Artykuł metodologiczny

Łagodzenie przyczepiania się komórek krwiopochodnych do metalowych implantów poprzez immobilizację peptydów pochodzących z CD47

3.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61545

⸱

3 grudnia 2020

 ,  ,  ,  ,  , 
1The Children's Hospital of Philadelphia, 2Department of Pediatrics, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Prezentowany tutaj jest protokół dołączania peptydu CD47 (pepCD47) do metalowych stentów za pomocą chemii polibisfosfonianów. Funkcjonalizacja stentów metalowych za pomocą pepCD47 zapobiega przyłączaniu się i aktywacji komórek zapalnych, poprawiając w ten sposób ich biokompatybilność.

Streszczenie

Kluczowymi komplikacjami związanymi ze stentami metalowymi i stentami uwalniającymi leki są odpowiednio restenozy w stencie i późna zakrzepica w stencie. W związku z tym poprawa biokompatybilności stentów metalowych pozostaje poważnym wyzwaniem. Celem tego protokołu jest opisanie solidnej techniki modyfikacji powierzchni metalu za pomocą biologicznie aktywnych peptydów w celu zwiększenia biokompatybilności implantów medycznych mających kontakt z krwią, w tym stentów wewnątrznaczyniowych. CD47 jest immunologicznie specyficznym dla gatunku markerem siebie i ma właściwości przeciwzapalne. Badania wykazały, że peptyd składający się z 22 aminokwasów odpowiadający domenie Ig CD47 w regionie zewnątrzkomórkowym (pepCD47) ma właściwości przeciwzapalne, podobnie jak białko o pełnej długości. Badania in vivo na szczurach oraz badania ex vivo na systemach doświadczalnych krwi królików i ludzi z naszego laboratorium wykazały, że immobilizacja pepCD47 na metalach poprawia ich biokompatybilność, zapobiegając przyczepianiu się i aktywacji komórek zapalnych. W artykule opisano krok po kroku protokół funkcjonalizacji powierzchni metalowych i przyłączania peptydów. Powierzchnie metalowe są modyfikowane za pomocą bisfosforanu polialliloaminy z utajonymi grupami tiolowymi (PABT), a następnie deprotekcja tioli i amplifikacja miejsc reagujących tiolem w reakcji z polietylenoiminą zainstalowaną z grupami pirydyloditionowymi (PEI-PDT). Wreszcie, pepCD47, zawierający końcowe reszty cysteiny połączone z sekwencją peptydu rdzeniowego za pomocą podwójnego dystansu 8-amino-3,6-dioksa-oktanoilowego, jest przyłączony do powierzchni metalu za pomocą wiązań dwusiarczkowych. Ta metodologia przyłączania peptydów do powierzchni metalu jest wydajna i stosunkowo niedroga, a zatem może być stosowana do poprawy biokompatybilności kilku biomateriałów metalicznych.

Wprowadzenie

Przezskórna interwencja wieńcowa jest pierwszą linią terapii w leczeniu chorób wieńcowych (CAD) i polega głównie na stentowaniu chorych tętnic. Jednak restenoza w stencie (ISR) i zakrzepica w stencie są częstymi powikłaniami związanymi z wdrażaniem stentów1. Interakcja krwi na granicy faz krew-stent charakteryzuje się niemal natychmiastową adsorpcją białek osocza na powierzchni metalu, po której następuje przyczepienie i aktywacja komórek płytkowych i zapalnych2. Uwalnianie cytokin i chemokin zapalnych z aktywowanych komórek zapalnych prowadzi do fenotypowej modyfikacji komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych (VSMC) w osłonce środkowej i wyzwala ich migrację dośrodkową do przedziału wewnętrznego. Proliferacja aktywowanego VSMC w błonie wewnętrznej powoduje pogrubienie warstwy wewnętrznej, zwężenie światła i restenozę w stencie3. Sttenty uwalniające leki (DES) zostały opracowane w celu zapobiegania proliferacji VSMC; Jednak leki te mają niezamierzony wpływ cytotoksyczny na komórki śródbłonka4,5. Dlatego późna zakrzepica stentu jest częstym powikłaniem związanym z DES6,7. Stenty wykonane z biodegradowalnych polimerów, takich jak poli-L-laktyd, okazały się bardzo obiecujące w eksperymentach na zwierzętach i początkowych próbach klinicznych, ale ostatecznie zostały wycofane, gdy "rzeczywiste" zastosowanie kliniczne wykazało ich niższość w stosunku do DES8. W związku z tym istnieje potrzeba poprawy biokompatybilności stentów z gołego metalu w celu uzyskania lepszych wyników leczenia pacjentów.

