Artykuł metodologiczny

Trójwymiarowe generowanie organoidów nerwów ruchowych

DOI:

10.3791/61544

⸱

24 września 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Industrial Science, The University of Tokyo, 2Department of Chemistry and Biotechnology, School of Engineering, The University of Tokyo, 3Faculty of Science and Engineering, Tecnologico de Monterrey, 4Jiksak Bioengineering, Inc.

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół zapewnia kompleksową procedurę wytwarzania ludzkiego organoidu nerwu ruchowego pochodzącego z komórek iPS poprzez spontaniczne składanie solidnego pakietu aksonów przedłużonego z sferoidy w chipie do hodowli tkankowej.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pęczek aksonów jest jednym z głównych motywów strukturalnych obserwowanych w układzie nerwowym. Przerwanie pęczków aksonów może powodować choroby rozwojowe i neurodegeneracyjne. Chociaż przeprowadzono liczne badania nad aksonami, nasza wiedza na temat powstawania i dysfunkcji pęczków aksonów jest nadal ograniczona ze względu na brak solidnych trójwymiarowych modeli in vitro. W tym miejscu opisujemy krok po kroku protokół szybkiego generowania organoidu nerwów ruchowych (MNO) z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPS) w mikroprzepływowym chipie do hodowli tkankowej. Po pierwsze, opisano wytwarzanie chipów wykorzystywanych w tej metodzie. Z ludzkich komórek iPS tworzy się sferoida neuronu ruchowego (MNS). Następnie zróżnicowany MNS jest przenoszony do chipa. Następnie aksony spontanicznie wyrastają ze sferoidy i łączą się w pęczek w mikrokanale wyposażonym w chip, który generuje tkankę MNO przenoszącą wiązkę aksonów wysuniętych ze sferoidy. W celu dalszej analizy MNO mogą zostać wyjęte z chipa w celu utrwalenia w celu przeprowadzenia analiz morfologicznych lub wypreparowania w celu przeprowadzenia analiz biochemicznych, a także obrazowania wapnia i zapisów z matrycy wieloelektrodowej. MNO wygenerowane za pomocą tego protokołu mogą ułatwić testowanie narkotyków i badania przesiewowe oraz mogą przyczynić się do zrozumienia mechanizmów leżących u podstaw rozwoju i chorób pęczków aksonów.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rdzeniowe neurony ruchowe (MN) rozciągają aksony do mięśni szkieletowych, aby kontrolować ruchy ciała. Ich trajektorie aksonalne są wysoce zorganizowane i regulowane w procesie rozwojowym. Pomimo wielu badań nad rozszerzaniem i prowadzeniem aksonów1, mechanizmy tworzenia zorganizowanych wiązek aksonów są nadal badane. Aksony neuronów ruchowych są często uszkadzane przez choroby neurodegeneracyjne, takie jak stwardnienie zanikowe boczne (ALS)2, ale patofizjologiczne mechanizmy uszkodzenia pęczków aksonów są słabo poznane. W związku z tym w terenie wymagany jest fizjologiczny i patologiczny model do podsumowania tworzenia i regresji wiązki aksonów.

Neuron ruchowy pochodzenia ludzkiego z komórek macierzystych jest obiecującą platformą do zrozumienia rozwoju i chorób, takich jak ALS3. Ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (komórki iPS) mogą być wykorzystywane do modelowania chorób przy użyciu komórek pochodzących od pacjenta. Do tej pory opisano różne metody różnicowania pluripotencjalnych komórek macierzystych do MN4,5,6. Jednak aksony neuronów w kulturze dwuwymiarowej są zorientowane losowo i nie rekapitulują in vivo mikrośrodowiska w rozwijających się nerwach, w których aksony są jednokierunkowo składane poprzez gęste interakcje akso-aksonalne7. Aby przezwyciężyć ten problem, opracowaliśmy technikę generowania trójwymiarowej tkanki przypominającej nerw ruchowy z ludzkich komórek iPS8 i nazwaliśmy tę tkankę organoidem nerwu ruchowego (MNO). MNO składa się z ciał komórkowych znajdujących się w sferoidzie neuronu ruchowego (MNS) i pęczku aksonalnym wysuniętym ze sferoidy. Aksony w pęczku są zorientowane jednokierunkowo, co przypomina aksony w rozwoju nerwów ruchowych. W związku z tym MNO w unikalny sposób zapewniają fizjologiczne mikrośrodowisko aksonalne, czego nie osiągnięto za pomocą żadnych innych wcześniej opracowanych metod hodowli neuronów.

W tym protokole opisujemy metody wytwarzania chipów do hodowli tkankowych, szybkiego różnicowania neuronów ruchowych i tworzenia organoidów nerwów ruchowych w opracowanych chipach. Nasz chip do hodowli tkankowej jest bardzo prosty i zawiera tylko komorę do przyjmowania sferoidy, mikrokanalik do tworzenia wiązki aksonów i komorę do przechowywania końców aksonów. Urządzenie nie zawiera skomplikowanych struktur, w tym mikrorowków ani filtrów mikroporowych, które są często używane do oddzielania aksonów i ciał komórek według rozmiaru9,10. Dzięki temu nasze urządzenia można łatwo wyprodukować, wykonując czynności opisane w tym protokole, jeśli dostępna jest konfiguracja fotolitograficzna.

Szybkie różnicowanie ludzkich komórek iPS osiąga się dzięki zoptymalizowanej kombinacji czynników indukujących i wzorcujących (SB431542, LDN-193189, kwas retinowy (RA) i wygładzonego agonisty (SAG)) oraz czynników przyspieszenia (SU5402 i DAPT). Doniesiono, że połączenie SU5402 i DAPT przyspiesza różnicowanie neuronów obwodowych i komórek grzebienia nerwowego11. W tym protokole oferujemy trzy różne metody generowania MNO, dzięki czemu czytelnicy mogą zdecydować się na metodę najbardziej dopasowaną do ich potrzeb. Zalecamy przeprowadzenie różnicowania ludzkich komórek iPS po utworzeniu sferoidy (metoda 3D), ponieważ zróżnicowany MNS może być przenoszony bezpośrednio do chipa do hodowli tkankowej. Alternatywnie, ludzkie komórki iPS mogą być różnicowane w neurony ruchowe w hodowli jednowarstwowej (2D), a następnie tworzone w trójwymiarowe sferoidy neuronów ruchowych, jak wcześniej informowaliśmy8. Zaktualizowaliśmy protokół, a dzięki metodzie trójwymiarowego różnicowania opisanej w tym protokole można uniknąć przejścia z 2D do 3D, a MNO można uzyskać przy krótszym czasie różnicowania, mniejszej liczbie kroków i zmniejszonym ryzyku technicznym bez etapu dysocjacji. Dostępne na rynku neurony mogą być również wykorzystywane do generowania MNS w celu skrócenia czasu różnicowania.

