101-812
Probówki do sejfów 1,5 mlEppendorf0030120086
Probówki z zamkiem 2,0 mlEppendorf0030120094
Jednokomórkowy ATAC10x Genomics
Ekspresja genów jednokomórkowych10x Genomika
SacharozaSigmaS0389
Końcówki do pipet o szerokim otworze (1000 &mikro; L)Themo Fisher Scientific2079GPK
Końcówki do pipet szerokootworowych (200 i mikro; L)Themo Fisher Naukowy2069GPK

Bibliografia

  1. Huse, J. T., Holland, E. C. Targeting brain cancer: advances in the molecular pathology of malignant glioma and medulloblastoma. Nature Reviews Cancer. 10 (5), 319-331 (2010).
  2. Kreso, A., Dick, J. E. Evolution of the cancer stem cell model. Cell Stem Cell. 14 (3), 275-291 (2014).
  3. Filbin, M. G., Suva, M. L. Gliomas Genomics and Epigenomics: Arriving at the Start and Knowing It for the First Time. Annual Review of Pathology. 11, 497-521 (2016).
  4. Ferris, S. P., Hofmann, J. W., Solomon, D. A., Perry, A. Characterization of gliomas: from morphology to molecules. Virchows Archive. 471 (2), 257-269 (2017).
  5. Louis, D. N., et al. The 2016 World Health Organization Classification of Tumors of the Central Nervous System: a summary. Acta Neuropathologica. 131 (6), 803-820 (2016).
  6. Eckel-Passow, J. E., et al. Glioma Groups Based on 1p/19q, IDH, and TERT Promoter Mutations in Tumors. The New England Journal of Medicine. 372 (26), 2499-2508 (2015).
  7. Suzuki, H., et al. Mutational landscape and clonal architecture in grade II and III gliomas. Nature Genetics. 47 (5), 458-468 (2015).
  8. Cancer Genome Atlas Research. Comprehensive, Integrative Genomic Analysis of Diffuse Lower-Grade Gliomas. The New England Journal of Medicine. 372 (26), 2481-2498 (2015).
  9. Noushmehr, H., et al. Identification of a CpG island methylator phenotype that defines a distinct subgroup of glioma. Cancer Cell. 17 (5), 510-522 (2010).
  10. Yan, H., et al. IDH1 and IDH2 mutations in gliomas. The New England Journal of Medicine. 360 (8), 765-773 (2009).
  11. Yan, H., Bigner, D. D., Velculescu, V., Parsons, D. W. Mutant metabolic enzymes are at the origin of gliomas. Cancer Research. 69 (24), 9157-9159 (2009).
  12. Gawad, C., Koh, W., Quake, S. R. Single-cell genome sequencing: current state of the science. Nature Reviews Genetics. 17 (3), 175-188 (2016).
  13. Tanay, A., Regev, A. Scaling single-cell genomics from phenomenology to mechanism. Nature. 541 (7637), 331-338 (2017).
  14. Wu, M., Singh, A. K. Microfluidic Flow Cytometry for Single-Cell Protein Analysis. Methods in Molecular Biology. 1346, 69-83 (2015).
  15. Schwartzman, O., Tanay, A. Single-cell epigenomics: techniques and emerging applications. Nature Reviews Genetics. 16 (12), 716-726 (2015).
  16. Macaulay, I. C., Ponting, C. P., Voet, T. Single-Cell Multiomics: Multiple Measurements from Single Cells. Trends in Genetics. 33 (2), 155-168 (2017).
  17. Buenrostro, J. D., et al. Single-cell chromatin accessibility reveals principles of regulatory variation. Nature. 523 (7561), 486-490 (2015).
  18. Habib, N., et al. Massively parallel single-nucleus RNA-seq with DroNc-seq. Nature Methods. 14 (10), 955-958 (2017).
  19. Corces, M. R., et al. An improved ATAC-seq protocol reduces background and enables interrogation of frozen tissues. Nature Methods. 14 (10), 959-962 (2017).
  20. Slyper, M., et al. A single-cell and single-nucleus RNA-Seq toolbox for fresh and frozen human tumors. Nature Medicine. 26 (5), 792-802 (2020).
  21. Mathys, H., et al. Single-cell transcriptomic analysis of Alzheimer's disease. Nature. 570 (7761), 332-337 (2019).
  22. Krishnaswami, S. R., et al. Using single nuclei for RNA-seq to capture the transcriptome of postmortem neurons. Nature Protocols. 11 (3), 499-524 (2016).
  23. Al-Dalahmah, O., et al. Single-nucleus RNA-seq identifies Huntington disease astrocyte states. Acta Neuropathologica Communications. 8 (1), 19(2020).
  24. Jakel, S., et al. Altered human oligodendrocyte heterogeneity in multiple sclerosis. Nature. 566 (7745), 543-547 (2019).
  25. Butler, A., Hoffman, P., Smibert, P., Papalexi, E., Satija, R. Integrating single-cell transcriptomic data across different conditions, technologies, and species. Nature Biotechnology. , (2018).
  26. Lake, B. B., et al. Integrative single-cell analysis of transcriptional and epigenetic states in the human adult brain. Nature Biotechnology. 36 (1), 70-80 (2018).
  27. Stuart, T., et al. Comprehensive Integration of Single-Cell Data. Cell. 177 (7), 1888-1902 (2019).
  28. Bready, D., Placantonakis, D. G. Molecular Pathogenesis of Low-Grade Glioma. Neurosurgery Clinics of North America. 30 (1), 17-25 (2019).
  29. Venteicher, A. S., et al. Decoupling genetics, lineages, and microenvironment in IDH-mutant gliomas by single-cell RNA-seq. Science. 355 (6332), (2017).
  30. Tirosh, I., et al. Single-cell RNA-seq supports a developmental hierarchy in human oligodendroglioma. Nature. 539 (7628), 309-313 (2016).
  31. Weng, Q., et al. Single-Cell Transcriptomics Uncovers Glial Progenitor Diversity and Cell Fate Determinants during Development and Gliomagenesis. Cell Stem Cell. 24 (5), 707-723 (2019).
  32. Neftel, C., et al. An Integrative Model of Cellular States, Plasticity, and Genetics for Glioblastoma. Cell. 178 (4), 835-849 (2019).
  33. Al-Ali, R., et al. Single-nucleus chromatin accessibility reveals intratumoral epigenetic heterogeneity in IDH1 mutant gliomas. Acta Neuropathologica Communications. 7 (1), 201(2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Świeża mrożona tkankaATAC-seq pojedynczych jąderwirowanie gradientoweroztwór jodiksanolubufor do lizy jąderetapy filtracjiliczenie komór w komorze countingowejbarwienie błękitem trypanowym
Izolacja jąder ze świeżo zamrożonych guzów mózgu dla sekwencji RNA pojedynczego jądra i sekwencji ATAC
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.