CD47 to białko transbłonowe o wszechobecnej ekspresji, które hamuje wrodzoną odpowiedź immunologiczną, gdy jest związane z pokrewnym receptorem białka regulatorowego sygnału alfa (SIRPα)9. Receptor SIRPα ma domenę motywu hamującego tyrozynę komórki odpornościowej (ITIM), a zdarzenia sygnalizacyjne w interakcji SIRPα - CD47 ostatecznie skutkują obniżeniem aktywacji komórek zapalnych10,11,12,13. Badania w naszym laboratorium wykazały, że rekombinowany CD47 lub jego pochodna peptydowa, odpowiadająca domenie 22 aminokwasów Ig regionu zewnątrzkomórkowego CD47 (pepCD47), może zmniejszać odpowiedź immunologiczną gospodarza na szereg klinicznie istotnych biomateriałów14,15,16. Ostatnio wykazaliśmy, że pepCD47 może być unieruchomiony na powierzchniach stentów ze stali nierdzewnej i znacznie zmniejszyć patofizjologiczną odpowiedź związaną z restenozą. Warto zauważyć, że modyfikowane powierzchnie pepCD47 są podatne na odpowiednie warunki użytkowania, takie jak długotrwałe przechowywanie i sterylizacja tlenkiem etylenu17. W tym celu pepCD47 może być użytecznym celem terapeutycznym w celu rozwiązania problemów klinicznych stentów wewnątrznaczyniowych.

Strategia kowalencyjnego mocowania pepCD47 do powierzchni metalu obejmuje szereg nowatorskich modyfikacji chemicznych powierzchni metalu. Powierzchnie metalowe są najpierw powlekane bisfosfonianem polialliloaminy z utajonymi grupami tiolowymi (PABT), a następnie deprotekcja tioli i przyłączanie polietylenoiminy (PEI) z zainstalowanymi grupami pirydyloditionowymi (PDT). Grupy PDT PEI nieskonsumowane w reakcji z odchronionymi tiolami PABT są następnie poddawane reakcji z pepCD47 zawierającym tiole w końcowych resztach cysteiny, co skutkuje wiązaniem pepCD47 z powierzchnią metalu za pomocą wiązania dwusiarczkowego14,17,18. Użyliśmy sprzężonego z fluoroforem pepCD47 (TAMRA-pepCD47) do określenia stężenia wejściowego peptydu, które powoduje maksymalne unieruchomienie powierzchniowe peptydu. Na koniec oceniliśmy ostrą i przewlekłą zdolność przeciwzapalną powierzchni metalowych pokrytych pepCD47, ex vivo, przy użyciu aparatu pętli Chandlera i testu przyłączenia monocytów / ekspansji makrofagów, odpowiednio.

Ten artykuł dostarcza systematycznego protokołu dołączania tiolowanych peptydów do powierzchni metalu; określania maksymalnej gęstości immobilizacji peptydu; oraz oceny właściwości przeciwzapalnych powierzchni metalowych pokrytych pepCD47 wystawionych na działanie pełnej krwi i izolowanych monocytów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie próbki ludzkie do tego eksperymentu zostały pobrane zgodnie z IRB Szpitala Dziecięcego w Filadelfii. Wszystkie eksperymenty na zwierzętach przeprowadzono za zgodą IACUC Szpitala Dziecięcego w Filadelfii.