Aby wygenerować MNO, wyhodowaliśmy MNS w chipie do hodowli tkankowej. Aksony wydłużają się od sferoidy i rozciągają się do mikrokanału, w którym aksony gromadzą się i ustawiają jednokierunkowo. Ułatwia to interakcję aksoaksonalną i spontaniczne tworzenie ciasno zmontowanej jednokierunkowej tkanki pęczka aksonów w mikrokanale, co jest unikalnie osiągane przez ten protokół, podczas gdy zarówno spontaniczne tworzenie pęczka, jak i sama sterowana orientacja aksonów mogą być osiągnięte przez inne protokoły12,13,14. W typowym eksperymencie niewiele komórek migruje ze sferoid do mikrokanałów, a większość komórek pozostaje w pobliżu sferoid. Metoda ta pozwala na spontaniczne oddzielenie aksonów od sferoid bez użycia zależnych od wielkości barier fizycznych (np. mikrorowków lub filtrów mikroporowych) w celu oddzielenia aksonów od ciał komórkowych.

Wynikowy MNO może być poddany różnym badaniom, w tym analizom morfologicznym, biochemicznym i fizycznym. Ciało komórki i rozszerzona wiązka aksonów mogą być fizycznie izolowane przez cięcie i mogą być oddzielnie analizowane w dalszych eksperymentach, np. testach biochemicznych. Materiały biologiczne, w tym RNA i białko, można wyizolować z zaledwie kilku wiązek aksonów w celu przeprowadzenia regularnych testów biochemicznych, w tym RT-PCR i western blotting. W tym miejscu opisujemy protokół generowania organoidu nerwów ruchowych z komórek iPS, który oferuje atrakcyjny model fizjologiczny i patologiczny do badania mechanizmu leżącego u podstaw rozwoju i choroby pęczków aksonów.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Wytwarzanie form SU-8 metodą fotolitografii

UWAGA: Ta procedura dotyczy niebezpiecznych substancji chemicznych. Przez cały czas używaj dygestorium i środków ochrony osobistej.

  1. Oczyść płytkę silikonową (o średnicy 4 cali, grubości 1 mm, polerowanej) acetonem i przedmuchaj gazowym azotem. Następnie piecz w temperaturze 180 °C przez 3 minuty do wyschnięcia.
  2. Dozować 3 ml SU-8 2100 na oczyszczoną płytkę.
  3. Pokryć SU-8 równomiernie na płytce za pomocą powlekarki wirowej z prędkością 500 obr./min przez 10 s, a następnie kolejno wirować z prędkością 1500 obr./min przez 30 s z przyspieszeniem 300 obr./s, aby uzyskać warstwę SU-8.
    o grubości 150 μm UWAGA: Upewnij się, że płytka krzemowa jest umieszczona na środku powlekarki wirowej i prawidłowo zamocowana za pomocą próżni.
  4. Wafel pieczemy na miękko na płycie grzejnej w temperaturze 50 °C przez 10 minut, w temperaturze 65 °C przez 7 minut, a w temperaturze 95 °C przez 45 minut.
  5. Ustaw fotomaskę (Rysunek 1) na wyrównywacz maski i naświetlaj światło UV (365 nm) przez 60 s.
    UWAGA: Czas ekspozycji musi być zoptymalizowany przez odpowiednią dawkę światła UV.
  6. Po ekspozycji piecz wafel w temperaturze 65 °C przez 6 minut, a w temperaturze 95 °C przez 13 minut na płycie grzejnej.
  7. Rozwijaj płytkę przez 10-20 minut w wywoływaczu SU-8 z mieszaniem za pomocą wytrząsarki orbitalnej, zmieniając roztwór wywoływania raz w trakcie procesu.
    UWAGA: Wydłuż czas wywoływania, gdy pozostaną szczątki SU-8.
  8. Opłucz wafel w izopropanolu i delikatnie osusz wafel gazowym azotem.
  9. Zmierz wysokość osadzonego SU-8 za pomocą mikroskopu pomiarowego i upewnij się, że ma grubość około 150 μm. Może być przechowywany w nieskończoność w temperaturze pokojowej.

2. Produkcja chipów do hodowli tkankowych opartych na mikroprzepływach PDMS

  1. Przymocuj wafel osadzony na SU-8 do pojemnika (np. plastikowej szalki Petriego o średnicy 15 cm) za pomocą dwustronnej taśmy.
  2. Zdmuchnij kurz z płytki za pomocą gazowego azotu.
  3. Aby sylizanizować należy umieścić wafel osadzony w SU-8 w komorze próżniowej wraz z małym pojemnikiem (np. szalką 35 mm). Wrzuć 10 μl (tridekafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooktylo)-1-trichlorosilanu do małego pojemnika. Nie stosować bezpośrednio (tridekafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooktylo)-1-trichlorosilanu do płytki SU-8.
  4. Zamknij szczelnie komorę próżniową i włącz pompę próżniową na co najmniej 2 godziny.
  5. Weź plastikowy kubek i wlej elastomer silikonowy (np. Silpot 184 lub równoważny Sylgard 184) i utwardzacz w stosunku wagowym 10:1. Następnie dobrze wymieszaj za pomocą szpatułki i odgazuj w komorze próżniowej, aż pęcherzyki zostaną całkowicie usunięte.
  6. Wlej mieszaninę PDMS do pojemnika z waflem SU-8 do żądanej grubości (3-4 mm) i ponownie odgazuj w celu usunięcia pęcherzyków.
  7. Piecz PDMS w piekarniku w temperaturze 60 °C przez co najmniej 3 godziny, aby w pełni utwardzić PDMS.
  8. Po schłodzeniu odciąć utwardzony PDMS od wafla za pomocą skalpela lub żyletki.
  9. Aby utworzyć dwie komory chipa do hodowli tkankowej, przebij dwa otwory, w których znajdują się dwie komory, za pomocą stempla do biopsji o średnicy 1,5 mm.
  10. Aby utworzyć zbiornik pożywki, należy przygotować kolejną mieszaninę PDMS (elastomer silikonowy i utwardzacz w stosunku wagowym 10:1) i wlać ją do nowej szalki Petriego o średnicy 10 cm. Dostosuj objętość nalewania do 5 mm grubości PDMS.
  11. Piecz PDMS w piekarniku w temperaturze 60 °C przez co najmniej 3 godziny, aby w pełni utwardzić PDMS.
  12. Po schłodzeniu PDMS odetnij utwardzony PDMS skalpelem, aby uzyskać prostokątny pierścień.
  13. Połącz dolną warstwę ze zbiornikiem pożywki, nakładając między nie nieutwardzony PDMS i wypalając zmontowane warstwy PDMS. Ta powiązana struktura skutkuje powstaniem chipa do hodowli tkankowej PDMS.
  14. Wyczyść chip do hodowli tkankowej PDMS za pomocą taśmy klejącej, aby usunąć kurz i małe cząstki z powierzchni. Chipy do hodowli tkankowych PDMS mogą być przechowywane w temperaturze pokojowej, jeśli są chronione przed kurzem i promieniowaniem UV.

3. Przygotowanie kultury

  1. Pożywka hodowlana
    UWAGA: Wszystkie pożywki wymienione poniżej należy przefiltrować w celu sterylizacji, chyba że zaznaczono inaczej. Przygotowane podłoża można przechowywać w temperaturze 4 °C i zużyć w ciągu miesiąca.
    1. Aby przygotować pożywkę mTeSR Plus: połączyć jedną butelkę 100 ml suplementu mTeSR Plus 5x z jedną butelką 400 ml pożywki mTeSR Plus Basal Medium.
    2. Aby przygotować 100 ml pożywki KSR: W 85 ml DMEM/F12 dodaj 15 ml zamiennika surowicy Knockout (KSR, 15%), 1 ml komercyjnego suplementu glutaminy (1%) i 1 ml aminokwasu endogennego (NEAA, 1%).
    3. Aby przygotować 100 ml pożywki N2: W 100 ml pożywki Neurobasel dodaj 1 ml N2 (100x), 1 ml komercyjnego suplementu glutaminy i 1 ml NEAA.
    4. Aby przygotować 250 ml pożywki do dojrzewania: W 250 ml pożywki Neurobasel dodaj 5 ml witaminy B27 (2%), 2,5 ml dostępnego w handlu suplementu glutaminy (1%) i 2,5 ml penicyliny/streptomycyny (1%).
    5. Zawiesić związki (kwas retinowy (RA), SB431542, LDN-193189, SU5402, DAPT, SAG, Y-27632) w DMSO klasy hodowli komórkowej do pożądanego stężenia. Przygotować porcje i przechowywać je w temperaturze -20 °C przez okres do 6 miesięcy. Stosowane są następujące roztwory podstawowe: 1 mM RA, 10 mM SB431542, 100 μM LDN-193189, 10 mM SU5402, 10 mM DAPT, 1 mM SAG, 10 mM Y-27632.
  2. Powłoka
    UWAGA: Aby zapobiec polimeryzacji matrycy membrany podstawnej pod wpływem ciepła, należy unikać powtarzających się cykli zamrażania i rozmrażania. Jeśli to możliwe, wszystkie procedury powlekania należy wykonywać za pomocą wstępnie schłodzonych końcówek pipet i probówek. Matrycę błony podstawnej należy rozmrażać przez noc w temperaturze 4 °C i porcjować za pomocą wstępnie schłodzonych końcówek i rurek do pipet. Podwielokrotności można zamrażać w temperaturze -20 °C lub -80 °C.
    1. Zamrożoną porcję rozmrozić w temperaturze 4°C na lodzie. Podwielokrotność powinna być przechowywana w niskiej temperaturze podczas procedury powlekania. Za pomocą wstępnie schłodzonej końcówki pipety rozcieńczyć matrycę membrany podstawnej lodowatym DMEM/F12 w stosunku 1:40. Niewykorzystana, rozcieńczona matryca błony podstawnej może być przechowywana w temperaturze 4 °C przez 2-3 dni, pod warunkiem, że nie nastąpiła polimeryzacja.
    2. Dodaj 1 ml matrycy błony podstawnej/roztworu DMEM-F12, aby pokryć jedną studzienkę z płytki 6-dołkowej.
    3. Inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez co najmniej godzinę lub 4 °C przez noc. Powlekane talerze można przechowywać w temperaturze 4 °C maksymalnie przez tydzień.

4. Utrzymanie komórek iPS

UWAGA: Niezróżnicowane komórki iPS są utrzymywane w pożywce mTeSR Plus i subhodowlane, gdy w tym protokole zaobserwowano konfluencję ≥ 90% na płytce 6-dołkowej. Niewielkie dostosowania mogą być wymagane w przypadku komórek iPS hodowanych w innych pożywkach.

  1. Przygotuj naczynia pokryte matrycą z membraną podstawną, jak wspomniano wcześniej w kroku 3.2.
  2. W pełni zassać pożywkę mTeSR Plus. Umyj studzienkę raz PBS i dodaj 0,5 ml odczynnika do pasażowania (patrz Tabela materiałów). Odczekaj kilka sekund i odessaj roztwór.
  3. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C w inkubatorze przez 5 minut lub do momentu, gdy komórki staną się okrągłe.
    UWAGA: Czas inkubacji może się różnić w zależności od różnych linii komórkowych iPS i zbiegu. Należy okresowo sprawdzać pod mikroskopem, aby określić czas dysocjacji podczas inkubacji.
  4. Dodaj 1 ml pożywki mTeSR Plus i postukaj w płytkę przez 30-60 s, aby oderwać kolonie.
  5. Delikatnie wymieszać 1 ml roztworu zawiesiny komórkowej z 7 ml świeżego mTeSR plus pożywka. Nie pipetować więcej niż 5 razy.
  6. Talerz w stosunku 1:8. Zazwyczaj dodaje się 1 ml zawiesiny z kroku 4.5 i dodaje 1 ml mTeSR plus pożywkę uzupełnioną 5-10 μM Y-27632 (inhibitor ROCK). Współczynnik rozcieńczenia pasażu zależy od linii iPSC.
  7. Umieścić komórkę w inkubatorze o stężeniu 5% CO2/37 °C. Następnego dnia usuń Y-27632, dodając świeżą pożywkę mTeSR Plus. Następnie zmieniaj pożywkę początkowo co drugi dzień i codziennie, gdy komórka osiągnie większą konfluencję.

5. Różnicowanie komórek iPS w neurony ruchowe

UWAGA: Wszystkie poniższe opcje (5.2, 5.3 i 5.4) generują MNO z wydajnością > 90%.