1. Powlekanie gołych powierzchni metalowych za pomocą PEI-PDT

  1. Umyj kupony z folii ze stali nierdzewnej (1 cm x 1 cm lub 0,65 cm x 1 cm) lub krążki siatkowe ze stali nierdzewnej z 2-izopropanolem w wytrząsarce (60 °C, prędkość 200 obr./min) przez 5 minut. Wykonaj ten krok 2x. Następnie przemyć 2x chloroformem (60 °C, prędkość 200 obr./min) przez 10 min każdy.
  2. Oczyszczone próbki ze stali nierdzewnej umieścić w piecu w temperaturze 220 °C na 30 minut.
  3. Przygotować 5 ml 0,5% roztworu PABT, rozpuszczając 25 mg bisfosfonianu polialliloaminy z utajonymi grupami tiolowymi (PABT) i 5 mg wodorowęglanu potasu (KHCO3) w 5 ml DDW i inkubować w temperaturze 72 °C w wytrząsarce przy 200 obr./min przez 30 min.
    UWAGA: Aby zapoznać się z syntezą PABT, zapoznaj się z wcześniej opublikowaną literaturą18.
  4. Zanurzyć upieczone folie lub krążki siatkowe w 0,5% wodnym roztworze PABT i inkubować w wytrząsarce (72 °C, prędkość 200 obr./min) przez 1 godzinę.
  5. Próbki zmodyfikowane PABT przemyć dejonizowaną wodą destylowaną (DDW) przez 5x, przenieść próbki do nowej fiolki i ponownie przemyć DDW przez 5x.
  6. Przygotować łącznie 5 ml roztworu TCEP (12 mg/ml), rozpuszczając 60 mg chlorowodorku fosfiny tris (2-karboksyetylo) (TCEP) w 5 ml 0,1 M buforu octowego (0,57 ml lodowatego kwasu octowego, 820 mg octanu sodu w 100 ml DDW).
  7. Próbki zmodyfikowane PABT należy poddawać działaniu TCEP przez 15 minut w temperaturze pokojowej (RT) na wytrząsarce.
    UWAGA: TCEP służy do deochrony grup tiolowych.
  8. Odgazować DDW w kolbie okrągłodennej za pomocą urządzenia wytwarzającego podciśnienie, takiego jak liofilizator i przepłukać folie lub krążki siatkowe poddane działaniu TCEP odgazowanym DDW przez 5 razy. Przenieść próbki do nowej fiolki i dodatkowo przemyć 5x odgazowanym DDW.
    UWAGA: Niezwykle ważna jest szybka praca, aby zapobiec utlenianiu tioli na powierzchni metalu przez tlen atmosferyczny.
  9. Przygotować 5 ml 1% roztworu PEI-PDT, rozcieńczając 212,5 μl podstawowego PEI-PDT i 125 μl 0,4 M octanu sodu w odgazowanym DDW. Wykonać krok 1.9 jednocześnie z krokiem 1.8, aby zminimalizować narażenie próbek na działanie powietrza atmosferycznego.
    UWAGA: Synteza PEI-PDT jest opisana we wcześniej opublikowanej literaturze18.
  10. Inkubować umyte próbki ze stali nierdzewnej z 1% PEI-PDT. Zastąp powietrze argonem, szczelnie zamknij fiolki i mieszaj na wytrząsarce w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Albo natychmiast przystąpić do koniugacji peptydowej, albo przechowywać w temperaturze 4 °C do 1 tygodnia.

2. Przywiązanie i jakościowa/ilościowa ocena retencji pepCD47 sprzężonego z fluoroforem na powierzchni metalu za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i fluorymetrii

  1. Próbki należy przemyć folią lub krążkami siatkowymi przygotowanymi zgodnie z opisem w sekcji 1, kroki 1.1-1.10 powyżej za pomocą DDW 5x. Przenieść próbki do nowej fiolki i przemyć DDW przez dodatkowe 5 razy. Na koniec przemyć 2x odgazowanym etanolem i 2x odgazowanym dimetyloformamidem (DMF).
  2. Przygotować roztwór podstawowy pepCD47 sprzężony z tetrametylodaminą (TAMRA), rozpuszczając proszek pepCD47 sprzężony z TAMRA w odgazowanym dimetyloformamidzie (DMF) do końcowego stężenia 1 mg/ml. Podwielokrotnić roztwór podstawowy w przydziałach o objętości 1 ml. Przechowywać w szczelnie zamkniętych probówkach w atmosferze argonu w temperaturze -20 °C.
  3. Rozcieńczyć 1 mg/ml roztworu podstawowego pepCD47 sprzężonego z TAMRA za pomocą odgazowanego DMF w celu przygotowania następujących stężeń pepCD47 sprzężonego z fluoroforem - 10, 30, 100 i 200 μg/ml.
    UWAGA: Jeśli wydaje się, że pepCD47 sprzężony z TAMRA został wytrącony, zredukuj podstawowy roztwór pepCD47 sprzężony z TAMRA za pomocą kulek TCEP w stosunku 1:1, w temperaturze RT przez 20 minut. Należy zauważyć, że przed dodaniem sprzężonego z TAMRA pepCD47 do kulek TCEP, należy obrócić roztwór kulek TCEP, usunąć supernatant, a następnie przystąpić do dodawania pepCD47 sprzężonego z TAMRA.
  4. Inkubować zmodyfikowane kupony foliowe PEI-PDT z 10, 30, 100 lub 200 μg/ml pepCD47 sprzężonego z TAMRA w trzech egzemplarzach dla każdego stanu na wytrząsarce w temperaturze pokojowej w atmosferze argonu przez 1 godzinę. Inkubować zmodyfikowane przez PEI-PDT krążki siatkowe, jak również krążki siatkowe niezmodyfikowane poza etapem 1.2 (kontrola bez metali) za pomocą 100 μg/ml pepCD47 sprzężonego z TAMRA w trzech powtórzeniach w temperaturze pokojowej w atmosferze argonu na wytrząsarce przez 1 godz.
    UWAGA: Począwszy od tego etapu, fiolki są zawijane w folię aluminiową, aby chronić zawartość przed światłem.
  5. Umyj powierzchnie pokryte fluoroforem sprzężonym z pepCD47 w celu usunięcia niekowalencyjnie przyłączonego peptydu w następującej kolejności: DMF (3x), DMF/DDW w stosunku 1:1, DDW (3x), 0,3% SDS w 20 mM Tris pH 7,4 (3x, po 5 minut w temperaturze 70 °C na shakerze), DDW (3x), wymiana fiolek i końcowe płukanie DDW.
  6. Umieścić kontrolne i kowalencyjnie sprzężone krążki siatkowe na szkle mikroskopu, dodać 50 μl PBS i umieścić szkiełko nakrywkowe. Obrazowanie dysków siatkowych za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w zestaw filtrów rodaminowych. Rób reprezentatywne zdjęcia w 100-krotnym powiększeniu.
  7. Przygotować 15 ml roztworu TCEP o stężeniu 12 mg/ml, rozpuszczając 180 mg TCEP w mieszaninie metanolu i buforu octowego o stężeniu 1:1 v/v.
  8. Każdą umytą folię inkubować z 1 ml roztworu TCEP na wytrząsarce w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
  9. Przygotować następujące wzorce, seryjnie rozcieńczając zapas pepCD47 sprzężony z TAMRA (1 mg/ml) – 100 μg/ml, 10 μg/ml, 1 μg/ml, 0,1 μg/ml i 0,01 μg/ml. Użyj roztworu TCEP jako rozcieńczalnika.
  10. Przeanalizować sprzężony z TAMRA pepCD47 uwolniony z powierzchni metalu w stosunku do krzywej kalibracyjnej wygenerowanej przy użyciu wzorców za pomocą fluorymetrii przy długościach fal wzbudzenia i emisji 544/590 nm.