  1. Pasażowanie iPSC do różnicowania neuronów ruchowych
    UWAGA: Różnicowanie można z powodzeniem przeprowadzić zarówno w protokole 3D (5.2), jak i 2D (5.3).
    1. Pozwól niezróżnicowanym komórkom iPS rosnąć, aż osiągną zbieg około 80% w pożywce mTeSR Plus na płytce 6-dołkowej.
    2. Całkowicie zassać pożywkę. Natychmiast umyj studzienkę sterylnym PBS i dodaj 0,5 ml roztworu dysocjacji komórek do komórek.
    3. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C w inkubatorze przez około 2-3 minuty lub do momentu, gdy komórki rozdzielą się i zaokrąglą, ale pozostaną połączone ze studzienką.
    4. Dodać 1 ml pożywki i delikatnie pipetować kilka razy w górę i w dół za pomocą pipety serologicznej o pojemności 5 ml. Przenieść zawiesinę komórek do probówki o pojemności 15 ml składającej się z 4 ml pożywki.
    5. Wirować przy 200 x g przez 3 min.
    6. Ostrożnie odessać supernatant, pozostawiając osad w nienaruszonym stanie, i ponownie zawiesić komórki w 1 ml pożywki uzupełnionej 10 μM Y-27632.
    7. Policz komórki za pomocą hemocytometru i przejdź do 5,2 (różnicowanie 3D) lub 5,3 (różnicowanie 2D).
  2. Tworzenie sferoidy neuronu ruchowego (MNS) w różnicowaniu 3D ("protokół 3D")
    UWAGA: Całkowita zmiana podłoża jest wykonywana codziennie od 0 do 12 dni różnicowania (Rysunek 2).
    1. Zasiaj komórki iPS z kroku 5.1.7 na 96-dołkowej dolnej płytce U przy 40 000 komórek / dołku w 100 μL mTeSR Plus uzupełnionym 10 μM Y-27632.
    2. Następnego dnia zastąp każdą studzienkę 100 μl świeżej pożywki.
    3. W dniach 0 i 1: Odessać pożywkę hodowlaną i zastąpić 100 μl pożywki KSR (3.1.2) uzupełnionej 10 μM SB431542 i 100 nM LDN-193189.
    4. W dniach 2 i 3: Odessać pożywkę hodowlaną i zastąpić 100 μl pożywki KSR uzupełnionej 10 μM SB431542, 100 nM LDN-193189, 5 μM DAPT, 5 μM SU5402, 1 μM RA i 1 μM SAG.
    5. W dniu 4 i 5: Przygotować mieszaną pożywkę składającą się z 75% pożywki KSR i 25% pożywki N2 (3.1.3). Następnie odessać pożywkę hodowlaną i zastąpić ją 100 μl mieszanej pożywki uzupełnionej 10 μM SB431542, 100 nM LDN-193189, 5 μM DAPT, 5 μM SU5402, 1 μM RA i 1 μM SAG.
    6. W dniach 6 i 7: Przygotuj mieszaną pożywkę składającą się z 50% pożywki KSR i 50% pożywki N2. Następnie odessać pożywkę hodowlaną i zastąpić ją 100 μl mieszanej pożywki uzupełnionej 5 μM DAPT, 5 μM SU5402, 1 μM kwasu retinowego i 1 μM SAG.
    7. W dniach 8 i 9: Przygotuj mieszaną pożywkę składającą się z 25% pożywki KSR i 75% pożywki N2. Następnie odessać pożywkę hodowlaną i zastąpić 100 μl mieszanej pożywki uzupełnionej 5 μM DAPT, 5 μM SU5402, 1 μM RA i 1 μM SAG.
    8. W dniach 10 i 11: Zastąp pożywkę 100 μl pożywki N2 uzupełnionej 5 μM DAPT, 5 μM SU5402, 1 μM RA i 1 μM SAG.
    9. W dniu 12: Przystąp do przeniesienia MN do chipa do hodowli tkankowej (krok 6) lub zastąp pożywkę 100 μl pożywki dojrzewającej (3.1.4) uzupełnionej 20 ng/ml neurotroficznego czynnika neurotroficznego pochodzenia mózgowego (BDNF).
      UWAGA: MNS można przenieść do chipa do hodowli tkankowej od 12 do 19 dnia. Sferoidy, które nie są przenoszone, powinny być hodowane na 96-dołkowych płytkach dolnych U w pożywce do dojrzewania uzupełnionej 20 ng / ml BDNF do czasu przeniesienia.
  3. (Opcja alternatywna) Różnicowanie 2D i przejście do 3D MNS ("Protokół 2D")
    1. Odessać roztwór powlekający z wstępnie powlekanej płytki 12-dołkowej.
    2. Zasiej komórki iPS z kroku 5.1.7 o gęstości 100 000 – 200 000 komórek na studzienkę w pożywce mTeSR Plus z 10 μM Y-27632.
      UWAGA: Kontynuuj hodowlę niezróżnicowanych komórek iPS w pożywce mTeSR Plus bez Y-27632, aż komórki osiągną 80% konfluencji, jeśli komórki są zbyt rzadkie do następnego kroku (5.3.3).
    3. W dniach 0 i 1: Odessać pożywkę hodowlaną i zastąpić 1 ml pożywki KSR (3.1.2) uzupełnionej 10 μM SB431542 i 100 nM LDN-193189.
    4. W dniach 2 i 3: Odessać pożywkę hodowlaną i zastąpić ją 1 ml pożywki KSR uzupełnionej 10 μM SB431542, 100 nM LDN-193189, 5 μM DAPT, 5 μM SU5402, 1 μM RA i 1 μM SAG.
    5. W dniu 4 i 5: Przygotować mieszaną pożywkę składającą się z 75% pożywki KSR i 25% pożywki N2 (3.1.3). Odessać pożywkę hodowlaną i zastąpić 1 ml mieszanej pożywki uzupełnionej 10 μM SB431542, 100 nM LDN-193189, 5 μM DAPT, 5 μM SU5402, 1 μM RA i 1 μM SAG.
    6. W dniach 6 i 7: Przygotuj mieszaną pożywkę składającą się z 50% pożywki KSR i 50% pożywki N2. Odessać pożywkę hodowlaną i zastąpić ją 1 ml mieszanej pożywki uzupełnionej 5 μM DAPT, 5 μM SU5402, 1 μM kwasu retinowego i 1 μM SAG.
    7. W dniach 8 i 9: Przygotuj mieszaną pożywkę składającą się z 25% pożywki KSR i 75% pożywki N2. Odessać pożywkę hodowlaną i zastąpić 1 ml zmieszanej pożywki uzupełnionej 5 μM DAPT, 5 μM SU5402, 1 μM RA i 1 μM SAG.
    8. W dniach 10 i 11: Zastąp pożywkę 1 ml pożywki N2 uzupełnionej 5 μM DAPT, 5 μM SU5402, 1 μM RA i 1 μM SAG.
    9. W dniu 12: Odessać pożywkę różnicującą, szybko dobrze przemyć PBS i dodać 0,5 ml pożywki do oddzielania komórek. Umieścić płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C na 1-3 minuty (np. w przypadku stosowania TrypLE Express) lub 20-30 minut (np. w przypadku stosowania Accutase).
    10. Za pomocą pipety P1000 delikatnie zebrać komórki i przenieść je do stożkowej probówki o pojemności 15 ml ze świeżą pożywką do dojrzewania i odwirować przy 200 x g przez 3 minuty. Jeśli komórki są grudkowate, delikatnie odpipetuj kilka razy w górę i w dół. Nie należy pipetować zbyt dużo, ponieważ może to spowodować uszkodzenie komórek.
    11. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 ml pożywki dojrzewającej (3.1.4) uzupełnionej 20 ng/ml BDNF.
    12. Policz komórkę za pomocą hemocytometru. Umieść komórki w 10 000-40 000 komórek na studzience w 96-dołkowej dolnej płytce U w pożywce do dojrzewania uzupełnionej 20 ng / ml BDNF. Początkowa gęstość wysiewu powinna być zoptymalizowana w zależności od linii komórkowej iPS i stanu komórek, tak aby średnica sferoidy wynosiła 800-900 μm po wprowadzeniu do chipa hodowli tkankowej. W większości przypadków zacznij od 20 000 komórek na studzienkę, a następnie zwiększ lub zmniejsz liczbę komórek w zależności od rozmiaru.
    13. Hoduj przez dodatkowe 3-10 dni, aż komórki utworzą sferoidę o gładkiej krawędzi.
  4. (Opcja alternatywna): Tworzenie MNS z neuronów ruchowych
    UWAGA: Dostępne na rynku ludzkie neurony ruchowe pochodzące z komórek iPS (patrz Tabela materiałów) mogą być używane do generowania MNO zamiast różnicowania się od ludzkich komórek iPS.
    1. Po rozmrożeniu kriowialu neuronów ruchowych należy szybko zawiesić komórki za pomocą 9 ml pożywki neuronów ruchowych. Wirować w temperaturze 400 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    2. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad z pożywką neuronu ruchowego.
    3. Wykonaj te same czynności, co powyżej (5.3.12-5.3.13), aby utworzyć MNS.

6. Przygotowanie chipa do hodowli tkankowej do tworzenia organoidów nerwów ruchowych (MNO)

  1. Wysterylizuj przygotowany PDMS (z kroku 2.13), zanurzając go w 70% etanolu na szalce Petriego na co najmniej 1 godzinę
    UWAGA: Wszystkie poniższe kroki należy wykonywać w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
  2. Wysterylizuj szkło mikroskopu (76 x 52 mm), zanurzając je w 70% etanolu na szalce Petriego.
  3. Podczas procesu suszenia szkła mikroskopowego umieść urządzenie PDMS na połowie mokrym szkle mikroskopu i pozostaw do całkowitego wyschnięcia, czekając przez noc. Po całkowitym wyschnięciu urządzenie PDMS powinno przylegać do szkła.
    UWAGA: To połączenie nie jest trwałe, aby umożliwić odłączenie urządzeń PDMS od szkła mikroskopu po hodowli w celu pobrania tkanki. Trwałe wiązanie za pomocą plazmy tlenowej może być stosowane w celu maksymalizacji przyczepności między PDMS a szkłem, ale uniemożliwiłoby to demontaż chipów i pobieranie tkanek.
  4. Pokryj powierzchnię mikrokanalika w urządzeniu PDMS i szkle mikroskopu 30 μl rozcieńczonej matrycy membrany podstawnej w DMEM/F12 (1:40), tworząc kroplę po jednej stronie wlotu kanału, a następnie odessaj roztwór z drugiej strony wlotu za pomocą pipety lub pompy ssącej (Rysunek 3A). Nie zasysaj zbyt dużej objętości roztworu, aby uniknąć zanieczyszczenia pęcherzykami.
  5. Następnie inkubować urządzenie PDMS przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C w pojemniku wtórnym (np. na szalce Petriego).

7. Tworzenie organoidów nerwów ruchowych (MNO)

  1. Zastąp roztwór powlekający wstępnie podgrzanym 150 μl pożywki do dojrzewania uzupełnionej 20 ng/ml BDNF tuż przed użyciem.
  2. Następnie umieść MNS z kroku 5.2.9 lub 5.3.13 na wlocie mikrokanału za pomocą mikropipety z końcówką o szerokim otworze. MNS może samoistnie osiąść na dnie urządzenia pod wpływem grawitacji. Nie wywieraj zbyt dużego nacisku podczas wstrzykiwania MNS (Rysunek 3B).
    UWAGA: Jeśli MNS utknął na bocznej ścianie otworu w chipie do hodowli tkankowej, delikatnie zassaj roztwór z drugiej strony wlotu.
  3. Napełnij mały zbiornik (np. nakrętkę z probówką o pojemności 15 ml) sterylną wodą i umieść go w pobliżu chipa do hodowli tkankowej w pojemniku wtórnym, aby zapobiec parowaniu pożywki. Następnie umieść go w inkubatorze o stężeniu 5% CO2/37 °C.
  4. Aby zmienić pożywkę, odessać wyczerpaną pożywkę hodowlaną ze środka zbiornika pożywki (Rysunek 3C). Nie odsysać całego podłoża i tkanki.
  5. Delikatnie dodaj świeżą pożywkę do dojrzewania (z BDNF). Pożywkę należy zmieniać co 2-3 dni. Nie suszyć pożywki hodowlanej w żadnym momencie podczas hodowli. Aksony rosną z MNS do kanału i spontanicznie łączą się w pojedynczy wiązkę w ciągu 2-3 tygodni, co prowadzi do powstania MNO. MNO może być hodowany w urządzeniu przez ponad 1 dodatkowy miesiąc.