3. Dołączanie ludzkiego pepCD47 do powierzchni zmodyfikowanych przez PEI-PDT

  1. Próbki pokryte PEI-PDT opracowane zgodnie z opisem w sekcji 1, kroki 1.1-1.10 powyżej, przemyć odgazowanym DDW 5x, zmienić fiolkę i przemyć odgazowanym DDW 5x.
  2. Przygotować ludzki roztwór podstawowy pepCD47 (1 mg/ml), rozpuszczając ludzki proszek pepCD47 w odgazowanym 50% kwasie octowym do uzyskania stężenia 1 mg/ml.
  3. Przygotować stężenie robocze ludzkiego pepCD47 (100 μg/ml) przez rozpuszczenie 500 μl ludzkiego pepCD47 w 4,500 μl odgazowanego 1x buforowanego fosforanem soli fizjologicznej (PBS).
  4. Inkubować przemyte próbki pokryte PEI-PDT ze 100 μg/ml pepCD47 w temperaturze pokojowej z wytrząsaniem przez 1 godzinę.
  5. Przemyć ludzkie próbki pokryte pepCD47 w celu usunięcia nadmiaru peptydu w następującej kolejności: PBS (3x), DDW (3x), 0,2% Tween-20 (3x, 5 min każda), DDW (3x), zmienić fiolki i końcowe płukanie DDW.
    UWAGA: Powierzchnie pokryte ludzkim pepCD47 mogą być przechowywane w suchym stanie w temperaturze 4 °C przez okres do 6 miesięcy.

4. Powlekanie zmodyfikowanych powierzchni PEI-PDT sekwencją zaszyfrowaną (Scr)

  1. Rozpuścić zaszyfrowany proszek sekwencyjny w odgazowanym 0,1% kwasie octowym, aby przygotować roztwór podstawowy o stężeniu 1 mg/ml.
  2. Przygotować roztwór 100 μg/ml zaszyfrowanego peptydu, rozpuszczając 500 μl w 4 500 μl odgazowanego 0,1% kwasu octowego.
  3. Umyte próbki PEI-PDT należy pokryć 100 μg/ml zaszyfrowanego peptydu w temperaturze pokojowej, wytrząsając przez 1 godzinę.
  4. Aby usunąć nieprzyczepiony peptyd, umyj powierzchnie w następującej kolejności: 0,01% kwas octowy (3x), DDW (3x), 0,2% Tween-20 (3x, 5 min), DDW (3x), zmienić fiolki i przepłukać jedną DDW.