8. Dalsza analiza MNO

  1. Barwienie immunologiczne w całości
    1. Przynieś urządzenie lub naczynia do dygestorium chemicznego. Utrwalić MNO poprzez dodanie w przybliżeniu równej objętości 8% paraformaldehydu (PFA) do pożywki, aby uzyskać końcowe stężenie 4% PFA. Oderwij urządzenie PDMS od szkła i inkubuj przez 15-20 minut w temperaturze pokojowej.
    2. Umyj MNO za pomocą PBS, a następnie powtórz mycie PBS 2x.
    3. Przepuścić MNO z 0,2% Triton X-100 w PBS i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    4. Umyj MNO za pomocą PBS, a następnie powtórz mycie PBS 2x. Następnie zablokować MNO za pomocą PBS zawierającego 1% BSA i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
    5. Rozcieńczyć przeciwciała pierwszorzędowe w PBS zawierającym 0,1% BSA i inkubować MNO z roztworem przeciwciała pierwszorzędowego przez noc w temperaturze 4 °C. Przemyć MNO trzykrotnie PBS.
    6. Rozcieńczyć przeciwciała drugorzędowe w PBS 0,1% BSA i inkubować MNO z roztworem przeciwciała drugorzędowego przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Następnie umyj MNO trzykrotnie za pomocą PBS.
    7. Wybarwić MNO za pomocą Hoechst w PBS zawierającym 0,2% Triton-X i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    8. Umyj MNO trzy razy za pomocą PBS. Wybarwiony immunologicznie MNO jest gotowy do obrazowania za pomocą fluorescencyjnego lub konfokalnego mikroskopu laserowego.
  2. Pobieranie tkanek i izolacja pęczka aksonów
    1. Wlać 10 ml roztworu HBSS na 10 cm szalkę Petriego. Następnie zanurz całe urządzenie PDMS w roztworze HBSS.
    2. Ostrożnie odłącz PDMS od szkła mikroskopu pod mikroskopem stereoskopowym. Gdy chusteczki przykleją się do urządzenia PDMS, delikatnie nałóż 1 ml roztworu HBSS od góry otworu za pomocą pipety.
    3. Gdy tkanka odpadnie od PDMS, delikatnie nałóż 1 ml HBSS na szkło mikroskopu, aby całkowicie oderwać PDMS od szkła mikroskopu.
    4. Aby odizolować wiązkę aksonów od sferoidy, przetnij wiązkę aksonów nożem chirurgicznym lub pęsetą pod mikroskopem. Odetnij wiązkę aksonów nieco dalej (> 1 mm) od sferoidy, aby uniknąć zanieczyszczenia migrowanych komórek.
    5. Izolowane wiązki aksonów i sferoidy mogą być dalej analizowane za pomocą różnych dalszych analiz, takich jak RT-PCR, RNA-seq i western blotting.
    6. Chip hodowlany PDMS może być ponownie użyty. Aby oczyścić chip hodowlany, należy poddać go sonikacji w wodzie destylowanej przez 15 minut. Następnie poddaj chip sonikacji w wodzie destylowanej z dodatkiem 1% detergentu. Umyj chip hodowlany wodą destylowaną 5 razy.
  3. Obrazowanie wapnia
    UWAGA: Aktywność neuronalną można mierzyć za pomocą wskaźnika wapnia zarówno przed, jak i po pobraniu tkanki z chipa do hodowli tkankowej (od 8.2). Protokół oparty jest na konkretnym zestawie komercyjnym (patrz tabela materiałów). Alternatywnie można zastosować inne zestawy do obrazowania wapnia lub równoważne metody.
    1. Przemyć MNO za pomocą PBS (bez Ca2+ i Mg2+) trzy razy.
    2. Inkubować tkankę z 5 μM Fluo-4AM w podłożu rejestrującym (20 mM HEPES, 115 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 0,8 mM MgCl2, 1,8 mM, CaCl2, 13,8 mM glukozy) przez 30-60 minut w temperaturze 37 °C. Dodatek 0,01-0,02% Pluronic F-127 może pomóc w wychwytywaniu Fluo-4 AM do komórek.
    3. Następnie przemyć tkankę PBS (bez Ca2+ i Mg2+) i zastąpić ją nośnikiem zapisu.
    4. Pozyskiwanie obrazów poklatkowych przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej z zestawem filtrów GFP/Cy2. Ustaw czas ekspozycji krótszy niż 20 ms na klatkę.
    5. Otwórz pobrany plik filmowy jako sekwencję obrazów za pomocą obrazu J.
    6. W przypadku korzystania z kolorowej kamery CCD lub CMOS należy konwertować obrazy RGB na 16-bitowe obrazy monochromatyczne. Otwórz "Analizuj | Narzędzia | Menedżer ROI", narysuj interesujący Cię obszar i kliknij "Dodaj". Kliknij "Multi Measure". Średnia intensywności w wielokrotnym ROI zostanie pokazana w wyniku.
    7. Wykreśl zmianę intensywności sygnału za pomocą ogólnego oprogramowania do analizy danych.
  4. Pomiar aktywności neuronalnej za pomocą układu wieloelektrodowego
    UWAGA: Aktywność neuronów ruchowych może być uchwycona przez matrycę wieloelektrodową (MEA).
    1. Po utworzeniu MNO przenieś go na sondę MEA pokrytą matrycą membrany podstawnej. Umieść tkankę na elektrodach.
    2. Dodać 200 μl pożywki do dojrzewania i inkubować przez 1-2 godziny w temperaturze 37 °C, aby MNO mógł przyłączyć się do powierzchni.
    3. Zastąp nośnik nośnikiem danych (8.3.2). Opcjonalnie umieść siatkę i obciążnik na MNO, aby zwiększyć skurcz z elektrodami.
    4. Ustaw sondę MEA na głowicę nagrywającą stage. Przetrzyj styk między sondą MEA a głowicą stage 70% etanolem.
    5. Rozpocznij rejestrowanie aktywności neuronalnej, postępując zgodnie z instrukcjami producentów MEA.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neurony ruchowe zostały zróżnicowane w ciągu 12-14 dni w procedurach różnicowania 3D (Rysunek 4 i Rysunek 5). Co ważne, ponad 60% komórek wykazywało ekspresję markera neuronu ruchowego HB9 podczas różnicowania. Immunohistochemia wykazała, że około 80% komórek w MNS było neuronami ruchowymi SMI32-dodatnimi. HB9 i SMI32 są uznanymi markerami neuronów ruchowych we wczesnym stadium rozwoju15,16. Ekspresja HB9 i SMI32 to kluczowe parametry, które muszą zostać potwierdzone, aby zapewnić tożsamość komórkową neuronów ruchowych. Po wprowadzeniu MNS do chipa hodowlanego, aksony rozciągają się do kanału i tworzy się wiązka aksonów. Ze względu na mikrokanały służące jako fizyczne przewodniki, aksony wydłużają się z MNS i tworzą wiązkę w wyniku interakcji aksoaksonalnej (Rysunek 6A). Niezbędne jest potwierdzenie powstania wiązki aksonów za pomocą obserwacji mikroskopowej, aby potwierdzić powstanie MNO. Udany MNO ma wiązkę aksonów szerszą niż 50 μm i kilka izolowanych aksonów poza wiązką w kanale. Początkowe wydłużenie aksonów można zaobserwować po 24 godzinach od wprowadzenia sferoidy. W ciągu następnych 3-4 dni aksony dotarły do środka mikrokanału, a następnie dotarły do drugiego końca w ciągu dodatkowych 10 dni (Rysunek 6A). W rezultacie aksony złożyły się i utworzyły prostą i jednokierunkową wiązkę w ciągu 2-3 tygodni w chipie, a następnie obserwowano aktywność neuronalną.

Organoidy nerwów ruchowych można pobrać z chipa, odłączając PDMS od szkła mikroskopu do analizy biologicznej (Rysunek 6B). Pęczki aksonów i ciała komórek można wypreparować i wyizolować poprzez cięcie za pomocą noża chirurgicznego lub pęsety pod mikroskopem (Ryc. 6B). Te materiały biologiczne, w tym RNA i białko, mogą być używane do regularnych testów biochemicznych, takich jak RT-PCR i western blotting. W wiązkach aksonów MNO, jądrowe lub dendrytyczne białka wytwarzające nie są wykrywane w western blotting (Rysunek 6C).

W połączeniu ze wskaźnikiem wapnia (Fluo-4 AM), aktywność neuronalna może być uchwycona w chipie do hodowli tkankowej. W obrębie MNO obserwowano spontaniczną aktywność neuronów ruchowych w sferoidzie i wiązce aksonów. Aktywność neuronalną obserwowano również przy użyciu systemu matryc wieloelektrodowych.

figure-results-1
Rysunek 1: Wymiar chipa do hodowli tkankowej PDMS.
(A) Fotomaska chipa do hodowli tkankowej. (B) Wymiary mikrokanalika w chipie do hodowli tkankowej. Średnica komory bazowej do trzymania sferoidy neuronu ruchowego wynosi 2 mm, a otwór PDMS nad komorą wynosi 1,5 mm. Szerokość i wysokość mikrokanału łączącego dwie komory wynoszą 150 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Ryc. 2: Schematyczna ilustracja różnicowania neuronów ruchowych.
(A) Etapy różnicowania obejmowały indukcję neuronalną, tworzenie wzorców w linii neuronów ruchowych i dojrzewanie neuronów ruchowych. (B) Dwie opcje tworzenia sferoidy neuronu ruchowego (MNS) z komórek iPS: protokół 3D i protokół 2D z etapem dysocjacji neuronów ruchowych. Organoid nerwów ruchowych (MNO) można uzyskać za pomocą obu protokołów. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Ryc. 3: Protokół krok po kroku dotyczący powlekania macierzy błony podstawnej i wprowadzania sferoidów neuronów ruchowych.
(A) Powłoka macierzy błony podstawnej w kanale chipa do hodowli tkankowej. (B) Wprowadzenie MNS do otworu w chipie. (C) Zmiana pożywki przez aspirację wyczerpanej pożywki. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Różnicowanie neuronów ruchowych 2D i 3D.
(A) Przebieg czasowy reprezentatywnego różnicowania 3D MNS (protokół 3D). Rozmiar MNS stopniowo zwiększał się w miarę upływu czasu. Podziałka: 500 μm. (B) Przebieg czasowy różnicowania 2D na -D2, D0, D1, D6, D12 (protokół 2D). Podziałka skali: 500 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rycina 5: Charakterystyka neuronów ruchowych.
(A) (Po lewej) Kriosekcja MNS wybarwionego przeciwciałem SMI-32 i DAPI. (Środek) Obraz z kontrastem fazowym ponownie platerowanego MNS na powierzchni pokrytej matrycą membrany podstawnej. Zaobserwowano wydłużenie aksonów. (Po prawej) Aksony ponownie posiaczonych MNS barwionych przeciwciałami Synapsyny I i Tuj1. Podziałka: 500 μm (lewa i środkowa) i 50 μm (prawa). (B) Reprezentatywny obraz neuronów ruchowych 2D barwionych immunologicznie przeciwciałami Tuj i HB9. Podziałka skali: 200 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-6
Rycina 6: Charakterystyka organoidu nerwu ruchowego (MNO) generowanego w chipie hodowlanym.
(A) Reprezentatywne obrazy wydłużenia aksonów i tworzenia grubych wiązek aksonów na D32. Pasek skali: 500 μm. (B) Barwienie immunologiczne organoidu nerwów ruchowych (MNO) za pomocą SMI-32 i DAPI. Aksony i ciała komórkowe można izolować przez fizyczne cięcie. Podziałka skali: 1 mm. (C) Czystość białka z aksonów i ciał komórkowych określona ilościowo za pomocą western blot. MAP2, marker dendrytyczny, nie został wykryty w białku aksonalnym, podczas gdy marker aksonalny Tau1 jest wzbogacony w białko aksonalne. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten opisuje tworzenie organoidu nerwu ruchowego (MNO), który ma wiązkę aksonów przedłużoną ze sferoidy neuronu ruchowego generowanej z ludzkich komórek iPS. Utworzona wiązka aksonów jest gruba, elastyczna i dobrze zorganizowana w jednokierunkowe struktury. Poprzez preparację pęczka aksonów można uzyskać białko aksonalne i RNA o wysokiej czystości w stopniu wystarczającym do analiz biochemicznych. Aktywność neuronalną można mierzyć w wiązkach aksonów i sferoidach za pomocą obrazowania wapnia. Zanieczyszczenie białek jądrowych i dendrytycznych w lizacie aksonalnym nie zostało wykryte przez western blotting, co pokazuje, że nasza metoda skutecznie oddziela aksony od ciał komórkowych i dendrytów.