5. Pętla Chandlera do analizy przyłączenia komórkowego do powierzchni metalowych

  1. Pokryj folie metalowe (0,65 cm x 1 cm) ludzkim pepCD47 lub poszyfrowanym peptydem zgodnie z opisem w sekcji 1, a następnie 3 lub 4.
  2. Pokrój rurki PVC 1/4" na trzy kawałki o długości 38 cm.
  3. Włóż do 8 niemodyfikowanych, zaszyfrowanych folii metalowych z peptydem lub modyfikacją pepCD47 do trzech różnych probówek.
  4. Zbierz 30 ml krwi od zdrowych dawców ludzkich wolnych od jakichkolwiek leków przeciwpłytkowych, zgodnie z instytucjonalnym protokołem IRB. Wstępnie napełnij strzykawkę 1 ml 4% cytrynianu sodu, aby zapobiec krzepnięciu pobranej krwi.
  5. Wlej 10 ml krwi do każdej probówki za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml i połącz końce metalowymi łącznikami. Umieść probówki wypełnione krwią na kołach aparatu pętlowego Chandlera.
  6. Przepuszczać krew wzdłuż folii metalowych, obracając koło w temperaturze 37 °C z prędkością obliczoną na wytworzenie ścinania 25 dyn/cm2 przez 4 godziny.
  7. Odcedź krew z probówek i wyrzuć krew zgodnie z wymaganiami IRB.
  8. Przetnij rurki za pomocą skalpela, aby wydobyć folie z każdej tuby.
  9. Przygotować 2% roztwór aldehydu glutarowego, rozcieńczając 10 ml 4% roztworu aldehydu glutarowego, używając 10 ml buforu kakodylanu sodu z 0,1 M chlorkiem sodu.
  10. Inkubować folie w 2% roztworze aldehydu glutarowego przez 15 minut i przechowywać w temperaturze 4 °C przez noc. Przed analizą umyj folie metalowe 3x PBS.

6. Analiza przyczepiania komórek do powierzchni metalowych za pomocą barwnika CFDA

  1. Ogrzać 8 ml PBS w probówce o pojemności 15 ml w łaźni wodnej nastawionej na 37 °C.
  2. Przygotować roztwór barwnika CFDA (dioctan karboksyfluoresceiny, ester sukcynimidylu) w następujący sposób - dodać 90 μl DMSO do jednej fiolki z barwnikiem CFDA, aby uzyskać stężenie wyjściowe 10 mM. Następnie przygotuj stężenie robocze 93,75 μM, dodając 75 μL wywaru CFDA do 8 ml ciepłego PBS. Wymieszaj, odwracając rurki kilka razy i przykryj probówkę folią aluminiową.
    UWAGA: Zaleca się świeże przygotowanie barwnika CFDA przed każdym użyciem.
  3. Inkubować każdą folię z 1 ml barwnika CFDA na 24-dołkowej płytce. Przykryć płytkę folią aluminiową i inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 15 minut.
  4. Umyj folie metalowe 3x PBS, aby usunąć nadmiar barwnika. Obraz za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego.