Jedną z zalet tego protokołu jest szybkie różnicowanie i generowanie MNO wyposażonego w wiązkę aksonów, w której wszystkie procesy można wykonać w ciągu 4 tygodni przy użyciu protokołu 3D i 5-6 tygodni przy użyciu protokołu 2D. Jest to krótki okres w porównaniu z innymi protokołami, które zazwyczaj potrzebują 3-4 tygodni, aby po prostu różnicować się w MN z embrionalnych komórek macierzystych i komórek iPS17 , a uzyskanie wydłużenia aksonów zajmuje dodatkowe 2-4 tygodnie. Protokół 3D jest ogólnie preferowany w stosunku do protokołu 2D ze względu na krótszy czas różnicowania, mniej kroków i zmniejszone ryzyko techniczne bez etapu dysocjacji w porównaniu z protokołem 2D. Chip do hodowli tkankowej oparty na mikroprzepływach został zaprojektowany w taki sposób, aby aksony MNS mogły wydłużać się w kierunku drugiego przedziału przez mikrokanał, co ułatwia tworzenie wiązki aksonów poprzez indukowanie interakcji aksoaksonalnych i powinowactwa między aksonami. Ze względu na prostą konfigurację eksperymentalną, wszystkie opisane tutaj protokoły mogą być wykonywane nie tylko przez bioinżynierów, którzy są zaznajomieni z manipulacją chipem do hodowli tkankowej, ale także przez biologów i neurobiologów, którzy nie są zaznajomieni z technikami mikrofluidyki i mikrofabrykacji. Należy zauważyć, że kroki 1 i 2 można również wykonać przy użyciu zewnętrznej usługi produkcyjnej.

Jednym z kluczowych kroków do realizacji protokołu jest sekwencyjna zmiana pożywki hodowlanej. Zaleca się całkowitą zmianę pożywki hodowlanej na każdym etapie różnicowania, tak aby czynniki w zużytej pożywce nie zakłócały różnicowania MN. Kolejnym krytycznym punktem tego protokołu jest utrzymanie niezróżnicowanych komórek iPS w dobrej jakości. Jakość początkowej hodowli komórek iPS znacząco wpływa na efektywność pozyskiwania neuronów ruchowych i MNO. Kolejną kwestią jest to, że średnica MNS powinna być mniejsza niż rozmiar otworu chipa (1,5 mm). Większe sferoidy nie mogą dostać się do komory i potencjalnie doświadczają ciężkiej martwicy niedotlenienia w środkowej części. Wielkość MNS może być kontrolowana poprzez zmianę początkowej liczby zasiewów komórek iPS (w protokole 3D) lub neuronów ruchowych (w protokole 2D). Gęstość wysiewu komórek powinna być zoptymalizowana dla każdej linii komórkowej iPS.

Podzielone na przedziały urządzenia mikroprzepływowe z mikrorowkami i filtrami o małych porach są szeroko stosowane do oddzielania aksonów od ciał komórkowych i dendrytów. Technika ta może również oddzielać aksony od ciał komórkowych i dendrytów, z większą obfitością aksonów w tkankach wiązkowych. W porównaniu z innymi metodami, jednym z głównych ograniczeń tej metody jest to, że nie może ona oddzielić dwóch różnych pożywek hodowlanych w obecnej konstrukcji chipa do hodowli tkankowej, co utrudnia wspólną hodowlę dwóch różnych komórek, które wymagają dwóch różnych pożywek. Kolejnym ograniczeniem jest to, że chip PDMS nakłada z góry określone ograniczenie na rozmiar tkanki. Sferoida większa niż otwór nie może wejść do komory, a wiązka aksonów nie może urosnąć grubsza niż szerokość kanału mikroprzepływowego.

Metodę tę można zastosować do innych typów neuronów. Nasza grupa wykazała zdolność do modelowania układu mózgowego przy użyciu zmodyfikowanej metody w połączeniu z technikami organoidów mózgowych18. Sferoidy korowe zostały wprowadzone do obu przedziałów, a aksony spontanicznie wydłużały się odwrotnie w kierunku każdej sferoidy, a następnie spontanicznie utworzyła się wiązka aksonów. W rezultacie dwie sferoidy korowe można połączyć za pomocą wiązki aksonów, a tkankę można uzyskać jako jeden kawałek. Pokazuje to, że podejście to jest bardzo wszechstronne w tworzeniu tkanek pęczka aksonów niezależnie od typów komórek neuronalnych. W tym protokole wykorzystano ludzkie komórki iPS, jednak inne komórki macierzyste, w tym ludzkie komórki ES i ludzkie nerwowe komórki macierzyste, mogą być wykorzystane z modyfikacjami przedstawionego protokołu. Sferoidy 3D neuronów mogą być generowane za pomocą różnych protokołów 19,20. Ta metoda wytwarzania tkanek z wiązką aksonów może być potencjalnie połączona w przyszłości z innymi protokołami różnicowania w celu uzyskania sferoidy 3D MN. Ponadto grubość i długość wiązki aksonów można kontrolować, po prostu zmieniając szerokość i wysokość mikrokanałów chipa do hodowli tkankowej w celu przyszłych opracowań.

Uważamy, że protokół ten może być wykorzystany do testowania narkotyków i badań przesiewowych oraz może przyczynić się do zrozumienia mechanizmów leżących u podstaw rozwoju i chorób pęczków aksonów.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W ramach tego protokołu patent został udzielony firmie Jiksak Bioengineering, Inc., która została założona przez Jiro Kawadę.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie było wspierane przez Japońskie Towarzystwo Promocji Nauki (JSPS) Grants-in-Aid for Scientific Research 17H05661 i 18K19903, program Core-2-core oraz instytut Beyond AI.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
(Tridekafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooktylo)-1-trichlorosilanSigma440302
16% wodny roztwór paraformaldehydu (formaldehydu)Mikroskopia elektronowa Nauki15710
200&mikro; l Końcówki do pipet o szerokim otworzeBMBioBMT-200WRS 6-dołkowe
płytkiViolamo2-8588-01
Suplement AccutaseICTAT104
B-27 (50X)Gibco17504044
Albumina surowicy bydlęcejSigmaA6003
Neurotroficzny czynnik pochodzenia mózgowego (BDNF)Wako020-12913
Inkubator CO2PanasonicMCO-18AIC
Cryostor CS10Stem Cell Technologies07959
DAPTSigmaD5942
DMEM/F12SigmaD8437
Fluo-4 AMDojindo LaboratoriesCS22
Suplement GlutaMAXGibco35050-061
Zredukowany czynnik wzrostu Matrigel (macierz błony podstawnej)Corning354230
HB9 PrzeciwciałoSanta Cruzsc-22542
HBSSWako085-09355
Hoechst 33342Sigma14533
Neuron ruchowy iCell (dostępne na rynku ludzkie neurony ruchowe pochodzące z komórek iPS)Dynamika komórkowaR1051
Alkohol izopropylowy (IPA)Wako166-04836
Zamiennik surowicy do nokautowaniaGibco10828028
LDN193189SondaSML0559
Sigma MEAAlpha MED Scientific incMED-P5004A
MEM Nieistotny roztwór aminokwasów (100x) (NEAA)SigmaM7145
Mikroskop szklanyMatsunamiS9111
mTeSR PlusStem Cell Technologies05825
Suplement N2Wako141-08941
Pożywka neuropodstawowaGibco21103049
Penicylina-streptomycynaGibco15140122
Photoresist SU-8 2100Microchem#SU-8 2100
Powierzchnia Prime 96USumitomo BakeliteMS-9096U
ReLeSR (odczynnik do pasakcji)Stem Cell Technologies05872
Kwas retinowyWako186-01114
SAGSigmaSML1314
SB431542Wako192-16541
Wafel krzemowySUMCOPW-100-100
Silpot 184 zzestawem Dow ToraySilpot 184 z zestawem
Smi32 PrzeciwciałoBiolegend801701
SU5402SigmaSML0443
SU-8 DeveloperMicrochemY020100
Synapsin I PrzeciwciałoMilliporeAb1543
TrypLE Ekspresowy płyn bez czerwieni fenolowej (roztwór dysocjacyjny)Gibco12604-021
Przeciwciało Tuj1Biolegend801202
Y-27632Wako030-24021

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Raper, J., Mason, C. Cellular strategies of axonal pathfinding. Cold Spring Harbor Perspective Biology. 2 (9), 001933(2010).
  2. Ito, Y., et al. RIPK1 mediates axonal degeneration by promoting inflammation and necroptosis in ALS. Science. 353 (6299), 603-608 (2016).
  3. Fujimori, K., et al. Modeling sporadic ALS in iPSC-derived motor neurons identifies a potential therapeutic agent. Nature Medicine. 24 (10), 1579-1589 (2018).
  4. Chen, H., et al. Modeling ALS with iPSCs Reveals that Mutant SOD1 Misregulates Neurofilament Balance in Motor Neurons. Cell Stem Cell. 14 (6), 796-809 (2014).
  5. Osaki, T., Uzel, S. G. M., Kamm, R. D. Microphysiological 3D model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) from human iPS-derived muscle cells and optogenetic motor neurons. Science Advances. 4 (10), (2018).
  6. Imamura, K., et al. The Src/c-Abl pathway is a potential therapeutic target in amyotrophic lateral sclerosis. Science Translational Medicine. 9 (391), (2017).
  7. Wang, L., Marquardt, T. What axons tell each other: axon-axon signaling in nerve and circuit assembly. Current Opinion in Neurobiology. 23 (6), 974-982 (2013).
  8. Kawada, J., et al. Generation of a Motor Nerve Organoid with Human Stem Cell-Derived Neurons. Stem Cell Reports. 9 (5), 1441-1449 (2017).
  9. Nagendran, T., Poole, V., Harris, J., Taylor, A. M. Use of Pre-Assembled Plastic Microfluidic Chips for Compartmentalizing Primary Murine Neurons. JoVE. (141), e58421(2018).
  10. Paranjape, S. R., Nagendran, T., Poole, V., Harris, J., Taylor, A. M. Compartmentalization of Human Stem Cell-Derived Neurons within Pre-Assembled Plastic Microfluidic Chips. JoVE. (147), e59250(2019).
  11. Chambers, S. M., et al. Combined small-molecule inhibition accelerates developmental timing and converts human pluripotent stem cells into nociceptors. Nature Biotechnology. 30 (7), 715-720 (2012).
  12. Rimington, R. P., Fleming, J. W., Capel, A. J., Wheeler, P. C., Lewis, M. P. Bioengineered model of the human motor unit with physiologically functional neuromuscular junctions. bioRxiv. , (2020).
  13. Cullen, D. K., et al. Bundled Three-Dimensional Human Axon Tracts Derived from Brain Organoids. iScience. 21, 57-67 (2019).
  14. Giandomenico, S. L., et al. Cerebral organoids at the air-liquid interface generate diverse nerve tracts with functional output. Nature Neurosciences. 22 (4), 669-679 (2019).
  15. Egawa, N., et al. Drug screening for ALS using patient-specific induced pluripotent stem cells. Science Translational Medicine. 4 (145), (2012).
  16. Sances, S., et al. Modeling ALS with motor neurons derived from human induced pluripotent stem cells. Nature Neurosciences. 19 (4), 542-553 (2016).
  17. Qu, Q., et al. High-efficiency motor neuron differentiation from human pluripotent stem cells and the function of Islet-1. Nature Communications. 5 (1), 3449(2014).
  18. Kirihara, T., et al. A Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Tissue Model of a Cerebral Tract Connecting Two Cortical Regions. iScience. 14, 301-311 (2019).
  19. Rigamonti, A., et al. Large-Scale Production of Mature Neurons from Human Pluripotent Stem Cells in a Three-Dimensional Suspension Culture System. Stem Cell Reports. 6 (6), 993-1008 (2016).
  20. Yan, Y., Song, L., Madinya, J., Ma, T., Li, Y. Derivation of Cortical Spheroids from Human Induced Pluripotent Stem Cells in a Suspension Bioreactor. Tissue Engineering Part A. 24 (5-6), 418-431 (2017).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Ludzkie kom rki iPSchip mikrofluidycznytworzenie p czk w aksonalnychsferoid neuron w ruchowychwytwarzanie chipa z PDMSsuplementacja BDNFmonta wi zek akson wobrazowanie wapniowewielood elektrodowa matryca

Powiązane artykuły