7. Przyczepianie monocytów i ekspansja makrofagów na zmodyfikowanych pepCD47 i gołych powierzchniach metalowych

  1. Zbierz 10 ml krwi obwodowej przez dostęp do żyły głównej podczas składania ofiary z samca szczura Sprague-Dawley o wadze 400-450 g. Natychmiast wymieszać z 1 000 j.m. heparyny sodu, aby zapobiec krzepnięciu.
  2. Odpipetować 10 ml pożywki o gradiencie gęstości do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Wymieszać krew z 5 ml PBS i ostrożnie nałożyć rozcieńczoną krew na podłoże o gradiencie gęstości za pomocą pipety Pasteura. Wirować w obracającym się wirniku kubełkowym o ciśnieniu 800 x g i temperaturze 18-25 °C przez 20 minut przy minimalnych ustawieniach przyspieszania i zwalniania.
  3. Za pomocą pipety Pasteura zbierz nieprzezroczystą warstwę kożucha na granicy faz między osoczem a Ficollem. Rozcieńczyć kożuszek w stosunku 1:3 PBS i odwirować w temperaturze 550 x g i 4 °C przez 10 minut do komórek kożucha kożuchowego.
  4. Ponownie zawiesić komórki płaszcza kożuchowego w 3 ml buforu do lizy ACK w celu lizy zanieczyszczających erytrocytów. Inkubować na lodzie przez 4 minuty. Dodać 12 ml buforu do separacji komórek (CSB; 0,5% BSA, 0,5% FBS, 2 mM EDTA/PBS).
  5. Wirować w temperaturze 550 x g i temperaturze 4 °C przez 10 minut. Ponownie zawiesić osad w 10 ml CSB.
  6. Wirować w temperaturze 200 x g i temperaturze 4 °C przez 10 minut w celu wyeliminowania płytek krwi. Powtórz dwa razy.
  7. Ponownie zawiesić osad w 500 μl CSB. Dodać 10 μg każdego z następujących mysich przeciwciał antyszczurzych: CD8a (klon OX-8), anty-CD5 (klon OX-19), anty-CD45RA (klon OX-33) i anty-CD6 (klon OX-52).
  8. Inkubować w temperaturze 4 °C na pionowym rotatorze probówkowym przez 1 godzinę. Dodać 9,5 ml CSB. Wirować przy 300 x g i 4 °C przez 10 min. Odrzucić supernatant, ponownie zawiesić osad w 10 ml CSB i powtórzyć wirowanie.
  9. Ponownie zawiesić osad w 500 μl CSB. Dodaj 150 μl kozich mikrogranulek anty-mysich IgG. Inkubować w temperaturze 4 °C na pionowym rotatorze probówkowym przez 20 minut. Dodać 9,5 ml CSB. Wirować przy 300 x g i 4 °C przez 10 min.
  10. Odrzucić supernatant. Zawiesić osad w 1 ml CSB.
  11. Umieść kolumnę LS w separatorze magnetycznym. Zalej kolumnę LS 3 ml CSB. Odrzuć przepływność kolumny. Dodać 1 ml ponownie zawieszonego osadu komórkowego z kroku 7.10. Rozpocznij zbieranie przepływności. Po zatrzymaniu przepływu dodaj 5 ml CSB i kontynuuj zbieranie przepustowości kolumny, aż przepływ ustanie.
  12. Odwirować przepustowość kolumny (6 ml) zawierającej ujemnie wybrane monocyty w temperaturze 300 x g i 4 °C przez 10 minut. Ponownie zawiesić powstały mały osad w 2 ml pożywki RPMI-1640 uzupełnionej 10% FCS, 1% pen/strep i 100 ng/ml czynnika stymulującego tworzenie kolonii makrofagów szczura (M-CSF).
  13. Policz monocyty za pomocą hemocytometru. Dostosuj stężenie monocytów do 5 x 105 komórek/ml.
  14. Dodać 1 ml objętości zawiesiny monocytów do poszczególnych studzienek 12-dołkowej płytki z gołymi próbkami folii ze stali nierdzewnej (N = 3) lub próbkami ze stali nierdzewnej zmodyfikowanymi szczurzym pepCD47 (N = 3) zgodnie z 1.1-1.10 i 3.1-3.6.
  15. Zmień podłoże w 3 i 5 dniu po wysiewie. W 6 dniu po wysiewie przemyj komórki PBS i utrwal 4% paraformaldehydem w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Umyć dwukrotnie PBS przez 5 min.
  16. Usuń folie ze stali nierdzewnej i umieść je pojedynczo na nowej płytce 12-dołkowej. Nie odwracaj folii.
  17. Inkubować w 0,5% Tween-20/PBS przez 15 minut, aby przepuszczalność komórek. Umyć dwukrotnie PBS przez 5 min.
  18. Zablokuj 10% kozią surowicę/PBS na 20 minut. Odessaj surowicę. Nie prać. Dodaj mysie przeciwciało antyszczurze CD68 (rozcieńczone w stosunku 1:100 w 1% BSA/PBS). Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Prać 3x w PBS po 5 min każdy.
  19. Dodaj kozi anty-mysi IgG Alexa Fluor 546 (rozcieńczony w stosunku 1:200 w 1% BSA/PBS). Inkubować w ciemności w temperaturze pokojowej przez 45 minut. Prać w PBS przez 5 min. Barwienie przeciwstawne 1 μg/ml barwnika Hoechst 33342 w ciemności w temperaturze pokojowej przez 10 min. Prać 3x w PBS po 5 min każdy.
  20. Odwróć folie i obraz za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego z odwróconą optyką. Rób zdjęcia w 200-krotnym powiększeniu z ustawieniami filtrów niebieskiego i czerwonego.
  21. Policz przyłączone monocyty na poszczególnych obrazach i oblicz średnie grupowe oraz odchylenia standardowe.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Powierzchnie metalowe zostają uczynione reaktywnymi wobec tioli w celu przyłączenia peptydów poprzez serię modyfikacji chemicznych, co zilustrowano na Rysunku 1. Inkubacja z PABT, a następnie traktowanie PEI-PDT sprawia, że powierzchnia metalowa staje się podatna na przyłączenie peptydów. Peptyd CD47 (pepCD47) zawierający resztę cysteiny na C-końcu, połączony z rdzeniową sekwencją pepCD47 poprzez elastyczny podwójny mostek AEEAc, zostaje kowalencyjnie przyłączony do powierzchni reaktywnych w...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Demonstrujemy i opisujemy stosunkowo nową strategię chemiczną polegającą na dołączaniu terapeutycznych ugrupowań peptydowych do powierzchni ze stali nierdzewnej, mając na celu zmniejszenie reaktywności powierzchni z komórkami zapalnymi znajdującymi się we krwi. Opisana tutaj chemia bisfosfonianów obejmuje tworzenie wiązań koordynacyjnych między tlenkami metali i grupami bisfosfonianów PABT. Grubość monowarstwy polibisfosfonianu utworzonej na powierzchni metalu nie przekracza 5 nm18, a zatem nie ma...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Rozwój protokołu i badania przedstawione w tym artykule były wspierane przez finansowanie NIH (NBIB) R01 (# EB023921) dla IF i SJS oraz finansowanie NIH (NHLBI) R01 (# HL137762) dla IF i RJL.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1 M Tris-HCLInvitrogen15567-027pH - 7,5
4% Aldehyd glutarowyMikroskopia elektronowa Sciences16539-07
4% Cytrynian soduSigmaS5770
ACK bufor lizującyQuality Biologicals118-156-721
anty-CD45RA Ab (mysi anty-szczur; klon OX-19)Biolegend202301
anty-CD5 Ab (mysi anty-szczur; klon OX-19)Biolegend203501
anty-CD6 Ab (mysi anty-szczur; klon OX-52)BD Biosciences550979
anty-CD68 Ab (mysi anty-szczur; klon ED-1)BioRadMCA341
anty-CD8a Ab (mysi antyszczur; klon OX-8)Biolegend201701
Chloroform z certyfikatem ACSFisher ChemicalC298-500
Dimethyl Formammide (DMF)Alfa Aesar39117
Siatka ze stali nierdzewnej EmbraMikroskopia elektronowa SciencesE200-SSdyski siatkowe ze stali nierdzewnej
Ficoll HypaqueGE Healthcare17-1440-02
Lodowaty kwas octowyACROS organiczny148930025
kozia anty-mysia IgG Alexa FluorThermoFisherA11030
Heparyna sodowaSagent Pharmaceuticals402-01
Ludzki pepCD47Bachem4099101
IzopropanolFisher ChemicalA426P-4
Adaptery metalowe LeurFitting6515INDAdapter 1-drożny 316 ss 1/4 "-5/16" końcówki motyki
Firmachemiczna RICCA4829-32
MikroskopNikon EclipseTE300
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS)Gibco14190-136
Wodorowęglan potasu (KHCO3)Fisher ChemicalP184-500
Rurki PVCTerumo-CVS600501/4 "X 1/16 8'
kakodylanu sodu z 0,1 M chlorkiem soduElektron Nauki mikroskopowe11653
Dodecylosiarczan sodu (SDS)Laboratoria Bio-Rad161-0302
Taktetynian sodu (C2H3NaO2)Alfa AesarA13184
Peptyd SrcBachem4092599
Próbki w kształcie cylindra ze stali nierdzewnej (AISI 304) o świetleMikrogrupa, Medway, MA200973281 cm X 6 mm OD
Folie ze stali nierdzewnej (AISI 316L)Goodfellow, Coraopolis, PA100 mm X 100 mm X 0,05 mm
PepCD47 (TAMRA-pepCD47)Bachem4100277
Substrat TMB (3,3',5,5' -tetrametylobenzydyna) i tris(2-karboksyetylo)chlorowodorek fosfiny (TCEP)Thermo ScientificPG82089
Tween-20Laboratoria Bio-Rad170-6531
Zestaw do śledzenia komórek Vybrant CFDA SEInvitrogenV12883
bufor

Bibliografia

  1. Buccheri, D., Piraino, D., Andolina, G., Cortese, B. Understanding and managing in-stent restenosis: a review of clinical data, from pathogenesis to treatment. Journal Thoracic Disease. 8 (10), 1150-1162 (2016).
  2. van Oeveren, W. Obstacles in haemocompatibility testing. Scientifica. 2013, Cairo. 392584(2013).
  3. Mitra, A. K., Agrawal, D. K. In stent restenosis: bane of the stent era. Journal of Clinical Pathology. 59 (3), 232-239 (2006).
  4. Iqbal, J., Gunn, J., Serruys, P. W. Coronary stents: historical development, current status and future directions. British Medical Bulletin. 106, 193-211 (2013).
  5. Hoffmann, R., et al. Patterns and mechanisms of in-stent restenosis. A serial intravascular ultrasound study. Circulation. 94 (6), 1247-1254 (1996).
  6. Stefanini, G. G., Windecker, S. Stent thrombosis: no longer an issue with newer-generation drug-eluting stents. Circulation: Cardiovascular Interventions. 5 (3), 332-335 (2012).
  7. Palmerini, T., et al. Clinical outcomes with bioabsorbable polymer- versus durable polymer-based drug-eluting and bare-metal stents: evidence from a comprehensive network meta-analysis. Journal of the American College of Cardiology. 63 (4), 299-307 (2014).
  8. Omar, W. A., Kumbhani, D. J. The Current Literature on Bioabsorbable Stents: a Review. Current Atherosclerosis Reports. 21 (12), 54(2019).
  9. Slee, J. B., Christian, A. J., Levy, R. J., Stachelek, S. J. Addressing the Inflammatory Response to Clinically Relevant Polymers by Manipulating the Host Response Using ITIM Domain-Containing Receptors. Polymers (Basel). 6 (10), 2526-2551 (2014).
  10. Oldenborg, P. A., et al. Role of CD47 as a marker of self on red blood cells. Science. 288 (5473), 2051-2054 (2000).
  11. vanden Berg, T. K., vander Schoot, C. E. Innate immune 'self' recognition: a role for CD47-SIRPalpha interactions in hematopoietic stem cell transplantation. Trends in Immunology. 29 (5), 203-206 (2008).
  12. Tengood, J. E., Levy, R. J., Stachelek, S. J. The use of CD47-modified biomaterials to mitigate the immune response. Experimental Biology Medicine (Maywood). 241 (10), 1033-1041 (2016).
  13. Tsai, R. K., Rodriguez, P. L., Discher, D. E. Self inhibition of phagocytosis: the affinity of 'marker of self' CD47 for SIRPalpha dictates potency of inhibition but only at low expression levels. Blood Cells, Molecules and Diseases. 45 (1), 67-74 (2010).
  14. Slee, J. B., et al. Enhanced biocompatibility of CD47-functionalized vascular stents. Biomaterials. 87, 82-92 (2016).
  15. Finley, M. J., et al. Diminished adhesion and activation of platelets and neutrophils with CD47 functionalized blood contacting surfaces. Biomaterials. 33 (24), 5803-5811 (2012).
  16. Stachelek, S. J., et al. The effect of CD47 modified polymer surfaces on inflammatory cell attachment and activation. Biomaterials. 32 (19), 4317-4326 (2011).
  17. Inamdar, V. V., et al. Stability and bioactivity of pepCD47 attachment on stainless steel surfaces. Acta Biomaterialia. 104, 231-240 (2020).
  18. Fishbein, I., et al. Local delivery of gene vectors from bare-metal stents by use of a biodegradable synthetic complex inhibits in-stent restenosis in rat carotid arteries. Circulation. 117 (16), 2096-2103 (2008).
  19. Moser, K. V., Humpel, C. Primary rat monocytes migrate through a BCEC-monolayer and express microglia-markers at the basolateral side. Brain Research Bulletin. 74 (5), 336-343 (2007).
  20. vander Giessen, W. J., et al. Marked inflammatory sequelae to implantation of biodegradable and nonbiodegradable polymers in porcine coronary arteries. Circulation. 94 (7), 1690-1697 (1996).
  21. Fishbein, I., et al. Bisphosphonate-mediated gene vector delivery from the metal surfaces of stents. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (1), 159-164 (2006).
  22. Mouro-Chanteloup, I., et al. Evidence that the red cell skeleton protein 4.2 interacts with the Rh membrane complex member CD47. Blood. 101 (1), 338-344 (2003).
  23. Finley, M. J., Clark, K. A., Alferiev, I. S., Levy, R. J., Stachelek, S. J. Intracellular signaling mechanisms associated with CD47 modified surfaces. Biomaterials. 34 (34), 8640-8649 (2013).
  24. Slee, J. B., Alferiev, I. S., Levy, R. J., Stachelek, S. J. The use of the ex vivo Chandler Loop Apparatus to assess the biocompatibility of modified polymeric blood conduits. Journal of Visualized Experiments. (90), e51871(2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Immobilizacja peptydu CD47modyfikacja powierzchni metalicznejprotok koniugacji peptyd wfunkcjonalizacja PABT PEI PDTanaliza z u yciem mikroskopii fluorescencyjnejzgodno z cytometri przep ywowpoprawa biokompatybilno ci stent wprzy czanie peptyd w terapeutycznychpowlekanie metalicznych biomateria w

Powiązane artykuły